CN102399845B - 基于尾气中co2浓度的维生素b12发酵生产控制工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于氧消耗速率的维生素B12发酵生产控制工艺。具体地，本发明提供了一种生产维生素B12的发酵方法，包括步骤：(a)培养维生素B12的生产菌株；(b)在发酵过程中检测发酵体系的尾气中二氧化碳的浓度，通过调控搅拌速度和/或进气，控制尾气中二氧化碳的浓度，从而维持高水平的维生素B12的产物合成速率；和(c)从发酵液中分离纯化出维生素B12。本发明方法可明显提高维生素B12产率，降低底物消耗，同时降低单位能耗，可大幅降低生产成本，具有工艺控制简单、可操作性强、节约能源等特点。

Description

基于尾气中CO2浓度的维生素B12发酵生产控制工艺

技术领域

本发明涉及发酵领域，更具体地涉及一种基于尾气中CO₂浓度的维生素B12发酵生产控制工艺。

背景技术

维生素B12(VB₁₂)是一种生物催化活性物质，是哺乳动物不可缺少的维生素。

维生素B₁₂在临床上主要用于治疗恶性贫血，亦与叶酸合用于治疗各种巨幼细胞贫血、抗叶酸药引起的贫血及脂肪泻等；其也用于治疗神经系统疾病如神经炎、神经萎缩等；还用于治疗肝脏疾病如肝炎、肝硬化等^[1]。另外，VB₁₂还与其他维生素一起构成复合维生素产品，作为OTC药物、保健食品广泛销售。VB₁₂除了用于医药方面，还大量应用于动物饲料、营养补充剂和食品加工，如维生素强化面粉、再制食品、婴儿食品等。

1961年Hodgkin利用X-射线技术首先鉴定出了VB₁₂的三维结构^[2]。1978年，Barker等系统地阐明了VB₁₂的生物学功能及作为辅酶参加体内的代谢反应^[3]。

VB₁₂又名钴胺素，是一类含咕啉环化合物；分子中三价钴位于类似卟啉的咕啉环平面的中心，与Co连接的基团X可以为脱氧腺苷(5′-deoxyadenosyl)、甲基(-CH3)、氰基(-CN)所取代，从而形成腺苷钴胺素、甲基钴胺素和氰钴胺素^[4]。维生素B₁₂的化学结构如图1所示。

微生物生物合成的VB₁₂为腺苷钴胺素、甲基钴胺素和羟钴胺素，但是由于它们的性状不太稳定，因此在工业提纯过程中需要加入氰化钠，使天然形式的VB₁₂转化为性质更为稳定的氰钴胺素^[5，6]。

1974年Eschenmoser完成了VB12的全化学合成^[7]，由于VB₁₂的化学结构式极其复杂，化学合成需要70多步反应且成本十分昂贵，因此开始寻找能够合成VB₁₂的微生物，利用深层液体发酵技术直接生产。

现在国内和国外商品化的维生素B₁₂几乎都是通过微生物发酵来生产的。能够合成维生素B₁₂的微生物根据其耗氧情况分为两类：(1)厌氧菌或间性厌氧菌如：费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)等，这些菌在合成VB₁₂时不需要氧。(2)好氧菌：比如脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrificans)，钴胺素根瘤菌(RhizobiumcobalaminogenumFERMBP-4429)等，这些菌在VB₁₂的生物合成过程中需要氧的参与。

以脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrificans)为生产菌株的好氧发酵工艺是目前工业化生产VB₁₂的主要工艺，培养基采用甜菜糖蜜或麦芽糖为主要碳源，玉米浆或酵母膏为氮源，补加无机盐、钴离子以及5，6-二甲基苯并咪唑(DMBI)。

在脱氮假单胞菌的育种方面，随着P.denitrificansVB₁₂的合成途径及相应基因被详细阐明，利用基因工程技术有目的地改造VB₁₂生产菌株成为研究的热点^[8，9，10]。

在脱氮假单胞菌的发酵生产工艺方面，Marwaha等报道了甜菜碱对发酵的促进作用，阐明了外源前体和产物促进剂对菌体生长和VB₁₂合成的影响^[11]。李昆太等对Zn²⁺、Co²⁺和DMBI在VB₁₂发酵中的作用进行了研究，并通过补料工艺的改进提高了发酵生产单位^[12-14]。由于该菌好氧工艺条件下的发酵单位是P.freudenreichii厌氧工艺的三倍，所以被国内外众多厂家所应用。

供氧对微生物的生长和产物形成有着重要的影响。对于耗氧微生物发酵过程中，必须供给适量的无菌空气，菌体才能繁殖和积累所需代谢产物。不同菌种及不同发酵阶段的菌体的需氧量是不同的，发酵液的供氧能力的大小直接影响微生物的酶的活性、代谢途径及产物产量。因此研究供氧大小对发酵的影响及控制对提高生产效率，改善产品质量等都有重要意义。一般的耗氧发酵过程均控制较高的供氧以避免氧限制的发生，在这种情况下可以以溶解氧浓度(DissolvedOxygen，简称DO)来表征供氧水平，但对于某些特殊的高耗氧菌种来说，溶氧可能不能成为有效的控制指标，这就需要寻找另外的能有效表征供氧水平的参数。此外，现有技术中尚没有通过调控二氧化碳来提高维生素B12产量的报道。

目前，维生素B12需求量较大，因此优化生产工艺、提高维生素B12的生产水平成为当务之急。本领域迫切需要开发高效的生产维生素B12的方法，不仅要提高维生素B12的产量，而且尽可能的节约能耗、降低成本，提高生产效率，以满足市场的需求。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效的生产维生素B12的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种生产维生素B12的发酵方法，它包括步骤：

(a)在适合发酵的条件下，培养维生素B12的生产菌株；

(b)在发酵过程中检测发酵体系的尾气中二氧化碳的浓度，通过调控搅拌速度、罐压和/或进气，使得尾气中二氧化碳的浓度处于5-10.5％(v/v)范围内，从而维持高水平的维生素B12的产物合成速率，并产生维生素B12；和

(c)从发酵液中分离纯化出维生素B12。

在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的调控是间歇式调控、或连续调控。

在另一优选例中，当尾气中二氧化碳浓度低于5％(v/v)时，提高搅拌速度/或增加二氧化碳气体的进气量；当尾气中二氧化碳浓度大于10.5％(v/v)时，降低搅拌速度/或增加空气的进气量。

