CN104774888A - 一种虫草素发酵固体培养基及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种虫草素发酵固体培养基及其制备方法和应用，该培养基由如下步骤制备得到：1)将葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、吐温80，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.5～6.0，制得发酵培养液；2)将步骤1)中的发酵培养液与膨胀珍珠岩混合均匀，经喷雾干燥后装入发酵罐，121℃蒸汽灭菌20min，获得虫草素发酵固体培养基。本方法所提供的子实体量大，同步性佳，活力强，并通过喷淋补加虫草素前体腺嘌呤和三油酸甘油酯促进蛹虫草的生长与虫草素的积累，能够提高虫草素的产量和质量。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种虫草素发酵固体培养基及其制备方法与应用。
背景技术
虫草素是虫草中主要的活性成分之一。虫草素具有多种生物学活性，如抗肿瘤、抗增殖、抗转移、抗菌、抗病毒、免疫调节和抗炎等。虫草素的制备主要有化学合成和生物合成两种方式。由于目前化学合成虫草素生产成本高，合成工艺复杂，收率低，产物纯化比较难，所以虫草素主要由生物合成法制备。生物合成法制备虫草素有两种途径：一是固体发酵获得虫草子实体，再从中提取；二是通过虫草液体发酵，从发酵液中直接提取。由于液体发酵比固体发酵在发酵规模、菌体生长速率、生长密度以及可控性上的优势，虫草液体发酵提取虫草素成为主要的虫草素制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可产生大量子实体的虫草素发酵固体培养基。
本发明还要解决的技术问题是提供上述固体培养基的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述固体培养基的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种虫草素发酵固体培养基的制备方法，它包括如下步骤：
1)将葡萄糖40～50g/L，酵母膏3～10g/L，蛋白胨5～15g/L，磷酸二氢钾0.2～1.0g/L，磷酸氢二钾0.2～1.0g/L，硫酸镁0.2～1.0g/L，吐温80 0.5～5.0g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.5～6.0，制得发酵培养液；
2)将步骤1)中的发酵培养液与膨胀珍珠岩混合均匀，经喷雾干燥后装入发酵罐，121℃蒸汽灭菌20min，获得虫草素发酵固体培养基。
步骤1)中，将葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温802g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.8，制得发酵培养液。
步骤2)中，所述的膨胀珍珠岩粒径为4～8mm，优选6mm。
步骤2)中，发酵培养液与膨胀珍珠岩的体积质量比为30～50ml/g，优选40ml/g。
步骤2)中，喷雾干燥后的物料含水量控制在2.5-5ml/g，优选4ml/g。
上述制备方法制备得到的虫草素发酵固体培养基也在本发明的保护范围之内。
上述虫草素发酵固体培养基在发酵生产虫草素中的应用也在本发明的保护范围之内。
具体的应用方法是，将在PDA斜面培养基上长好的蛹虫草菌种用5ml无菌生理盐水洗下，制成菌悬液，接种至灭菌好的装有50ml的发酵培养液摇瓶中，于27℃，180rpm恒温摇床培养4天，加入无菌水450ml，混合均匀后，再以1wt％接种至灭菌好的虫草素发酵固体培养基中，充分搅拌使菌种均匀分布于虫草素发酵固体培养基中，每24h时以1wt％比例补水维持相对湿度，并搅拌翻料，同时从发酵罐底部通入相对湿度为80％的无菌空气，通气比为0.5min-1，27℃培养4天后，通气比降为0.5h-1，每5天以5wt％喷淋加入含有0.5g/L腺嘌呤和2～6g/L(优选4g/L)三油酸甘油酯的培养液使其产生大量的子实体，其余条件不变，再培养21天后发酵结束；加入1.5倍固料体积的水，80℃搅拌翻料2h，过滤收集滤液；水煮过程进行三次，合并滤液，浓缩至固料体积，得到虫草素提取液。
上述蛹虫草菌种为任意具有虫草素生产能力的蛹虫草菌种，例如可以是购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC 14014的菌株。
本技术通过培养液在20目膨胀珍珠岩上的吸附，发挥固体发酵的优势，克服其缺陷，利用20目膨胀珍珠岩中丰富的比表面积达到大量生产子实体的目的。众所周知，虫草素通常富集于蛹虫草子实体顶部。
我们通过文献调研和研究发现虫草素的直接前体是腺嘌呤，而虫草素的另一个结构单元是3’-脱氧核糖。在蛹虫草发酵中，我们发现在发酵培养基中加入腺嘌呤能大大提高虫草素产量。而且，我们还发现加入植物油后蛹虫草发酵液中的虫草素含量又有进一步升高。
