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CN117646040A - 一种通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法 - Google Patents

一种通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法 Download PDF

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CN117646040A
CN117646040A CN202311681748.8A CN202311681748A CN117646040A CN 117646040 A CN117646040 A CN 117646040A CN 202311681748 A CN202311681748 A CN 202311681748A CN 117646040 A CN117646040 A CN 117646040A
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xylitol
mother liquor
fermentation
xylose mother
strain
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Application number
CN202311681748.8A
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李欢欢
张春燕
苏玉庆
刁功科
张文魁
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Henan Yuxin Sugar Alcohol Co ltd
Original Assignee
Henan Yuxin Sugar Alcohol Co ltd
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Abstract

本发明属于木糖醇制备以及生物发酵技术领域，具体涉及一种通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法。本发明提供的通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法，以马克斯克鲁维酵母作为发酵菌种，先利用亚硝基胍对菌株进行诱变，得到碱基突变菌株；然后采用TC染色法进行筛选，得到呼吸酶活力旺盛的菌株，减少普通筛选的盲目性；最后根据木糖转化木糖醇的途径，添加特殊的营养添加物，能够进一步促进木糖向木糖醇的转化。本发明采用该方法，不仅省去了木糖纯化步骤，而且简化了木糖醇的分离步骤，能够有效降低木糖醇的生产成本，而且所得产物中木糖醇的含量和纯度较高，在木糖母液的再利用以及木糖醇的生产领域均具有良好的应用前景。

Description

一种通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法
技术领域
本发明属于木糖醇制备以及生物发酵技术领域，具体涉及一种通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法。
背景技术
木糖醇是含五个碳原子和五个羟基的一种多元醇，在食品、医药、造纸、化工等行业有广泛应用。目前产业上制备木糖醇的方法主要是：先通过酸水解木聚糖获得木糖，再采用化学催化加氢方法制备木糖醇。该方法提取木糖过程中，会产生大量的木糖母液副产物。木糖母液呈褐黄色，含杂质较多，且纯度低、粘度大，其组分除木糖外还含有一定浓度的葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等碳源以及少量的糠醛、四氢呋喃等物质。
为避免资源浪费并实现木糖母液的再利用，已有许多研究者针对木糖母液的利用和再提取技术进行研究。现有的最常见的提纯工艺是将木糖母液进行减压蒸发，然后将蒸发后的木糖结晶滤出。但是该方法存在能耗大、质量不稳定、且所得结晶的含水率较高的问题。此外，相继有学者提出采用树脂分离提纯木糖母液的工艺方法、以及采用色谱分离木糖醇母液中有效成分的工艺方法。上述分离方法均需要将母液中木糖进行浓缩分离等工序对木糖提纯氢化后，再次经过过滤交换等一系列操作得到木糖醇，存在设备要求高、操作难度大的问题。后来，有部分研究学者提出采用菌株发酵木糖母液的方法，其采用菌种直接将木糖母液中木糖发酵成木糖醇，但是仍存在发酵周期偏长，转化率偏低的问题，限制了其进一步应用。
发明内容
为解决现有技术的问题，本发明的目的是提供一种通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法，该方法从菌种选育到发酵条件和配方进行综合改进，能够大幅度提高木糖醇的产率和纯度
