CN117480240A - 回收利用细胞培养基的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开部分地提供了用于回收利用细胞培养基的系统。还提供了用于回收利用细胞培养基的方法。这种系统和方法可用于生产培养肉或从患者血液中去除废产物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年5月10日提交的美国临时申请第63/186,334的权益，所述临时申请的公开内容通过引用以其整体并入本文。
领域
本公开总体上涉及液体过滤和回收利用。更具体地，本公开涉及用于回收利用细胞培养基的系统和方法，以及在培养基中扩增细胞并由此生产培养肉的方法。
背景
细胞、蛋白质或疫苗的大规模生物制造基本上有两种主要方法：分批补料或灌注。在分批补料方法中，细胞在体积高达25,000升的生物反应器中生长，并连续地进料营养物，直至毒素达到阈值(通常氨为5mM)且细胞达到直至3000万个细胞/ml的密度。在灌注方法中，通过膜(通常是中空纤维膜)过滤细胞悬浮液来连续更换培养基。这使毒素被洗掉，同时允许细胞在高达5,000升的生物反应器中达到直至2.7亿个细胞/ml的密度。然而，灌注方法浪费多倍容器体积的培养基，使得生产比补料分批方法更昂贵(尽管工厂成本低30％)。
美国专利第5,071,561号公开了通过使含水培养基与支撑液膜(supported-fluidmembrane)(其中所述支撑物是微孔疏水性聚合物膜基质)的一侧接触；以及保持膜再生液(strip solution)与所述膜的另一侧接触而从细胞培养物中去除氨的方法和装置。FidelRey等人(Cytotechnology 6:121-130；1991)公开了利用沸石填充床从动物细胞培养物中选择性去除氨。
目前世界人口超过70亿，并且仍在快速增长。为了满足日益增长的人口的营养需求，越来越多的土地被专用于食物生产。目前的天然来源不足以满足对动物蛋白日益增长的需求。这导致了世界上一些地方的饥荒。在世界其它地方，该问题正在通过在恶劣条件下在密集的工厂化农场中大规模生产动物来解决。这种大规模生产不仅给动物造成巨大痛苦，而且由于有机砷化合物和抗生素用于提高食物效率和控制感染而使肉制品中的砷水平升高和耐药性细菌增加，从而进一步增加了疾病的数量并恶化了其对动物和人的后果。需要大规模屠宰来满足当前的食品需求，因此，其可导致大规模的疾病爆发，诸如猪瘟病毒、禽流感和疯牛病的发生。这些疾病导致人类食用肉的损失，从而完全否定了最初饲养动物的目的。
另外，大规模生产消减了成品的风味。偏好存在于那些能够负担非层架式养鸡场所产的蛋和非层架式养鸡场所产的肉的人群中。这不仅是味道的问题，也是更健康的选择，从而避免消费各种饲料添加剂，诸如生长激素。与大规模动物生产相关的另一个问题是由动物的大量粪便物引起的环境问题，随后环境不得不处理这些问题。此外，目前生产动物或动物饲料所需的大量土地不能用于其它目的(诸如种植其它作物、住房、娱乐、野生自然和森林)，这是一个问题。
自农业革命开始以来，鸡肉一直是膳食蛋白质的主要来源。传统上，生产是地方性的，其中家庭和后来的小村庄生长他们自己的用谷物饲养的动物。然而，由工业革命驱动的快速城市化和人口增长导致了集约耕作方法的发展。在美国，工厂化农场现在每年生产近90亿只鸡，其中动物生长和运输产生了18％的当前温室气体排放。本发明人认识到大量鸡肉(例如，在美国超过70％)含有不安全水平的砷和抗生素耐药性细菌。人们还认识到，运输和动物密度导致鸡肉的广泛粪便污染，这导致沙门氏菌感染增加。
实验室生长的肉允许在无菌条件下由动物细胞生长肉。本发明人发现，在不使用动物产品诸如胎牛血清的情况下，可以生产每单位质量肉制品足够量的细胞(例如，每克约500至约200×106个细胞)。然而，尽管在过去的50年中已经开发了许多用于生物学研究的细胞培养技术，但是本发明人发现此类培养技术极其浪费，需要大量的培养基来生产少量的实验室生长的肉。例如，已知的技术需要约230升的体积来生产约1kg的肉，仅基于培养基成本，转换成每千克至少4,600美元的成本。
