CN114437963B

CN114437963B - 橄榄链霉菌及其在生物合成香兰素中的应用

Info

Publication number: CN114437963B
Application number: CN202111616530.5A
Authority: CN
Inventors: 裴亮; 潘月; 华君; 华卿汝
Original assignee: Sichuan Ingia Biosynthetic Co ltd
Current assignee: Sichuan Ingia Biosynthetic Co ltd
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2023-08-22
Anticipated expiration: 2041-12-27
Also published as: CN114437963A

Abstract

本发明涉及橄榄链霉菌及其在生物合成香兰素中的应用，属于微生物技术领域。本发明解决的技术问题是提供一种橄榄链霉菌，该菌株拉丁名为Streptomycesolivaceus，于2021年08月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.23152。本发明提供的菌株可以催化转化阿魏酸得到香兰素，可采用粗品阿魏酸为原料，降低了成本，且得到的香兰素成品的纯度和产率仍然能够达到现有技术的水平。本发明提供的橄榄链霉菌的代谢产物也可以转化粗品阿魏酸生成香兰素。本发明制备香兰素的步骤简单，产品环境友好，安全可靠，具有很大的应用前景。

Description

橄榄链霉菌及其在生物合成香兰素中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及橄榄链霉菌及其在生物合成香兰素中的应用。

背景技术

香兰素(Vanillin)，又称香草醛，其化学名为3-甲氧基-4羟基苯甲醛，外观呈白色或微黄色针状结晶或粉末，具有香荚兰豆独特的香气，微溶于水，能够在潮湿的空气中被缓慢氧化为香兰酸。香兰素是一种主要的天然调味剂，目前广泛应用于制药、食品等行业。香兰素也是用于合成药物和其他香料的重要中间体。

香兰素的生成方法主要有植物提取法、化学合成法以及生物转化法。植物提取法是从天然香荚兰中提取香兰素，但是，天然植物中香兰素含量较低，提取困难收率较低导致成本加大，且香荚兰在种植过程中需要人工授粉，劳动程度大，难以大规模种植。因此植物提取的香兰素远远不能满足市场需要。化学合成法则是通过将丁香酚、木质素、乙醛酸和愈创木酚等作为底物，以低廉的成本和简单的工艺来生产香兰素。但是化学合成法往往造成严重的环境污染，并且其合成的香兰素在纯度、香味等方面远不及天然香兰素，且化学合成的香兰素的安全性也受到质疑。生物转化法是在细胞或酶等生物催化下进行的化学反应，既是指利用微生物(微生物的生长细胞、微生物的休止细胞)、酶(来自微生物或动植物的纯酶或粗酶) 或植物细胞，通过简单的生物转化或生物合成制备所需物质的方法。与化学催化剂相比，生物催化剂专一性更强、催化活性更高、条件更易控制。用生物转化法生产的香兰素与植物提取的天然香兰素等同(Natural-identical vanillin)，被称为生物香兰素(Bilogic Vanillin)。

目前，生物转化生产香兰素，主要是以微生物发酵法为主，涉及到的微生物主要有芽孢杆菌、沙雷氏菌、链球菌、大肠杆菌、假单胞菌等，其转化前体(即发酵底物)主要有阿魏酸、丁香酚、异丁香酚、香草醇、香草胺、松柏醇、芳香族氨基酸等天然化合物。其中，由于阿魏酸对微生物的毒性小、产生的副产物少，且可以从农副产品例如米糠、麸皮中提取，是常用的底物之一。利用微生物发酵法，将阿魏酸转化为香兰素已有报道，并且取得一定进展，但是距离工业化大规模地投入生产还是有一定的局限。

专利申请号为CN200610117386.X的中国发明专利公开了一株链霉菌及利用该链霉菌生物转化阿魏酸生产高浓度香兰素的方法。利用该菌株以GY转化培养基转化阿魏酸可得到高浓度香兰素发酵液，在阿魏酸补料转化过程中加入大孔吸附树脂DM11时香兰素浓度可大幅提高。

专利申请号为CN201110240035.9的中国发明专利公开了一种枯草芽孢杆菌及其生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，该方法以阿魏酸为底物的微生物转化法生产香兰素，转化效率达55～63％，且相比其它生物转化法节省成本30％。

