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CN113528599A - 一种高效螯合型酵素肽的生产方法 - Google Patents

一种高效螯合型酵素肽的生产方法 Download PDF

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CN113528599A CN202110626455.4A CN202110626455A CN113528599A CN 113528599 A CN113528599 A CN 113528599A CN 202110626455 A CN202110626455 A CN 202110626455A CN 113528599 A CN113528599 A CN 113528599A
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Abstract

本发明属于生物饲料领域，涉及一种高效螯合型酵素肽的生产方法。步骤为：活化扩培菌种，分别得到枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌发酵种子液；称取豆渣和豆粕，搅拌均匀制成固体发酵培养基；接种枯草芽孢杆菌发酵种子液，添加次粉并调节含水量进行一期好氧发酵；再接种酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌发酵种子液、蛋白酶和无机矿物盐进行二期厌氧发酵，发酵结束后获得螯合型酵素肽。本发明采用好氧和厌氧分步发酵、菌酶协同发酵、发酵与螯合同步进行的模式，生产工艺简单，所得螯合酵素肽中各种矿物质元素螯合率高，螯合Fe以Fe2+为主，含有较低含量植酸和较高含量的小肽、有机酸和益生菌，经济效益显著。

Description

一种高效螯合型酵素肽的生产方法
技术领域
本发明属于生物饲料领域，具体涉及一种适用于家禽的矿物质元素高效螯合型酵素肽的生产方法。
背景技术
Ca、Fe、Cu、Zn、Mn等矿物质元素涉及蛋鸡等家禽的生长代谢、信号转导、免疫调节、酶激活等几乎所有的生命活动过程，对于维持机体的正常生理功能、健康状态和高效生产性能，具有十分重要的意义。当饲料中缺乏相应的矿物质元素时，家禽会出现生长缓慢，抗病能力下降，产蛋率下降，所产蛋品质降低等现象。
家禽矿物质元素补充经历四代发展。第一代，无机盐型，如：硫酸亚铁、硫酸铜等。无机盐型矿物质元素稳定性差，吸收利用率低，不同矿物质元素之间存在拮抗作用，易与植酸等结合形成不溶性盐影响吸收。第二代，有机酸型，如：乳酸钙、葡萄糖酸锌等。有机酸型矿物质元素吸收利用率较第一代有所提高，但依然存在价格高、稳定性差、不同矿物质元素之间存在吸收竞争等问题。第三代，氨基酸螯合型，如：甘氨酸亚铁、蛋氨酸锌等。氨基酸螯合型矿物质元素吸收利用率高、稳定性强、安全无毒副作用，但价格极其高昂，在大规模养殖中使用极大地增加了养殖成本。第四代，小肽螯合型，如：大豆肽螯合钙、酪蛋白螯合铁等。矿物质元素借助小肽的转运吸收机制以螯合物的形式被转运吸收。小肽螯合型矿物质元素具有价格低廉、吸收利用率高、稳定性强、无毒副作用等优点。小肽螯合型还具有小肽配体的生物学功能，如：增强免疫力、抗菌、抗氧化、降低胆固醇等。但小肽螯合型矿物质元素研究多处于理论阶段，实际工厂化生产较少，市场上购买困难。
在实际养殖中，为了控制养殖成本和满足家禽对于Ca、Fe、Cu、Zn、Mn等矿物质元素的需求，往往添加大量的无机盐型矿物质元素。家禽对无机矿物质盐吸收利用率很低，大部分被直接排出体外，造成严重的环境污染和资源浪费。家禽摄入过多的无机矿物质盐，对机体有巨大的毒副作用。此外，无机盐型的Fe2+极其容易氧化为Fe3+，显著降低家禽对Fe2+的吸收利用，造成机体血红蛋白减少，运输氧气能力下降，产生贫血。
目前，补充螯合型矿物质元素是公认的最理想的矿物质元素补充方式。传统的螯合型矿物质元素生产方式，首先通过化学水解、酶水解等方法水解蛋白质，再通过蛋白纯化获得高纯度的氨基酸、小肽等小分子物质，或通过氨基酸发酵工艺或化学合成工艺先得到较纯的氨基酸，再接着通过相应的螯合工艺将游离矿物质元素与纯化的小分子物质进行螯合。最后，通过无水乙醇洗涤、液相色谱分离等方法获得高纯度的螯合型矿物质元素。获得的这些矿物质元素螯合物纯度高、稳定性强。但是，这些高纯度的螯合物生产工艺复杂，设备要求高，生产成本高昂，对于矿物质元素螯合物的实际生产和广泛使用造成了困难。此外，一味地追求高纯度的单一络合物，并不一定是最佳的矿物质元素补充方式。单一矿物质元素螯合物或者单一氨基酸、小肽螯合物，满足不了全面的矿物质元素和氨基酸营养补充。而且，价格高昂的氨基酸、小肽螯合物使得养殖饲料成本大幅度增加，对于养殖行业的发展是一大阻力。所有类型的营养物质都有其吸收途径，但吸收途径都会达到饱和。单一的氨基酸或小肽螯合物虽然比无机矿物质盐要强得多，但添加量超过其吸收能力也会降低矿物质元素的吸收。
