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CN117801972A - 西弗威克汉姆酵母菌和四乙酰基植物鞘氨醇的制备方法 - Google Patents

西弗威克汉姆酵母菌和四乙酰基植物鞘氨醇的制备方法 Download PDF

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CN117801972A
CN117801972A CN202410019615.2A CN202410019615A CN117801972A CN 117801972 A CN117801972 A CN 117801972A CN 202410019615 A CN202410019615 A CN 202410019615A CN 117801972 A CN117801972 A CN 117801972A
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fermentation
fermentation broth
yeast
fed
culture
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于大禹
孙磊
陶福平
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Hangzhou Viablife Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Viablife Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明涉及微生物工程技术领域，具体而言，涉及西弗威克汉姆酵母菌和四乙酰基植物鞘氨醇的制备方法。西弗威克汉姆酵母菌(Wickerhamomyces ciferrii)的保藏号为CGMCC No.27391。该西弗威克汉姆酵母菌能发酵生产四乙酰基植物鞘氨醇，且发酵周期短，在节约材料和能源的同时获得高产量，能大幅度降低生产成本。

Description

西弗威克汉姆酵母菌和四乙酰基植物鞘氨醇的制备方法
技术领域
本发明涉及微生物工程技术领域，具体而言，涉及西弗威克汉姆酵母菌和四乙酰基植物鞘氨醇的制备方法。
背景技术
鞘脂类物质不仅是细胞膜必要的结构物质，还可以作为信号转导物质在细胞分化、增值、免疫及凋亡方面发挥重要作用。神经酰胺是鞘脂类代谢中最重要的转换物质，由不同长度或饱和度的脂肪酸与鞘氨醇骨架上氨基发生酰基化反应生成。
随着科技的快速发展和人们对生活品质追求的提高，天然安全的护肤品原料受到了市场的广泛关注。其中，植物鞘氨醇具有良好的乳化和润滑能力及保湿，美白，抗氧化功效，在护肤品领域拥有广泛市场。
动植物中的天然植物鞘氨醇含量极低，导致提取困难，继而其生产成本高昂，难以满足市场需求。而化学合成则副产物较多，步骤繁琐，也难以实现规模化生产。相比而言，采用微生物发酵生产四乙酰基植物鞘氨醇再脱乙酰化生产植物鞘氨醇的方法不仅成本低廉，原料易获取，且符合绿色发展的理念。
据报道，微生物如毕赤酵母、酿酒酵母均可产生鞘氨醇类碱及其衍生物。四乙酰基植物鞘氨醇上游合成途径中的二氢神经鞘氨醇和植物鞘氨醇具有较高细胞毒性，而威克汉姆西弗酵母细胞对其有一定耐性，使其成为生物技术生产鞘脂类的最佳宿主。但目前产四乙酰植物鞘氨醇的威克汉姆西弗酵母菌种仍存在产量较低(0.23g/L)，发酵周期长(5～10天)的问题，导致生产成本较高。因此，获得一株能够快速高产四乙酰基植物鞘氨醇的威克汉姆西弗菌株有助于在大规模工业生产中降低生产成本、提高生产效率。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供西弗威克汉姆酵母菌和四乙酰基植物鞘氨醇的制备方法。本发明实施例提供一种西弗威克汉姆酵母菌其能够缩短发酵周期，在节约材料和能源的同时获得高四乙酰基植物鞘氨醇(Tetraacetyl Phytosphingosine，TAPS)产率，从而大幅降低了生产成本。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种西弗威克汉姆酵母菌(Wickerhamomyces ciferrii)，其保藏号为CGMCC No.27391。
第二方面，本发明提供一种发酵液的制备方法，包括：对前述实施方式所述的西弗威克汉姆酵母菌进行发酵。
在可选的实施方式中，包括：将所述西弗威克汉姆酵母菌在摇瓶培养条件下发酵；