专利申请号为CN201210324407.0的中国发明专利公开了一种植生拉乌尔菌及其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，通过菌种活化、制备种子培养液、发酵培养、转化发酵液，以得到高浓度香兰素发酵液。

专利申请号为CN201210117028.4的中国发明专利公开了桑肠杆菌及利用其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，按以下步骤进行：(1)菌种活化；(2)制备种子培养液；(3)发酵； (4)转化，转化发酵液在7000rpm/min条件下，12min离心处理，收集上清液，得到淡黄色天然香兰素发酵液。

专利申请号为CN201310140820.6的中国发明专利公开了一种地衣芽孢杆菌7172及其应用，使用地衣芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素是在高温条件下进行的，可以有效控制杂菌的生长，有利于工业生产。

专利申请号为CN201510446456.5的中国发明专利公开了一种沙链霉菌的用途及香兰素的生产方法，采用微生物发酵法生产香兰素，采用原料阿魏酸等，经过微生物代谢生成目标产物。

综上，现有的生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，均是利用高纯度的阿魏酸作为转化底物。因为粗品阿魏酸含有脂肪酸、醌类、酚类物质等，这些物质对微生物生长代谢有抑制作用，且香兰素本身对微生物也有一定毒性。由于毒性的存在，目前很少有利用粗品阿魏酸进行生物转化生产香兰素的报道。

发明内容

针对以上缺陷，本发明解决的技术问题是提供一种橄榄链霉菌，并将其应用在生物合成香兰素中，该橄榄链霉菌主要解决的技术问题在于能够转化粗品阿魏酸得到香兰素，降低了成本。

本发明橄榄链霉菌，其菌株拉丁名为Streptomyces olivaceus，于2021年08月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.23152。

本发明解决的第二个技术问题是提供本发明所述橄榄链霉菌的代谢产物。

本发明所述橄榄链霉菌的代谢产物，由上述橄榄链霉菌代谢产生。该代谢产物，也可用于催化转化粗品阿魏酸得到香兰素。

本发明解决的第三个技术问题是提供本发明所述橄榄链霉菌或其代谢产物在生物合成香兰素中的应用。

本发明还提供一种香兰素的生产方法。

本发明香兰素的生产方法，利用橄榄链霉菌作为转化菌株，阿魏酸为转化底物，进行生物转化，得到香兰素，其中，所述橄榄链霉菌为本发明所述的橄榄链霉菌。

在本发明优选的实施方式中，所述阿魏酸的纯度为50～98％。

在进一步优选的一些实施例中，所述阿魏酸的纯度为60～85％。

在本发明一个具体实施例中，所述香兰素的生产方法包括以下步骤：

1)菌体的培养：将橄榄链霉菌的菌种接种于培养基中培养，得到菌液；

2)阿魏酸的转化：将菌液与灭菌后的阿魏酸溶液混合，继续培养，得到含香兰素的发酵液；

3)产物收获：收获含香兰素的发酵液，去除菌体，将上清液进行分离纯化，获得香兰素。

在一个具体的实施方式中，步骤1)中，所述培养的具体方法为：先将菌种接种于斜面培养基，20～35℃培养2～3天，挑取表面菌丝体，接种于液体种子培养基，20～35℃培养2～ 3天获得种子液，再转接发酵培养基，20～35℃培养2～3天，得到菌液。

在一个具体的实施方式中，步骤2)中，菌液与灭菌后的阿魏酸溶液混合后，阿魏酸的有效浓度为1～50g/L；继续培养的培养时间为3～4天。

在一些实施方式中，步骤3)中，分离纯化的具体方法为：将上清液的pH值调节至弱碱性，采用大孔吸附树脂柱进行吸附，用纯水顶洗，再用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，将pH 调至酸性，浓缩，添加活性炭吸附色素和杂质，过滤后再次浓缩，结晶，得到香兰素。