本领域已知技术的主要问题之一是，生产时间长，成本极高，产品质量一般，不能也不会取代目前的牲畜肉。例如，Just-Inc.在培养基中培养提取的动物细胞来制造鸡块，每块鸡块的制造成本为50美元。
用于体外实验或离体培养的细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)的培养(以用于向人或动物施用)是研究和治疗人疾病的重要工具。细胞培养广泛用于生产各种生物活性产品，例如病毒疫苗、单克隆抗体、多肽生长因子、激素、酶、肿瘤特异性抗原和食品。然而，用于培养细胞的许多培养基或方法包含对细胞生长和/或未分化细胞培养物的维持具有负面影响的组分。例如，哺乳动物或昆虫细胞培养基通常补充有血源性血清，诸如胎牛血清(FCS)或胎牛血清(FBS),以提供促进培养细胞增殖和生长的生长因子、载体蛋白、附着和铺展因子、营养物和微量元素。然而，在FCS或FBS中发现的因子，诸如转化生长因子(TGF)β或视黄酸，可以促进某些细胞类型的分化(Ke等人，Am J Pathol.137:833-43,1990)或在细胞中启动非预期的下游信号传导，其促进培养物中不需要的细胞活性(Veldhoen等人，NatImmunol.7(11):1151-6,2006)。
培养基的成本是培养肉生产成本的主要驱动因素。培养基由相对简单的基础培养基组成，该基础培养基包含碳水化合物、氨基酸、维生素和矿物质以及昂贵得多的血清替代组分，包括：白蛋白、生长因子、酶、附着因子和激素。好食品研究所(the Good FoodInstitute)最近的分析表明，血清替代蛋白占培养基成本超过99％。
需要有成本效益的细胞培养基，以及从细胞培养基中有效过滤废料并回收利用该培养基用于细胞、蛋白质或疫苗的大规模生物制造的改进的系统或方法。本发明满足了这一长期需求。
概述
本公开部分地提供了用于将液体培养基中的废料与必需物质分离、再生和回收利用培养基以供连续使用的系统和方法。虽然所述系统或方法可用于处理大量的液体制剂或组合物，但是本公开旨在使用这些系统作为高效且简单的方式，以将细胞培养基的废物组分与必需组分分离，并回收利用所述培养基以供连续使用。
因此，本公开的一个方面提供了用于回收利用细胞培养基的系统。此类系统包括用于从生物反应器中移取细胞培养基的装置，用于过滤细胞培养基从而获得废培养基和浓缩培养基的装置。废培养基包含至少一种废料并且可以不含有任何细胞和大的蛋白质。当浓缩培养基循环回生物反应器时，进一步处理废培养基以获得再生培养基。再生培养基可以减少或基本上不含有至少一种废料。
为了进一步处理废培养基，在一些方面，该系统包括用于酸化废培养基的装置，和用于对酸化的废培养基进行纳米过滤从而从废培养基中除去至少一种废料或降低其浓度并获得基本上减少/不含有所述至少一种废料的再生培养基的装置。可将再生培养基循环回到生物反应器中，从而回收利用细胞培养基。在一些方面，再生培养基直接流回到在回路中的系统中。在一些方面，可从系统中移取再生培养基并储存以备将来使用。在一些方面，可将再生培养基在回收利用或将来使用之前进一步与新鲜培养基或回收利用的培养基混合。在一些方面，可从系统中移取废培养基，并使用独立的系统进行处理，以获得再生培养基。
在一些实施方案中，细胞培养基包含选自由以下各项组成的组的一种或多种物质：细胞、组织、营养物、补充剂、进料、氨基酸、肽、蛋白质、维生素、多胺、糖类、碳水化合物、脂质、核酸、激素、脂肪酸、痕量物质和废料。作为非限制性的实例，细胞培养基可包含血细胞。