优选地，所述摇瓶培养的培养基成分如下：甘油10～35g/L、蛋白胨5～10g/L、酵母粉1～5g/L、麦芽提取物1～2g/l、硫酸铵0.4～0.8g/L、磷酸氢二钾0.5-1.5g/L、丝氨酸1～10g/L、氯化钙0.2～1.1g/L。
在可选的实施方式中，包括：将所述西弗威克汉姆酵母菌在分批补料发酵培养条件发酵；
优选地，所述分批补料发酵采用的培养基成分如下：甘油25～40g/L、蛋白胨10～20g/L、酵母粉1～2g/L、麦芽提取物2～4g/l、丝氨酸3～6g/L、磷酸二氢钾2～3g/L、硫酸铵0.8～1.2g/L、氯化钙1～1.2g/L、烟酸0.03～0.06g/L、对氨基苯甲酸0.03～0.06g/L、泛酸钙0.02～0.03g/L、盐酸硫胺素0.03～0.12g/L、无水硫酸镁0.8～1.4g/L、七水硫酸亚铁0.02～0.04g/L和消泡剂0.4～0.8ml/L。
在可选的实施方式中，分批补料发酵的条件包括：发酵温度25～30℃、溶解氧饱和度为25％～35％、pH值为6.0～7.5、以12-25mL/h的补料速度进行补入碳源。
优选地，发酵温度26～30℃；
优选地，pH值为6.3～7.4；
优选地，以12-22.5mL/h的补料速度进行补入碳源；
第三方面，本发明提供一种发酵液，其通过前述实施方式任一项所述的发酵液的制备方法制备得到。
在可选的实施方式中，所述发酵液内包括四乙酰基植物鞘氨醇。
在可选的实施方式中，所述发酵液中四乙酰基植物鞘氨醇的浓度为990mg/L以上，所述发酵液通过所述西弗威克汉姆酵母菌在摇瓶培养条件制备得到。
在可选的实施方式中，分批补料发酵96h后，所述发酵液中四乙酰基植物鞘氨醇的浓度为21.2g/L以上，所述发酵液通过所述西弗威克汉姆酵母菌在分批补料发酵培养条件制备得到。
第四方面，本发明提供一种四乙酰基植物鞘氨醇的制备方法，其包括前述实施方式任一项所述的发酵液的制备方法。
本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供一种新的威克汉姆西弗菌株，其发酵生产四乙酰基植物鞘氨醇(TAPS)的周期短，工艺简单，效率高且不受地域限制。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供一种生长快速且高产TAPS的威克汉姆西弗菌株，该菌株于2023年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.27391。
该菌株在摇瓶发酵培养基10％装液量的三角瓶中，200rpm，30℃下发酵96h可产生991mg/L四乙酰基植物鞘氨醇(TAPS)发酵液。
本实施例还提供一种上述西弗威克汉姆酵母菌株筛选方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将酵母细胞涂布McClary产孢培养基，进行产孢诱导，使其减数分裂形成大量子囊孢子；
其中，该酵母细胞为威克汉姆西弗野生型二倍体菌株NRRL Y-1031，购买自宁波明舟生物科技有限公司，由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)于2018年9月5日引进保藏，其保藏编号为CCTCC AY 2018003，通过诱导产孢可使其减数分裂产生单倍体孢子。
McClary产孢培养基包含如下组分：葡萄糖1.0g/L，氯化钾1.8g/L，酵母提取物2.5g/L，醋酸钠8.2g/L，琼脂粉20.0g/L。
产孢诱导培养步骤为：将保存的NRRL Y-1031酵母细胞接种于YPD培养基中，在28～30℃、180～220rpm的条件下培养至对数生长期，菌液涂布产孢培养基，28～30℃条件下培养7～10天。
(2)将上述(1)得到的子囊孢子进行紫外诱变，得到酵母突变体菌株；
具体步骤如下：
将子囊孢子制成菌悬液，于55～60℃水浴15～30min，使其中二倍营养体失活，富集子囊孢子。
加入终浓度0.3～0.4g/L蜗牛酶/zymolyase及0.1～0.3g直径为0.4～0.6mm的玻璃珠，在28～37℃下180～320rpm摇床震荡1～4h，进行破壁使得子囊孢子得以释放。
收集破壁处理后的孢子液，转移至无菌离心管中进行稀释，取5mL菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中。将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处，照射lmin后打开培养皿盖，开始照射，照射时间分别为15s、30s、lmin、2min、5min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h然后在红灯下取少量菌液涂布于YPD平板，30℃条件下培养2～5天。
