CN116333948B - 一种食气梭菌增菌培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种食气梭菌增菌培养基及其制备方法，属于微生物领域。本发明通过对培养基的优化，使得食气梭菌能快速复苏和增殖，提高食气梭菌的生长速率。所述培养基的组分包括碳酸氢钠、酵母浸粉、可溶性淀粉、山梨醇、果糖、α‑酮戊二酸、3‑吲哚乙酸、L‑半胱氨酸盐酸盐、氢氧化钠、硫化钠、金属溶液、维生素溶液、氨基酸溶液。制备方法为将以上组分在厌氧状态下煮沸、灭菌，混合。本配方中，可溶性淀粉能降低菌种繁殖过程中的有害物质积累，山梨醇、α‑酮戊二酸、3‑吲哚乙酸协同作用能延缓菌种的衰退，多种氨基酸能在相同培养时间内大幅提高食气梭菌的生长速率，使菌在短时间内快速复苏增殖达到较高数量，有利于食气梭菌的工业发酵活化培养和研究。

Description

一种食气梭菌增菌培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种食气梭菌增菌培养基及其制备方法。

背景技术

目前，温室效应仍是人类面临的重大课题之一，引起温室效应的气体主要有水蒸气，其次就是二氧化碳，而通过生物法实现工业含碳气体的转化利用，在减少碳排放的同时产生有价值的化学品是一条重要的研究方向。

食气梭菌是一类主要的化能自养微生物，属于革兰氏阳性的厌氧梭状芽胞杆菌。食气梭菌可利用二氧化碳和一氧化碳合成多种化学品和燃料，是一类主要的化能固碳菌，具有良好的工业应用前景。已报道的食气梭菌主要包括扬氏梭菌、自产醇梭菌、食一氧化碳梭菌等。

近年来，国内外研究者在优化和提升食气梭菌发酵性能方面做了诸多尝试，例如通过优化通入含碳气体的比例提高食气梭菌的产醇产酸效率，通过控制钼酸根离子的浓度来提高食气梭菌发酵产物的醇含量，以及通过提高发酵液的气液传质速率来提高物质转化效率，还有学者研究了锌元素对其发酵的影响。此外，得益于近几年分子遗传操作工具的发展，食气梭菌的代谢工程设计、改造以及合成生物学研究也有了一定的进展和发现。

但现阶段通过利用发酵液或培养基提高食气梭菌生长繁殖速率方面的研究还很少，目前食气梭菌发酵工艺需要前期食气梭菌的活化及活化后投入发酵罐，工序繁琐，市场上的食气梭菌培养基因缺少一些必要的组分，尤其是氨基酸溶液，在食气梭菌活化前期无法实现食气梭菌的快速增殖，且成活率较低，投入发酵使用后，由于菌数达到一定数量而存在有害物质积累、营养竞争等因素使菌体大幅度衰退，需要频繁补料来维持菌的数量，不适用于食气梭菌的大规模增菌培养，并且目前市场上的培养基对食气梭菌的科学研究贡献不大。

发明内容

基于以上背景，本发明通过优化培养基组分，提供了一种食气梭菌增菌培养基及其制备方法，可使食气梭菌在活化期的较短时间内大量增殖，快速进入对数生长期，有利于食气梭菌的生长，并适用于食气梭菌的增菌培养及发酵，更有利于食气梭菌的科学研究。

本发明所采用的技术方案为：

一种食气梭菌增菌培养基，其特征在于：每升培养基中含碳酸氢钠1-5g、酵母浸粉2-4g、可溶性淀粉0.1-2g、山梨醇1-2g、果糖2-3g、α-酮戊二酸0.5-0.8g、3-吲哚乙酸0.01-0.03g、L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.3g、氢氧化钠0.01-0.05g、硫化钠0.1-0.3g，金属溶液5-8mL、维生素溶液5-8mL、氨基酸溶液5-10mL；