本发明还提供一种阿魏酸生产香兰素的方法，利用橄榄链霉菌的代谢产物生产香兰素。

本发明阿魏酸生产香兰素的方法，采用上述橄榄链霉菌的代谢产物为催化剂，阿魏酸为转化底物，进行生物转化，得到香兰素。

在本发明的一个实施方式中，所述阿魏酸生产香兰素的方法包括以下步骤：

a、代谢产物的培养：将橄榄链霉菌的菌种接种于培养基中培养，收获发酵液，去除菌体，获得上清液；

b、阿魏酸的转化：向上清液中加入阿魏酸，配制成1～20g/L的溶液，继续转化4～5天，获得含香兰素的转化液；

c、产物收获：将含香兰素的转化液的pH值调节至弱碱性，采用大孔吸附树脂柱进行吸附，用纯水顶洗，再用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，将pH调至酸性，浓缩，添加活性炭吸附色素和杂质，过滤后再次浓缩，结晶，得到香兰素。

在一个优选的实施方式中，加入阿魏酸后，还加入大孔吸附树脂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了橄榄链霉菌Streptomyces olivaceus，该菌株可应用于制备香兰素，本发明提供的菌株可以催化转化阿魏酸得到香兰素，可采用粗品阿魏酸为原料，降低了成本，且得到的香兰素成品的纯度和产率仍然能够达到现有技术的水平。本发明提供的橄榄链霉菌的代谢产物也可以转化粗品阿魏酸生成香兰素。本发明制备香兰素的步骤简单，产品环境友好，安全可靠，具有很大的应用前景。

附图说明

图1为实施例1步骤(3)中发酵液的HPLC检测图。

具体实施方式

本发明橄榄链霉菌，其菌株拉丁名为Streptomyces olivaceus，于2021年08月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.23152。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明橄榄链霉菌，记做CGMCC-23152，能够转化粗品阿魏酸得到香兰素，降低了成本。

本发明所述橄榄链霉菌的代谢产物，由上述橄榄链霉菌CGMCC-23152代谢产生。该代谢产物的获取方法为本发明常规方法，比如，将橄榄链霉菌的菌种接种于培养基中培养，得到菌液，然后去除菌体，获得的上清液即为代谢产物。

本发明橄榄链霉菌的代谢产物，也可用于催化转化粗品阿魏酸得到香兰素。

本发明还提供一种香兰素的生产方法。

本发明香兰素的生产方法，利用橄榄链霉菌作为转化菌株，阿魏酸为转化底物，进行生物转化，得到香兰素，其中，所述橄榄链霉菌为本发明所述的橄榄链霉菌CGMCC-23152。

在本发明优选的实施方式中，所述阿魏酸的纯度为50～98％。为了节约成本，同时兼顾转化率，所述阿魏酸的纯度为60～85％。

进一步的，步骤1)中，所述培养的具体方法为：先将菌种接种于斜面培养基，20～35℃ 培养2～3天，挑取表面菌丝体，接种于液体种子培养基，20～35℃培养2～3天获得种子液，再转接发酵培养基，20～35℃培养2～3天，得到菌液。

在一个优选的实施例中，步骤1)所述培养的具体方法为：先将菌种接种于斜面培养基， 30℃培养3天，挑取表面菌丝体，接种于液体种子培养基，28℃、180r/min培养3天获得种子液，再按2％的比例转接发酵培养基，28℃、180r/min培养3天，得到菌液。

其中，斜面培养基按重量百分比包括以下成分：酵母浸粉0.4％，麦芽汁1％，葡萄糖0.4％，琼脂1.7％。

种子培养基按重量百分比包括以下成分：黄豆饼粉4％，葡萄糖3％，淀粉l％，碳酸钙 0.2％，pH调至6.0～8.0。

发酵培养基按重量百分比包括以下成分：七水硫酸镁0.05％，3水磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.2％，黄豆饼粉4％，酵母粉1％，葡萄糖1％，淀粉5％，pH调至6.0～8.0。

步骤2)中所述阿魏酸的纯度为50～98％，发酵液中阿魏酸的有效浓度为1～50g/L；继续培养的培养时间为3～4天。在一些具体的实施例中，所述阿魏酸的纯度为50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％等等。除特殊说明外，本发明所述的纯度均为重量百分比。

在一些实施方式中，步骤3)中，分离纯化的具体方法为：将上清液的pH值调节至弱碱性，采用大孔吸附树脂柱进行吸附，直至流出液中香兰素浓度达到上样液中的5～10％结束；用纯水顶洗，再用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，将pH调至酸性，浓缩为原体积的1/5，添加活性炭吸附色素和杂质，过滤后再次浓缩，结晶，得到香兰素。