(3)将上述(2)得到的突变体菌株进行生长速率比较，筛选生长速度较快的菌株；
具体操作如下：对突变体菌株在28～30℃，180～220rpm条件下进行过夜活化，将活化后的菌液OD600值稀释至同一水平，然后以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5进行梯度稀释并点滴于YPD平板上，25～30℃条件下培养2～5天，观察生长速度明显优于对照的菌株；然后对具有生长速度优势的菌株再次进行活化，并接种于YPD液体培养基中28～30℃，180～220rpm条件下进行培养，期间测定不同时间点的OD600值，绘制生长曲线，确认其生长优势。
(4)将上述(3)筛选得到的生长速度较快的菌株进行摇瓶发酵，筛选TAPS产量高的菌株。
其中，摇瓶发酵培养基包含以下组分：
甘油10～35g/L、蛋白胨5～10g/L、酵母粉1～5g/L、麦芽提取物1～2g/l、硫酸铵0.4～0.8g/L、磷酸氢二钾0.5-1.5g/L、丝氨酸1～10g/L、氯化钙0.2～1.1g/L；
摇瓶发酵的条件包括：在试管中预培养的细胞OD600达到约5时，按照10％接种量转接至含有发酵培养基的三角瓶中(10％装液量)，在25～30℃，180～220rpm条件下发酵，48h后停止发酵。
摇瓶发酵结束后，收集发酵液，提取TAPS进行HPLC(高效液相法)检测TAPS产量。
第二方面，本发明提供一种发酵液的制备方法，包括：对前述实施方式所述的西弗威克汉姆酵母菌进行发酵。
例如，利用在摇瓶培养条件下发酵；在摇瓶发酵培养基10％装液量的三角瓶中，200rpm，30℃下发酵96h。此发酵得到的发酵液中四乙酰基植物鞘氨醇的浓度为990mg/L以上。
例如，将所述西弗威克汉姆酵母菌在分批补料发酵培养条件发酵。
具体地，在5L发酵罐中进行发酵培养，发酵温度25～30℃、溶解氧饱和度为25％～35％、罐压0.04～0.05Mpa，发酵培养过程中采用氨水控制pH值为6.0～7.5，通过添加80％的甘油溶液来补充碳源，其中，在24～48h内补料速度为15mL/h；48～96h内补料速度为18.5mL/h，96～117h内补料速度为20-25mL/h。
本发明实施例以甘油为碳源，成本低廉，原料易获得，大大降低生产成本，推动了TAPS大规模工业化生产。
发酵培养基组分：甘油25～40g/L、蛋白胨10～20g/L、酵母粉1～2g/L、麦芽提取物2～4g/l、丝氨酸3～6g/L、磷酸二氢钾2～3g/L、硫酸铵0.8～1.2g/L、氯化钙1～1.2g/L、烟酸0.03～0.06g/L、对氨基苯甲酸0.03～0.06g/L、泛酸钙0.02～0.03g/L、盐酸硫胺素0.03～0.12g/L、无水硫酸镁0.8～1.4g/L、七水硫酸亚铁0.02～0.04g/L、消泡剂0.4～0.8ml/L。
分批补料发酵96h，此发酵得到的发酵液中四乙酰基植物鞘氨醇的浓度为21.2g/L以上。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种威克汉姆西弗菌株的筛选方法，包括：
(1)子囊孢子诱导；
将初始威克汉姆西弗菌株NRRL Y-1031接种于YPD(葡萄糖20.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L)液体培养基摇瓶中。过夜培养至生长对数期。将培养液离心，收集菌体，用灭菌蒸馏水重悬后涂布至McClary培养基(葡萄糖1.0g/L，氯化钾1.8g/L，酵母提取物2.5g/L，醋酸钠8.2g/L，琼脂粉20.0g/L)，28℃培养7～10d。
(2)子囊孢子分离；
刮取产孢培养基上的菌苔制成菌悬液，55℃水浴10～15min，灭活其中的二倍体；加入终浓度为0.3～0.4g/L的蜗牛酶/zymolyase及0.1～0.3g直径为0.4～0.6mmd的玻璃珠，30℃摇床200rpm条件下振荡1～4h，释放出子囊孢子。
(3)紫外诱变；
将水浴后的孢子悬液离心，弃上清，无菌水重悬至一定浓度，打开紫外灯(30W)预热20min，取5mL菌悬液于无菌的培养皿(9cm)中，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处，照射1min后打开培养皿盖，开始照射，照射时间分别为15s、30s、lmin、2min、5min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h然后在红灯下取少量菌液涂布于YPD平板，25～30℃条件下培养2～5天。
