CN111394280A - 一种适合地衣芽孢杆菌生长的培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种适合地衣芽孢杆菌生长的培养基及其应用。所述培养基中含有的成分为：玉米浆干粉、豆粕粉、糖蜜、硫酸铵、硫酸镁、硫酸锰、磷酸氢二钾。与现有技术相比，本发明优化碳氮源种类，氮源方面主要利用玉米浆干粉替代蛋白胨的使用，碳源方面利用糖蜜替代葡萄糖的使用。两者原料在采购方面易取得，成本较低；同时糖蜜与葡萄糖相比，含有更多促菌生长因子，可以满足菌体生长需求，在原有基础上提高了菌量水平；而玉米浆干粉中含有微量元素，能够促进地衣芽孢杆菌芽孢的生成，显著提高了菌体的存活率。

Description

一种适合地衣芽孢杆菌生长的培养基及其应用

技术领域

本发明涉及一种培养基，尤其是涉及一种适合地衣芽孢杆菌生长的培养基及其应用。

背景技术

地衣芽孢杆菌是我国农业部2003年公告批准使用的饲料级菌株之一，在改善肠道健康、促进动物生长以及提高宿主免疫力起着重要作用。该菌抗逆性强、耐高湿高压、易贮存，还能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多种氨基酸等，被认为是最理想的微生物添加剂，在畜牧养殖等方面有较高的应用价值。

在工业生产中，地衣芽孢杆菌的发酵主要有固体发酵与液体发酵，固体发酵相对而言比较稳定，对菌量有一定限制，液体发酵能够使菌量得到大大提升，形成高菌量，但是高菌量依赖于富营养培养基。

中国专利CN102260637A公开了胶质芽孢杆菌PM13的一种液体发酵培养基，其组成为糖蜜3.0～5.0g/L，淀粉1.0～3.0g/L，豆粕粉5.0～10.0g/L，碳酸钙4.0～10.0g/L，磷酸氢二钾1.0～3.0g/L，七水硫酸镁1.0～3.0g/L，NaCl0.0～5.0g/L，pH7.0～8.0，蒸馏水配制。该发明培养基配制较为复杂，培养基成本较高。

中国专利CN103525728B提供了一种胶质芽孢杆菌工业化液体形成芽孢的工艺技术，具体是涉及一种应用于微生物肥料的胶质芽孢杆菌深层发酵培养基。按重量百分比计，由如下原料组成：玉米粉0.9～1.5％、豆粕粉0.1～0.3％、磷酸氢二钾0.08～0.2％、余量为水。将玉米粉、豆粕粉、磷酸氢二钾和水混合，搅拌均匀，121℃灭菌20～40min，再冷却至25～40℃，得到培养基。该发明的培养基pH值约为6.0～7.5，而胶质芽孢在pH值为6.0～8.0范围内生长良好，因此培养基在灭菌前无需用酸碱调节pH即可促进菌体生长和芽孢的形成，简化了操作，提高了产品质量，降低了生产成本，更适于工业大规模生产。

CN104862263A公开了一种含玉米秸秆的培养基及其制备方法和培养枯草芽孢杆菌(或植物乳杆菌)的方法，培养基包括玉米芯、玉米秸秆、豆粕、大豆糖蜜；采用混合的方法制备。菌种的培养方法：活化菌种，制备种子液，然后接种到培养基中。在37℃恒温震荡箱中振荡培养24小时。该培养基中含有蛋白胨。

目前生产所用的地衣芽孢杆菌的培养基成本普遍较高，最终所得的生产效益在一定程度上被限制。因此寻找一种成本低廉，又不影响菌量的培养基配方，成为一种地衣芽孢杆菌的发酵生产应用并有效降低成本的手段之一。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种适合地衣芽孢杆菌生长的培养基及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种适合地衣芽孢杆菌生长的培养基，所述培养基中含有的成分为：玉米浆干粉：3.5-5g/L；豆粕粉：2-3g/L；糖蜜：0.8-1.5g/L；硫酸铵：0.2-0.3g/L；硫酸镁：0.005-0.007g/L；硫酸锰：0.001-0.0015g/L；磷酸氢二钾：0.3-0.4g/L。

