CN113817635A - 一种利用大豆乳清废水培养芽孢杆菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业生物技术领域，涉及一种大豆乳清废水在发酵生产芽孢杆菌中的应用，及利用大豆乳清废水发酵生产枯草芽孢杆菌的方法，解决了大豆乳清废水问题，实现了污水零排放，同时能够提供一种成本低廉、高活菌数的枯草芽孢杆菌发酵液。本发明首次提出直接利用大豆乳清废水发酵生产芽孢杆菌，生产工艺简单，大豆乳清废水不需要离心、浓缩等处理，既降低生产成本，又解决了大豆乳清废水问题，实现了污水零排放，回收利用水资源。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种利用大豆乳清废水发酵生产芽孢杆菌的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧、革兰氏阳性、产芽孢的细菌，对植物、人畜无致病性，应用范围广阔、安全性好，抑菌及抗逆性能优越。目前芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等菌种被广泛应用在农业植保、畜牧饲养业、环保三废处理、动植物病害防治、食品以及生物医药等领域。目前工业上主要以水作为溶剂，通过添加一定量的碳源、氮源和无机盐发酵生产芽孢杆菌。
据报道，大豆分离蛋白和豆制品加工过程中会产生大量的大豆乳清废水，其主要成分是小分子水溶性蛋白质、蔗糖、无机盐，另外还含有少量的大豆低聚糖、淀粉酶、细胞色素、异黄酮类化合物、大豆皂甙、植酸等对人体有特殊保健功能的高附加值物质。如果仅仅作为废水处理掉，其中含有的高浓度有机物质会造成极大的资源浪费和环境污染，如何对其进行有效利用，节约资源，提高收益，是现在需要解决的问题。
现有技术中，涉及大豆乳清废水处理的专利情况如下：“一种具有保肝和抗氧化作用的大豆乳清多肽的制备方法”(CN201210241261.3)，“一种从大豆乳清废水中制备高纯度大豆低聚糖的方法”(CN201210192793.2)，但这些专利涉及大豆乳清废水中某一种成分的利用和开发，对于大量的污染废水处理无益。专利“一种用豆清水发酵生产酵母细胞的方法”(CN201310227567.8)，涉及用大豆乳清废水发酵培养酵母菌，获得单细胞蛋白，且污水COD明显降低，COD去除率达到40％，大大解决了资源浪费和环境污染问题；专利“大豆乳清废水在制备高活性乳酸菌菌剂中的应用”(CN201710799714.7)，涉及用大豆乳清废水可以用于制备活性乳酸菌，得到高活性乳酸菌，工艺中间过程所得废水COD在1000mg/L以下，处理成本大为降低；但是现有技术和专利多侧重于污水处理方式的改进及新技术的应用，处理工艺比较复杂，成本大、收益小，很难进入工业化利用。因此，如何高效的处理大豆乳清废水有待进一步解决和完善。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种大豆乳清废水在发酵生产芽孢杆菌中的应用，及利用大豆乳清废水发酵生产枯草芽孢杆菌的方法，解决了大豆乳清废水问题，实现了污水零排放，同时能够提供一种成本低廉、高活菌数的枯草芽孢杆菌发酵液。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种利用大豆乳清废水培养芽孢杆菌的方法，包括：
以大豆乳清废水为原料制备培养基；
向所述培养基接种芽孢杆菌，发酵培养，即得。
本发明首次提出直接利用大豆乳清废水发酵生产芽孢杆菌，生产工艺简单，大豆乳清废水不需要离心、浓缩等处理，既降低生产成本，又解决了大豆乳清废水问题，实现了污水零排放，回收利用水资源。
研究表明：虽然现有技术已有利用大豆乳清废水进行菌种培养的技术，但受限于废水来源复杂、培养基营养成分组成和菌种的发酵条件等因素，发酵水平较低。为此，本发明以特定来源的大豆乳清废水为主要原料，通过复配、工艺优化，菌株筛选，发现：直接利用大豆乳清废水发酵生产芽孢杆菌，发酵水平高，工业化前景好。
本发明的第二个方面，提供了任一上述的方法培养的芽孢杆菌。
本发明整体发酵时间在24-48小时左右，发酵周期短，发酵速度快，节省大量人力物力，同时对操作水平要求较低，枯草芽孢杆菌菌量较大，芽孢形成较好，具有工业化开发价值。
本发明的第三个方面，提供了大豆乳清废水在发酵生产芽孢杆菌中的应用。
本发明所提供的发酵技术，最终发酵水平在100亿/ml以上，达到芽孢杆菌的产业化生产水平。