在一些实施方案中，一种或多种废料干扰细胞的期望生长和/或期望的分化，其包括但不限于氨、乳酸盐、毒素、钠盐、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、铵、活性氧和氮物质。在一些实施方案中，废料具有不大于60kDa的分子量。作为非限制性实例，至少一种废料可包括氨、铵和/或乳酸盐。
在一些实施方案中，细胞培养基包含为抗体生产或培养肉生产而培养的组织。当从细胞培养基中除去废料时，将任何产生的抗体和产生的培养肉保留在细胞培养基中。在一些方面，该系统包括过滤装置或离心装置或两者。在一些方面，过滤装置可包括交替切向流(ATF)过滤系统。在一些方面，ATF可包括微滤装置。在一些方面，ATF可包括超滤装置。在一些实施方案中，过滤装置包括至少一根中空纤维。在一些实施方案中，中空纤维壁的孔隙率分布被配置成提供仅允许小于60kDa的分子通过的平均孔径和孔密度。在一些实施方案中，孔密度为每个中空纤维的壁表面的至少10％。
在一些实施方案中，过滤装置包括密度离心或其它形式的连续离心，从而产生基本上不含有细胞和大的蛋白质的废培养基。在一些实施方案中，过滤装置可包括超声细胞截留或转鼓和错流过滤。
在一些实施方案中，浓缩培养基包含细胞和用于细胞生长和/或分化的必需物质，并在通过过滤装置后循环回到生物反应器中。
当浓缩培养基循环回生物反应器时，废培养基进行进一步处理。在一些方面，废培养基可以直接流入酸化装置。在一些方面，废培养基首先流过超滤装置，然后进一步引导至酸化装置。
在一些实施方案中，用于酸化废培养基的方式包括使废培养基经过阳离子交换柱和/或向废培养基中加入酸。在一些实施方案中，阳离子交换柱包含至少一种阳离子树脂。作为非限制性实例，阳离子交换柱可包含AmberLite FPC88。
在一些实施方案中，可加入酸来酸化废培养基。作为非限制性实例，酸可以是HCl、硫酸、硝酸、磷酸、碳酸、柠檬酸或乙酸。在一些实施方案中，酸化的废培养基具有小于4的pH值。作为非限制性实例，酸化的废培养基的pH值约为2。
酸化的废培养基进一步经过纳米过滤。在一些实施方案中，纳米过滤也以渗滤模式进行，其包括在纳米过滤之前用去离子水预稀释酸化的废培养基。在一些实施方案中，纳米过滤具有约150至约300Da的分子量截断值。
在一些实施方案中，从纳米过滤后的酸化废培养基中回收废料，其包括但不限于氨、铵和乳酸盐。在一些实施方案中，这些组分被进一步分别地和回收。回收的单独的组分可具有可以作为单独产品出售的商业价值。
在一些实施方案中，再生培养基包含葡萄糖和分子量大于150Da的脂肪酸，并通过中和其pH值进行进一步处理。在一些实施方案中，中和方法包括将再生培养基经历阴离子交换柱。在一些实施方案中，阴离子交换柱包含至少一种阴离子树脂。作为非限制性实例，阴离子交换柱可包含FPA55。
在一些实施方案中，可加入碱来中和再生培养基的酸性。作为非限制性实例，碱可以是NaOH、碳酸氢钠、氢氧化钾、氢氧化镁或氢氧化钙。在一些实施方案中，再生培养基的pH被调节至pH>6。作为非限制性实例，再生培养基的pH值约为7。
在一些实施方案中，再生培养基的渗透压被调节至低于360毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)水。作为非限制性实例，再生培养基的渗透压约为280mOsm/kg。
对于上文和本文描述的任何系统，在细胞培养基中扩增生物质以生产培养肉。
本公开的另一个方面提供了用于回收利用细胞培养基的方法。这种方法包括从生物反应器中移出细胞培养基；过滤细胞培养基，从而获得废培养基和浓缩培养基；酸化废培养基；以及对酸化的废培养基进行纳米过滤，从而从废培养基中除去至少一种废料，并获得至少一种废料减少的再生培养基以用于回收利用。在一些实施方案中，再生培养基基本上不含有至少一种废料以用于回收利用。在该方法中，在过滤时，废培养基包含至少一种废料，并且基本上不含有细胞和大的蛋白质，并且浓缩培养基减少了/不含有至少一种废料。当浓缩培养基循环回生物反应器时，进一步处理废培养基。