在另一优选例中，在步骤(b)中，通过调控使得发酵体系的尾气中二氧化碳的浓度处于6-10％(v/v)范围内，更佳地处于7-9.5％(v/v)范围内。

在另一优选例中，在步骤(b)中，根据以下公式计算尾气中的二氧化碳浓度并进行调控：

Eco₂＝RQ×F^-0.6358×R^0.2250×P^-0.0716×V×22.57+0.03

式中，ECO₂为尾气中二氧化碳体积浓度，％；RQ为呼吸熵，无量纲；F为进气流量，m³/h；R为搅拌转速，rpm；P为罐压力，MP；V为发酵液体积，m³。

在另一优选例中，在步骤(b)中还包括控制发酵体系的氧消耗速率，使得氧消耗速率为12-25mmol·L^-1·h^-1。

在另一优选例中，所述的氧消耗速率按以下公式计算：

式中，F_in为进气流量L/min；V发酵液体积L；C_惰in\CO_2in\CCO_2in：分别为进气中惰性气体、氧气及二氧化碳的质量分率；CO_2out\CCO_2out：分别为排气中氧及二氧化碳的质量分率；

$f=\frac{273}{273+t_{\mathrm{in}}}\·P_{\mathrm{in}}\·\frac{1}{1+h}\×{10}^{-5}$

式中，P_in是进气的绝对压强Pa；t_in是进气的温度℃；h是进气的相对湿度％。

在另一优选例中，所述的高水平的维生素B12的产物合成速率是≥2.0mg·L^-1·h^-1。

在另一优选例中，所述的发酵体系的体积为5L至200立方米，较佳地为50L至150立方米。

在另一优选例中，所述的工程菌是费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrificans)或钴胺素根瘤菌。

在另一优选例中，优选的工程菌是脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrificans)。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：在维生素B12的生产菌株发酵产生维生素B12的期间，控制发酵体系的氧消耗速率，使得氧消耗速率小于或等于25mmol·L^-1·h^-1(较佳地，16-25mmol·L^-1·h^-1，更佳地18-20mmol·L^-1·h^-1范围)。

在另一优选例中，还包括以下步骤：

在发酵过程前期维持发酵体系的高水平的氧消耗速率，从而促进菌体生长和维生素B12合成的启动，其中所述的发酵过程前期是指从发酵开始起至菌株进入生长稳定期；以及

在发酵过程的中后期降低并维持发酵体系的低水平的氧消耗速度，从而维持高水平的维生素B12的产物合成速率，从而产生维生素B12，其中所述的发酵过程中后期是指从发酵过程前期结束起至发酵结束。

在另一优选例中，一旦菌体的生长进入生长稳定期，就可视为发酵过程前期结束。

在另一优选例中，在步骤(b)中，氧消耗速度的降低是间歇式降低、连续下降或逐步降低。

在另一优选例中，在步骤(a)中高水平的氧消耗速率是控制氧消耗速率为35-45mmol·L^-1·h^-1。

在另一优选例中，在步骤(b)中低水平的氧消耗速率是控制氧消耗速率为12-25mmol·L^-1·h^-1，更佳地15-20mmol·L^-1·h^-1范围。

在另一优选例中，所述的高水平的维生素B12的产物合成速率是≥2.0mg·L^-1·h^-1，通常在2.0-5.0mg·L^-1·h^-1范围，更佳地为在3.0-4.0mg·L^-1·h^-1范围。

在另一优选例中，所述方法还包括：通过控制检测发酵体系的尾气计算出所述的氧消耗速率，从而调节供氧实现所需的氧消耗速率。

在另一优选例中，所述的方法还包括：在发酵过程的中后期，降低发酵体系中的搅拌速度。

在另一优选例中，所述方法还包括：控制以下参数：罐温32±0.5℃，和/或罐压0.05～0.06Mpa。

在另一优选例中，所述方法还包括：在培养基中添加可溶性无机钾盐(包括氯化钾、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙酸钾、硫酸钾)，这些无机钾盐被用作发酵生产维生素B12的促进剂。

在本发明的第二方面，提供了一种维生素B12发酵生产方法，该方法包括：在发酵过程中，当生产维生素B12的工程菌菌体生长进入生长稳定期时或之后(通常为从发酵开始的40-72小时后)，通过调控搅拌速度和/或进气，控制发酵体系的尾气中二氧化碳的浓度，使得尾气中二氧化碳的浓度处于5-10.5％(v/v)范围内，从而维持维生素B12的生产速率大于或等于2.0mg·L^-1·h^-1。

在另一优选例中，所述方法还包括：当生产维生素B12的工程菌菌体生长进入生长稳定期时或之后(通常为从发酵开始的40-72小时后)，控制发酵体系的氧消耗速率，使得氧消耗速率小于或等于25mmol·L^-1·h^-1(较佳地，16-25mmol·L^-1·h^-1，更佳地18-20mmol·L^-1·h^-1范围)。

在另一优选例中，所述的工程菌是费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrificans)或钴胺素根瘤菌。

在另一优选例中，优选的工程菌是脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrificans)。

在另一优选例中，所述方法还包括：在培养基中添加可溶性无机钾盐(包括氯化钾、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙酸钾、硫酸钾)，这些无机钾盐被用作发酵生产维生素B12的促进剂。

在本发明的第三方面，提供了一种提高维生素B12生产速率和/或降低糖消耗的方法，所述方法包括步骤：控制发酵体系的尾气中二氧化碳的浓度，使得尾气中二氧化碳的浓度处于5-10.5％(v/v)范围内。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：在维生素B12的生产菌株发酵产生维生素B12的期间，控制发酵体系的氧消耗速率，使得氧消耗速率小于或等于25mmol·L^-1·h^-1(较佳地，16-25mmol·L^-1·h^-1，更佳地18-20mmol·L^-1·h^-1范围)。

在另一优选例中，在所述的受控的氧消耗速率和尾气二氧化碳浓度下，所述的维生素B12生产菌株的维生素B12的生产速率大于或等于2.0mg·L^-1·h^-1，通常在2.0-5.0mg·L^-1·h^-1范围，更佳地为在3.0-4.0mg·L^-1·h^-1范围。