发明内容
针对现有家禽矿物质元素补充存在的问题，本发明提供一种以豆渣和豆粕为原料通过菌酶协同发酵螯合生产矿物质元素高效螯合型酵素肽的方法。该方法生产工艺简单，成本低廉，经济效益显著。获得的螯合型酵素肽中各种矿物质元素螯合率较高，螯合的Fe以Fe2+为主，植酸含量较低和小肽、有机酸、益生菌等含量较高。
为了实现以上技术目的，本发明提供一种以豆渣和豆粕为原料发酵螯合生产矿物质元素高效螯合型酵素肽的方法，包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌分别进行活化扩培得到相应的发酵种子液；
(2)称取豆渣和豆粕，搅拌均匀制成固态发酵培养基；
(3)将步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵种子液接入步骤(2)中制成的固态发酵培养基，加入次粉，根据含水量加入水，搅拌均匀，进行一期好氧发酵，得到好氧发酵的发酵培养基；
(4)将步骤(1)得到的酿酒酵母发酵种子液、植物乳杆菌发酵种子液、鼠李糖乳杆菌发酵种子液、蛋白酶、无机矿物质盐接入步骤(3)中得到的好氧发酵的发酵培养基，搅拌均匀后的混合物，密封进行二期厌氧发酵，发酵结束后获得矿物质元素高效螯合型酵素肽。
优选的，步骤(2)中所述固态发酵培养基中豆渣占总质量的25％～70％，豆粕占总质量的30％～75％。
优选的，步骤(3)中所述枯草芽孢杆菌接种量为步骤(2)中固体发酵培养基质量的1～15％；所述次粉添加量为步骤(2)中固体发酵培养基质量的5％～30％。
优选的，步骤(3)中所述含水量为25％～65％。
优选的，步骤(3)中所述一期好氧发酵温度为20～40℃，好氧发酵时间为3～48h。
优选的，步骤(4)中所述酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌种子液接种量均为步骤(2)中固体发酵培养基质量的1％～10％。
优选的，步骤(4)中所述蛋白酶为酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶；所述酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶总添加量为步骤(2)中固体发酵培养基质量的0.01％～2％，两种酶的添加比例为1:1，酶活力均为6万u/g。
优选的，步骤(4)中所述无机矿物质盐为CaCO3、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O和ZnSO4·7H2O。
优选的，步骤(4)中所述CaCO3添加量为步骤(2)中固体发酵培养基质量的1～12％；所述FeSO4·7H2O添加量为步骤(2)中固体发酵培养基质量的0.01～1.6％；所述CuSO4·5H2O添加量分别为步骤(2)中固体发酵培养基质量的0.001～0.064％；所述MnSO4·H2O添加量分别为步骤(2)中固体发酵培养基质量的0.01～1％；所述ZnSO4·7H2O添加量分别为步骤(2)中固体发酵培养基质量的0.01～1.2％。
优选的，步骤(4)中所述二期厌氧发酵温度为20～40℃，发酵时间为2～30天。
菌种来源：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，CGMCC 1.557)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnose，CGMCC 1.2467)均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)购于生合生物科技有限公司。
酶来源：酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶均购于夏盛酶生物技术有限公司。
本发明的有益效果是：
(1)本发明发酵与矿物质元素螯合同时进行，发酵工艺简单易操作，生产成本低廉，显著降低家禽矿物质元素饲喂成本，符合大规模生产应用的要求。
(2)本发明获得的螯合型酵素肽中各种矿物质元素螯合率高，显著提高家禽对矿物质元素的吸收利用率。
(3)本发明获得的螯合型酵素肽中Fe主要为Fe2+，并且螯合型酵素肽对Fe2+有很好的抗氧化作用，延长了Fe2+的存放时间，显著提高了家禽对Fe2+的吸收利用率，减少了家禽贫血症的发生。
(4)本发明通过菌酶协同发酵显著降低了螯合型酵素肽中的植酸含量，避免了植酸与矿物质元素结合，降低矿物质元素的吸收。