本发明所提供的发酵技术，最终发酵产生聚谷氨酸的量为20g/L。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明首次提出直接利用大豆乳清废水发酵生产芽孢杆菌，生产工艺简单，大豆乳清废水不需要离心、浓缩等处理，既降低生产成本，又解决了大豆乳清废水问题，实现了污水零排放，回收利用水资源。
(2)本发明所提供的发酵技术，最终发酵水平在100亿/ml以上，达到芽孢杆菌的产业化生产水平。
(3)本发明所提供的发酵技术，最终发酵产生聚谷氨酸的量为20g/L。
(4)本发明整体发酵时间在24-48小时左右，发酵周期短，发酵速度快，节省大量人力物力，同时对操作水平要求较低，枯草芽孢杆菌菌量较大，芽孢形成较好，具有工业化开发价值。
(5)本发明的生产方法简单、操作方便、实用性强，易于推广。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的目的在于提供一种大豆乳清废水在发酵生产芽孢杆菌中的应用。
本发明中的大豆乳清废水，尤其是指是由脱脂大豆经过碱提、酸沉工序，离心去除蛋白之后留下的液体。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明提供了一种大豆乳清废水在发酵生产芽孢杆菌中的应用。
本申请中对于芽孢杆菌的具体种类并不作特殊的限定，在一些实施例中，所述芽孢杆菌包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，以获得较好的开发价值。
本申请中对于芽孢杆菌的具体培养方法也不作特殊的限定，在一些实施例中，所述大豆乳清废水在发酵生产芽孢杆菌中的应用，包括以下步骤：1)大豆乳清废水培养基的制备：在大豆乳清废水加入碳源0-10％，氮源0-10％，pH缓冲盐0-10％，其他营养成分0-10％，pH范围4.0-9.0，置于105℃，灭菌20分钟；2)种子液制备：取斜面保存的芽孢杆菌接入装有液体培养基的锥形瓶中扩大培养，于37℃下恒温培养8-16小时，转速200rpm；3)上罐发酵：种子液OD值大于30时转接入灭菌后的发酵罐中进行液体发酵，接种量10％，装液量70％，于37℃下恒温培养24-36小时，转速最高300rpm，通风比为1.0vvm，pH控制在6.5以上；发酵罐培养过程中，pH先下降后回升，12小时内pH控制在6.0-7.5，12小时后pH自然回升，培养至OD值不再增加，芽孢率≥90％，停止发酵。实验结果表明：直接利用大豆乳清废水发酵生产芽孢杆菌，不仅生产工艺简单，所得芽孢杆菌发酵液菌体密度数量级可达1010cfu/ml，达到了芽孢杆菌的产业化生产水平，市场前景较好。
上述大豆乳清废水为大豆分离蛋白制备过程中的副产物，为蛋白质沉淀后剩余的有机废水。
本发明采用大豆乳清废水与碳源、氮源、必要的盐及营养物质构成培养基以支持芽孢杆菌的生长，为了达到较好的培养效果，本发明进行了广泛筛选试验，以获得商业化价值较高的培养基配方。因此，在一些实施例中，所述培养基的配方包括：Na2HPO4或K2HPO4，CaCO3，与可溶性淀粉、玉米浆粉、玉米粉、酵母浸粉、糖蜜、酵母粉、尿素中的至少一种，和/或葡萄糖、味精中的至少一种。研究结果表明：上述原料的组合不仅原料易得、而且能够很好地支持各类芽孢杆菌的生长，在实际应用过程中，技术人员可以根据菌种的特点和生产条件在上述原料中选择相应的组分进行培养，以获得较优的枯草芽孢杆菌的工业化生产条件。
进一步地，针对常用的几种芽孢杆菌，本申请还进一步给出了优选的方案，例如：在一些实施例中，对于枯草芽孢杆菌，推荐采用液体培养基的制备方法为：在大豆乳清废水加入玉米浆粉或玉米粉4％、K2HPO43％、CaCO34％，将pH值调至7.5，置于105℃或110℃，灭菌20分钟，即得，各百分比为各原料相当于大豆乳清废水的体积的百分比，以更好地支持枯草芽孢杆菌的生长。
而在另一些实施例中，针对解淀粉芽孢杆菌的培养，可以选择的液体培养基的制备方法为：在大豆乳清废水加入玉米粉3％、Na2HPO4 2％、CaCO3 1％、尿素2％，将pH值调至7.2，置于110℃，灭菌20分钟，即得。更优选的，可以采用糖蜜替代玉米粉，作为解淀粉芽孢杆菌的培养基。