应理解，上述的以及本文下文中所详述的任何二个或多个技术特征都可相互组合，以构成新的技术方案。在此申请中，为了节省篇幅，不再一一列出。

附图说明

图1显示了维生素B12结构式。

图2显示了50L发酵罐中的发酵过程曲线图。

图3显示了不同CO₂浓度对发酵过程中菌体生长、pH值、糖耗和产物合成的影响。图中，各二氧化碳的浓度分别为：A：0.03±0.001％；B：3.32±0.12％；C：8.86±0.24％；D：13.84±0.27％。

图4显示了利用优化的阶段供氧控制策略在工业规模发酵生产维生素B12过程中各参数的变化。

图4显示了不同CO₂浓度对前体氨基乙酰丙酸和丙酮酸羧化酶的影响。图中，各二氧化碳的浓度分别为：A：0.03±0.001％；B：3.32±0.12％；C：8.86±0.24％；D：13.84±0.27％。

图5显示了不同CO₂浓度下的脱氮假单胞菌菌体形态。图中，各二氧化碳的浓度分别为：A：0.03±0.001％(对照)；B：3.32±0.12％；C：8.86±0.24％；D：13.84±0.27％。

图6显示了50L发酵生产中溶解CO₂对VB₁₂发酵的影响；A：RPM和通气(Aeration)；B：OUR；C：尾气中CO₂浓度(ECO₂)；D：VB₁₂。其中包括了优化的控制策略(optimal)，发酵对照试验(control)。

图7显示了120m³反应器中转速和流量的交互作用对供氧和尾气中二氧化碳浓度的变化关系，其中OUR等高线为mol/m³/h，尾碳浓度等高线为％。

图8显示了发酵过程中二氧化碳浓度控制对发酵的影响。其中包括常规的未优化工艺(CK)和尾气二氧化碳浓度优化控制工艺。

具体实施方式

本发明人通过深入而广泛的研究，意外地发现：在发酵过程中通过调控搅拌速度、罐压和/或进气，控制尾气中二氧化碳的浓度处于5-10.5％(v/v)范围内，可以提高和维持高水平的维生素B12的产物合成速率，从而大幅提高维生素B12的产量，同时降低底物消耗和单位能耗。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“发酵初期”、“发酵过程前期”和“发酵前期”可互换使用，都指从发酵开始起至菌株进入生长稳定期为止的一段发酵期间。通常，菌体进入生长稳定期的时间在36-72小时之间，故所述的发酵过程前期是从发酵开始起至菌体进入生长稳定期为止，换言之，如果进入生长稳定期为40小时，则所述的发酵过程前期为自发酵起的0-40小时；如果如果进入生长稳定期为40小时，则所述的发酵过程前期为自发酵起的0-72小时。应理解，受发酵条件、生产菌株等因素的影响，菌体进入生长稳定期的时间会略有不同。

如本文所用，术语“稳定期”和“生长稳定期”可互换使用。在发酵过程前期，随着菌体的生长，其OD值会上升(处于上升期)，当进入生长稳定期时，其OD值基本保持不变(处于平台期)。一旦进入生长稳定期，就可视为发酵过程前期结束。

确定进入生长稳定期的方法是本领域中已知的。一种常规的方法是测定发酵液的OD值。例如，每2-4小时测定一次OD值(如每3小时测定一次)，如果连续三个时间点OD值不变或基本不变(例如，各OD值≤(100％±5％)×OD平均值)，则可视为菌体生长进入生长稳定期。

如本文所用，术语“发酵过程中后期”是指从发酵过程前期结束起至发酵结束的一段时间。换言之，发酵过程中后期是从菌体生长进入生长稳定期开始至发酵结束。

就维生素B12的发酵而言，整个发酵过程通常为约6-8天。因菌体进入生长稳定期的时间在36-72小时之间，故发酵过程前期为0至36-72小时，之后可视为发酵过程中后期。

尾气中二氧化碳浓度的控制

本发明人首次提出了以尾气中二氧化碳的浓度为控制变量，间接控制二氧化碳溶解浓度，进行发酵控制的策略。

具体地，在发酵过程中，根据发酵体系的二氧化碳浓度情况，通过调控搅拌速度、罐压和/或进气等手段，控制尾气中二氧化碳的浓度处于5-10.5％(v/v)范围内，可以提高和维持高水平的维生素B12的产物合成速率，从而大幅提高维生素B12的产量，同时降低底物消耗和单位能耗。

应理解，直接控制发酵液中的CO₂溶解浓度也是可行的。因为发酵液中的CO₂溶解浓度与尾气中二氧化碳浓度存在对应关系，且CO₂溶解浓度的测量较复杂，因此可以间接采用尾气中二氧化碳浓度作为指标进行控制。

在本发明中，宜通过调控手段，使得尾气中二氧化碳的浓度处于5-10.5％(v/v)，较佳地6-10％(v/v)，更佳地7-9.5％(v/v)，从而提高和/或维持维生素B12的生产速率大于或等于2.0mg·L^-1·h^-1(较佳地大于或等于2.5mg·L^-1·h^-1，更佳地大于或等于3.0mg·L^-1·h^-1)。

在本发明中，适用的控制尾气中二氧化碳手段包括：调控搅拌速度、罐压和/或进气等。

以搅拌速度为例，通常增加搅拌速度有助于提高尾气中二氧化碳浓度，降低搅拌速度有助于降低尾气中二氧化碳浓度。

以罐压为例，通常增加罐压有助于提高尾气中二氧化碳浓度，减小罐压有助于降低尾气中二氧化碳浓度。

以进气为例，通常增加CO₂的进气有助于提高尾气中二氧化碳浓度，减小CO₂的进气有助于降低尾气中二氧化碳浓度；增加空气或O₂的进气量或进气速度有助于降低尾气中二氧化碳浓度，减少空气或O₂的进气量或进气速度有助于提高尾气中二氧化碳浓度。

其他优化控制

本发明方法还可与其他的优化手段联合使用，从而进一步提高维生素B12的产率和产量。这些优化手段包括添加甜菜碱、Zn²⁺、Co²⁺和DMBI等。

一种优选的优化手段是以氧消耗速率(OUR)为控制参数，采用了分阶段的供氧控制策略，发酵过程前期维持高供氧以促进菌体生长和VB12合成的启动，中后期间歇式降低、连续下降或逐步降低供氧以维持高的产物合成速率，该控制工艺也可明显提高维生素B12产率，同时也可降低单位能耗，降低生产成本，并具有工艺控制简单、可操作性强、节约能源等特点。