(5)本发明通过菌酶协同发酵，显著增加了螯合型酵素肽中的小肽含量、有机酸含量和益生菌含量，提高了螯合型酵素肽的营养品质，有利于家禽对蛋白质的吸收，维护肠道菌群健康，增强家禽免疫力，降低抗生素的使用。
附图说明
图1是本发明发酵工艺的流程图。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：
(1)枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的活化培养和发酵种子液的制备：
A、菌种培养基的配制：
斜面和平板培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌30min；
种子液养基：黄豆20g，红糖20g，蒸馏水1000mL，制成豆浆，121℃灭菌30min；
B、各菌种的活化和发酵种子液的制备：
枯草芽孢杆菌的活化和发酵种子液的制备：将保存于4℃的枯草芽孢杆菌菌种接种于斜面培养基，37℃培养36h。再在平板上划单菌落，37℃倒置培养36h，挑选单菌落接种于含有50mL种子液培养基的250mL锥形瓶中，在37℃、160r/min条件下培养18h。按需要以3％接种量(v/v)进行扩大培养制得发酵种子液，培养条件为37℃、160r/min培养24h。
酿酒酵母的活化和发酵种子液的制备：将保存于4℃的酿酒酵母菌种接种于斜面培养基，28℃培养36h。再在平板上划单菌落，28℃倒置培养36h，挑选单菌落接种于含有50mL种子液培养基的250mL锥形瓶中，在28℃、160r/min条件下培养18h。按需要以3％接种量(v/v)进行扩大培养制得发酵种子液，培养条件为28℃、160r/min培养24h。
植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的活化和发酵种子液的制备：将保存于4℃的植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌菌种分别接种于斜面培养基，37℃培养48h。再在平板上划单菌落，37℃倒置培养48h，挑选单菌落接种于装有230mL种子液培养基的250mL厌氧瓶中，在37℃条件下培养18h。按需要以3％接种量(v/v)进行扩大培养制得发酵种子液，培养条件为37℃培养24h。
(2)固体发酵培养基的制备：各组分质量占比为：豆渣50％，豆粕50％；
(3)将制得的枯草芽孢杆菌发酵种子液按接种量为固体发酵培养基质量的3％接种于发酵培养基中，加入固体发酵培养基质量10％的次粉，加水使含水量为45％，搅拌均匀，进行一期好氧发酵，发酵温度为32℃，好氧发酵15h；
(4)将制得的酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌发酵种子液按接种量为固体发酵培养基质量的3％分别接种于发酵培养基中，加入质量为固体发酵培养基质量的0.5％蛋白酶(酸性蛋白酶与木瓜蛋白酶比例为1:1)，最后再加入6％CaCO3、0.8％FeSO4·7H2O、0.032％CuSO4·5H2O、0.5％MnSO4·H2O、0.6％ZnSO4·7H2O，搅拌均匀，装入含有单向排气孔的发酵袋中，密封进行二期厌氧发酵，发酵温度为31℃，发酵时间为15天，发酵结束后获得矿物质元素高效螯合型酵素肽。
实施例2：
(1)枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的活化和发酵种子液的制备方法，具体操作同实施例1；
(2)固体发酵培养基的制备：各组分质量占比为：豆渣60％，豆粕40％；
(3)将制得的枯草芽孢杆菌发酵种子液按接种量为固体发酵培养基质量的8％接种于发酵培养基中，加入固体发酵培养基质量24％的次粉，加水使含水量为55％，搅拌均匀，进行一期好氧发酵，发酵温度为36℃，好氧发酵24h；
(4)将制得的酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌发酵种子液按接种量为固体发酵培养基质量的10％分别接种于发酵培养基中，再加入质量为固体发酵培养基质量的1.5％蛋白酶(酸性蛋白酶与木瓜蛋白酶比例为1:1)、12％CaCO3、0.4％FeSO4·7H2O、0.05％CuSO4·5H2O、0.1％MnSO4·H2O、1.2％ZnSO4·7H2O，搅拌均匀，装入含有单向排气孔的发酵袋中，密封进行二期厌氧发酵，发酵温度为40℃，发酵时间为8天，发酵结束后获得矿物质元素高效螯合型酵素肽。
实施例3：
(1)枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的活化和发酵种子液的制备方法，具体操作同实施例1；
(2)固体发酵培养基的制备：各组分质量占比为：豆渣40％，豆粕60％；