所述玉米浆干粉是以鲜玉米浆为原料经低温瞬间加热喷雾干燥而成。所述玉米浆干粉的水溶性蛋白质保存完好，保持了玉米浆液的所有特性，所含蛋白质、微量元素含量高，在生物发酵过程中作水溶性植物蛋白及水溶性维生素等营养元素补充剂。本发明主要利用玉米浆干粉替代蛋白胨，作为氮源使用。同时，玉米浆干粉中存在微量元素能够促进地衣芽孢杆菌芽孢的生成，显著提高了菌体的存活率。

糖蜜是制糖工业的副产品，主要含有大量可发酵糖，是很好的发酵原料，矿物质含量较高，约8％～10％，能够抗酸碱、抗氧化，促进畜禽对矿物质的吸收和利用；同时含有维生素、矿物质、菌体蛋白、核酸、表面活性物及促生长因子(生物活性物质)等成分。本发明利用糖蜜替代葡萄糖，作为碳源使用。糖蜜与葡萄糖相比，存在更多促菌生长因子，可以满足菌体生长需求，在原有基础上提高了菌量水平。

进一步地，所述培养基中还含有消泡剂。

进一步地，所述消泡剂的含量为0.03-0.05g/L。本申请加入适量的消泡剂，若过多会抑制菌生长，过少会影响消泡效果。

进一步地，所述培养基为液体发酵用培养基。

本发明主要通过优化培养基中碳氮源的组分来进一步提高地衣芽孢杆菌菌量。优化后的培养基不仅有效的提高了地衣芽孢杆菌的菌量，同时降低了培养基所占成本，提高了生产效益。

本发明还提供所述培养基的应用，所述培养基用于对地衣芽孢杆菌进行发酵，方法为：

将保存于斜面的地衣芽孢杆菌接到摇瓶发酵培养基中，于37℃，摇床培养，用作发酵种子液；

将发酵种子液加入含有所述培养基的发酵罐进行发酵。

进一步地，所述摇瓶发酵培养基的配方为：蛋白胨：10g/L，酵母粉：5g/L，氯化钠：5g/L，葡萄糖：2g/L。

进一步地，发酵罐内进行发酵的条件为：温度：37℃；通气：3-5m³/h；PH：7.2；转速：200-300rpm。

进一步地，进行发酵后，使地衣芽孢杆菌的菌量达到：210-230×10⁸CFU/mL，芽孢率达到：95-97％，芽孢数：199-220×10⁸CFU/mL。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

1、优化了氮源种类，主要利用玉米浆干粉、豆粕作为有机氮源替代蛋白胨的使用。玉米浆干粉的主要成分是氨基酸、多肽类，并含有丰富的维生素、生长因子以及少量还原糖和乳酸，其丰富的蛋白质可为地衣芽孢杆菌提供氮源，同时少量还原糖和乳酸可以提供部分碳源和有机酸，既可降低培养基成本又促进了地衣芽孢杆菌芽孢的生成。利用硫酸铵作为无机氮源供应给地衣芽孢杆菌，硫酸铵以铵盐的形式存在于原料中，可直接分解成铵而被微生物利用。豆粕为菌株生长提供氮源，材料易得，成本低廉。

2、碳源方面利用糖蜜替代葡萄糖的使用，糖蜜含有丰富的蔗糖、还原糖(葡萄糖，果糖)、氨基酸、维生素与微量元素等营养物质，与葡萄糖相比，含有更多促菌生长因子，可以满足菌体生长需求，在原有基础上提高了菌量水平。

3、添加了玉米浆干粉，其含有微量元素，能够促进地衣芽孢杆菌芽孢的生成，显著提高了菌体的存活率。同时磷和钾元素都是微生物生长所必需的营养素，磷酸氢二钾为培养基中增加了磷元素和钾元素，且呈弱碱性，可作为缓冲剂平衡地衣芽孢杆菌在发酵时产生的酸，维持该菌适宜生长的PH，协同促进地衣芽孢杆菌芽孢的生成，提高了菌体的存活率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

按照实验设计方案，对地衣芽孢杆菌进行发酵实验。在实验过程中定时取样镜检，观察地衣芽孢杆菌菌体的生长状况及芽孢形成情况。在发酵结束后，利用稀释平板涂布法进行菌量的测定。