本发明人在中国专利申请CN200810204263.9中(该专利申请被全部引入本文，作为参考)，首次提出了以氧消耗速率OUR为控制变量进行分阶段供氧的控制策略。试验表明，在发酵过程的前期维持较高的供氧以促进菌体的快速增长和VB12合成的快速启动，发酵过程的中后期通过降低转速来降低供氧以控制菌体的呼吸代谢，可以维持较高的比生产速率和底物转化率。

具体地，本发明还提供了一种生产维生素B12的发酵方法，除了调控尾气中的二氧化碳之外，它还包括步骤：

(a)在发酵过程前期维持发酵体系的高水平的氧消耗速率，从而促进菌体生长和维生素B12合成的启动，其中所述的发酵过程前期是指从发酵开始起至菌株进入生长稳定期；

(b)在发酵过程的中后期降低并维持发酵体系的低水平的氧消耗速度，从而维持高水平的维生素B12的产物合成速率，从而产生维生素B12，其中所述的发酵过程中后期是指从发酵过程前期结束起至发酵结束。

在本发明中，就氧消耗速率的控制而言，应在发酵中后期的全部或部分时间内(通常至少50％以上，较佳地60％以上，较佳地70％以上，较佳地80％以上，最佳地90％以上的中后期时间内)，控制氧消耗速率小于或等于25mmol·L^-1·h^-1(较佳地，12-25mmol·L^-1·h^-1，更佳地15-20mmol·L^-1·h^-1范围)。

在本发明中，虽然对于发酵前期的氧消耗速率可以不加控制，然而为了促进菌体生长和维生素B12合成的启动，宜提供高水平的氧消耗速率，即控制氧消耗速率为35-50mmol·L^-1·h^-1，较佳地为35-45mmol·L^-1·h^-1。

生产菌株

适用于本发明方法的表达维生素B12的菌株没有特别限制，可以是现有的生产维生素B12的工程菌，也可用常规方法改造或诱变的工程菌。代表性的工程菌包括(但并不限于)：厌氧菌或间性厌氧菌如：费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)；以及好氧的脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrificans)，钴胺素根瘤菌^[6](RhizobiumcobalaminogenumFERMBP-4429)等。一种优选的工程菌是脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrificans)。

在获得了表达维生素B12的工程菌后，便可在常规的适合表达维生素B12的条件下培养，以表达维生素B12。

培养基

用于本发明的培养基没有特别限制，可以是各种常规的培养基。例如对于脱氮假单胞菌而已，可以选用(但并不限于)：培养基1(g/L)：蔗糖80，玉米浆45，甜菜碱14，(NH₄)₂SO₄1，CoCl₂·6H₂O0.075，MgO0.5，DMBI0.05，ZnSO₄·7H₂O0.08，CaCO₃1，pH7.2-7.4；培养基2(g/L)：葡萄糖55g，玉米浆35g(干物)，硫酸铵5g，磷酸二氢钠8g，氯化钻0.01g，调pH6.8-7.0；或低盐发酵培养基等。

当然，为了用于有利于维生素B12的发酵，可以在培养基中添加一定浓度的钾盐，以便使得使用时钾离子的浓度处于合适的范围。当然，也可使用一般的培养基，然后在发酵过程中添加或补加钾离子源，从而将发酵体系中的氧消耗速率控制在合适的范围。

另外，还在培养基中添加一定浓度的葡萄糖和/或磷酸氢二铵，以便使得使用时葡萄糖和/或磷酸氢二铵的浓度处于合适的范围。当然，也可使用一般的培养基，然后在发酵过程中补加或添加葡萄糖和/或磷酸氢二铵，从而将发酵体系中的葡萄糖和/或磷酸氢二铵浓度控制在合适的范围。

分离纯化

在本发明中，对于发酵生产的维生素B12，可以用常规方法进行纯化，随后制成药剂。一种优选方法是对发酵样品用常规方法酸化后进行离心、过滤等方式去除菌体，获得含维生素B12的发酵清液。然后，对发酵清液通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行离子层析纯化。

在本发明的一个实施例中，在50L规模发酵罐上采用优化后的二氧化碳控制策略，其180小时VB12的浓度为235.4mg·L^-1，比对照批次大幅提高(至少提高10％)。在120吨的发酵罐也获得了类似的结果。

本发明的主要优点在于：

(a)通过简单有效的控制方法(控制氧消耗速率)，可以极其有效地提高维生素B12的产量。

(b)本发明方法可有效降低单位能耗，极大的降低了生产成本，具有工艺控制简单、可操作性强、节约能源等特点，有利于进一步工业化放大及推广应用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非特别说明，所有的百分比和份数按重量计算。

实施例1

一、材料与方法

1.1菌种与培养基

菌种：脱氮假单胞杆菌(P.denitrificans)(购自石家庄华荣制药集团)。

种子培养基(g/L)：蔗糖40，玉米浆20，甜菜碱5，(NH₄)₂SO₄1，(NH₄)₂HPO₄2，MnSO₄·H₂O0.8，CoCl₂·6H₂O0.02，MgO0.3，DMBI0.01，ZnSO₄·7H₂O0.01，pH7.2～7.4。

发酵培养基(g/L)：蔗糖80，玉米浆45，甜菜碱14，(NH₄)₂SO₄1，KH₂PO₄0.75，CoCl₂·6H₂O0.075，MgO0.5，DMBI0.05，ZnSO₄·7H₂O0.08，CaCO₃1，pH7.2～7.4。

补料培养基1(g/L)：葡萄糖300，DMBI0.15，CoCl₂·6H₂O0.15。

补料培养基2(g/L)：甜菜碱30，DMBI0.4，CoCl₂·6H₂O0.3。

合成发酵培养基(g/L)：(NH₄)₂HPO₄10.0，KCl0.2，MgSO₄·7H₂O1.4，(NH₄)₂SO₄5.0，5，6-二甲基苯并咪唑(5，6-dimethylbenzimidazole)0.0065，MnSO₄·H₂O0.002，ZnSO₄·7H₂O0.002，CoCl₂·6H₂O0.0025，FeSO₄·7H₂O0.0003，Na₂MO₄O.0002。

