CN102653724B

CN102653724B - 一株干酪乳杆菌及其在发酵产l-乳酸中的应用

Info

Publication number: CN102653724B
Application number: CN201210172564.4A
Authority: CN
Inventors: 李玉燕; 黄思思; 虞龙; 龚文静; 钱梦宇; 陈晓双
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2012-05-30
Filing date: 2012-05-30
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2032-05-30
Also published as: CN102653724A

Abstract

本发明公开了一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC-N235，保藏编号：CCTCC No.M2012157。本发明采用低能氮离子注入诱变干酪乳杆菌LC-5出发菌株，利用高糖平板、琥珀酸平板、纯乳酸平板筛选出能够耐高糖、EMP途径强化且不分解利用乳酸的菌株，再通过发酵复筛，筛选出L-乳酸高产菌株作为下一轮诱变的出发菌株，重复上述步骤直至筛选到目标菌株干酪乳杆菌LC-N235。该菌株能有效利用廉价的玉米粉糖化液发酵产L-乳酸，糖酸转化率高。在5L发酵罐中，L-乳酸产量达到了173g/L，比原始出发菌发酵产L-乳酸提高了46.6%，具有重大的社会意义和经济价值。

Description

一株干酪乳杆菌及其在发酵产L-乳酸中的应用

技术领域

本发明涉及一株干酪乳杆菌及其在发酵产L-乳酸中的应用，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

乳酸是一种古老且重要的有机酸，乳酸、乳酸盐及其衍生产物，被广泛应用于药品、医药、饲料、化工的等领域。在食品工业上广泛用作酸味剂、防腐剂和还原剂。乳酸，尤其是L-乳酸具有很强的杀菌作用，可直接用作手术室、病房、实验室等场所的消毒剂。L-乳酸、L-乳酸钠与葡萄糖、氨基酸等复合配制成输液，可治疗酸中毒及高钾血症。乳酸可添加至烟草中，能保持烟草的湿度，提高卷烟的质量。还可以用来处理纺织纤维，可使之易于着色，增加光泽等。L-乳酸经聚合可生成立链的或环状的聚乳酸，在人体内能被分解成L-乳酸为人体代谢，因此可用于生产缓释胶囊制剂、生物降解纤维、生物降筋塑料、生物植片等。聚L-乳酸在自然条件下缓慢分解，它不像Pvc、PP塑料那样造成“白色污染”。因此在制造食品包装材料和农用薄膜等方面有很大的潜力。由此可见，L-乳酸的发展前景十分诱人。

乳酸可以通过化学合成法、微生物发酵法（同型乳酸发酵、异型乳酸发酵）及酶法几种方法合成得到。由于微生物发酵能够专业得到L-乳酸且无污染，因此发酵法被广泛应用于L-乳酸的生产。目前国内外多以米根霉、德氏乳杆菌等进行L-乳酸发酵生产。根霉属于异型乳酸发酵，营养要求简单，但转化率相对较低，且发酵产物光学纯度不高。乳酸细菌属于同型乳酸发酵，转化率高，产物光学纯度也较高，属于化能异养型微生物，必须由外界提供多种营养物质及生长因子，如氨基酸、维生素、核酸碱基等。

自然界中产L-乳酸能力强，并可应用于工业生产的菌种只有霉菌中德根霉属及细菌中的乳杆菌属、芽孢杆菌属、链球菌属。为了提高发酵产L-乳酸的产量，降低生产制备成本，提高生产质量，国内外对其生产过程进行了大量研究，主要包括：生产菌种诱变改良、低价原料的开发利用、发酵工艺的优化等方面。由此可见，提高L-乳酸发酵产物光学纯度、提高发酵糖酸转化率、提高产物耐高糖能力等已经成为发酵产L-乳酸的研究热点。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一株干酪乳杆菌及其在发酵产L-乳酸中的应用，使其发酵产物L-乳酸产量大幅度提高。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一株干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235，已于2012年5月10日，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC M 2012157。

本发明所述的干酪乳杆菌LC-N235的筛选方法是：干酪乳杆菌LC-5出发菌株经低能氮离子注入诱变后，利用高糖平板、琥珀酸平板、纯乳酸平板筛选得到耐高糖、EMP途径强化且不分解利用乳酸的菌株。经摇瓶发酵筛选出发酵产L-乳酸含量最高的干酪乳杆菌作为下一轮诱变的出发菌株。重复上述过程，直至筛选到目标菌株，即干酪乳杆菌LC-N235。