实施例1-实施例5中不同的培养基配方如表1所示。

表1 培养基配方

成分(g/L)	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5
						玉米浆干粉	4	3.5	4.5	5	4.5
豆粕粉	2.5	3	2	2	2.5
						糖蜜	1.5	0.9	1	1.5	0.8
硫酸铵	0.25	0.3	0.25	0.2	0.2
						硫酸镁	0.005	0.006	0.005	0.007	0.006
磷酸氢二钾	0.3	0.35	0.35	0.4	0.3
						硫酸锰	0.0015	0.001	0.001	0.0015	0.001
消泡剂	0.04	0.04	0.05	0.03	0.04

对比例的培养基配方如表2所示。

表2 对比例的培养基配方

使用实施例1-5以及对比例的地衣发酵培养基对地衣芽孢杆菌进行培养，培养方法如下：

将保存于斜面的地衣芽孢杆菌接到100mL摇瓶发酵培养基中，摇瓶发酵培养基的配方为：蛋白胨：10g/L；酵母粉：5g/L；氯化钠：5g/L；葡萄糖：2g/。于37℃，200rpm摇床培养24h，用作发酵种子液；

将发酵种子液加入含有所述培养基的50L发酵罐进行发酵，发酵罐内进行发酵的条件为：温度：37℃；通气：3-5m³/h；PH：7.2；转速：200-300rpm。

使用实施例1-5以及对比例的地衣发酵培养基对地衣芽孢杆菌进行培养的结果如表3所示。

表3

注：芽孢率的计算：发酵结束后，采用平板涂布稀释计数法进行总菌量测定；80℃水浴后20min后，进行平板涂布稀释计数检测芽孢生成量。其中芽孢率的计算方式为：芽孢生产率＝(芽孢生成量/总活菌量)*100％。

在本试验研究中可得出，利用该实验所用的发酵培养基可以使地衣芽孢杆菌的菌量达到205-230×10⁸CFU/mL，芽孢率达到95-97％，芽孢数199-220×10⁸CFU/mL，在成本降低的前提下，活菌数、芽孢的总量和形成率得到了大幅度提高。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种适合地衣芽孢杆菌生长的培养基，其特征在于，所述培养基中含有的成分为：玉米浆干粉：3.5-5g/L；豆粕粉：2-3g/L；糖蜜：0.8-1.5g/L；硫酸铵：0.2-0.3g/L；硫酸镁：0.005-0.007g/L；硫酸锰：0.001-0.0015g/L；磷酸氢二钾：0.3-0.4g/L。

2.根据权利要求1所述适合地衣芽孢杆菌生长的培养基，其特征在于，所述玉米浆干粉是以鲜玉米浆为原料经低温瞬间加热喷雾干燥而成。

3.根据权利要求1所述适合地衣芽孢杆菌生长的培养基，其特征在于，所述培养基中还含有消泡剂。

4.根据权利要求3所述适合地衣芽孢杆菌生长的培养基，其特征在于，所述消泡剂的含量为0.03-0.05g/L。

5.根据权利要求1所述适合地衣芽孢杆菌生长的培养基，其特征在于，所述培养基为液体发酵用培养基。

6.如权利要求1所述培养基的应用，其特征在于，所述培养基用于对地衣芽孢杆菌进行发酵，方法为：

将保存于斜面的地衣芽孢杆菌接到摇瓶发酵培养基中，于37℃，摇床培养，用作发酵种子液；

将发酵种子液加入含有如权利要求1所述培养基的发酵罐进行发酵。

7.根据权利要求6所述适合地衣芽孢杆菌生长的培养基，其特征在于，所述摇瓶发酵培养基的配方为：蛋白胨：10g/L；酵母粉：5g/L；氯化钠：5g/L；葡萄糖：2g/L。

8.根据权利要求6所述适合地衣芽孢杆菌生长的培养基，其特征在于，进行发酵的条件为：温度：37℃；通气：3-5m³/h；PH：7.2；转速：200-300rpm。

9.根据权利要求6所述适合地衣芽孢杆菌生长的培养基，其特征在于，进行发酵后，使地衣芽孢杆菌的菌量达到205-230×10⁸CFU/mL，芽孢率达到95-97％，芽孢数199-220×10⁸CFU/mL。