(4)优势菌株筛选；
挑取YPD平板菌落大小大于普通单倍体菌株的单克隆转接至新的YPD平板，作为初筛所得菌株；对初筛得到的菌株在25～30℃，180～220rpm条件下进行过夜活化，将活化后的菌液用灭菌蒸馏水稀释OD600值至同一水平，然后以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5进行梯度稀释并点滴于YPD平板上，25～30℃条件下培养2～5天，观察并选择生长速度显著优于未经紫外诱变处理的单倍体Wc-000的菌株，作为复筛所得菌株。
(5)摇瓶发酵筛选；
将(4)筛选到的优势菌株再次进行活化后，挑取单克隆接入YPD液体培养基，25～30℃，180～220rpm条件下进行预培养24h，按照10％接种量接入发酵培养基(甘油30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、麦芽提取物2g/l、硫酸铵0.8g/L、磷酸氢二钾1g/L、丝氨酸6g/L、氯化钙1.1g/L)，25～30℃条件下培养2d，期间测定不同时间点的OD600值，绘制生长曲线，停止发酵后提取发酵液中的TAPS进行HPLC检测产量，以未经紫外诱变的单倍体菌株Wc-000为对照，选择其中生长速度和TAPS产量均有明显优势的菌株作为最优菌株。
(5)利用HPLC检测发酵液中TAPS产量：
色谱条件与检测仪器：
高效液相色谱仪：岛津LC 2030Plus；
色谱柱：ShimNex HE C8 4.6×150mm 3μm；
色谱条件：流动相A：0.02％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；流速：1.0ml/min；进样量：10μL；柱温：40℃；检测波长：200nm；洗脱梯度如下表：
时间min 流动相A％ 流动相B％
0 20 80
5 13 87
10 20 80
15 20 80
检测结果如下：
可见，本发明实施例筛选得到的威克汉姆西弗菌株能生产更多的TAPS。
实施例2
本实施例提供一种利用威克汉姆西弗菌株CGMCC No.27391生产TAPS的方法，包括：
一级种子培养：将实施例1中获得的优势菌株CGMCC No.27391在YPD固体平板上活化后挑取单克隆接入含有YPD液体的试管中，在30℃、220rpm条件下培养12～16h，然后接入50mL灭菌的一级种子培养基(甘油30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、麦芽提取物2g/L、硫酸铵0.8g/L、氯化钙1.2g/L)，在30℃，220rpm条件下，500mL摇瓶培养至OD600＝10，得到一级种子液。
二级种子培养：将一级种子液按照5％接种量接种至200mL灭菌的二级种子培养基(甘油30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、麦芽提取物2g/l、丝氨酸5g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵0.8g/L、氯化钙1.2g/L、烟酸0.05g/L、对氨基苯甲酸0.03g/L、泛酸钙0.03g/L、盐酸硫胺素0.05g/L、无水硫酸镁0.8g/L、七水硫酸亚铁0.02g/L)，在30℃、220rpm条件下，2L摇瓶培养至OD600＝25，得到二级种子液。
发酵罐培养：将二级种子液按照10％接种量接种至装有2L发酵培养基(甘油30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉2g/L、麦芽提取物2g/l、丝氨酸5g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵0.8g/L、氯化钙1.2g/L、烟酸0.05g/L、对氨基苯甲酸0.03g/L、泛酸钙0.03g/L、盐酸硫胺素0.03g/L、无水硫酸镁0.8g/L、七水硫酸亚铁0.02g/L、消泡剂0.4ml/L)的5L发酵罐中，在26℃、溶解氧饱和度为25％～35％、罐压0.04～0.05Mpa的条件下进行发酵培养，发酵培养过程中采用氨水控制pH值为6.3～6.5，通过添加80％的甘油溶液来补充碳源，其中，在24～48h内补料速度为15mL/h；48～96h内补料速度为18.5mL/h，96～117h内补料速度为20mL/h；放罐前3h停止补料，发酵期间采集样品进行TAPS产量测定。
实施例3
本实施例提供一种利用威克汉姆西弗菌株CGMCC No.27391生产TAPS的方法，包括：