本发明菌株的形态学及生理生化学特征如下：

菌落颜色：米白色；

需氧方式：兼性厌氧；

菌落大小：2~5mm；

适宜生长温度：35~45℃；

适宜生长pH：6.0~7.0；

菌落形态：圆形；

革兰氏染色：阳性。

本发明所提供的干酪乳杆菌LC-N235诱变方法，具体步骤如下：

(a)、单孢子悬浮液制备：将干酪乳杆菌LC-5出发菌株孢子制成孢子悬液，调整孢子浓度为10⁶个/毫升。

(b)、低能氮离子注入诱变：取0.1mL的步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，在18KeV、注入剂量为160×10¹³ions/cm²下对其进行氮离子注入。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用1mL无菌水洗脱，涂布到高糖平板培养基上；在35~45℃下倒置培养2~3d。

(c)、琥珀酸平板初筛：将步骤(b)筛选到的能生长良好且透明圈大的菌株挑接至琥珀酸平板培养基上，在35~45℃下倒置培养2~3d，筛选菌株。

(d)、纯乳酸平板初筛：将步骤(c)筛选到比出发菌株延迟出现菌落的单菌落挑接至纯乳酸平板培养基上，在35~45℃下倒置培养2~3d，筛选在纯乳酸平板上不能生长的菌株。

(e)、发酵复筛：将步骤(d)筛选出的干酪乳杆菌接入斜面培养基，在35~45℃下培养2~3d，取斜面培养物接入种子培养基在35~45℃下扩培12~20h。取种子液接入发酵培养基，接种量5%~15%（v/v），250mL摇瓶装液量20~50mL，发酵温度35~45℃，发酵30~50h后测定发酵液中L-乳酸含量，筛选出L-乳酸含量最高的干酪乳杆菌作为下一轮诱变筛选的出发菌株，重复上述步骤直至筛选到目标菌株，即干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235。

在上述筛选方法中：步骤(b)所采用的高糖平板培养基包含如下质量百分数的组分：碳源25%~35%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂 2%~4%，琼脂1.0%~1.5%，其余为水，pH 6.0~7.0；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；氮源为胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；中和剂为重质碳酸钙。步骤(c)所采用的琥珀酸平板培养基以25%~35%的琥珀酸代替高糖培养基中碳源，其他成分不变。步骤(d)所采用的纯乳酸平板培养基以0.4%~0.6%的乳酸代替高糖培养基中碳源，其他成分不变。

在上述筛选方法中：步骤(b)所采用的斜面培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.3%~0.6%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂 0.2%~0.4%，琼脂1.0%~1.5%，其余为水，pH 6.0~7.0；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；氮源为胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；中和剂为重质碳酸钙。

在上述筛选方法中：步骤(e)所采用的种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4%~8%、氮源1.0%~5.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂 2%~4%，其余为水，pH6.0~7.0；其中所述碳源为葡萄糖、淀粉中的一种或几种；氮源为胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐中的一种或几种混合；中和剂为重质碳酸钙。

在上述筛选方法中：步骤(e)所采用的发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源10%~20%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂 5%~10%，其余为水，pH 6.0~7.0；其中所诉碳源为葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一种或几种；氮源为胰蛋白胨、酵母膏、牛肉膏中的一种或几种混合；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐磷酸盐中的一种或多种；中和剂为重质碳酸钙。

干酪乳杆菌LC-N235在发酵产L-乳酸中的应用，包括如下步骤：

1)、平板培养：将干酪乳杆菌LC-N235接种至平板基本培养基上培养，培养温度为35~45℃，培养时间为2~3 d；

2)、斜面培养：将步骤1)平板培养的干酪乳杆菌LC-N235接种至斜面培养基培养，培养温度为35~45℃，培养时间2~3 d；

3)、种子培养：将步骤2)中的干酪乳杆菌LC-N235的斜面培养物接种至种子培养基中培养，培养温度为35~45℃，250ml摇瓶装液量10~30ml，培养时间12~20h；

4)、发酵培养：将步骤3)中的种子培养液接种至发酵培养基中，接种量5~15%(v/v)，250ml摇瓶装液量20~50ml，发酵温度35~45℃，发酵培养时间30~50 h。