在一些实施方案中，细胞培养基包含选自由以下各项组成的组的一种或多种物质：细胞、组织、营养物、补充剂、进料、氨基酸、肽、蛋白质、维生素、多胺、糖、碳水化合物、脂质、核酸、激素、脂肪酸、痕量物质和废料。作为非限制性的实例，细胞培养基可包含血细胞。
在一些实施方案中，一种或多种废料干扰细胞的期望生长和/或期望的分化，其包括但不限于氨、乳酸盐、毒素、钠盐、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、铵、活性氧和氮物质。在一些实施方案中，废料具有不大于60kDa的分子量。作为非限制性实例，至少一种废料可包括氨、铵和/或乳酸盐。
在一些实施方案中，细胞培养基包含为抗体生产或培养肉生产而培养的组织。当从细胞培养基中除去废料时，任何产生的抗体和产生的培养肉被保留在细胞培养基中。
在一些实施方案中，离开生物反应器的细胞培养基流过至少一根中空纤维以进行过滤。在一些实施方案中，中空纤维壁的孔隙率分布被配置成提供仅允许小于60kDa的分子通过的平均孔径和孔密度。在一些实施方案中，孔密度为每个中空纤维的壁表面的至少10％。
在一些实施方案中，浓缩培养基包含细胞和用于细胞生长和/或分化的必需物质，并且被循环回生物反应器中用于连续使用。
当浓缩培养基循环回生物反应器时，废培养基进行进一步处理。在一些实施方案中，使废培养基经过阳离子交换柱和/或添加酸。在一些实施方案中，阳离子交换柱包含至少一种阳离子树脂。作为非限制性实例，阳离子交换柱可包含AmberLite FPC88。
在一些实施方案中，可以加入酸来酸化废培养基。在一些实施方案中，酸化的废培养基具有小于4的pH值。作为非限制性实例，酸化的废培养基的pH值约为2。
对酸化的废培养基进一步进行纳米过滤。在一些实施方案中，纳米过滤也以渗滤模式进行，其包括在纳米过滤之前用去离子水预稀释酸化的废培养基。在一些实施方案中，纳米过滤具有约150至约300Da的分子量截断值。
在一些实施方案中，上文和本文所述的方法可进一步包括在纳米过滤后从酸化的废培养基中回收废料；分离废料的组分；以及回收单独的组分。在一些实施方案中，废料包括氨、铵和/或乳酸盐，并且回收的单独的组分可具有可以作为单独产品出售的商业价值。
在一些实施方案中，再生培养基包含葡萄糖和分子量大于150Da的脂肪酸，并进一步对其进行pH中和。在一些实施方案中，使再生培养基经历阴离子交换柱。在一些实施方案中，阴离子交换柱包含至少一种阴离子树脂。作为非限制性实例，阴离子交换柱可包含FPA55。
在一些实施方案中，可加入碱来中和再生培养基的酸性。作为非限制性实例，碱可以是NaOH、碳酸氢钠、氢氧化钾、氢氧化镁或氢氧化钙。在一些实施方案中，再生培养基的pH被调节至pH>6。作为非限制性实例，再生培养基的pH值约为7。
在一些实施方案中，再生培养基的渗透压被调节至低于360毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)水。作为非限制性实例，再生培养基的渗透压约为280mOsm/kg。
对于上文和本文所述的任何方法，回收利用的细胞培养基可用于生产培养肉。
本公开的一些方面提供了用于在生物反应器中扩增细胞的方法。该方法包括在包含营养物和废物分子的细胞培养基中培养组织；以及根据上文和本文公开的方法回收利用细胞培养基并就此从培养基中减少废物分子的量或除去废物分子。在一些实施方案中，扩增的细胞用于生产培养肉。
本公开的又一些方面提供了用于从患者血液中减少或去除废产物的方法。该方法包括使用透析从患者获得血液；过滤血液以获得含有废产物的无蛋白血浆；以及根据上文和本文公开的方法回收无蛋白血浆并就此从血浆中减少废产物的量或除去废产物。
附图说明
为了更好地理解本文公开的主题并且为了举例说明在实践中可以如何实施其，现在将参考附图仅通过非限制性示例来描述实施方案，其中：
图1A是用于回收利用细胞培养基的再生系统的示意图。