氨基酸溶液组分为每升含精氨酸5g、丝氨酸2g、色氨酸3g、谷氨酸0.5g。

进一步优选的方案：金属溶液的组分为每升含亚硒酸钠5mg、钨酸钠12mg、葡萄糖酸锌0.01g、柠檬酸铋铵2g、氯化钠5g、氯化锰0.7g、硫酸钴0.15g、硫酸亚铁0.05g、硝酸锌0.3g、硫酸铝钾0.04g、硼酸0.03g。

进一步优选的方案：维生素溶液组分为每升含烟酰胺0.2mg、芦丁7mg、核黄素3mg、维生素C5mg、硫辛酸8mg。

一种食气梭菌增菌培养基的制备方法，其特征在于：

（1）将亚硒酸钠5mg、钨酸钠12mg、葡萄糖酸锌0.01g、柠檬酸铋铵2g、氯化钠5g、氯化锰0.7g、硫酸钴0.15g、硫酸亚铁0.05g、硝酸锌0.3g、硫酸铝钾0.04g、硼酸0.03g加入到盛有一升去离子水的容器一中，搅拌溶解，制成金属溶液；

（2）将烟酰胺0.2mg、芦丁7mg、核黄素3mg、维生素C5mg、硫辛酸8mg加入到盛有一升去离子水的容器二中，搅拌溶解，制成维生素溶液；

（3）将900mL去离子水放入容器三中，称取碳酸氢钠1-5g、酵母浸粉2-4g、可溶性淀粉0.1-2g、α-酮戊二酸0.5-0.8g、3-吲哚乙酸0.01-0.03g加入去离子水中，再加入容器一的金属溶液5-8mL，容器二的维生素溶液5-8mL搅拌溶解，将其煮沸、脱气、厌氧分装密封，121℃灭菌15分钟；

（4）在容器四中加入山梨醇1-2g、果糖2-3g、氢氧化钠0.01-0.05g、L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.3g、硫化钠0.1-0.3g，再加入100ml去离子水，搅拌溶解，将其煮沸、脱气、厌氧分装密封，121℃灭菌15分钟；

（5）在厌氧条件下将容器五中加入精氨酸5g、丝氨酸2g、色氨酸3g、谷氨酸0.5g、牛血清白蛋白1g，再加入1升去离子水，搅拌溶解，过滤除菌，分装密封，制成氨基酸溶液；

（6）临用前，取容器五的氨基酸溶液5-10mL与步骤（3）-（4）所制备的液体在厌氧条件下混合均匀，即得。

本发明有益效果：

（1）本发明所述的一种食气梭菌增菌培养基，不仅能用于活化食气梭菌，提高活化效率和成活率，使食气梭菌快速进入对数生长期，为后续投入发酵及科学研究做基础，而且可以用于食气梭菌大规模发酵培养；

（2）传统发酵培养基需要添加麦麸等未经提纯的原料，虽然经济但是加大了对后期菌种或发酵产物的提纯难度，本发明可用于要求较高的发酵提纯，且不需要经过菌种活化步骤，可直接投入菌种使用，节约了发酵时间；

（3）本发明所述的食气梭菌增菌培养基，优化了培养基的营养成分，特别添加了多种氨基酸，能为冻存状态及其他生命活动微弱的食气梭菌提供大量营养，同时降低活化过程中有害物质的积累，使食气梭菌快速生长分裂达到对数生长期，在短时间内获得较高数量的菌，提高了发酵前期菌种的效率，有利于菌种活化及食气梭菌发酵的推广应用；

（4）本发明添加了可溶性淀粉、山梨醇、α-酮戊二酸、3-吲哚乙酸等成分，其中可溶性淀粉降低了微生物发酵过程中有害物质的积累，其他组分通过协同作用，能调控微生物的生命活动，使菌种保持在活跃状态，延缓微生物的自然衰退，一定程度上维持了活菌数量的稳定，减少了补料频率；