步骤1)中平板基本培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4%~6%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂2%~4%，琼脂1.0%~1.5%、其余为水，pH 6.0~7.0；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。

步骤2)中的斜面培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.3%~0.6%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂0.2%~0.4%、琼脂1.0%~1.5%、其余为水，pH 6.0~7.0；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。

步骤3)中的种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4%~8%、氮源1%~5%、无机盐0.02%~0.08%，中和剂 2%~4%，其余为水，pH6.0~7.0；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。

步骤4)中的发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源10%~20%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂 5.0%~10.0%，其余为水，pH 6.0~7.0；其中所述碳源为葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一种或多种的混合；所述氮源为胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或多种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。

本发明的有益效果在于：

本发明采用低能氮离子注入诱变干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-5出发菌株，利用高糖平板、琥珀酸平板、纯乳酸平板筛选出能够耐高糖、EMP途径强化且不分解利用乳酸的菌株，再通过发酵复筛，筛选出高产菌株作为下一轮诱变的出发菌株，重复上述步骤直至筛选到目标菌株，即干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235。该菌株能有效地利用廉价的玉米粉糖化液发酵产L-乳酸，糖酸转化率高。在5L发酵罐中，L-乳酸产量达到了173g/L，比原始出发菌发酵提高了46.6%。具有重大的社会意义和经济价值。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

本实施例说明将干酪乳杆菌进行低能氮离子注入诱变筛选的方法。

进行第一步低能氮离子注入诱变筛选的具体步骤如下：

(a)、单孢子悬浮液制备：取35~45℃恒温培养2~3d的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-5新鲜斜面加无菌水10mL，刮洗下孢子倾于带有一定玻璃珠的250mL三角瓶内震荡摇匀20min(250rpm)，打散孢子链，三层脱脂纱布过滤，滤液用血球计数板计数，调整孢子浓度10⁶个/毫升。

(b)、低能氮离子注入诱变：取0.1mL步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌平皿上，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。本实验低能氮离子注入机为离子束生物工程装置。在18KeV的能量下分别对干酪乳杆菌进行离子注入。注入剂量为160×10¹³ions/cm²，靶室真空度为10^-3Pa，以20S脉冲式注入，间隔15s，靶室内放置不接受注入的对照样。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用1ml无菌水洗脱，涂布到高糖平板培养基上，在35~45℃下倒置培养2~3d。

(c)、诱变菌株的筛选：

琥珀酸平板初筛：将步骤(b)筛选到的生长良好且透明圈大的单菌株挑接至琥珀酸平板培养基上，在35~45℃下倒置培养2~3d，筛选比出发菌株延迟出现菌落的菌株。

纯乳酸平板初筛：将琥珀酸平板上筛选到生长良好且透明圈大的单菌落挑接至高乳酸平板培养基上，在35~45℃下倒置培养2~3d，筛选在纯乳酸平板不生长的菌株。

发酵复筛：将初筛最终筛选到的单菌落接至斜面培养基，在35~45℃条件下培养2~3d；将斜面培养物分别接入装有10~30mL/250mL摇瓶种子培养基中在35~45℃、50~120rpm摇床转速下扩培12~20h。取种子液接入发酵培养基，接种量5%~15%(v/v)，250mL摇瓶装液量20~50mL，发酵温度35~45℃，发酵培养30~50h后测定发酵液中L-乳酸的含量，同时筛选出发酵产L-乳酸含量最高的干酪乳杆菌作为下一轮诱变筛选的出发菌株，直至筛选到目标菌株，即干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235。

其中，所使用的培养基配方（%为质量百分比）：

步骤(b)中所用的高糖平板培养基为：葡萄糖 30%，胰蛋白胨0.5%，酵母膏1.5%，七水合硫酸镁0.05%，碳酸钙 3%，琼脂1.2%，其余为蒸馏水（其中葡萄糖0.05MPa分消30min，重质碳酸钙0.1MPa分消40min。），pH 6.8。步骤(c)中所用的琥珀酸平板培养基以8%琥珀酸代替高糖培养基中“葡萄糖 30%”，其他成分不变。所用的纯乳酸平板培养基以0.5%乳酸代替中高糖培养基中“葡萄糖 30%”，其他成分不变。