图1B是使用离心装置7回收利用细胞培养基的替代再生系统的示意图。
图1C是用于回收利用细胞培养基的再生系统的示意图，所述再生系统还包括在2处具有微滤装置的超滤单元8。
图2A是细胞培养系统的示意图，其中培养基是新鲜的。
图2B是用于回收利用细胞培养基的再生系统的示意图，其中培养基是回收利用的培养基与新鲜培养基的混合物。
图2C是其中培养基是完全再生的培养基的再生系统的示意图。
图3是永生化成纤维细胞SCF-2细胞群的示例性中试生产运行的示意图。(1)生物反应器，(2)ATF 50kDa，(3)再生罐，(4)纳米过滤，(6)阴离子交换柱。生物反应器具有270L的工作容积(Solaris)。所用的酸是盐酸。纳米过滤采用DK膜。所用的碱是氢氧化钠。
图4A是提供了在2L生物反应器中生长永生化成纤维细胞、SCF-2细胞的增长率的图。正方形代表灌注中使用新鲜培养基的运行。该运行中的最大灌注速率为26L/天。三角形表示在灌注中使用29％的回收利用的培养基与71％的新鲜培养基的混合物的运行。该运行的最大灌注速率为10L/天。圆圈代表使用27％的再生培养基与73％的新鲜培养基的混合物的运行。
图4B是显示在再生阶段过程中谷氨酰胺、谷氨酸盐、葡萄糖、乳酸盐、铵、钠和渗透压降低的柱状图。
图5A是显示灌注速率(VVD)随时间变化的图，其中灌注从第7天开始使用50％的再生培养基。在第6天、第7天和第8天分别收获约30L、80L和60L细胞培养物。
图5B是显示灌注速率(VVD)随时间变化的图，其中灌注从第6天开始使用50％的再生培养基。在第6天和第7天分别收获约25L和36L。
图5C是显示灌注速率(VVD)随时间变化的图，其中灌注从第8天开始使用50％的再生培养基。在第7天和第8天分别收获约50L和70L。
图6是显示生产中试规模运行I的氨基酸保留％值的柱状图。该方法的保留定义为再生处理后氨基酸浓度相对于再生处理前浓度的百分比。用UPLC(Agilent)测量氨基酸浓度。
图7示出了使用各种类型的树脂的渗透压(黑条)、乳酸盐(白条)和铵(灰条)的减少测量。在掺有乳酸钠、氯化铵和氯化钠的DMEM-高葡萄糖培养基中进行筛选测试。乳酸盐和乳酸铵的初始浓度分别为45±15mmole/L和10mmole/L(铵)。渗透压被调节至430±30mOsm/kg。筛选测试在树脂床浓度为10％w/v的多孔板(120rpm)中进行。由树脂混合物组成的床由55％阴离子型和45％阳离子型组成。
图8示出了在掺有48mmole/L乳酸盐的DMEM-高葡萄糖培养基中对AmberLiteFPC88存在的平衡时的pH响应。
图9是示出对谷氨酰胺渗透物(斜条)、谷氨酸渗透物(横条)、葡萄糖渗透物(点状)、乳酸盐渗透物(黑色)、铵渗透物(白色)和渗透压(灰色)的纳米过滤去除的柱状图。在三种pH值：2、4和7(上部水平轴)下，通过各种纳米过滤膜(下部水平轴)进行筛选。进料是由DMEM组成的生长培养基，其特征在于30±13mM乳酸盐、1.3±0.8mM铵和381±53mOsm/kg。操作压力为10.5巴，回收率为70％。
图10是显示在pH 7.5(斜线条纹)、6.1(水平条纹)、3.9(灰色)、3.1(黑色)和2.0(白色)时通过DL膜的对渗透物的纳米过滤去除的柱状图。进料是由DMEM组成的生长培养基，其特征在于26±1mM乳酸盐、1.9±0.1mM铵和343±20mOsm/kg。操作压力为10.5巴，回收率为70％。
图11是通过纳米过滤和离子交换处理显示去除的柱状图。通过用预先负载有质子的AmberLite FPC88树脂填充的阳离子交换柱(灰色条)预处理，或通过用HCl滴定，将pH降低至所需的设定点。纳米过滤方法以黑条给出。还通过在纳米过滤阶段之前用去离子水将培养基预稀释2倍(白色条)来进行渗滤。堆叠的柱表示离子交换预处理和纳米过滤或渗滤阶段中每种元素的去除。进料是由DMEM组成的生长培养基，其特征在于37±4mM乳酸盐、3.5±1.7mM铵和383±61mOsm/kg。操作压力为10.5巴，回收率为70％。