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法，包括以下步骤：
(1)采用亚硝基胍对马克斯克鲁维酵母进行化学诱变处理，得到诱变后的菌株；
(2)采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑对步骤(1)诱变后的菌株进行染色处理，根据染色结果筛选得到呼吸酶活力旺盛的菌落；
(3)将步骤(2)得到的呼吸酶活力旺盛的菌落分别接种至含有木糖母液的筛选培养基中进行培养，发酵后对所得发酵液中的木糖醇含量和纯度进行测定，根据含量和纯度测定结果筛选得到最佳菌株；
(4)将步骤(3)筛选得到的最佳菌株接种至含有木糖母液的发酵培养基中进行发酵培养，即实现木糖母液向木糖醇的转化。
作为进一步优选的方案，步骤(1)中，所述化学诱变处理是将0.8～1.2mg/mL的亚硝基胍溶液加入到马克斯克鲁维酵母的菌悬液中，于35～40℃水浴处理20～40min。亚硝基胍诱变主要在DNA链的复制区引起GC→AT的转换，使微生物产生高频率的突变。
作为进一步优选的方案，步骤(1)中，所述马克斯克鲁维酵母预先进行活化处理；所述活化处理是将马克斯克鲁维酵母接种至活化培养基中，于200～300rpm、28～32℃条件下活化培养10～15h；所述活化培养基的组成为：葡萄糖9～12g、酵母浸粉0.3～0.7g、蛋白胨0.3～0.5g，加水定容至50mL。
作为进一步优选的方案，步骤(2)中，所述染色处理是将2,3,5-三苯基氯化四氮唑水溶液与诱变后的菌株的菌悬液混合后进行染色处理；所述染色处理的时间为1～3d；所述2,3,5-三苯基氯化四氮唑水溶液的质量浓度为0.8％～1.2％。本发明中，利用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)显色剂进行染色反应，称为TC染色法，通常用于植物种子活力鉴定，也能对酵母的代谢产物发生呈色反应，根据显色程度判断酵母中呼吸酶活力的大小。本发明利用亚硝基胍对菌株马克斯克鲁维酵母进行化学诱变处理，再通过TC染色法进行筛选，能够辨别出酵母产木糖醇能力的高低，避免盲目筛选。
作为进一步优选的方案，步骤(3)中，所述筛选培养基由以下质量份数的组分组成：木糖母液16％～20％、玉米浆干粉0.3％～0.8％、磷酸二氢钾0.03％～0.08％，溶剂为水。进行筛选培养基的配制时，取木糖母液16～20g、玉米浆干粉0.3～0.8g、磷酸二氢钾0.03～0.08g，加水定容至100mL，即可。
作为进一步优选的方案，步骤(3)中，所述培养的条件为：200～300rpm、28～33℃条件下培养70～80h。
作为进一步优选的方案，步骤(4)中，所述发酵培养基由基础培养基和营养添加物组成；所述基础培养基由以下质量份数的组分组成：木糖母液23％～28％、玉米浆干粉0.3％～0.8％、尿素0.4％～0.6％、磷酸二氢钾0.02％～0.05％，溶剂为水；以在基础培养基中的终浓度计，所述营养添加物的组成为：氨基酸混合液4～6mL/L、VB2 8～12mg/L、VB3 4～6mg/L。
基于进一步提升木糖醇的得率以及纯度的考虑，作为更优选的方案，所述基础培养基由以下质量份数的组分组成：木糖母液25％、玉米浆干粉0.5％、尿素0.5％、磷酸二氢钾0.025％，溶剂为水；以在基础培养基中的终浓度计，所述营养添加物的组成为：氨基酸混合液5mL/L、VB2 10mg/L、VB3 5mg/L。
作为进一步优选的方案，步骤(4)中，所述发酵培养的条件为：200～300rpm转速、28～33℃温度、5.5～6.5pH条件下发酵培养70～80h。
作为进一步优选的方案，步骤(4)中，所述发酵培养时，最佳菌株的接种量13％～17％V/V。
本发明技术方案的有益效果在于：
本发明提供的通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法，以马克斯克鲁维酵母作为发酵菌种，先利用亚硝基胍对菌株进行诱变，得到碱基突变菌株；然后采用TC染色法进行筛选，得到呼吸酶活力旺盛的菌株，减少普通筛选的盲目性；最后根据木糖转化木糖醇的途径，添加氨基酸混合物和维生素，从而进一步促进木糖向木糖醇的转化。
本发明的上述方法，利用微生物中的还原酶，以粗放的木糖母液为底物来发酵生产木糖醇，不仅省去了木糖纯化步骤，而且简化了木糖醇的分离步骤，能够有效降低木糖醇的生产成本。此外，本发明采用生物技术生产木糖醇，其生产过程是在微生物细胞里木糖还原酶的催化下将木糖还原为木糖醇，氢来源于细胞里还原型辅酶中的氢原子和水中的氢离子，不必单独制氢，也无需额外提供氢源，生产过程简单、安全、节能，是一种极具前途的生产方法，在木糖母液的再利用以及木糖醇的生产领域均具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面将结合具体实施例和试验例对本发明的技术方案进行清楚完整的描述。但本领域技术人员应当理解，实施例仅用于说明本发明的技术方案，而不应视为限制本发明的保护范围。基于下述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施方案，例如修改、变形或简单替换后得到的实施方案，均应属于本发明的保护范围。