步骤(a)和(c)中所用的斜面培养基为：葡萄糖 0.5%，胰蛋白胨0.5%，酵母膏1.5%，七水合硫酸镁0.05%，碳酸钙 0.3%，琼脂1.2%，其余为蒸馏水，pH 6.8。

步骤(c)中所用的种子培养基为：葡萄糖6.0%，胰蛋白胨1.0%，酵母膏1.0%，七水合硫酸镁0.05%，碳酸钙 3.0%，其余为蒸馏水（其中葡萄糖0.05MPa分消30min，重质碳酸钙0.1MPa分消40min。），pH 6.8。

步骤(c)中所用的发酵培养基为：葡萄糖12%，胰蛋白胨0.05%，酵母膏1.5%，七水合硫酸镁0.05%，碳酸钙 7.5%，其余为蒸馏水（其中葡萄糖0.05MPa分消30min，重质碳酸钙0.1MPa分消40min。），pH 6.8。

发酵结束后检测各菌株L-乳酸含量如表1所示：

表1

菌号	干酪乳杆菌LC-5出发菌株	干酪乳杆菌LC-N235
			L-乳酸含量(g/L)	118	162

经过筛选获得的突变株干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235在发酵过程中L-乳酸产量明显高于出发菌株。

实施例2

本实施例说明干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235的遗传稳定性。传代发酵试验结果如表2所示：

表2干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235的遗传稳定性

传代次数	L-乳酸产量（g/L）
		1	160
2	161
		3	157
4	152
		5	150

从遗传稳定性实验结果可知，经过5次连续传代，突变株干酪乳杆菌LC-N235发酵产L-乳酸产量较稳定，具有很好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。

实施例3

本实施例说明突变株干酪乳杆菌LC-N235发酵产L-乳酸。

本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：

平板基本培养基：葡萄糖5%，胰蛋白胨0.5%，酵母膏1.5%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙3%，琼脂1.2%，其余为水，pH 6.8。

斜面培养基：葡萄糖0.5%，胰蛋白胨0.5%，酵母膏1.5%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙0.3%，琼脂1.2%，其余为水，pH 6.8。

种子培养基：葡萄糖6.0%，胰蛋白胨1.0%，酵母膏1.0%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙3.0%，其余为水，pH 6.8。其中葡萄糖0.05MPa分消30min，重质碳酸钙0.1MPa分消40min。

发酵培养基：葡萄糖12%，胰蛋白胨0.05%，酵母膏1.5%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙7.5%，其余为水，pH 6.8。

将筛选到得突变株干酪乳杆菌LC-N235接种至平板基本培养基上于38℃条件下倒置培养60h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度38℃，培养时间48h。将斜面培养物接种到种子培养基中，培养温度38℃，250mL摇瓶瓶装液量30mL，在80rpm摇床转速下培养时间16h；将种子液接种到发酵培养基中，接种量10%(v/v)，发酵温度38℃，250mL摇瓶装液量40mL，静止发酵培养40h后检测发酵液中L-乳酸含量达到了165g/L，比同等培养条件下的原始出发菌株发酵提高了39.8%。

实施例4

本实施例说明突变株干酪乳杆菌LC-N235发酵产L-乳酸。

本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：

发酵培养基：玉米粉糖化液12%，胰蛋白胨0.05%，酵母膏1.5%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙7.5%，其余为水，pH 6.8。

将筛选到得突变株干酪乳杆菌LC-N235接种至平板基本培养基上于38℃条件下倒置培养60h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度38℃，培养时间48h。将斜面培养物接种到种子培养基中，培养温度38℃，250mL摇瓶瓶装液量30mL，在80rpm摇床转速下培养时间16h；将种子液接种到发酵培养基中，接种量10%(v/v)，发酵温度38℃，250mL摇瓶装液量40mL，静止发酵培养40h后检测发酵液中L-乳酸含量达到了170g/L，比同等培养条件下的原始出发菌提高了44.1%。

实施例5

本实施例说明突变株干酪乳杆菌LC-N235发酵产L-乳酸。

本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：

发酵培养基：大米糖化液12%，胰蛋白胨0.05%，酵母膏1.5%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙7.5%，其余为水，pH 6.8。