（5）本发明培养基的制备方法，在100%氮气的厌氧条件下，加入还原剂避免了培养基的氧化而不利于食气梭菌的生长，加上煮沸脱气等工序，严格控制了培养基的配制环境，保证了培养基无氧特性，保证了食气梭菌的生长。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中食气梭菌随时间的生长曲线图。

图2为实施例1中食气梭菌培养2天的生长效果图。

图3为实施例1-4及对照组食气梭菌的比浊度对比图。

图4为实施例2中食气梭菌培养2天的生长效果图。

图5为实施例3中食气梭菌培养2天的生长效果图。

图6为实施例4中食气梭菌培养2天的生长效果图。

图7为对照组中食气梭菌培养2天的生长效果图。

实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施病例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

以下实施例中菌种来源为ATCC 55383，试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

一种食气梭菌增菌培养基及其制备方法如下：

培养基配方如下：

每升培养基中含碳酸氢钠1-5g、酵母浸粉2-4g、可溶性淀粉0.1-2g、山梨醇1-2g、果糖2-3g、α-酮戊二酸0.5-0.8g、3-吲哚乙酸0.01-0.03g、L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.3g、氢氧化钠0.01-0.05g、硫化钠0.1-0.3g、金属溶液5-8mL、维生素溶液5-8mL、氨基酸溶液5-10mL。

其中：

维生素溶液组分为每升含烟酰胺0.2mg、芦丁7mg、核黄素3mg、维生素C5mg、硫辛酸8mg；

该配比的维生素溶液通过多种维生素的共同作用，参与了食气梭菌中多种辅基和辅酶的形成，维持和调节微生物细胞的正常代谢，在本发明培养基中，维生素溶液调控了食气梭菌的细胞代谢和参与细胞中的各种生化反应，使食气梭菌的生命活动正常进行。

氨基酸溶液组分为每升含精氨酸5g、丝氨酸2g、色氨酸3g、谷氨酸0.5g。

氨基酸是微生物细胞生长过程中蛋白质的重要组成部分，而蛋白质决定了微生物各个结构的功能。本配方经多次实验筛选出四种氨基酸，并通过适当配比，使食气梭菌在活化期能迅速利用氨基酸合成自身生命需要的重要蛋白质，使食气梭菌能够快速增殖进入对数生长期。

金属溶液的组分为每升含亚硒酸钠5mg、钨酸钠12mg、葡萄糖酸锌0.01g、柠檬酸铋铵2g、氯化钠5g、氯化锰0.7g、硫酸钴0.15g、硫酸亚铁0.05g、硝酸锌0.3g、硫酸铝钾0.04g、硼酸0.03g。

食气梭菌的酶活性需要多种金属离子参与调控，酶的活性也会影响其产醇产酸速率，此配比的金属溶液能维持食气梭菌的产醇产酸，在一定条件下有利于食气梭菌的生长繁殖。

本配方经优化，不仅能满足食气梭菌生长所需的各种微量元素，又从20种氨基酸中经组合，筛选出4种有利于食气梭菌生长的氨基酸，营养更全面，能够提高食气梭菌的生长分裂速率，使其快速进入对数生长期。

培养基的制备：

（1）将亚硒酸钠5mg、钨酸钠12mg、葡萄糖酸锌0.01g、柠檬酸铋铵2g、氯化钠5g、氯化锰0.7g、硫酸钴0.15g、硫酸亚铁0.05g、硝酸锌0.3g、硫酸铝钾0.04g、硼酸0.03g加入到盛有一升去离子水的容器一中，搅拌溶解，制成金属溶液；

（2）将烟酰胺0.2mg、芦丁7mg、核黄素3mg、维生素C5mg、硫辛酸8mg加入到盛有一升去离子水的容器二中，搅拌溶解，制成维生素溶液；

（3）将900mL去离子水放入容器三中，称取碳酸氢钠1-5g、酵母浸粉2-4g、可溶性淀粉0.1-2g、α-酮戊二酸0.5-0.8g、3-吲哚乙酸0.01-0.03g加入去离子水中，再加入容器一的金属溶液5-8mL，容器二的维生素溶液5-8mL搅拌溶解，将其煮沸、脱气、厌氧分装密封，121℃灭菌15分钟；