蛹虫草传统培养方法是应用葡萄糖、蛋白胨和酵母膏为主要成分的发酵培养基。这些成分只能满足蛹虫草基本的生长和发育需要，虫草素产量较低。而加入腺嘌呤后提供了一定的虫草素前体，使得虫草素产量有所提高。但是3’-脱氧核糖单元是通过脂肪酸代谢途径，经乙酰CoA，再经过次级代谢途径合成的，这与先前理解的3’-脱氧核糖是通过磷酸戊糖途径合成的有差别。因此，在缺乏乙酰CoA供给的条件下，虫草素含量很难再提高。而植物油等甘油酯在蛹虫草中通过脂肪酸代谢能够分解为大量的乙酰CoA，进而能够进一步提高虫草素的产量。
本发明的有益效果：
1、本发明所采用的20目膨胀珍珠岩作为支持介质，其比表面积为10m2/g(内径为10米的发酵罐，在非搅拌条件下气液界面仅为78.5m2，仅相当于8g20目膨胀珍珠岩)，孔隙率达到50-90％，这些有利于传质及子实体生长和孢子的产生，同步性佳。
2、根据蛹虫草菌体生长和虫草素积累所需的不同供氧条件，利用通气比来改变，影响因素少，更简单方便。
3、本发明加入腺嘌呤和三油酸甘油酯，提供虫草素的两种前体，更有利于虫草素的积累。
附图说明
图1为不同培养基对虫草素含量的影响图，其中横坐标1为实施例4，2为实施例5，3为实施例6，4为对比例1，5为对比例2，纵坐标代表测得的发酵液或虫草素提取液中虫草素含量。
图2为不同培养基对子实体浓度的影响图，其中横坐标1为实施例4，2为实施例5，3为实施例6，4为对比例1，5为对比例2，纵坐标代表测得的子实体浓度。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，以下实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：蛹虫草发酵固体培养基制备。
1)葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温80 2g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.8，制得发酵培养液。
2)将步骤1)中的发酵培养液与粒径6mm的膨胀珍珠岩按照体积质量比为40ml/g混合搅拌，经喷雾干燥后，物料含水量控制在4ml/g装入发酵罐，121℃蒸汽灭菌20min，获得虫草素发酵固体培养基。
实施例2：蛹虫草发酵培养基制备。
1)葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温80 2g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.8，制得发酵培养液。
2)将步骤1)中的发酵培养液与粒径4mm的膨胀珍珠岩按照体积质量比为30ml/g混合搅拌，经喷雾干燥后，物料含水量控制在5ml/g装入发酵罐，121℃蒸汽灭菌20min，获得虫草素发酵固体培养基。
实施例3：蛹虫草发酵培养基制备。
1)葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温80 2g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.8，制得发酵培养液。
2)将步骤1)中的发酵培养液与粒径8mm的膨胀珍珠岩按照体积质量比为50ml/g混合搅拌，经喷雾干燥后，物料含水量控制在2.5ml/g装入发酵罐，121℃蒸汽灭菌20min，获得虫草素发酵固体培养基。
实施例4：蛹虫草固体发酵培养基在提高蛹虫草虫草素产量上的应用。
1、从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的蛹虫草菌种(编号：CICC14014)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，使安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.5ml 0.9％的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2ml菌体悬浮液加至斜面培养基中，25℃恒温培养7d。
2、将在PDA斜面培养基上长好的菌种用5ml无菌生理盐水洗下，制成菌悬液，接种至灭菌好的装有50ml的发酵培养液摇瓶中，于27℃，180rpm恒温摇床培养4天，加入无菌水450ml，混合均匀后，再以1wt％接种至灭菌好的实施例1固料培养基中，充分搅拌使菌种均匀分布于培养基中，每24h时以1wt％比例补水维持适当的相对湿度，并搅拌翻料，同时从发酵罐底部通入相对湿度为80％的无菌空气，通气比为0.5min-1，27℃培养4天后，通气比降为0.5h-1，每5天以5wt％喷淋加入含有0.5g/L腺嘌呤和4g/L三油酸甘油酯的培养液使其产生大量的子实体，其余条件不变，再培养21天后发酵结束。加入1.5倍固料体积的水，80℃搅拌翻料2h，过滤收集滤液。水煮过程进行三次，合并滤液，浓缩至固料体积，得到虫草素提取液。
实施例5：蛹虫草发酵培养基在提高蛹虫草发酵液中虫草素含量上的应用