同时，在一些实施例中，针对生产地衣芽孢杆菌，培养基的制备方法可以为：在大豆乳清废水加入酵母浸粉1.5％、尿素2.5％、K2HPO4 3.5％、CaCO3 2％、葡萄糖4％，将pH值调至7.5，置于110℃，灭菌20分钟，即得，以利用酵母浸粉富含蛋白质、氨基酸、多肽、核苷酸、B族维生素、生长因子的特点，促进地衣芽孢杆菌的生长。
在其他的一些实施例中，本发明为了更好地利用大豆乳清废水发酵生产纳豆芽孢杆菌，并联产聚谷氨酸，选择玉米粉3％、酵母浸粉1.5％、尿素2.5％、K2HPO4 1.5％、CaCO31.5％、葡萄糖4％，味精5％作为培养基的成分，同时，将pH值调至7.2，置于110℃，灭菌20分钟，以获得合格的培养基，实验结果表明：纳豆芽孢杆菌发酵液活菌数和聚谷氨酸的产量都达到了较高的水平。
在一些实施例中，上罐发酵时，转接入灭菌后的发酵罐中进行液体发酵，接种量5％，装液量35％，于37℃下恒温培养48小时。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
以下实施例中，大豆乳清废水为某工厂脱脂大豆经过碱提、酸沉工序，离心去除蛋白之后留下的液体。
具体方法为：将脱脂大豆与蒸馏水以1：10的比例混合，用NaOH调节混合物的pH值为7～9，充分搅拌浸提碱溶大豆蛋白，离心分离，用稀HCl调整上清液的pH值为4.3～4.8，沉淀出蛋白质，离心分离，得到大豆乳清废水和沉淀，沉淀重新溶于pH值为7.0～8.0的NaOH溶液中，喷雾或冷冻干燥得到大豆分离蛋白。
以下实施例中，利用系列稀释法对枯草芽孢杆菌发酵液活菌数进行菌落计数；聚谷氨酸的产量采用茚三酮比色法测定。
实施例1
大豆乳清废水在发酵生产枯草芽孢杆菌的应用，包括以下步骤：
1)培养基的制备：在大豆乳清废水加入玉米浆粉4％、K2HPO43％、CaCO34％，将pH值调至7.5，置于105℃，灭菌20分钟；各百分比为各原料相当于大豆乳清废水的体积的百分比。
2)种子液制备：取斜面保存的枯草芽孢杆菌接入装有液体培养基的锥形瓶中扩大培养，接种1环菌苔，于37℃下恒温培养12小时，转速200rpm；
3)上罐发酵：转接入灭菌后的发酵罐中进行液体发酵，接种量5％，装液量65％，于37℃下恒温培养32小时，转速最高300rpm，通风比为1.0vvm，pH控制在6.5以上；培养至OD600不再增加，芽孢率≥90％，停止发酵，所得枯草芽孢杆菌发酵液活菌数为1.8×1010cfu/ml。
实施例2
大豆乳清废水在发酵生产解淀粉芽孢杆菌的应用，包括以下步骤：
1)培养基的制备：在大豆乳清废水加入糖蜜3％、Na2HPO44％、CaCO33％，将pH值调至7.2，置于105℃，灭菌20分钟；各百分比为各原料相当于大豆乳清废水的体积的百分比。
2)种子液制备：取斜面保存的枯草芽孢杆菌接入装有液体培养基的锥形瓶中扩大培养，接种1环菌苔，于37℃下恒温培养8小时，转速200rpm；
3)上罐发酵：转接入灭菌后的发酵罐中进行液体发酵，接种量5％，装液量65％，于37℃下恒温培养24小时，转速最高300rpm，通风比为1.0vvm，pH控制在6.5以上；培养至OD值不再增加，芽孢率≥90％，停止发酵，所得解淀粉芽孢杆菌发酵液活菌数为1.4×1010cfu/ml。
实施例3
大豆乳清废水在发酵生产地衣芽孢杆菌的应用，包括以下步骤：
1)培养基的制备：在大豆乳清废水加入酵母粉1.5％、尿素2.5％、K2HPO43.5％、CaCO36％，将pH值调至7.8，置于105℃，灭菌20分钟；各百分比为各原料相当于大豆乳清废水的体积的百分比。
2)种子液制备：取斜面保存的枯草芽孢杆菌接入装有液体培养基的锥形瓶中扩大培养，接种1环菌苔，于37℃下恒温培养8-16小时，转速200rpm；
3)上罐发酵：转接入灭菌后的发酵罐中进行液体发酵，接种量5％，装液量65％，于37℃下恒温培养36小时，转速最高300rpm，通风比为1.0vvm，pH控制在6.5以上；培养至OD值不再增加，芽孢率≥90％，停止发酵，所得地衣芽孢杆菌发酵液活菌数为1.6×1010cfu/ml。
实施例4
大豆乳清废水在发酵生产纳豆芽孢杆菌的应用，包括以下步骤：
1)培养基的制备：在大豆乳清废水加入玉米粉3％、酵母浸粉1.5％、尿素2.5％、K2HPO4 1.5％、CaCO3 1.5％、葡萄糖4％，味精5％，将pH值调至7.2，置于110℃，灭菌20分钟；各百分比为各原料相当于大豆乳清废水的体积的百分比。
2)种子液制备：取斜面保存的纳豆芽孢杆菌接入装有液体培养基的锥形瓶中扩大培养，接种1环菌苔，于37℃下恒温培养8-16小时，转速200rpm；