其中，以下实施例中，采用的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)来自上海抚生实业有限公司。
以下实施例中，氨基酸混合液为常规的市售产品，其组成为：脯氨酸0.6％，苏氨酸0.6％，蛋氨酸0.7％，异亮氨酸0.7％，丙氨酸0.4％，缬氨酸0.6％，亮氨酸0.7％，半胱氨酸1.2％，苯丙氨酸0.8％，对氨基苯甲酸0.2％，天门冬氨酸0.7％，甘氨酸0.4％，组氨酸0.8％，赖氨酸0.7％，丝氨酸0.5％，色氨酸1％，酪氨酸0.9％，谷氨酸0.9％，精氨酸0.2％。
实施例1
该实施例提供一种通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法，包括以下步骤：
(1)采用亚硝基胍对马克斯克鲁维酵母进行化学诱变处理，得到诱变后的菌株；
该步骤具体操作过程为：①配制50mL活化培养基(葡萄糖10g、酵母浸粉0.5g、蛋白胨0.4g，加水定容至50mL)装到500mL的摇瓶中，115℃灭菌25min。②待活化培养基冷却后，取适量菌体(马克斯克鲁维酵母)接入到摇瓶中，30℃、220r培养12h。③培养结束后，将菌液分别倒进灭菌处理后的离心管中，12000r离心10min，倒掉上清液；再向有菌体沉淀的离心管中加1mL无菌水，充分混匀洗涤，12000r离心10min，倒掉上清液，重复洗涤两次。④在洗涤后的菌体中加入1mL的磷酸盐缓冲液(pH＝6)混匀制成菌悬液；然后在菌悬液中添加100uL、1mg/ml的亚硝基胍溶液，混匀，37℃水浴30min(每5分钟混匀1次)以进行化学诱变处理。
(2)采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑对步骤(1)诱变后的菌株进行TC染色处理，根据染色结果筛选得到呼吸酶活力旺盛的菌落；
该步骤具体操作过程为：①配制质量浓度为1％的2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)水溶液，过滤除菌。另配制100mL的固体培养基(葡萄糖15g、酵母浸粉0.5g、琼脂18g，加水定容至100mL)，115℃灭菌25min。②待固体培养基冷却至50℃时加入100uL的TTC水溶液，轻轻混匀后倒入4块平板。③亚硝基胍化学诱变后的菌悬液梯度稀释为100、10-1、10-2、10-3共4个浓度，分别吸取200uL涂布上述处理后的平板，30℃倒置培养2天，然后根据染色结果，选择颜色较红的菌落，作为呼吸酶活力旺盛的菌落。
(3)将步骤(2)得到的呼吸酶活力旺盛的菌落分别接种至含有木糖母液的筛选培养基中进行发酵培养，发酵后对所得发酵液中的木糖醇含量和纯度进行测定，根据含量和纯度测定结果筛选得到最佳菌株；
该步骤具体操作过程为：配制固体培养基(葡萄糖15g、酵母浸粉0.5g、琼脂18g，加水定溶质100mL)分装到试管中，115℃灭菌25min，倾斜放置至培养基凝固。挑取20个步骤(2)染色后颜色较红的单菌落分别命名为M-1～M-20并在试管斜面上划线培养，30℃培养2天。培养后进行摇床筛选，将筛选培养基(木糖母液18％、玉米浆干粉0.5％、磷酸二氢钾0.05％，加水定溶质100mL)分装到带棱三角瓶中，每瓶各50mL，115℃灭菌25min，然后分别接种上述M-1～M-20菌株(接种量为接种环的一环)，于220r、30℃培养72h，进行木糖醇纯度和含量检测。
其中，木糖醇的纯度测试采用HPLC方法，HPLC仪器带有RID检测器，流动相为纯水，流速0.6mL/min，外标法定量。木糖醇含量测定，采用折射仪测定发酵所得溶液中干物质的质量含量(单位g/100mL)，然后将干物质的质量含量和纯度相乘即得木糖醇的含量。例如：发酵后溶液干物质28g/100mL，木糖醇纯度60％，则该溶液中木糖醇含量为28*60％＝16.8g/100mL。
以购买得到的马克斯克鲁维酵母的原始菌株作为实验菌株(对照组)，各菌株发酵后所得木糖醇的含量和纯度测定结果如表1所示。
表1不同菌株发酵所得木糖醇的含量和纯度测定结果
序号 实验菌株 M1 M2 M3 M4 M5 M6
含量g/100mL 6.99 6.47 6.4 6.75 7.35 4.71 5.48
木糖醇纯度％ 58.29 51.77 51.21 55.31 61.78 36.2 42.8
序号 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13
含量g/100mL 7.72 6.85 6.68 5.93 4.66 7.22 6.83
木糖醇纯度％ 64.29 57.08 55.61 49.39 33.26 60.13 56.89