本发明所述的弱碱性为pH值8.5～9.5。

优选的，将上清液的pH值调节至8.5～9.5，将洗脱后溶液的pH调节至1.0～6.5，活性炭添加量为1～5％，洗脱液为氢氧化钠乙醇溶液。

一种优选的实施方式为，离心除去菌体，将上清液的pH值调节至9.0，采用大孔吸附树脂柱进行吸附，大孔吸附树脂柱采用D201树脂，直至流出液中香兰素浓度达到上样液中的 5％结束。吸附结束后，采用5个柱体积的纯水顶洗大孔吸附树脂柱，再用10个柱体积的洗脱剂洗脱大孔吸附树脂柱，得到洗脱液。其中，洗脱剂为60％乙醇-1％氢氧化钠的氢氧化钠乙醇溶液。随后将洗脱液的pH调至5.0，浓缩为原体积的1/5，添加5％的活性炭吸附色素和杂质，80℃保温30分钟，过滤除去活性炭，将清液体积再浓缩1倍，结晶获得香兰素成品。

c、产物收获：将含香兰素的转化液的pH值调节至弱碱性，采用大孔吸附树脂柱进行吸附，直到流出液中香兰素浓度达到上样液中的5～10％结束；用纯水顶洗，再用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，将pH调至酸性，浓缩，添加活性炭吸附色素和杂质，过滤后再次浓缩，结晶，得到香兰素。

一种进一步优选的实施方案中，步骤b中，当加入阿魏酸并开始反应后，向溶液中加入大孔吸附树脂，添加量为100～200g/L转化液。转化结束后直接过滤收集含香兰素的大孔吸附树脂，用纯水洗涤后将含香兰素的大孔吸附树脂填装色谱柱，采用2个柱体积的纯水顶洗大孔吸附树脂，再用10个柱体积的洗脱剂洗脱大孔吸附树脂，得到洗脱液。洗脱的具体方法与步骤3)相同。相对于在步骤3)中使用大孔树脂进行动态吸附的方案，该进一步优选实施方案将转化液中产生的香兰素及时吸附，有助于促进阿魏酸的转化效果，且减少了分离纯化中的上样步骤，提高了效率。

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。本发明中如无特别说明，“％”均表示重量百分比。

实施例1

一种橄榄链霉菌菌株，该橄榄链霉菌的菌株拉丁名为Streptomyces olivaceus，于2021年 08月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.23152。

本实施例中所述橄榄链霉菌Streptomyces olivaceus，是由原始菌种诱变而得。其中，原始菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，编号为CICC 11001。

其诱变筛选方法如下：

(1)孢子液制备：将菌种接种于装有斜面培养基的试管，28～32℃培养3天。用20mL无菌生理盐水将斜面上的菌丝体洗下，倒入装有玻璃珠的无菌锥形瓶中，震荡25min，用无菌脱脂棉过滤，获得孢子液。

(2)诱变：取10mL孢子液放于无菌培养皿中，液面距离20W紫外灯30cm，照射90 s。照射完毕后在4℃避光静置30min，将孢子液加至琼脂平板上，涂布均匀，放置1小时，等培养基表面干燥，倒置于30℃恒温培养箱中培养72h，长出单菌落。

(3)筛选：挑取平板上长出的单菌落，接种于摇瓶培养基，28℃、180rpm培养5天，用HPLC法检测发酵液中香兰素生成情况。如图1所示，产物与香兰素标准品的出峰时间一致，证明所得产物为香兰素。图1中，上图为混合标准品的HPLC图，下图为本实施例发酵液样品的HPLC图。

其中，摇瓶培养基按重量百分比包括以下成分：硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.2％，黄豆饼粉4％，酵母粉1％，葡萄糖1％，淀粉5％，阿魏酸10g/L。

(4)复筛：将步骤3中香兰素产量较高(前20％样本数)的菌种在斜面培养基上接种培养，再接种于发酵培养基，28℃、180rpm培养3天，再加入终浓度10g/L的阿魏酸，继续培养3天，检测发酵液中香兰素生成情况。