（4）在容器四中加入山梨醇1-2g、果糖2-3g、氢氧化钠0.01-0.05g、L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.3g、硫化钠0.1-0.3g，再加入100ml去离子水，搅拌溶解，将其煮沸、脱气、厌氧分装密封，121℃灭菌15分钟；

（5）在厌氧条件下将容器五中加入精氨酸5g、丝氨酸2g、色氨酸3g、谷氨酸0.5g，再加入1升去离子水，搅拌溶解，过滤除菌，分装密封，制成氨基酸溶液；

（6）临用前，取容器五的氨基酸溶液5-10mL与步骤（3）-（4）所制备的液体在厌氧条件下混合均匀，即得。

本方法利用煮沸脱气、充氮来严格控制配制培养基的厌氧条件，并将还原剂、氨基酸与基础组分分开配制，临用时混合，既保证了食气梭菌生长时的厌氧环境，又避免了氨基酸提前与基础组分产生络合沉淀。

培养及观察：

将食气梭菌提前在-20℃冻存30天，取出备用。将厌氧培养箱中充满80%二氧化碳和20%的氮气，在此厌氧条件下将稀释后等量的食气梭菌接分两组种至所述食气梭菌增菌培养基中，放入37℃培养箱中培养，一组培养2天后取出，另一组继续培养至5天，将取出的菌液经离心过滤分离出菌体，经稀释后进行浊度检测，同时与未经优化的食气梭菌培养基进行对照。

实施例1

1、本实施例提供一种食气梭菌增菌培养基，培养基配方如下：

每升培养基中含碳酸氢钠3g、酵母浸粉4g、可溶性淀粉0.5g、山梨醇1g、果糖3g、α-酮戊二酸0.8g、3-吲哚乙酸0.01g、L-半胱氨酸盐酸盐0.2g、氢氧化钠0.03g、硫化钠0.1g、金属溶液5mL、维生素溶液8mL、氨基酸溶液10mL。

采用如下方法制得：

（1）将亚硒酸钠5mg、钨酸钠12mg、葡萄糖酸锌0.01g、柠檬酸铋铵2g、氯化钠5g、氯化锰0.7g、硫酸钴0.15g、硫酸亚铁0.05g、硝酸锌0.3g、硫酸铝钾0.04g、硼酸0.03g加入到盛有一升去离子水的容器一中，搅拌溶解，制成金属溶液；

（2）将烟酰胺0.2mg、芦丁7mg、核黄素3mg、维生素C5mg、硫辛酸8mg加入到盛有一升去离子水的容器二中，搅拌溶解，制成维生素溶液；

（3）将900mL去离子水放入容器三中，称取碳酸氢钠3g、酵母浸粉4g、可溶性淀粉0.5g、α-酮戊二酸0.8g、3-吲哚乙酸0.01g加入去离子水中，再加入容器一的金属溶液5mL，容器二的维生素溶液8mL搅拌溶解，将其煮沸、脱气、厌氧分装密封，121℃灭菌15分钟；

（4）在容器四中加入山梨醇1g、果糖3g、氢氧化钠0.03g、L-半胱氨酸盐酸盐0.2g、硫化钠0.1g，再加入100ml去离子水，搅拌溶解，将其煮沸、脱气、厌氧分装密封，121℃灭菌15分钟；