(3)将制得的枯草芽孢杆菌发酵种子液按接种量为固体发酵培养基质量的10％接种于发酵培养基中，加入固体发酵培养基质量18％的次粉，加水使含水量为40％，搅拌均匀，进行一期好氧发酵，发酵温度为25℃，好氧发酵48h；
(4)将制得的酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌发酵种子液按接种量为固体发酵培养基质量的5％分别接种于发酵培养基中，加入质量为固体发酵培养基质量的1％蛋白酶(酸性蛋白酶与木瓜蛋白酶比例为1:1)，最后再加入4％CaCO3、1.6％FeSO4·7H2O、0.064％CuSO4·5H2O、0.01％MnSO4·H2O、0.2％ZnSO4·7H2O，搅拌均匀，装入含有单向排气孔的发酵袋中，密封进行二期厌氧发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为2天，发酵结束后获得矿物质元素高效螯合型酵素肽。
实施例4：
(1)枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的活化和发酵种子液的制备方法，具体操作同实施例1；
(2)固体发酵培养基的制备：各组分质量占比为：豆渣25％，豆粕75％。
(3)将制得的枯草芽孢杆菌发酵种子液按接种量为固体发酵培养基质量的1％接种于发酵培养基中，加入固体发酵培养基质量30％的次粉，加水使含水量为25％，搅拌均匀，进行一期好氧发酵，发酵温度为40℃，好氧发酵9h；
(4)将制得的酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌发酵种子液按接种量为固体发酵培养基质量的8％接种于发酵培养基中，再加入质量为固体发酵培养基质量的2％蛋白酶(酸性蛋白酶与木瓜蛋白酶比例为1:1)，最后再加入8％CaCO3、0.01％FeSO4·7H2O、0.01％CuSO4·5H2O、0.8％MnSO4·H2O、0.9％ZnSO4·7H2O，搅拌均匀，密封进行二期厌氧发酵，发酵温度为20℃，发酵时间为21天，发酵结束后获得矿物质元素高效螯合型酵素肽。
实施例5：
(1)枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的活化和发酵种子液的制备方法，具体操作同实施例1；
(2)固体发酵培养基的制备：各组分质量占比为：豆渣70％，豆粕30％；
(3)将制得的枯草芽孢杆菌发酵种子液按接种量为固体发酵培养基质量的15％接种于发酵培养基中，加水使含水量为65％，搅拌均匀，进行一期好氧发酵，发酵温度为20℃，好氧发酵3h；
(4)将制得的酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌发酵种子液按接种量为固体发酵培养基质量的1％分别接种于发酵培养基中，再加入质量为固体发酵培养基质量的0.01％蛋白酶(酸性蛋白酶与木瓜蛋白酶比例为1:1)，最后再加入1％CaCO3、1.2％FeSO4·7H2O、0.001％CuSO4·5H2O、1％MnSO4·H2O、0.01％ZnSO4·7H2O，搅拌均匀，密封进行二期厌氧发酵，发酵温度为26℃，发酵时间为30天，发酵结束后获得矿物质元素高效螯合型酵素肽。
表1是各实施例中螯合型酵素肽中各种矿物质元素螯合率
矿物质元素 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
Ca(％) 89.87 82.35 85.74 87.86 93.14
Fe(％) 97.73 98.16 97.13 98.79 97.38
Cu(％) 76.42 74.24 73.85 77.43 78.29
Mn(％) 96.84 96.92 97.46 96.25 96.18
Zn(％) 96.28 95.63 96.37 95.82 97.93
表2是各实施例中螯合型酵素肽中相关物质含量
Figure BDA0003101361610000071
Figure BDA0003101361610000081
实施例6：饲喂实验
实验地点为浙江康星生物技术有限公司的蛋鸡养殖场，所用的高效螯合型酵素肽为实施例1制备。取72只当地三黄蛋鸡，随机组合成两组，每组36只，实验蛋鸡饲料配方如表3，饲养60天，实验结果如表4、表5和表6。
由表4-6结果可知，本发明高效螯合型酵素肽添加量为5％。饲喂螯合型酵素肽显著提高蛋鸡的平均日采食量、产蛋率、平均蛋重、蛋壳厚度，降低了软破蛋率，表明本发明所得螯合型酵素肽提高了蛋鸡的生产性能。同时，饲喂螯合型酵素肽显著降低了蛋鸡粪便中的Ca、Fe、Cu、Mn、Zn的含量，表明本发明所得螯合型酵素肽具有提高蛋鸡对矿物质元素的吸收，降低矿物质元素随粪便排放的作用。饲喂螯合型酵素肽蛋鸡的红细胞、血红蛋白、红细胞压积均显著高于对照组，表明饲喂螯合型酵素肽提高强蛋鸡对Fe2+、Cu2+等的吸收，增强蛋鸡体内氧的运输，避免蛋鸡贫血的出现。