一级种子培养：将优势菌株CGMCC 27391在YPD固体平板上活化后挑取单克隆接入含有YPD液体的试管中，在30℃、220rpm条件下培养12～16h，然后接入50mL灭菌的一级种子培养基(甘油30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、麦芽提取物2g/L、硫酸铵0.8g/L、氯化钙1.2g/L)，在30℃，220rpm条件下，500mL摇瓶培养至OD600＝10，得到一级种子液。
二级种子培养：将一级种子液按照5％接种量接种至200mL灭菌的二级种子培养基(甘油30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、麦芽提取物2g/l、丝氨酸5g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵0.8g/L、氯化钙1.2g/L、烟酸0.05g/L、对氨基苯甲酸0.03g/L、泛酸钙0.03g/L、盐酸硫胺素0.05g/L、无水硫酸镁0.8g/L、七水硫酸亚铁0.02g/L)，在30℃、220rpm条件下，2L摇瓶培养至OD600＝25，得到二级种子液。
发酵罐培养：将二级种子液按照10％接种量接种至装有2L发酵培养基(甘油30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉2g/L、麦芽提取物2g/l、丝氨酸5g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵0.8g/L、氯化钙1.2g/L、烟酸0.05g/L、对氨基苯甲酸0.03g/L、泛酸钙0.03g/L、盐酸硫胺素0.03g/L、无水硫酸镁0.8g/L、七水硫酸亚铁0.02g/L、消泡剂0.4ml/L)的5L发酵罐中，在28℃、溶解氧饱和度为25％～35％、罐压0.04～0.05Mpa的条件下进行发酵培养，发酵培养过程中采用氨水控制pH值为6.8～7.0，通过添加80％的甘油溶液来补充碳源，其中，在24～48h内补料速度为15mL/h；48～96h内补料速度为18.5mL/h，96～117h内补料速度为20mL/h；放罐前3h停止补料，发酵期间采集样品进行TAPS产量测定。
实施例4
本实施例提供一种利用威克汉姆西弗菌株CGMCC No.27391生产TAPS的方法，包括：
一级种子培养：将优势菌株CGMCC 27391在YPD固体平板上活化后挑取单克隆接入含有YPD液体的试管中，在30℃、220rpm条件下培养12～16h，然后接入50mL灭菌的一级种子培养基(甘油30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、麦芽提取物2g/L、硫酸铵0.8g/L、氯化钙1.2g/L)，在30℃，220rpm条件下，500mL摇瓶培养至OD600＝10，得到一级种子液。
二级种子培养：将一级种子液按照5％接种量接种至200mL灭菌的二级种子培养基(甘油30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、麦芽提取物2g/l、丝氨酸5g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵0.8g/L、氯化钙1.2g/L、烟酸0.05g/L、对氨基苯甲酸0.03g/L、泛酸钙0.03g/L、盐酸硫胺素0.05g/L、无水硫酸镁0.8g/L、七水硫酸亚铁0.02g/L)，在30℃、220rpm条件下，2L摇瓶培养至OD600＝25，得到二级种子液；
发酵罐培养：将二级种子液按照15％接种量接种至装有2L发酵培养基(甘油30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉2g/L、麦芽提取物2g/l、丝氨酸5g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵0.8g/L、氯化钙1.2g/L、烟酸0.05g/L、对氨基苯甲酸0.03g/L、泛酸钙0.03g/L、盐酸硫胺素0.03g/L、无水硫酸镁0.8g/L、七水硫酸亚铁0.02g/L、消泡剂0.4ml/L)的5L发酵罐中，在28℃、溶解氧饱和度为25％～35％、罐压0.04～0.05Mpa的条件下进行发酵培养，发酵培养过程中采用氨水控制pH值为6.8～7.0，通过添加80％的甘油溶液来补充碳源，其中，在24～48h内补料速度为15mL/h；48～96h内补料速度为18.5mL/h，96～117h内补料速度为20mL/h；放罐前3h停止补料，发酵期间采集样品进行TAPS产量测定。