（5）在厌氧条件下将容器五中加入精氨酸5g、丝氨酸2g、色氨酸3g、谷氨酸0.5g，再加入1升去离子水，搅拌溶解，过滤除菌，分装密封，制成氨基酸溶液；

（6）临用前，取容器五的氨基酸溶液10mL与步骤（3）-（4）所制备的液体在厌氧条件下混合均匀，即得。

2、培养：

将厌氧培养箱中充满80%二氧化碳和20%的氮气，在此厌氧条件下将食气梭菌接种至所述食气梭菌增菌培养基中，一组放入37℃培养箱中培养2天，另一组培养5天。

实施例1中食气梭菌随时间的生长曲线图如图1所示。

实施例1制备的培养基培养食气梭菌2天的结果如图2所示。

3、设置对照

以未经优化的食气梭菌培养基为对照，在厌氧条件下取食气梭菌菌液接种至培养基，一组37℃培养2天，另一组培养5天。以上对照组未注明之处与本发明实施例1均相同。

对照组食气梭菌培养2天的结果如图7所示。

将培养2天及培养5天后的食气梭菌菌液进行低温离心，弃去上清液，加入10ml0.9%无菌生理盐水，在涡旋混匀器上混匀后再进行一次低温离心，弃去上清液，加入10ml0.9%无菌生理盐水，混匀后放入浊度计检测比浊度，比浊度越高，含菌量越高。图3为实施例1-4及对照组食气梭菌的比浊度对比图。本实施例与对照组相比，接种等量菌数于等量培养基，培养2天后，本实施例培养基的食气梭菌能快速增殖，有利于食气梭菌的增菌培养，培养5天后，菌数平稳，稍有下降，而在对照组中，食气梭菌增殖缓慢，且经过一定时间后，培养基中的营养物质不能满足食气梭菌的生长需求，不利于食气梭菌的增菌培养。

通过图3结果对比可知，本实施例1为本发明的最佳实施例。

实施例2

1、本实施例提供一种食气梭菌增菌培养基，培养基配方如下：

每升培养基中含碳酸氢钠1g、酵母浸粉2g、可溶性淀粉0.7g、山梨醇1.5g、果糖2.5g、α-酮戊二酸0.8g、3-吲哚乙酸0.01g、L-半胱氨酸盐酸盐0.3g、氢氧化钠0.02g、硫化钠0.1g、金属溶液6mL、维生素溶液6mL、氨基酸溶液5mL。

采用如下方法制得：

（1）将亚硒酸钠5mg、钨酸钠12mg、葡萄糖酸锌0.01g、柠檬酸铋铵2g、氯化钠5g、氯化锰0.7g、硫酸钴0.15g、硫酸亚铁0.05g、硝酸锌0.3g、硫酸铝钾0.04g、硼酸0.03g加入到盛有一升去离子水的容器一中，搅拌溶解，制成金属溶液；

（2）将烟酰胺0.2mg、芦丁7mg、核黄素3mg、维生素C5mg、硫辛酸8mg加入到盛有一升去离子水的容器二中，搅拌溶解，制成维生素溶液；

（3）将900mL去离子水放入容器三中，称取碳酸氢钠1g、酵母浸粉2g、可溶性淀粉0.7g、α-酮戊二酸0.8g、3-吲哚乙酸0.01g加入去离子水中，再加入容器一的金属溶液6mL，容器二的维生素溶液6mL搅拌溶解，将其煮沸、脱气、厌氧分装密封，121℃灭菌15分钟；

（4）在容器四中加入山梨醇1.5g、果糖2.5g、氢氧化钠0.02g、L-半胱氨酸盐酸盐0.3g、硫化钠0.1g，再加入100ml去离子水，搅拌溶解，将其煮沸、脱气、厌氧分装密封，121℃灭菌15分钟；