1、从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的蛹虫草菌种(编号：CICC14014)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，使安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.5ml 0.9％的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2ml菌体悬浮液加至斜面培养基中，25℃恒温培养7d。
2、将在PDA斜面培养基上长好的菌种用5ml无菌生理盐水洗下，制成菌悬液，接种至灭菌好的装有50ml的发酵培养液摇瓶中，于27℃，180rpm恒温摇床培养4天，加入无菌水450ml，混合均匀后，再以1wt％接种至灭菌好的实施例2固料培养基中，充分搅拌使菌种均匀分布于培养基中，每24h时以1wt％比例补水维持适当的相对湿度，并搅拌翻料，同时从发酵罐底部通入相对湿度为80％的无菌空气，通气比为0.5min-1，27℃培养4天后，通气比降为0.5h-1，每5天以5wt％喷淋加入含有0.5g/L腺嘌呤和2g/L三油酸甘油酯的培养液使其产生大量的子实体，其余条件不变，再培养21天后发酵结束。加入1.5倍固料体积的水，80℃搅拌翻料2h，过滤收集滤液。水煮过程进行三次，合并滤液，浓缩至固料体积，得到虫草素提取液。
实施例6：蛹虫草发酵培养基在提高蛹虫草发酵液中虫草素含量上的应用
1、从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的蛹虫草菌种(编号：CICC14014)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，使安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.5ml 0.9％的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2ml菌体悬浮液加至斜面培养基中，25℃恒温培养7d。
2、将在PDA斜面培养基上长好的菌种用5ml无菌生理盐水洗下，制成菌悬液，接种至灭菌好的装有50ml的发酵培养液摇瓶中，于27℃，180rpm恒温摇床培养4天，加入无菌水450ml，混合均匀后，再以1wt％接种至灭菌好的实施例3固料培养基中，充分搅拌使菌种均匀分布于培养基中，每24h时以1wt％比例补水维持适当的相对湿度，并搅拌翻料，同时从发酵罐底部通入相对湿度为80％的无菌空气，通气比为0.5min-1，27℃培养4天后，通气比降为0.5h-1，每5天以5wt％喷淋加入含有0.5g/L腺嘌呤和6g/L三油酸甘油酯的培养液使其产生大量的子实体，其余条件不变，再培养21天后发酵结束。加入1.5倍固料体积的水，80℃搅拌翻料2h，过滤收集滤液。水煮过程进行三次，合并滤液，浓缩至固料体积，得到虫草素提取液。
对比例1：
1、葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温80 0.5-5.0g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.8，制得发酵培养液。
2、从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的蛹虫草菌种(编号：CICC14014)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，使安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.5ml 0.9％的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2ml菌体悬浮液加至斜面培养基中，25℃恒温培养7d。
3、将在PDA斜面培养基上长好的菌种用5ml无菌生理盐水洗下，制成菌悬液，接种至灭菌好的装有50ml的发酵培养液摇瓶中，于27℃，180rpm恒温摇床培养4天，加入无菌水450ml，混合均匀后，再以1％w/w接种至灭菌好的发酵培养液中，充分搅拌使菌种均匀分布于培养基中，每24h时以1％w/w比例补水维持适当的相对湿度，并搅拌翻料，同时从发酵罐底部通入相对湿度为80％的无菌空气，通气比为0.5min-1，27℃培养4天后，通气比降为0.5h-1，每5天以5％w/w喷淋加入含有0.5g/L腺嘌呤和4g/L三油酸甘油酯的培养液其余条件不变，再培养21天后发酵结束。过滤收集滤液，得到虫草素提取液。
对比例2：
1、葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温80 2g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.8，制得发酵培养液。
2、将步骤1中的发酵培养液与粒径6mm的膨胀珍珠岩按照体积质量比为40ml/g混合搅拌，经喷雾干燥后，物料含水量控制在4ml/g装入发酵罐，121℃蒸汽灭菌20min，获得虫草素发酵固体培养基。