表3是饲喂实验蛋鸡饲料配方
组成 实验组(％) 对照组(％)
玉米 62 62
豆粕 26.28 26.28
多元维生素 0.05 0.05
DL蛋氨酸 0.12 0.12
石子 5 5
磷酸氢钙 1.4 1.4
Vc 0.1 0.1
植酸酶 0.05 0.05
矿物质元素 5(螯合型酵素肽) 5(未发酵饲料)
合计 100 100
注：对照组的矿物质元素中所对应添加的未发酵饲料与实验组所添加的螯合型酵素肽区别在于，对照组不加入菌种和蛋白酶，也不进行发酵操作，其余添加物质和用量与实验组相同。
表4是饲喂实验蛋鸡生产性能检测结果
Figure BDA0003101361610000091
表5是饲喂实验蛋鸡粪便中矿物质离子含量
矿物质元素 实验组 对照组
Ca 18.99 25.8
Fe 0.44 0.70
Cu 0.059 0.078
Mn 0.18 0.26
Zn 0.15 0.21
表6是饲喂实验蛋鸡血常规检测结果
矿物质元素 实验组 对照组
白细胞 2.48 2.19
红细胞 3.52 2.24
血红蛋白 179 137
红细胞压积 43.8 30.6
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (9)

1.一种高效螯合型酵素肽的生产方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌分别进行活化扩培得到相应的发酵种子液；
(2)称取豆渣和豆粕，搅拌均匀制成固态发酵培养基；
(3)将步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵种子液接入步骤(2)中制成的固态发酵培养基，加入次粉，根据含水量加入水，搅拌均匀，进行一期好氧发酵，得到好氧发酵的发酵培养基；
(4)将步骤(1)得到的酿酒酵母发酵种子液、植物乳杆菌发酵种子液、鼠李糖乳杆菌发酵种子液、蛋白酶、无机矿物质盐接入步骤(3)中得到的好氧发酵的发酵培养基，搅拌均匀，密封进行二期厌氧发酵，发酵结束后获得高效螯合型酵素肽。
2.根据权利要求1所述的一种高效螯合型酵素肽的生产方法，其特征在于，步骤(2)中所述固态发酵培养基中豆渣占总质量的25％～70％，豆粕占总质量的30％～75％。
3.根据权利要求1所述的一种高效螯合型酵素肽的生产方法，其特征在于，步骤(3)中所述枯草芽孢杆菌接种量为步骤(2)中固体发酵培养基质量的1％～15％；所述次粉添加量为步骤(2)中固体发酵培养基质量的5％～30％。
4.根据权利要求1所述的一种高效螯合型酵素肽的生产方法，其特征在于，步骤(3)中所述含水量为25％～65％；所述一期好氧发酵温度为20～40℃，好氧发酵时间为3～48h。
5.根据权利要求1所述的一种高效螯合型酵素肽的生产方法，其特征在于，步骤(4)中所述酿酒酵母、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌种子液接种量均为步骤(2)中固体发酵培养基质量的1％～10％。
6.根据权利要求1所述的一种高效螯合型酵素肽的生产方法，其特征在于，步骤(4)中所述蛋白酶为酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶；所述酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶总添加量为步骤(2)中固体发酵培养基质量的0.01％～2％，两种酶的添加比例为1:1，酶活力均为6万u/g。
7.根据权利要求1所述的一种高效螯合型酵素肽的生产方法，其特征在于，步骤(4)中所述无机矿物质盐为CaCO3、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O；所述CaCO3添加量为步骤(2)中固体发酵培养基质量的1％～12％；所述FeSO4·7H2O添加量为步骤(2)中固体发酵培养基质量的0.01％～1.6％；所述CuSO4·5H2O添加量分别为步骤(2)中固体发酵培养基质量的0.001％～0.064％；所述MnSO4·H2O添加量分别为步骤(2)中固体发酵培养基质量的0.01％～1％；所述ZnSO4·7H2O添加量分别为步骤(2)中固体发酵培养基质量的0.01％～1.2％。
8.根据权利要求1～7任一所述方法生产的高效螯合型酵素肽用于家禽喂养提高家禽对矿物质元素的吸收以及产蛋率的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，具体操作为，所述高效螯合型酵素肽与家禽饲料混用，所述高效螯合型酵素肽的用量为家禽饲料重量的5％-10％。
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