（5）在厌氧条件下将容器五中加入精氨酸5g、丝氨酸2g、色氨酸3g、谷氨酸0.5g，再加入1升去离子水，搅拌溶解，过滤除菌，分装密封，制成氨基酸溶液；

（6）临用前，取容器五的氨基酸溶液5mL与步骤（3）-（4）所制备的液体在厌氧条件下混合均匀，即得。

2、培养：

将厌氧培养箱中充满80%二氧化碳和20%的氮气，在此厌氧条件下将食气梭菌接种至所述食气梭菌增菌培养基中，一组放入37℃培养箱中培养2天，另一组培养5天。

实施例2制备的培养基培养食气梭菌2天的结果如图4所示。

3、设置对照

以未经优化的食气梭菌培养基为对照，在厌氧条件下取食气梭菌菌液接种至培养基，一组37℃培养2天，另一组培养5天。以上对照组未注明之处与本发明实施例1均相同。

对照组食气梭菌培养2天的结果如图7所示。

将培养2天及培养5天后的食气梭菌菌液进行低温离心，弃去上清液，加入10ml0.9%无菌生理盐水，在涡旋混匀器上混匀后再进行一次低温离心，弃去上清液，加入10ml0.9%无菌生理盐水，混匀后放入浊度计检测比浊度。本实施例与对照组相比，接种等量菌数于等量培养基，培养2天后，本实施例培养基的食气梭菌能快速增殖，有利于食气梭菌的增菌培养，但菌数明显少于实施例1，培养5天后，菌数平稳，稍有下降。而在对照组中，食气梭菌增殖缓慢，培养后期培养基中的营养物质不能满足食气梭菌的生长需求，不利于食气梭菌的增菌培养。

实施例3

1、本实施例提供一种食气梭菌增菌培养基，培养基配方如下：

每升培养基中含碳酸氢钠2g、酵母浸粉3g、可溶性淀粉1g、山梨醇1g、果糖2.5g、α-酮戊二酸0.6g、3-吲哚乙酸0.01g、L-半胱氨酸盐酸盐0.2g、氢氧化钠0.04g、硫化钠0.2g、金属溶液5mL、维生素溶液7mL、氨基酸溶液7mL。

采用如下方法制得：

（1）将亚硒酸钠5mg、钨酸钠12mg、葡萄糖酸锌0.01g、柠檬酸铋铵2g、氯化钠5g、氯化锰0.7g、硫酸钴0.15g、硫酸亚铁0.05g、硝酸锌0.3g、硫酸铝钾0.04g、硼酸0.03g加入到盛有一升去离子水的容器一中，搅拌溶解，制成金属溶液；

（2）将烟酰胺0.2mg、芦丁7mg、核黄素3mg、维生素C5mg、硫辛酸8mg加入到盛有一升去离子水的容器二中，搅拌溶解，制成维生素溶液；

（3）将900mL去离子水放入容器三中，称取碳酸氢钠2g、酵母浸粉3g、可溶性淀粉1g、α-酮戊二酸0.6g、3-吲哚乙酸0.01g加入去离子水中，再加入容器一的金属溶液5mL，容器二的维生素溶液7mL搅拌溶解，将其煮沸、脱气、厌氧分装密封，121℃灭菌15分钟；

（4）在容器四中加入山梨醇1g、果糖2.5g、氢氧化钠0.04g、L-半胱氨酸盐酸盐0.2g、硫化钠0.2g，再加入100ml去离子水，搅拌溶解，将其煮沸、脱气、厌氧分装密封，121℃灭菌15分钟；