3)上罐发酵：转接入灭菌后的发酵罐中进行液体发酵，接种量5％，装液量30％，于37℃下恒温培养48小时，转速最高300rpm，通风比为1.0vvm，pH控制在6.5以上；培养至OD值不再增加，芽孢率≥90％，停止发酵，所得纳豆芽孢杆菌发酵液活菌数为1.3×1010cfu/ml，其聚谷氨酸的产量可达20g/L。
对比例1
(1)活化培养：将斜面中保存的芽孢杆菌接种至活化培养基中进行活化。活化培养基组成如下(按重量百分比)：可溶性淀粉0.5～1.5％、多价胨0～1.0％、氯化钠0～0.5％、磷酸二氢钾0～0.3％、磷酸氢二钾0～0.3％，黄浆水作为余量，搅拌均匀，加热。待上述各组分溶解后，用1mol/L NaOH或HCl调节pH值至6.0～8.0，补充黄浆水至1000mL。黄浆水的制备：将新鲜黄浆水进行离心，取上清液作为液体培养基原料。将配制好的培养基分装至250mL的三角瓶中，每瓶装量为50mL，用透气封口膜封口，121℃高压蒸汽灭菌30min。活化培养条件为：30～42℃，转速100～250rpm，振荡培养20～24h。
(2)发酵培养：将活化后的芽孢杆菌菌液按照1～5％接种量(v/v)接种至发酵培养基中。所述发酵培养基由以下原料组成(重量百分比)：可溶性淀粉0.5～1.5％、多价胨0～1.0％、氯化钠0～0.5％、磷酸二氢钾0～0.3％、磷酸氢二钾0～0.3％，硫酸镁0.05～0.15％、碳酸钙0.005～0.015％，硫酸锰0.05～0.15％，黄浆水作为余量，调整pH值为6.0～8.0。发酵培养条件为：培养温度30～42℃，转速100～250rpm，接种量为1～5％(v/v)，振荡培养20～36h。
上述方法培养的芽孢杆菌的细胞生物量达到1010个/mL以上。
由实施例1-4与对比例1的比较可知，本发明直接利用大豆乳清废水发酵生产芽孢杆菌的方法生产工艺简单，大豆乳清废水不需要离心、浓缩等处理，既降低生产成本，又解决了大豆乳清废水问题，实现了污水零排放，回收利用水资源。同时，最终发酵水平在100亿/ml以上，达到芽孢杆菌的产业化生产水平。特别是对于纳豆芽孢杆菌的发酵生产，实现了纳豆芽孢杆菌和聚谷氨酸的联产。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (10)
1.大豆乳清废水在培养芽孢杆菌中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌包括：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌。
3.大豆乳清废水在生产聚谷氨酸中的应用。
4.大豆乳清废水在培养纳豆芽孢杆菌和联产聚谷氨酸中的应用。
5.一种利用大豆乳清废水培养芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括：
以大豆乳清废水为原料制备培养基；
向所述培养基接种芽孢杆菌，发酵培养，即得。
6.如权利要求5所述的利用大豆乳清废水培养芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述大豆乳清废水，是由脱脂大豆经过碱提、酸沉工序，离心去除蛋白之后留下的液体。
7.如权利要求5所述的利用大豆乳清废水培养芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述培养基还包括：碳源0-10％，氮源0-10％，pH缓冲盐0-10％，其他营养成分0-10％，pH范围4.0-9.0。
8.如权利要求5所述的利用大豆乳清废水培养芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述培养基的配方包括：Na2HPO4或K2HPO4，CaCO3，与可溶性淀粉、玉米浆粉、玉米粉、酵母浸粉、糖蜜、酵母粉、尿素中的至少一种，和/或葡萄糖、味精中的至少一种。
9.如权利要求5所述的利用大豆乳清废水培养芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述发酵包括：种子液制备、上罐发酵；发酵时间在24-48小时。
10.如权利要求7所述的利用大豆乳清废水培养芽孢杆菌的方法，其特征在于，培养基在105℃～110℃下灭菌。
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