序号 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20
含量g/100mL 6.54 7.20 6.68 5.64 5.80 6.00 6.53
木糖醇纯度％ 54.47 60.04 55.64 47.04 48.37 50.02 57.29
由表1可知，对照组的实验菌株发酵72h木糖醇纯度为58.29％，含量6.99g/100mL；而编号为M7的诱变菌株发酵72h木糖醇纯度64.29％，含量7.72g/100mL，相较于对照组均有显著提升，因此将诱变菌株M7作为最佳菌株进行后续试验。
(4)将步骤(3)筛选得到的最佳菌株接种至含有木糖母液的发酵培养基中进行发酵培养，即实现木糖母液向木糖醇的转化。
以下对步骤(4)发酵培养基的培养选择和优化以及发酵工艺参数的确定进行具体说明。
发酵培养基是微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的载体，其主要是按一定比例配制而成的多种营养物质的混合物。适宜于大规模发酵的培养基应该能够满足产物最经济的合成、副产物尽可能的少、原料应因地制宜、价格低廉，且性能稳定、便于采购运输，适合大规模储藏的要求。
一、氮源、营养添加物的选择优化
氮源是可以提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养源。由于木糖醇属于不含N产物，理论上N源只需满足菌体自身生长所需营养成分，因此本发明以价格优惠的玉米浆干粉为氮源即可。
木糖转化成木糖醇的途径是木糖在木糖异构酶(XI)的作用下异构化为木酮糖，之后在木糖醇还原酶的作用下生成木糖醇。维生素B2是黄素酶的辅基，黄素酶在生物氧化还原过程中发挥递氢的作用。维生素B3又称烟酸，维生素B3与色氨酸一起，它们是(NAD+)辅酶Ⅰ、(NADP+)辅酶Ⅱ及其各自的还原形式(NAD(P)H)脱氢酶的辅酶，也用于传递氢离子。本发明拟通过添加适量的维生素、氨基酸强化营养因子，加强木糖醇的代谢途径。
具体试验如表2所示。其中，发酵培养基由基础培养基和营养添加物组成，基础培养基配方为：木糖母液20％、玉米浆干粉0.5％、尿素0.5％、磷酸二氢钾0.025％，溶剂为水。基础培养基配制时取玉米浆干粉0.5g、尿素0.5g、磷酸二氢钾0.025g，加20％木糖母液(干物质为20g/100mL的溶液)定容至100mL。初步选取的营养添加物主要为氨基酸混合液、胆碱、VB2、VB3，发酵培养基的具体组成参见表2。进行菌种发酵时，是将诱变菌株M7接种至发酵培养基中进行发酵培养，接种时M7种子液OD600在10-15，接种后OD600在0.7-1.0，于220r、30℃条件下进行发酵培养。上述营养添加物对于木糖醇含量和纯度的影响结果如表2所示。其中，“√”表示添加该组分，“/”表示不含该组分。
表2发酵培养基配方优化结果
由表2可知，在发酵培养基的配方中添加5ml/L的氨基酸混合液、10mg/L的VB2、5mg/L的VB3(对应于实验组14)能够有效缩短发酵周期并提高木糖醇的含量，因此确定的最佳的营养添加物的组成为：氨基酸混合液5mL/L、VB2 10mg/L、VB3 5mg/L。此外，通过试验发现，添加胆碱后会导致发酵周期明显延长，因此不再在营养添加物中加入胆碱。
二、初始木糖母液浓度优化
分别配制木糖母液浓度为10％、15％、20％、25％、30％进行对比试验，在上述相同的发酵条件下进行摇瓶发酵，考察木糖母液浓度对木糖醇产量的影响。结果如表3所示。
表3母液浓度对于发酵效果的影响
表3结果表明，木糖母液浓度在25％时，木糖醇含量和转化率较高，且综合成本是最低的。
三、发酵工艺优化
3.1发酵温度的控制
该试验考察发酵温度对木糖醇产量的影响：采用相同的发酵培养基，其他发酵条件相同，分别在28℃、30℃、33℃、35℃下进行摇瓶发酵，考察发酵温度对木糖醇产量的影响，结果表明发酵温度在30℃效果最好。
3.2发酵液pH的控制
该试验考察发酵培养基初始pH对木糖醇产量的影响：采用相同的发酵培养基，保持其他发酵条件相同，将初始pH分别调整为5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，进行摇瓶发酵，考察不同初始pH对木糖醇产量的影响，结果表明发酵pH在5.5、6.0和6.5效果基本一致，优于5.0和7.0，因此较优的发酵pH范围为5.5～6.5。
3.3接种量大小对发酵的影响
该试验考察接种量对木糖醇产量的影响：采用相同的发酵培养基，其他发酵条件相同，分别按5％、10％、15％(V/V)的接种量接入M7诱变菌株的液体种子，考察不同接种量对木糖醇产量的影响，结果表明接种量15％时发酵结果最好。
因此，本发明优化所得发酵培养基中，基础培养基由以下质量份数的组分组成：木糖母液25％、玉米浆干粉0.5％、尿素0.5％、磷酸二氢钾0.025％，溶剂为水；以在基础培养基中的终浓度计，营养添加物的组成为：氨基酸混合液5mL/L、VB2 10mg/L、VB3 5mg/L。发酵培养的条件为：200～300rpm转速、28～33℃温度、5.5～6.5pH条件下活化培养70～80h。发酵培养时，最佳菌株的接种量15％V/V。