(5)经过6轮的诱变筛选，获得一株产量最高的菌株，该菌株即为本发明涉及的橄榄链霉菌CGMCC-23152。

实施例2

香兰素的生产方法，具体包括以下步骤：

1.菌体的培养

1.1斜面培养：在无菌环境中挑取橄榄链霉菌CGMCC-23152的菌丝体或孢子，涂布于斜面培养基上，30℃培养3天。斜面培养基按重量百分比包括以下成分：酵母浸粉0.4％，麦芽汁1％，葡萄糖0.4％，琼脂1.7％。

1.2种子培养：在无菌环境中挑取斜面上的菌丝体或孢子，接种于种子培养基，30℃，180 r/min振荡培养3天。种子培养基按重量百分比包括以下成分：黄豆饼粉4％，葡萄糖3％，淀粉l％，碳酸钙0.2％，pH调至7.5。

1.3菌体发酵：将培养成熟的种子液按2％的比例接种于发酵培养基，28℃，180rpm振荡培养3天，得到菌液。发酵培养基按重量百分比包括以下成分：七水硫酸镁0.05％，3水磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.2％，黄豆饼粉4％，酵母粉1％，葡萄糖1％，淀粉5％，pH调至7.0。

2.阿魏酸的转化

向菌液中加入阿魏酸溶液，继续培养5天，得到含香兰素的发酵液。

本步骤中，分别采用纯度为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％的阿魏酸，菌液中阿魏酸的有效浓度均为10g/L，转化结束后，检测发酵液中香兰素的浓度，并计算转化率，结果见表1。

其中，香兰素转化率的计算方法为：

香兰素摩尔转化率＝香兰素摩尔浓度/阿魏酸起始摩尔浓度×100％。

表1

阿魏酸纯度

50％

55％

60％

65％

70％

75％

80％

85％

香兰素浓度，g/L

3.70

3.86

3.92

4.09

4.11

4.15

4.13

4.21

香兰素转化率，％

47.53％

49.59％

50.36％

52.54％

52.80％

53.32％

53.06％

54.09％

从表1的结果可以看出，50～85％纯度的阿魏酸作底物，都可以生产香兰素。随着阿魏酸纯度的提高，转化效果有一定提高。

3.产物收获

离心除去菌体，将上清液的pH值调节至9.0，采用大孔吸附树脂柱进行吸附，大孔吸附树脂柱采用D201树脂，直至流出液中香兰素浓度达到上样液中的5％结束。吸附结束后，采用5个柱体积的纯水顶洗大孔吸附树脂柱，再用10个柱体积的洗脱剂洗脱大孔吸附树脂柱，得到洗脱液。其中，洗脱剂为60％乙醇-1％氢氧化钠的氢氧化钠乙醇溶液。随后将洗脱液的 pH调至5.0，浓缩为原体积的1/5，添加5％的活性炭吸附色素和杂质，80℃保温30分钟，过滤后将清液体积再浓缩1倍，15℃水浴搅拌过夜，结晶获得香兰素粗品，纯度为92.1％。

对比例1

采用实施例2的方法，其区别仅在于菌体采用诱变前的原始菌，即CICC 11001，采用纯度为80％的阿魏酸进行转化，并计算转化率，具体步骤为：

1.菌体的培养

1.1斜面培养：在无菌环境中挑取橄榄链霉菌CICC 11001的菌丝体或孢子，涂布于斜面培养基上，30℃培养3天。斜面培养基按重量百分比包括以下成分：酵母浸粉0.4％，麦芽汁 1％，葡萄糖0.4％，琼脂1.7％。

2.阿魏酸的转化

向菌液中分批加入阿魏酸溶液，培养5天，得到含香兰素的发酵液。

本步骤中，阿魏酸采用纯度为85％的阿魏酸，菌液中阿魏酸的有效浓度均为10g/L。转化结束后，检测发酵液中香兰素的浓度，并计算香兰素转化率。结果显示，香兰素浓度为0.13 g/L，转化率为1.67％。

可见，采用现有的橄榄链霉菌，转化85％纯度的阿魏酸时，转化率很低，表明现有的微生物很难转化粗品阿魏酸。

实施例3

香兰素的生产方法，具体包括以下步骤：

1.菌体的培养

1.1无菌环境中挑取橄榄链霉菌CGMCC-23152的菌丝体或孢子，涂布于斜面培养基上， 30℃培养3天。斜面培养基按重量百分比包括以下成分：酵母浸粉0.4％，麦芽汁1％，葡萄糖0.4％，琼脂1.7％。