实施例5
本实施例提供一种利用威克汉姆西弗菌株CGMCC No.27391生产TAPS的方法，包括：
一级种子培养：将优势菌株CGMCC 27391在YPD固体平板上活化后挑取单克隆接入含有YPD液体的试管中，在30℃、220rpm条件下培养12～16h，然后接入50mL灭菌的一级种子培养基(甘油30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、麦芽提取物2g/L、硫酸铵0.8g/L、氯化钙1.2g/L)，在30℃，220rpm条件下，500mL摇瓶培养至OD600＝10，得到一级种子液。
二级种子培养：将一级种子液按照5％接种量接种至200mL灭菌的二级种子培养基(甘油30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、麦芽提取物2g/l、丝氨酸5g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵0.8g/L、氯化钙1.2g/L、烟酸0.05g/L、对氨基苯甲酸0.03g/L、泛酸钙0.03g/L、盐酸硫胺素0.05g/L、无水硫酸镁0.8g/L、七水硫酸亚铁0.02g/L)，在30℃、220rpm条件下，2L摇瓶培养至OD600＝30，得到二级种子液；
发酵罐培养：将二级种子液按照15％接种量接种至装有2L发酵培养基(甘油40g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉2g/L、麦芽提取物2g/l、丝氨酸5g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵0.8g/L、氯化钙1.2g/L、烟酸0.06g/L、对氨基苯甲酸0.03g/L、泛酸钙0.03g/L、盐酸硫胺素0.03g/L、无水硫酸镁0.8g/L、七水硫酸亚铁0.02g/L、消泡剂0.4ml/L)的5L发酵罐中，在30℃、溶解氧饱和度为25％～35％、罐压0.04～0.05Mpa的条件下进行发酵培养，发酵培养过程中采用氨水控制pH值为7.2～7.4，通过添加80％的甘油溶液来补充碳源，其中，在24～48h内补料速度为17mL/h；48～96h内补料速度为20mL/h，96～117h内补料速度为22.5mL/h；放罐前3h停止补料，发酵期间采集样品进行TAPS产量测定。
实施例6
TAPS高产菌株CGMCC27391的分批补料发酵优化
一级种子培养：将实施例3中获得的优势菌株CGMCC27391在YPD固体平板上活化后挑取单克隆接入含有YPD液体的试管中，在30℃、220rpm条件下培养12～16h，然后接入50mL灭菌的一级种子培养基(甘油30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、麦芽提取物2g/L、硫酸铵0.8g/L、氯化钙1.2g/L)，在30℃，220rpm条件下，500mL摇瓶培养至OD600＝10，得到一级种子液；
二级种子培养：将一级种子液按照5％接种量接种至200mL灭菌的二级种子培养基(甘油30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、麦芽提取物2g/l、丝氨酸5g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵0.8g/L、氯化钙1.2g/L、烟酸0.05g/L、对氨基苯甲酸0.03g/L、泛酸钙0.03g/L、盐酸硫胺素0.05g/L、无水硫酸镁0.8g/L、七水硫酸亚铁0.02g/L)，在30℃、220rpm条件下，2L摇瓶培养至OD600＝30，得到二级种子液；
发酵罐培养：将二级种子液按照15％接种量接种至装有2L发酵培养基(甘油40g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉2g/L、麦芽提取物2g/l、丝氨酸5g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵0.8g/L、氯化钙1.2g/L、烟酸0.05g/L、对氨基苯甲酸0.03g/L、泛酸钙0.03g/L、盐酸硫胺素0.03g/L、无水硫酸镁0.8g/L、七水硫酸亚铁0.02g/L、消泡剂0.4ml/L)的5L发酵罐中，在30℃、溶解氧饱和度为25％～35％、罐压0.04～0.05Mpa的条件下进行发酵培养，发酵培养过程中采用氨水控制pH值为6.8～7.0，通过添加80％的甘油溶液来补充碳源，其中，在24～48h内补料速度为17mL/h；48～96h内补料速度为20mL/h，96～117h内补料速度为22.5mL/h；放罐前3h停止补料，发酵期间采集样品进行TAPS产量测定。