（5）在厌氧条件下将容器五中加入精氨酸5g、丝氨酸2g、色氨酸3g、谷氨酸0.5g，再加入1升去离子水，搅拌溶解，过滤除菌，分装密封，制成氨基酸溶液；

（6）临用前，取容器五的氨基酸溶液7mL与步骤（3）-（4）所制备的液体在厌氧条件下混合均匀，即得。

2、培养：

将厌氧培养箱中充满80%二氧化碳和20%的氮气，在此厌氧条件下将食气梭菌接种至所述食气梭菌增菌培养基中，一组放入37℃培养箱中培养2天，另一组培养5天。

实施例3制备的培养基培养食气梭菌2天的结果如图5所示。

3、设置对照

以未经优化的食气梭菌培养基为对照，在厌氧条件下取食气梭菌菌液接种至培养基，一组37℃培养2天，另一组培养5天。以上对照组未注明之处与本发明实施例1均相同。

对照组食气梭菌培养2天的结果如图7所示。

将培养2天及培养5天后的食气梭菌菌液进行低温离心，弃去上清液，加入10ml0.9%无菌生理盐水，在涡旋混匀器上混匀后再进行一次低温离心，弃去上清液，加入10ml0.9%无菌生理盐水，混匀后放入浊度计检测比浊度。本实施例与对照组相比，接种等量菌数于等量培养基，培养2天后，本实施例培养基的食气梭菌能快速增殖，有利于食气梭菌的增菌培养，但菌数明显少于实施例1，多于实施例2，培养5天后，菌数平稳，稍有下降。而在对照组中，食气梭菌增殖缓慢，培养后期培养基中的营养物质不能满足食气梭菌的生长需求，不利于食气梭菌的增菌培养。

实施例4

1、本实施例提供一种食气梭菌增菌培养基，培养基配方如下：

每升培养基中含碳酸氢钠2.5g、酵母浸粉3.5g、可溶性淀粉0.5g、山梨醇2g、果糖3g、α-酮戊二酸0.6g、3-吲哚乙酸0.02g、L-半胱氨酸盐酸盐0.25g、氢氧化钠0.05g、硫化钠0.25g、金属溶液6mL、维生素溶液6mL、氨基酸溶液9mL。

采用如下方法制得：

（1）将亚硒酸钠5mg、钨酸钠12mg、葡萄糖酸锌0.01g、柠檬酸铋铵2g、氯化钠5g、氯化锰0.7g、硫酸钴0.15g、硫酸亚铁0.05g、硝酸锌0.3g、硫酸铝钾0.04g、硼酸0.03g加入到盛有一升去离子水的容器一中，搅拌溶解，制成金属溶液；

（2）将烟酰胺0.2mg、芦丁7mg、核黄素3mg、维生素C5mg、硫辛酸8mg加入到盛有一升去离子水的容器二中，搅拌溶解，制成维生素溶液；

（3）将900mL去离子水放入容器三中，称取碳酸氢钠2.5g、酵母浸粉3.5g、可溶性淀粉0.5g、α-酮戊二酸0.6g、3-吲哚乙酸0.02g加入去离子水中，再加入容器一的金属溶液6mL，容器二的维生素溶液6mL搅拌溶解，将其煮沸、脱气、厌氧分装密封，121℃灭菌15分钟；

（4）在容器四中加入山梨醇2g、果糖3g、氢氧化钠0.05g、L-半胱氨酸盐酸盐0.25g、硫化钠0.25g，再加入100ml去离子水，搅拌溶解，将其煮沸、脱气、厌氧分装密封，121℃灭菌15分钟；

（5）在厌氧条件下将容器五中加入精氨酸5g、丝氨酸2g、色氨酸3g、谷氨酸0.5g，再加入1升去离子水，搅拌溶解，过滤除菌，分装密封，制成氨基酸溶液；

（6）临用前，取容器五的氨基酸溶液9mL与步骤（3）-（4）所制备的液体在厌氧条件下混合均匀，即得。

2、培养：

将厌氧培养箱中充满80%二氧化碳和20%的氮气，在此厌氧条件下将食气梭菌接种至所述食气梭菌增菌培养基中，一组放入37℃培养箱中培养2天，另一组培养5天。

实施例4制备的培养基培养食气梭菌2天的结果如图6所示。

3、设置对照

以未经优化的食气梭菌培养基为对照，在厌氧条件下取食气梭菌菌液接种至培养基，一组37℃培养2天，另一组培养5天。以上对照组未注明之处与本发明实施例1均相同。

对照组食气梭菌培养2天的结果如图7所示。

将培养2天及培养5天后的食气梭菌菌液进行低温离心，弃去上清液，加入10ml0.9%无菌生理盐水，在涡旋混匀器上混匀后再进行一次低温离心，弃去上清液，加入10ml0.9%无菌生理盐水，混匀后放入浊度计检测比浊度。本实施例与对照组相比，接种等量菌数于等量培养基，培养2天后，本实施例培养基的食气梭菌能快速增殖，有利于食气梭菌的增菌培养，但菌数少于实施例1，多于实施例2和3，培养5天后，菌数平稳，稍有下降。而在对照组中，食气梭菌增殖缓慢，培养后期培养基中的营养物质不能满足食气梭菌的生长需求，不利于食气梭菌的增菌培养。