1.2种子培养：在无菌环境中挑取斜面上的菌丝体或孢子，接种于种子培养基，35℃，200 rpm振荡培养3天。种子培养基按重量百分比包括以下成分：黄豆饼粉4％，葡萄糖3％，淀粉l％，碳酸钙0.2％，pH调至7.5。

1.3菌体发酵：将培养成熟的种子液按8％的比例接种于发酵培养基，28℃，250rpm振荡培养4天，得到菌液。发酵培养基按重量百分比包括以下成分：七水硫酸镁0.05％，3水磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.2％，黄豆饼粉4％，酵母粉1％，葡萄糖1％，淀粉5％，pH调至7.0。

2.阿魏酸的转化

本步骤中，阿魏酸采用纯度为80％的阿魏酸，菌液中阿魏酸的有效浓度均为10g/L。阿魏酸的添加方式为：初始加入2g/L阿魏酸，第二天起追加投料2g/L/天。转化结束后，检测发酵液中香兰素的浓度，并计算香兰素转化率。结果显示，香兰素浓度为4.42g/L，转化率为 56.78％。

从结果可以看出：相对于实施例2中直接加入纯度为80％的阿魏酸，本实施例中分批加入阿魏酸的方式进一步提高了香兰素的转化率。

3.产物收获

离心除去菌体，将上清液的pH值调节至9.0，采用大孔吸附树脂柱进行吸附，大孔吸附树脂柱采用D201树脂，直至流出液中香兰素浓度达到上样液中的5％结束。吸附结束后，采用5个柱体积的纯水顶洗大孔吸附树脂柱，再用10个柱体积的洗脱剂洗脱大孔吸附树脂柱，得到洗脱液。其中，洗脱剂为60％乙醇-1％氢氧化钠的氢氧化钠乙醇溶液。随后将洗脱液的 pH调至5.0，浓缩为原体积的1/5，添加5％的活性炭吸附色素和杂质，80℃保温30分钟，过滤后将清液体积再浓缩1倍，15℃水浴搅拌过夜，结晶获得香兰素成品。

实施例4

香兰素的生产方法，具体包括以下步骤：

1.菌体的培养

无菌环境中挑取橄榄链霉菌CGMCC-23152的菌丝体或孢子，先将菌种接种于斜面培养基，30℃培养3天，挑取菌丝体接种于种子培养基，220r/min、30℃培养3天，再按照5％的比例接种于发酵培养基，200r/min、30℃培养5天，收获发酵液，去除菌体，获得上清液。

2.阿魏酸的转化

向上清液中加入一定量的阿魏酸，溶解阿魏酸配制成10g/L的溶液，25℃转化5天，获得含香兰素的转化液。

本步骤中，分别采用纯度为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％的阿魏酸，菌液中阿魏酸的有效浓度均为10g/L，转化结束后，检测发酵液中香兰素的浓度，并计算转化率，结果见表2。

表2

阿魏酸纯度

50％

55％

60％

65％

70％

75％

80％

85％

香兰素浓度，g/L

1.82

2.11

2.54

2.72

2.83

3.17

3.35

3.51

香兰素转化率，％

23.38％

27.11％

32.63％

34.94％

36.36％

40.73％

43.04％

45.09％

从表2的结果可以看出，不同纯度的阿魏酸都可以用橄榄链霉菌代谢产物进行转化生产香兰素，但转化效果不如菌液转化。

3.产物收获

将转化液的pH值调节至9.0，采用大孔吸附树脂柱进行吸附，大孔吸附树脂柱采用D201 树脂，直至流出液中香兰素浓度达到上样液中的5％结束。吸附结束后，采用5个柱体积的纯水顶洗大孔吸附树脂柱，再用10个柱体积的洗脱剂洗脱大孔吸附树脂柱，得到洗脱液。其中，洗脱剂为60％乙醇-1％氢氧化钠的氢氧化钠乙醇溶液。随后将洗脱液的pH调至5.0，浓缩为原体积的1/5，添加5％的活性炭吸附色素和杂质，80℃保温30分钟，过滤后将清液体积再浓缩1倍，15℃水浴搅拌过夜，结晶获得香兰素粗品，纯度为90.2％。