3、从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的蛹虫草菌种(编号：CICC14014)保藏在安瓿管中，处于冻干状态，在实验之前需要恢复菌种活性。在超净工作台中，用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，使安瓿管顶端在火焰上加热，向加热处滴几滴无菌水使玻璃开裂。用镊子敲下已开裂的安瓿管顶端，加入0.5ml 0.9％的生理盐水，振荡使冻干菌体溶解并呈悬浮状。取0.2ml菌体悬浮液加至斜面培养基中，25℃恒温培养7d。
4、将在PDA斜面培养基上长好的菌种用5ml无菌生理盐水洗下，制成菌悬液，接种至灭菌好的装有50ml的发酵培养液摇瓶中，于27℃，180rpm恒温摇床培养4天，加入无菌水450ml，混合均匀后，再以1wt％接种至灭菌好的虫草素发酵固体培养基中，充分搅拌使菌种均匀分布于培养基中，每24h时以1wt％比例补水维持适当的相对湿度，并搅拌翻料，同时从发酵罐底部通入相对湿度为80％的无菌空气，通气比为0.5min-1，27℃培养4天后，通气比降为0.5h-1，其余条件不变，再培养21天后发酵结束。加入1.5倍固料体积的水，80℃搅拌翻料2h，过滤收集滤液。水煮过程进行三次，合并滤液，浓缩至固料体积，得到虫草素提取液。
发酵液虫草素含量测定
实施例4-7的发酵液中虫草素的含量通过高效液相色谱法测定。发酵液离心取上清液用纯水稀释6倍，振荡混匀，检测虫草素。色谱条件：色谱柱：Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：甲醇：磷酸盐溶液(10mmol/L KH2PO4溶液)＝15：85，柱温30℃，流速1ml/min，进样量20μL，检测波长为260nm。
结果：实施例4制得的培养基分别比对比例1-2的虫草素含量增加约为200％和243％。
子实体浓度检测：
在制备固体培养基之前称量珍珠岩的质量，记为M0，液体培养基记为0；发酵结束后，过滤干燥后，称量发酵固体总质量，记为M总；发酵总体积为V，子实体浓度记为以(M总-M0)/V。
结果：实施例4制得的培养基分别比对比例1-2的子实体浓度增加约为118％和140％。
Claims (8)
1.一种虫草素发酵固体培养基的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：
1)将葡萄糖40～50g/L，酵母膏3～10g/L，蛋白胨5～15g/L，磷酸二氢钾0.2～1.0g/L，磷酸氢二钾0.2～1.0g/L，硫酸镁0.2～1.0g/L，吐温800.5～5.0g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.5～6.0，制得发酵培养液；
2)将步骤1)中的发酵培养液与膨胀珍珠岩混合均匀，经喷雾干燥后装入发酵罐，121℃蒸汽灭菌20min，获得虫草素发酵固体培养基。
2.根据权利要求1所述的虫草素发酵固体培养基的制备方法，其特征在于，步骤1)中，将葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，吐温802g/L，溶剂为水，充分搅拌溶解后调节溶液pH值5.8，制得发酵培养液。
3.根据权利要求1所述的虫草素发酵固体培养基的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的膨胀珍珠岩粒径为4～8mm。
4.根据权利要求1所述的虫草素发酵固体培养基的制备方法，其特征在于，步骤2)中，发酵培养液与膨胀珍珠岩的体积质量比为30～50ml/g。
5.根据权利要求1所述的虫草素发酵固体培养基的制备方法，其特征在于，步骤2)中，喷雾干燥后的物料含水量控制在2.5～5ml/g。
6.权利要求1～5中任意一项所述的制备方法制备得到的虫草素发酵固体培养基。
7.权利要求6所述的虫草素发酵固体培养基在发酵生产虫草素中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将在PDA斜面培养基上长好的蛹虫草菌种用5ml无菌生理盐水洗下，制成菌悬液，接种至灭菌好的装有50ml的发酵培养液摇瓶中，于27℃，180rpm恒温摇床培养4天，加入无菌水450ml，混合均匀后，再以1wt％接种至灭菌好的虫草素发酵固体培养基中，充分搅拌使菌种均匀分布于虫草素发酵固体培养基中，每24h时以1wt％比例补水维持相对湿度，并搅拌翻料，同时从发酵罐底部通入相对湿度为80％的无菌空气，通气比为0.5min-1，27℃培养4天后，通气比降为0.5h-1，每5天以5wt％喷淋加入含有0.5g/L腺嘌呤和2～6g/L三油酸甘油酯的培养液使其产生大量的子实体，其余条件不变，再培养21天后发酵结束；加入1.5倍固料体积的水，80℃搅拌翻料2h，过滤收集滤液；水煮过程进行三次，合并滤液，浓缩至固料体积，得到虫草素提取液。
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