综上所述，实施例1-4采用本发明的食气梭菌增菌培养基，能够实现食气梭菌在较短时间内的快速增殖且在一定时间内，随着培养天数的增加，菌数达到最高值后衰退缓慢；与实施例2-4相比，按实施例1的制备方法制备的食气梭菌增菌培养基的增菌效果最好，培养周期为2天。食气梭菌的快速增菌培养，能够填补现有食气梭菌培养基的不足，对于冻存的菌种，无需再进行活化，可直接投入生产，提高了生产效率，且可用于产物提纯要求较高的发酵生产，有利于未来食气梭菌的各类科学研究。

显而易见的，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

Claims (2)

1.一种食气梭菌增菌培养基，其特征在于：每升培养基中含碳酸氢钠1-5g、酵母浸粉2-4g、可溶性淀粉0.1-2g、山梨醇1-2g、果糖2-3g、α-酮戊二酸0.5-0.8g、3-吲哚乙酸0.01-0.03g、L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.3g、氢氧化钠0.01-0.05g、硫化钠0.1-0.3g，金属溶液5-8mL、维生素溶液5-8mL、氨基酸溶液5-10mL；

氨基酸溶液组分为每升含精氨酸5g、丝氨酸2g、色氨酸3g、谷氨酸0.5g；

所述金属溶液的组分为每升含亚硒酸钠5mg、钨酸钠12mg、葡萄糖酸锌0.01g、柠檬酸铋铵2g、氯化钠5g、氯化锰0.7g、硫酸钴0.15g、硫酸亚铁0.05g、硝酸锌0.3g、硫酸铝钾0.04g、硼酸0.03g；

所述维生素溶液组分为每升含烟酰胺0.2mg、芦丁7mg、核黄素3mg、维生素C5mg、硫辛酸8mg。

2.一种如权利要求1所述的食气梭菌增菌培养基的制备方法，其特征在于：

（1）将亚硒酸钠5mg、钨酸钠12mg、葡萄糖酸锌0.01g、柠檬酸铋铵2g、氯化钠5g、氯化锰0.7g、硫酸钴0.15g、硫酸亚铁0.05g、硝酸锌0.3g、硫酸铝钾0.04g、硼酸0.03g加入到盛有一升去离子水的容器一中，搅拌溶解，制成金属溶液；

（2）将烟酰胺0.2mg、芦丁7mg、核黄素3mg、维生素C5mg、硫辛酸8mg加入到盛有一升去离子水的容器二中，搅拌溶解，制成维生素溶液；

（3）将900mL去离子水放入容器三中，称取碳酸氢钠1-5g、酵母浸粉2-4g、可溶性淀粉0.1-2g、α-酮戊二酸0.5-0.8g、3-吲哚乙酸0.01-0.03g加入去离子水中，再加入容器一的金属溶液5-8mL，容器二的维生素溶液5-8mL搅拌溶解，将其煮沸、脱气、厌氧分装密封，121℃灭菌15分钟；

（4）在容器四中加入山梨醇1-2g、果糖2-3g、氢氧化钠0.01-0.05g、L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.3g、硫化钠0.1-0.3g，再加入100ml去离子水，搅拌溶解，将其煮沸、脱气、厌氧分装密封，121℃灭菌15分钟；

（5）在厌氧条件下将容器五中加入精氨酸5g、丝氨酸2g、色氨酸3g、谷氨酸0.5g，再加入1升去离子水，搅拌溶解，过滤除菌，分装密封，制成氨基酸溶液；

（6）临用前，取容器五的氨基酸溶液5-10mL与步骤（3）-（4）所制备的液体在厌氧条件下混合均匀，即得。