1.2试剂和仪器

试剂：糖蜜(内蒙古兰田糖业有限公司)，甜菜碱(华荣制药有限公司)，玉米浆(河北兴柏糖业有限公司)，5，6-二甲基苯并咪唑(河北科硕化工有限公司)，CoCl₂·6H₂O(山东临县汇丰钴厂)，其它试剂均为国产分析纯。

仪器：722型紫外一可见分光光度计；HPLC1100(Agilent公司)；尾气质谱分析仪：美国Extrel过程质谱MAX300-LG；50L发酵罐：上海国强生化装备有限责任公司；发酵控制系统：国佳生化工程中心NCBbiostar发酵控制系统。

1.3实验方法

1.3.1菌浓测定：

将菌液适当稀释后于波长700nm处测定吸光值，以去离子水为对照。菌体光密度值(OD₇₀₀)＝OD读数×稀释倍数。

1.3.2还原糖和总糖测定：采用改进了的DNS法和葡萄糖试剂盒^[16]。

1.3.3铵离子测定：利用苯酚-次氯酸盐反应测定^[17]。

1.3.4有机酸测定^[18]：

Agilent1100HPLC系统，色谱柱：AquaSep公司C8柱。流动相：0.05MKH₂PO₄(pH2.5)∶CH₃OH＝95∶5；流速：0.6mL/min。进样量：20μL。柱温：30℃。检测波长：210nm。

1.3.5氨基酸测定：

Agilent1100HPLC系统，色谱柱：ZorbaxEclipaseAAA，在线自动衍生，氨基酸用邻苯二甲醛(OPA)衍生，流动相A：40mMNaH₂PO₄，pH7.8；流动相B：CH₃CN∶CH₃OH∶H₂O(45∶45∶10，v/v/v)；流速2.0mL/min，紫外双波长检测：338nm和262nm。

1.3.65-氨基乙酰丙酸(δ-ALA)的测定：

取300μL细胞破碎的浸提液至试管中，试管预先装有400μL1.0mol/L的乙酸钠缓冲液(pH4.7)；加35μL乙酰丙酮，摇匀；置沸水浴中反应10min；冷却至室温，加入700μL改进的Ehrlich’s试剂到试管中，立刻振荡均匀进行显色；10min后，在分光光度计556nm处测定吸光值，根据吸光值和标准曲线，计算出发酵液中δ-ALA的含量^[19]。

1.3.7胆色素原(PBG)的测定：

PBG和Ehrlich’s试剂反应生成Ehrlich-PBG复合盐，该复合盐在555nm处有最大吸光值。取1mL细胞破碎的浸提液至试管中，加入1mLEhrlich’s试剂，充分振荡进行显色，15min后，在分光光度计上555nm处测定吸光值，然后根据其分子消光系数即可计算出PBG的含量。

1.3.8发酵过程尾气分析：

采用Extrel过程质谱MAX300-LG对发酵过程中的进气和尾气进行实时在线采集分析，该质谱仪能够精确测定发酵过程尾气中的氩气、氮气、二氧化碳和氧气等分子量300以内的可挥发性气体。使用之前用标准气体对仪器的响应度进行标定。

氧消耗速率(OUR)和二氧化碳生成速率(CER)测定：

OUR和CER的计算通过对发酵尾气的分析数据计算得到。以进气和尾气中惰性气体N₂维持恒定建立平衡方程，求得OUR和CER的计算公式如下：

$f=\frac{273}{273+t_{\mathrm{in}}}\·P_{\mathrm{in}}\·\frac{1}{1+h}\×{10}^{-5}---(1-3)$

式中，F_in：进气流量L/min；V：发酵液体积L；C_惰in\CO_2in\CCO_2in：分别为进气中惰性气体、氧气及二氧化碳的质量分率；CO_2out\CCO_2out：分别为排气中氧气和二氧化碳的质量分率；P_in：进气的绝对压强Pa；t_in：进气的温度℃；h：进气的相对湿度(％)。

比耗氧速率比二氧化碳释放率

$Q_{O_2}=\frac{\mathrm{OUR}}{X}---(1-4)$

$Q_{{\mathrm{CO}}_2}=\frac{\mathrm{CER}}{X}---(1-5)$

式中，X-菌体干重(g/L)。

1.3.9VB₁₂测定：

样品制备：取10mL发酵液，加入8％亚硝酸钠溶液和冰醋酸各2.5mL，摇匀，于95-100℃水浴30min；水浴后冷却至室温，加去离子水定容至50mL，过滤；所得滤液用0.22μm微孔滤膜过滤后进行液相色谱分析；高效液相色谱条件：流动相为(pH3.5)CH₃COONa水溶液：CH₃CN(30∶70，v/v)；色谱柱为BackmanC18柱；检测波长为361nm；进样量是20μL；流速为1.0mL/min。

1.3.1050L发酵罐发酵工艺

采用二级发酵：用10mL无菌水洗涤斜面，将悬液接种2mL到母瓶培养基中，装量100mL/500mL，32℃，转速260rpm，培养20～22h。将培养好的种子液1250mL接种到装有25L培养基的发酵罐中，发酵罐为二级平叶搅拌浆，32℃，通气量1vvm，发酵过程中根据菌体生长和残糖情况来连续补加葡萄糖和甜菜碱料液培养基。发酵过程中的pH值、溶氧、尾气数据等全部使用Biostar软件进行采集。

1.3.11120m³发酵罐生产工艺

采用三级发酵：将5支培养好的斜面用无菌水洗涤后得到的菌悬液接种到装有50升培养基的100升种子罐中，32℃，300rpm，培养45-50个h；当菌浓长到OD₇₀₀为15时，移种到9m³的二级种子罐，装液量5m³，32℃，200rpm，培养30～35h；待OD₇₀₀为15时，移种到120m³的生产罐中，装料量为80m³，发酵过程中温度控制在32℃，转速80rpm，pH值、溶氧、尾气实施在线采集和分析。