综上可知，本发明提供的通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法，以马克斯克鲁维酵母作为发酵菌种，先利用亚硝基胍对菌株进行诱变，得到碱基突变菌株；然后采用TC染色法进行筛选，得到呼吸酶活力旺盛的菌株，减少普通筛选的盲目性；最后根据木糖转化木糖醇的途径，添加氨基酸混合物和维生素，能够进一步促进木糖向木糖醇的转化。本发明采用该方法，不仅省去了木糖纯化步骤，而且简化了木糖醇的分离步骤，能够有效降低木糖醇的生产成本，而且所得产物中木糖醇的含量和纯度较高，生产过程简单、安全、节能，在木糖母液的再利用以及木糖醇的生产领域均具有良好的应用前景。

Claims (10)

1.一种通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用亚硝基胍对马克斯克鲁维酵母进行化学诱变处理，得到诱变后的菌株；
(2)采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑对步骤(1)诱变后的菌株进行染色处理，根据染色结果筛选得到呼吸酶活力旺盛的菌落；
(3)将步骤(2)得到的呼吸酶活力旺盛的菌落分别接种至含有木糖母液的筛选培养基中进行培养，发酵后对所得发酵液中的木糖醇含量和纯度进行测定，根据含量和纯度测定结果筛选得到最佳菌株；
(4)将步骤(3)筛选得到的最佳菌株接种至含有木糖母液的发酵培养基中进行发酵培养，即实现木糖母液向木糖醇的转化。
2.根据权利要求1所述的通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述化学诱变处理是将0.8～1.2mg/mL的亚硝基胍溶液加入到马克斯克鲁维酵母的菌悬液中，于35～40℃水浴处理20～40min。
3.根据权利要求1或2所述的通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述马克斯克鲁维酵母预先进行活化处理；所述活化处理是将马克斯克鲁维酵母接种至活化培养基中，于200～300rpm、28～32℃条件下活化培养10～15h；所述活化培养基的组成为：葡萄糖9～12g、酵母浸粉0.3～0.7g、蛋白胨0.3～0.5g，加水定容至50mL。
4.根据权利要求1所述的通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述染色处理是将2,3,5-三苯基氯化四氮唑水溶液与诱变后的菌株的菌悬液混合后进行染色处理；所述染色处理的时间为1～3d；所述2,3,5-三苯基氯化四氮唑水溶液的质量浓度为0.8％～1.2％。
5.根据权利要求1所述的通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述筛选培养基由以下质量份数的组分组成：木糖母液16％～20％、玉米浆干粉0.3％～0.8％、磷酸二氢钾0.03％～0.08％，溶剂为水。
6.根据权利要求1所述的通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述培养的条件为：200～300rpm、28～33℃条件下培养70～80h。
7.根据权利要求1所述的通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述发酵培养基由基础培养基和营养添加物组成；所述基础培养基由以下质量份数的组分组成：木糖母液23％～28％、玉米浆干粉0.3％～0.8％、尿素0.4％～0.6％、磷酸二氢钾0.02％～0.05％，溶剂为水；以在基础培养基中的终浓度计，所述营养添加物的组成为：氨基酸混合液4～6mL/L、VB2 8～12mg/L、VB3 4～6mg/L。
8.根据权利要求7所述的通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法，其特征在于，所述基础培养基由以下质量份数的组分组成：木糖母液25％、玉米浆干粉0.5％、尿素0.5％、磷酸二氢钾0.025％，溶剂为水；以在基础培养基中的终浓度计，所述营养添加物的组成为：氨基酸混合液5mL/L、VB2 10mg/L、VB3 5mg/L。
9.根据权利要求1所述的通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述发酵培养的条件为：200～300rpm转速、28～33℃温度、5.5～6.5pH条件下发酵培养70～80h。
10.根据权利要求1所述的通过生物发酵将木糖母液转化为木糖醇的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述发酵培养时，最佳菌株的接种量13％～17％V/V。
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