实施例5

香兰素的生产方法，具体包括以下步骤：

1.菌体的培养

2.阿魏酸的转化

向上清液中加入一定量纯度为80％的阿魏酸，溶解阿魏酸配制成10g/L的溶液，并加入转化液100g/L的D201大孔吸附树脂，25℃、150rpm转化5天，获得含香兰素的转化液。用无水乙醇稀释转化液，并解吸大孔树脂吸附的物质，检测香兰素的浓度。香兰素浓度为3.79 g/L，转化率为48.69％。

从结果可以看出：相对于实施例4中的液体转化体系，本实施例中加入大孔树脂，及时除去体系中生成的香兰素产物，有助于提高底物阿魏酸的转化效果。

3.产物收获

过滤含香兰素的转化液收集含香兰素的大孔吸附树脂，用纯水洗涤后将含香兰素的大孔吸附树脂填装色谱柱，采用2个柱体积的纯水顶洗大孔吸附树脂，在用10个柱体积的洗脱剂洗脱大孔吸附树脂，得到洗脱液。其中，洗脱剂为60％乙醇-1％氢氧化钠的氢氧化钠乙醇溶液。随后将洗脱液的pH调至5.0，浓缩为原体积的1/5，添加5％的活性炭吸附色素和杂质， 80℃保温30分钟，过滤后将清液体积再浓缩1倍，15℃水浴搅拌过夜，结晶获得香兰素粗品，纯度为90.7％。

Claims

1.橄榄链霉菌，其特征在于：所述橄榄链霉菌的菌株拉丁名为Streptomyces olivaceus，于2021年08月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.23152。

2.权利要求1所述的橄榄链霉菌在生物合成香兰素中的应用。

3.一种香兰素的生产方法，其特征在于：利用橄榄链霉菌作为转化菌株，阿魏酸为转化底物，进行生物转化，得到香兰素，其中，所述橄榄链霉菌为权利要求1所述的橄榄链霉菌。

4.根据权利要求3所述的香兰素的生产方法，其特征在于：阿魏酸的纯度为50～98%。

5.根据权利要求4所述的香兰素的生产方法，其特征在于：阿魏酸的纯度为60～85%。

6.根据权利要求3所述的香兰素的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）菌体的培养：将橄榄链霉菌的菌种接种于培养基中培养，得到菌液；

2）阿魏酸的转化：将菌液与灭菌后的阿魏酸溶液混合，继续培养，得到含香兰素的发酵液；

3）产物收获：收获含香兰素的发酵液，去除菌体，将上清液进行分离纯化，获得香兰素。

7.根据权利要求6所述的香兰素的生产方法，其特征在于：步骤1）中，所述培养的具体方法为：先将菌种接种于斜面培养基，20～35℃培养2～3天，挑取表面菌丝体，接种于液体种子培养基，20～35℃培养2～3天获得种子液，再转接发酵培养基，20～35℃培养2～3天，得到菌液；步骤2）中，菌液与灭菌后的阿魏酸溶液混合后，阿魏酸的有效浓度为1～50g/L；继续培养的培养时间为3～4天。

8.根据权利要求6所述的香兰素的生产方法，其特征在于：步骤3）中，分离纯化的具体方法为：将上清液的pH值调节至弱碱性，采用大孔吸附树脂柱进行吸附，用纯水顶洗，再用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，将pH调至酸性，浓缩，添加活性炭吸附色素和杂质，过滤后再次浓缩，结晶，得到香兰素。

9.一种阿魏酸生产香兰素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、代谢产物的培养：将权利要求1所述的橄榄链霉菌的菌种接种于培养基中培养，收获发酵液，去除菌体，获得上清液；

b、阿魏酸的转化：向上清液中加入阿魏酸，配制成1～20g/L的溶液，继续转化4～5天，获得含香兰素的转化液；c、产物收获：将含香兰素的转化液的pH值调节至弱碱性，采用大孔吸附树脂柱进行吸附，用纯水顶洗，再用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，将pH调至酸性，浓缩，添加活性炭吸附色素和杂质，过滤后再次浓缩，结晶，得到香兰素。

10.根据权利要求9所述的阿魏酸生产香兰素的方法，其特征在于：步骤b中，加入阿魏酸后，还加入大孔吸附树脂。