二、实验设计及结果分析

1.发酵过程中的CO₂对发酵影响实验设计

在50L反应器中126小时菌体生长已处于稳定期(图2)，发酵过程进入VB₁₂快速合成阶段。为了考察CO₂浓度对VB₁₂合成的影响，同时保证菌体有一样的初始生理状态，将发酵培养液无菌取出同时分装到在4个5L的发酵罐中(装液量2.5L)，通过尾气质谱仪对各个反应器的进气和尾气分别进行采集分析。通过转速的调整改变各个发酵罐的供氧水平，以保证他们有一样的OUR和CER后，开始通入不同比例的纯CO₂气体与空气的混合气体，维持4个5L的发酵罐不同的进气CO₂浓度，分别为A：0.03±0.001％、B：3.32±0.12％、C：8.86±0.24％和D：13.84±0.27％。

2.不同CO₂浓度下的发酵过程参数变化

实验结果表明，CO₂对脱氮假单胞菌的生长也有很大的影响(图3A)，3.32％的CO₂添加比例对菌体的生长没有影响，菌体量变化与对照基本一样，但随着CO₂添加比例的增加菌体生长逐渐受到抑制，尤其是当添加比例为13.84％时，培养48小时，菌体量明显下降，比对照低了近20％。导致这种结果的可能原因是：当细胞膜的脂质相中CO₂浓度达到一临界值时，膜的流动性及表面电荷密度发生变化，这将导致膜对许多基质的运输受阻，影响了细胞膜的运输效率，使细胞生长受抑制。

当不同初始浓度的CO₂通入发酵罐后，由于CO₂在发酵液中解离生成HCO3-离子，发酵液的pH随着CO₂浓度的增加而降低(图3B)，13.84％的CO₂使得培养基中的pH值迅速降了0.21，CO₂的溶解度明显增加。从整个发酵过程来看，3.32％和8.86％的进气CO₂浓度情况下的pH值变化与对照几乎一致，而13.84％的CO₂添加组pH值出现明显下降的趋势，可能是因为菌体的生理代谢途径过程发生了变化，过多的产生酸性代谢物造成的。

CO₂浓度对糖耗也有很大的影响，从图3C中可以看出发酵培养到24小时，不添加CO₂的对照组残糖浓度由36.0g/L降到6.1g/L，单位菌体糖消耗速率为39.06mg/g/h，然而，糖耗速率随着CO₂浓度的增加而降低，3.32％的CO₂在24h残糖浓度为8.0g/L，糖消耗速率为36.46mg/g/h，是对照的93％；8.86％的CO₂添加组糖耗速率为29.95mg/g/h，仅是对照组的77％；13.84％的CO₂添加组糖的消耗明显受到抑制，仅有18.23mg/g/h，是对照的47％，可能是因为较高的CO₂分压，使得培养液中碳酸氢根离子过高，影响了胞内的代谢平衡，进而改变了脱氮假单胞菌的生理代谢状态。

图3D显示了不同CO₂浓度对VB₁₂产量的影响。从产物VB12的合成变化情况可以看出，当CO₂的添加比例为8.86％时，培养48hVB12产量为164.6mg/L，明显高于对照情况下的129.2mg/L，产率为1.75mg/L/h，比对照情况下的1.02mg/L/h提高了73％。3.32％的CO₂添加组对VB₁₂的合成速率也有明显的促进作用，合成速率为对照的1.51倍，培养48h时的发酵单位比对照高出了21.8％。然而，当CO₂浓度为13.84％时，不管是菌体生长、糖消耗，还是产物合成速率都受到了显著的抑制，VB₁₂的生成量只有104.5mg/L比对照低了近20％，合成速率仅是对照的50％。

因此，当CO₂浓度处于5-10.5％(较佳地6-10％)时，对于VB₁₂的合成有利。

3.不同CO₂浓度对胞内前体物质和丙酮酸羧化酶活性的影响

为了进一步分析CO₂浓度对菌体生理代谢的影响，我们对胞内的VB₁₂合成关键前体物质5-氨基乙酰丙酸(δ-ALA)和丙酮酸羧化酶活性进行了测定，结果见图4。从图4A中胞内δ-ALA的含量变化趋势来看，适当浓度的CO₂的加入对VB₁₂合成的前体代谢物δ-ALA的生成是非常有利的，8.5％和4.3％的CO₂添加比例使得发酵过程中δ-ALA的合成速率明显增加，在培养32h后，8.5％的CO₂添加组中，δ-ALA的最高含量达到了26.4±1.2mg/gDCW，明显高于对照组的18.6mg/gDCW，δ-ALA的合成量的增加促进了VB₁₂的合成。

由第一章VB₁₂合成途径可知，前体物质δ-ALA合成的两条主要途径是C4和C5途径，这两条途径分别是以TCA循环中的谷氨酸和琥珀酰辅酶A，以及甘氨酸为底物，在发酵的快速合成期往往伴随着这些物质的大量合成，导致中心碳代谢TCA环底物琥珀酰辅酶A和α-酮戊二酸的“溢流”，为维持再生底物草酰乙酸的量，必须对TCA环进行回补。因此我们分析了参与CO₂的固定的反应的丙酮酸羧化酶在培养过程中的变化，结果如图4B。从丙酮酸羧化酶的活力变化可以看出，CO₂浓度对该酶活性有很大影响，8.86％的CO₂添加组的最大比酶活为37.2U/mg，比对照的27.5U/mg高出了35％，3.32％的CO₂添加组该酶的整体比酶活也明显高于对照组。而当CO₂浓度增加到13.84％时该酶的比活力明显降低，可见CO₂不仅影响了细胞的呼吸速率，同时也改变了代谢途径通量。

4CO₂浓度对中间代谢物的影响

为了更深入的了解CO₂浓度对菌体代谢的影响，对发酵过程中胞外的代谢产物有机酸和氨基酸的含量进行了测定分析，结果见表1和表2。

表1不同二氧化碳浓度对发酵过程中有机酸合成的影响(mg/L)

对应的CO₂溶解度为A：0.03±0.001％、B：3.32±0.12％、C：8.86±0.24％和D：13.84±0.27％

从测得的结果中可以看出，随着进气中CO₂浓度从0.03±0.001％升高到8.86±0.24％，α-酮戊二酸浓度在培养48h的生成量最高为409mg/L，明显高于对照的235.9mg/L。而丙酮酸、乙酸、乳酸和柠檬酸并没有太大的变化。然而，当CO₂溶解度增加到13.84±0.27％时，α-酮戊二酸、琥珀酸的合成受到了抑制，从而影响了谷氨酸的合成，同时丙酮酸和乙酸开始大量合成，这有可能是造成该组pH下降的原因。