对比例1
本对比例提供一种利用威克汉姆西弗菌株CGMCC No.27391生产TAPS的方法，该生产方法参见实施例5，区别在于采用的发酵培养基成分如下：
甘油30g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、麦芽提取物2g/l、硫酸铵0.8g/L、磷酸氢二钾1g/L、丝氨酸6g/L、氯化钙1.1g/L，其余条件均与实施例5相同。
对比例2
本对比例提供一种利用威克汉姆西弗菌株CGMCC No.27391生产TAPS的方法，该生产方法参见实施例5，区别在于：发酵培养过程采用氨水控制pH值为8.0。
对比例3
本对比例提供一种利用威克汉姆西弗菌株CGMCC No.27391生产TAPS的方法，该生产方法参见实施例5，区别在于：发酵培养过程发酵温度为34℃。
检测实施例2-6以及对比例1-3形成的发酵液中TAPS的含量，结果参见表1-2。
表1实施例2-6中CGMCC 27391的分批补料发酵96h和120h TAPS产量
方案 TAPS产量g/L(96h) TAPS产量g/L(120h)
实施例2 21.2 23.6
实施例3 22.5 24.2
实施例4 23.4 25.8
实施例5 24.5 26.8
实施例6 26.6 27.9
表2对比例1-3形成的发酵液中TAPS的含量
方案 TAPS产量g/L(96h)
对比例1 14.6
对比例2 12.1
对比例3 12.7
可见，采用本发明实施例提供的分批补料培养的条件能高产制备TAPS，若更改了发酵条件会导致TAPS产量下降。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种西弗威克汉姆酵母菌(Wickerhamomyces ciferrii)，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.27391。
2.一种发酵液的制备方法，其特征在于，包括：对权利要求1所述的西弗威克汉姆酵母菌进行发酵。
3.根据权利要求2所述的发酵液的制备方法，其特征在于，包括：将所述西弗威克汉姆酵母菌在摇瓶培养条件下发酵；
优选地，所述摇瓶培养的培养基成分如下：甘油10～35g/L、蛋白胨5～10g/L、酵母粉1～5g/L、麦芽提取物1～2g/l、硫酸铵0.4～0.8g/L、磷酸氢二钾0.5-1.5g/L、丝氨酸1～10g/L、氯化钙0.2～1.1g/L。
4.根据权利要求2所述的发酵液的制备方法，其特征在于，包括：将所述西弗威克汉姆酵母菌在分批补料发酵培养条件发酵；
优选地，所述分批补料发酵采用的培养基成分如下：甘油25～40g/L、蛋白胨10～20g/L、酵母粉1～2g/L、麦芽提取物2～4g/l、丝氨酸3～6g/L、磷酸二氢钾2～3g/L、硫酸铵0.8～1.2g/L、氯化钙1～1.2g/L、烟酸0.03～0.06g/L、对氨基苯甲酸0.03～0.06g/L、泛酸钙0.02～0.03g/L、盐酸硫胺素0.03～0.12g/L、无水硫酸镁0.8～1.4g/L、七水硫酸亚铁0.02～0.04g/L和消泡剂0.4～0.8ml/L。
5.根据权利要求4所述的发酵液的制备方法，其特征在于，分批补料发酵的条件包括：发酵温度25～30℃、溶解氧饱和度为25％～35％、pH值为6.0～7.5，以12-25mL/h的补料速度进行补入碳源；
优选地，发酵温度26～30℃；
优选地，pH值为6.3～7.4；
优选地，以12-22.5mL/h的补料速度进行补入碳源。
6.一种发酵液，其特征在于，其通过权利要求2-5任一项所述的发酵液的制备方法制备得到。
7.根据权利要求6所述的发酵液，其特征在于，所述发酵液内包括四乙酰基植物鞘氨醇。
8.根据权利要求7所述的发酵液，其特征在于，所述发酵液中四乙酰基植物鞘氨醇的浓度为990mg/L以上，所述发酵液通过所述西弗威克汉姆酵母菌在摇瓶培养条件制备得到。
9.根据权利要求7所述的发酵液，其特征在于，所述发酵液中四乙酰基植物鞘氨醇的浓度为21.2g/L以上，所述发酵液通过所述西弗威克汉姆酵母菌在分批补料发酵培养条件制备得到。
10.一种四乙酰基植物鞘氨醇的制备方法，其特征在于，其包括权利要求2-5任一项所述的发酵液的制备方法。
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