将筛选到得突变株干酪乳杆菌LC-N235接种至平板基本培养基上于38℃条件下倒置培养60h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度38℃，培养时间48h。将斜面培养物接种到种子培养基中，培养温度38℃，250mL摇瓶瓶装液量30mL，，在80rpm摇床转速下培养时间16h；将种子液接种到发酵培养基中，接种量10%(v/v)，发酵温度38℃，250mL摇瓶装液量40mL，静止发酵培养40h后检测发酵液中L-乳酸含量达到了156g/L，比同等培养条件下的原始出发菌提高了32.2%。

实施例6

本实施例说明突变株干酪乳杆菌LC-N235发酵产L-乳酸。

本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：

种子培养基：葡萄糖6%，胰蛋白胨1.0%，酵母膏1.0%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙3%，其余为水，pH 6.8。其中葡萄糖0.05MPa分消30min，重质碳酸钙0.1MPa分消40min。

发酵培养基：蔗糖12%，胰蛋白胨0.05%，酵母膏1.5%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙7.5%，其余为水，pH 6.8。

将筛选到得突变株干酪乳杆菌LC-N235接种至平板基本培养基上于38℃条件下倒置培养60h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度38℃，培养时间48h。将斜面培养物接种到种子培养基中，培养温度38℃，250mL摇瓶瓶装液量30mL，，在80rpm摇床转速下培养时间16h；将种子液接种到发酵培养基中，接种量10%(v/v)，发酵温度38℃，250mL摇瓶装液量40mL，静止发酵培养40h后检测发酵液中L-乳酸含量达到了140g/L，比同等培养条件下的原始出发菌提高了18.6%。

实施例7

本实施例说明突变株干酪乳杆菌LC-N235在5L发酵罐中发酵产L-乳酸。

本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：

种子培养基：葡萄糖6.0%，胰蛋白胨0.5%，酵母膏1.5%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙3.0%，其余为水，pH 6.8。其中葡萄糖0.05MPa分消30min，重质碳酸钙0.1MPa分消40min。

发酵培养基：玉米粉糖化液12%，蛋白胨0.05%，酵母膏1.5%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙7.5%，其余为水，pH6.8。

将筛选到得突变株干酪乳杆菌LC-N235接种至平板基本培养基上于38℃条件下倒置培养60h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度38℃，培养时间48h。将斜面培养物接种到种子培养基中，培养温度38℃，250mL摇瓶瓶装液量30mL，在80rpm摇床转速下培养时间16h；将种子液接种到装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量为10%(v/v)，发酵温度为38℃，前期0~12h发酵罐搅拌转速100rpm，12~40h静止发酵培养。40h后检测发酵液中L-乳酸含量，达到173g/L，相比同等培养条件下的原始出发菌提高了46.6%。

Claims

1.一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC-N235，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC M 2012157。

2.权利要求1所述的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC-N235在发酵产L-乳酸中的应用。

3.根据权利要求2所述的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC-N235在发酵产L-乳酸中的应用，其特征在于包括如下步骤：

4)、发酵培养：将步骤3)中的种子培养液接种至发酵培养基中，接种量按照体积比5~15%接种，250ml摇瓶装液量20~50ml，发酵温度35~45℃，发酵培养时间30~50 h。

4.根据权利要求3所述的干酪乳杆菌LC-N235在发酵产L-乳酸中的应用，其特征在于：所述步骤1)中平板基本培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4%~6%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂2%~4%，琼脂1.0%~1.5%、其余为水，pH 6.0~7.0；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。

5.根据权利要求3所述干酪乳杆菌LC-N235在发酵产L-乳酸中的应用，其特征在于：所述步骤2)中的斜面培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.3%~0.6%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂0.2%~0.4%、琼脂1.0%~1.5%、其余为水，pH 6.0~7.0；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。

6.根据权利要求3所述的干酪乳杆菌LC-N235在发酵产L-乳酸中的应用，其特征在于：所述步骤3)中的种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4%~8%、氮源1%~5%、无机盐0.02%~0.08%，中和剂 2%~4%，其余为水，pH 6.0~7.0；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。

7.根据权利要求3所述的干酪乳杆菌LC-N235在发酵产L-乳酸中的应用，其特征在于：所述步骤4)中的发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源10%~20%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂 5.0%~10.0%，其余为水，pH 6.0~7.0；其中所述碳源为葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一种或多种的混合；所述氮源为胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或多种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。