从表2中氨基酸的变化来看，谷氨酸、甘氨酸和苏氨酸的浓度受溶解CO₂的影响很大，当CO₂进气浓度增加到8.86±0.24％时，谷氨酸浓度从381.6mg/L增加到了1430.2mg/L，甘氨酸的浓度由371mg/L增加到了2716mg/L，这两种氨基酸的合成速率明显高于3.32±0.12％添加组，更高于对照组；在3.32±0.12％的CO₂添加组中苏氨酸由162mg/L增加到了462.4mg/L，在各组中合成速率最高。当CO₂浓度为13.84±0.27％时，谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的合成速率明显低于其他各组的速率。由于谷氨酸和甘氨酸是合成维生素B₁₂的主要前体物质，其合成速率的增加明显促进了维生素B₁₂的合成。

表2不同二氧化碳浓度对发酵过程中氨基酸合成的影响(mg/L)

CO₂浓度如下：A：0.03±0.001％、B：3.32±0.12％、C：8.86±0.24％和D：13.84±0.27％

5CO₂浓度对菌体形态的影响

CO₂浓度的高低对菌体形态的有一定影响，尤其是对丝状真菌最为明显，丝状真菌的菌丝形态变化比较明显，而且其变化与产物的合成息息相关。高浓度的CO₂不利于合成阶段最佳菌体形态的形成或维持的时间较短，不利于产物的合成。

CO₂浓度对脱氮假单胞菌的形态也有很大的影响，从过程中的菌体形态可以看出(图5)，3.32±0.12％和8.86±0.24的CO₂浓度下的菌体形态与对照组菌体形态基本一致，染色着色较深，胞质浓度均匀，活力较强；而菌体的长度大于对照组。但是在13.84±0.27％的CO₂添加组，36h的菌体明显变空，着色较浅，胞内有大量不着色区空泡，菌丝部分开始断裂，菌体活力明显下降，产物合成速率受到抑制。

通过CO₂的添加实验，证实了一定浓度的CO₂含量对VB₁₂的发酵产量的提高是非常有利的，8.86±0.24％的CO₂添加量不仅促进了产物的合成速率，同时降低了底物糖的消耗，使得转化率明显增加，胞内酶活测定结果也显示了3.32±0.12％和8.86±0.24％的CO₂浓度对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的提高是非常有利的，该酶活性的提高促进了TCA循环C4骨架物质的再生，从而增加了用于VB₁₂合成的前体谷氨酸和琥珀酰CoA的生成；但任何因素都有其不利的一面，过高的CO₂浓度能明显抑制菌体的生长和代谢产物的生成，使得细胞的活力明显下降。

因此在实际的生产过程中，可以通过适当降低通气比，提高转速、调节罐压等措施，在维持最佳比氧消耗速率的情况下，达到合适的CO₂溶解浓度，最大限度地提高VB₁₂发酵产率。因CO₂溶解浓度的测量较复杂，因此可以间接采用尾气中二氧化碳浓度作为指标进行控制。

650L发酵罐中二氧化碳的控制策略

在发酵过程中采取的优化控制策略为：在发酵过程中保持前期转速、流量与对照一致，在菌体生长进入稳定期时开始通过转速和通气量的协同调整(图6A)，维持较高的尾气CO₂浓度5.5-6.0％，并保证两个发酵过程中一样的氧消耗速率(OUR)的变化。在VB₁₂发酵过程中，OUR将随着供氧的改变而改变，它是微生物发酵过程中的生理特性指标，因此通过转速和流量来调节供氧，从而实现与对照罐相同的OUR(图6B)。

从VB₁₂的合成代谢(图6D)中可以看出，75h后，增加在CO₂浓度的优化发酵控制策略下，VB₁₂的产率高于对照，发酵180hVB₁₂发酵单位达到了235.4mg/L比对照批次终浓度213.1mg/L高出了10.1％。可见利用该控制策略对提高VB₁₂发酵产量是非常有效的。因此在生产更大规模的放大过程中，可以通过流量和转速的协同调整来控制发酵液中CO₂浓度，以促进VB₁₂的合成。

7生产放大过程中的二氧化碳控制策略

由于在B₁₂发酵过程是好氧发酵，发酵过程的供氧控制是根据不同的发酵阶段采取不同的供氧水平控制策略。脱氮假单胞菌对氧有极高的亲和力，因此在发酵过程中溶氧一直处于临界氧状态以下，随着供氧的变化，溶氧几乎为没有变化，因此过程中菌体的氧消耗速率与发酵液中的氧传递速率可以认为是相等的。生产过程中搅拌和通气条件对过程OTR的调控响应关系为(公式1)：

模拟假设条件：发酵过程中粘度的变化较小，认为是一个常数

OUR≈OTR＝m×F^α×R^β×P^γ(1)

M，α，β和γ分别为校正系数，流量、转速和罐压对氧传递速率的响应系数，OUR：氧消耗速率mol/m³/h，OTR氧传递速率mol/m³/h，F：进气流量m³/h，P：罐压力MP，R：搅拌转速rpm。

120m³发酵罐中转速、流量和罐压所对应的氧消耗速率过程参数，参见表3

表3发酵过程通气、搅拌转速、罐压与实际OUR及预测OUR的对应关系

利用表3中的实验数据对方程(1)进行线性回归分析，得到转速、流量和罐压对供氧的响应系数见表(4)：

表4120m³发酵罐中转速、流量和罐压对供氧的响应系数

因此得到120m³发酵罐VB12发酵过程中氧传递速率OTR及对应的OUR如公式2所示

OUR≈OTR＝1.0074×F^0.3642×R^0.2250×P^0.0716(2)

发酵过程中氧消耗速率和菌体的二氧化碳释放速率(CER)可以用呼吸商来表征(公式3)：

$\mathrm{RQ}=\frac{\mathrm{CER}}{\mathrm{OUR}}---\left(3\right)$

对二氧化碳浓度的效应关系(公式4)

$\mathrm{CER}=\frac{F}{V}\frac{(E_{\mathrm{CO}2}-0.03)}{22.4}---\left(4\right)$

由公式1、公式2和公式3可计算得到尾气中二氧化碳的浓度为：(公式5)

Eco₂＝RQ×F^-0.6358×R^0.2250×P^0.0716×V×22.57+0.03(5)

式中，V：发酵液体积m³，ECO₂尾气中二氧化碳浓度％(v/v)，RQ：呼吸熵，其他符号定义如上所述。

根据发酵过程中众多批次的考察和总结，总结了过程中呼吸熵的变化：

发酵0-50h处于菌体的生长期，RQ＝1.17±0.02；发酵50小时后，开始了VB₁₂的快速合成阶段，呼吸熵RQ维持在1.07±0.03。由公式2和公式5，得到了120m³发酵罐中不同转速和流量下OUR和尾气中CO₂浓度的等高线(见图7)。其中，由900＜F＜1100和60＜R＜70围成的区域是特别优选的区域。

一种优选的控制方式是：在生产发酵过程中，根据过程的供氧情况和尾碳的浓度，自动进行转速和流量的自动调节控制，将为尾气中的二氧化碳浓度调整在7.5＜Eco₂＜9.0％，在促进合成过程羧化途径的同时，有效避免过高溶解二氧化碳浓度对产物合成的抑制效应。

这类控制可以通过自动化控制或半自动化控制或人工控制方式实现。如采用自动控制，则在发酵过程中，自动采集搅拌速率、进气量、Eco₂等参数，送入参数分析调控器(微电脑)进行分析，然后基于分析结果输出控制信号，通过控制器控制发酵体系的转速、流量等参数，从而实现自动控制。

一种优选方式是：发酵过程中尾气参数经采集处理后，输入到参数分析调控器进行测量值与设定值的比较分析，并根据供氧和尾气中二氧化碳浓度的模型给出流量和转速的设定值，通过PI控制器对发酵罐的转速和流量进行自动调控。

经自动化调控工艺与正常生产工艺的发酵生产结果如下：

如图8所示，在120m³生产罐正常的发酵工艺控制下，在发酵过程中随着发酵过程的进行，菌体生物量的不断增加，尾碳浓度从1％快速上升到9％，大量的糖被消耗掉最终生成CO₂。正常工艺中往往通过流量的调整来控制发酵过程中的菌体的氧消耗速率，尾碳浓度继续上升，最高达到了12％以上。

从尾碳浓度优化控制条件下，在发酵开始阶段与正常工艺时的基本相同，在50h以后，通过转速和通气的匹配优化控制，发酵中后期主要以降低转速和提升通气来协同控制尾碳浓度在7.5％-9.0％的范围。

从两个罐批中VB₁₂合成速率可以看出，尾碳浓度的控制对VB₁₂合成速率提高的效果很明显。在75h之前，两个罐批的VB₁₂合成速率基本相当，此时两个罐批的尾碳浓度基本都在7.5％-9.0％的范围。75h-180h的数据可以看到，控制尾碳浓度的实验罐批尾碳浓度VB₁₂合成速率要明显高于正常罐批。这是由于正常罐批基尾碳浓度在不控制的条件下从9％逐渐上升到12.5％，过高的尾碳浓度对VB₁₂的合成产生了强烈的抑制作用，而工艺调整的罐批有解除了CO₂的抑制作用，从而实现了VB₁₂的高速合成。在180h-200h之间，两个罐批都出现了VB₁₂合成速率下降的现象，这主要是由于发酵后期部分菌体衰老死亡造成的。

由此可以看出，在120m³罐中不同的尾碳浓度对VB₁₂的合成有明显的控制作用，采用不同搅拌转速和通气流量匹配，自动或半自动地控制尾气中尾碳浓度维持在7.5％-9.0％对VB₁₂的生物合成最有利。

上述实验结果表明，通过以二氧化碳浓度为在线控制参数的发酵过程工艺控制策略，可以有效提高维生素B12的合成速率，提高维生素B12的测量。此外，二氧化碳浓度为在线控制参数的发酵过程工艺控制策略，有助于降低了糖耗速率，缩减了生产成本。

当二氧化碳浓度调控与其他优化手段(如OUR调控)等联用时，可以进一步提高维生素B12的合成速率和产量。

综上所述，应用优化的控制策略，不仅提高了VB12产率，而且有助于降低了生产成本和能耗。因此，该控制策略有着提高生产效益和节能减排的双方面意义，值得进一步工业化放大和推广应用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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Claims (8)

1.一种生产维生素B12的发酵方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)在适合发酵的条件下，培养维生素B12的生产菌株；该维生素B12的生产菌株是脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrificans)；

(b)在菌体生长进入稳定期时，检测发酵体系的尾气中二氧化碳的浓度，通过调控搅拌速度、罐压和/或进气，使得尾气中二氧化碳的浓度处于6-10％(v/v)范围内，从而维持高水平的维生素B12的产物合成速率，并产生维生素B12；所述的高水平的维生素B12的产物合成速率是≥2.0mg·L^-1·h^-1；和

(c)从发酵液中分离纯化出维生素B12。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述的调控是间歇式调控、或连续调控。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，通过调控使得发酵体系的尾气中二氧化碳的浓度处于7-9.5％(v/v)范围内。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，根据以下公式计算尾气中的二氧化碳浓度并进行调控：

Eco₂＝RQ×F^-0.6358×R^0.2250×P^-0.0716×V×22.57+0.03

式中，ECO₂为尾气中二氧化碳体积浓度，％；RQ为呼吸熵，无量纲；F为进气流量，m³/h；R为搅拌转速,rpm；P为罐压力，MP；V为发酵液体积，m³。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中还包括控制发酵体系的氧消耗速率，使得氧消耗速率为12-25mmol·L^-1·h^-1。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵体系的体积为5L至200立方米。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的发酵体系的体积为50L至150立方米。

8.一种维生素B12发酵生产方法，其特征在于，在发酵过程中，当生产维生素B12的工程菌菌体生长进入生长稳定期时或之后，通过调控搅拌速度和/或进气，控制发酵体系的尾气中二氧化碳的浓度，使得尾气中二氧化碳的浓度处于6-10％％(v/v)范围内，从而维持维生素B12的生产速率大于或等于2.0mg·L^{- 1}·h^-1；其中，所述的生产维生素B12的工程菌是脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrificans)。