图12是描述废培养基(黑色)、超滤渗透物(白色，低于检测限)、超滤后纳米过滤(灰色)和无在先超滤步骤的纳米过滤(黑色斜线)的牛血清白蛋白含量的柱状图。
图13是描述废培养基(黑色圆圈)、超滤后接着纳米过滤后的培养基(白色正方形)和无在先超滤步骤的纳米过滤后的培养基(白色三角形)的通过微过滤器(0.22mm,PVDF,8.5cm2)的流速的图。用UF10(TriSepTM)膜进行超滤。在通过加入盐酸将pH降低至2.8后，用DK膜进行纳米过滤。将每次处理的浓缩物流(有和无先前的超滤步骤)中和至pH 7.1，并稀释至300mOsm/kg。
详细描述
为了促进对本公开的原理的理解，现在将参考实施方案，并且将使用特定的语言来描述所述实施方案。然而，应当理解，并不因此意图限制本公开的范围，如本文所示的对本公开的这种改变和进一步修改被认为是本公开所涉及的领域的技术人员通常会想到的。
本文使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案，而不是旨在限制本发明。
如本文中所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”及其词形变化形式表示“包括但不限于”。术语“由......组成”意指“包括并限于”。术语“基本上由......组成”意指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但前提是另外的成分、步骤和/或部分没有实质上改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖的特征。
如本文中所用，“不含有(devoid of)”、“不含(free)”(如在“不含蛋白质”中)、“基本上不含有(essentially devoid of)”或“基本上不含(essentially free)”意指检测不到污染物的量或少量或微不足道的量。术语“检测不到的”被理解为基于本申请时本领域已知的标准检测方法。在一些实施方案中，“少量”指少于1重量％。
如本文中所用，术语“减少的”被理解为意指相对于未经处理的培养基，培养基中组分(例如“废料”或“蛋白质”)的量减少。术语减少的被理解为基于本申请时本领域已知的特定废物组分的标准检测方法。在一些方面，相对于未经处理的培养基，组分可以减少约80％至约85％，或约85％至约90％，或约90％至约95％，或约95％至约99％，或约99％至约100％。在一些方面，术语减少的还可以涵盖组分的“不可检测的”量或少量或微不足道的量。在其中组分是“不可检测的”的此类特定方面，该术语可以与含义“不含有”、“不含”(如在“不含蛋白质”中)、“基本上不含有”或“基本不含”互换使用。
如本文中所用，术语“一种或多种废料”和“一种或多种废物分子”可互换。这些是干扰在细胞培养基中培养的细胞的期望生长和/或期望分化(例如，抑制细胞生长和/或分化或诱导细胞死亡)的任何物质/分子。这些物质/分子通常选自矿物质(主要是钠盐)和小分子(低分子量分子)。作为非限制性实例，废料/分子包括但不限于氨、乳酸盐、毒素、钠盐、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、铵、活性氧和氮物质。
如本文中所用，术语“培养基”或“细胞培养基”涵盖本领域已知的任何此类培养基，包括细胞悬浮液、血液和包含生物来源成分的组合物。此类培养基和培养物可包含细胞(哺乳动物细胞、鸡细胞、甲壳动物细胞、鱼细胞和其它细胞)、血液组分、营养物、补充剂和进料、氨基酸、肽、蛋白质和生长因子(诸如白蛋白、过氧化氢酶、转铁蛋白、成纤维细胞生长因子(FGF)等)、维生素、多胺、糖类、碳水化合物、脂类、核酸、激素、脂肪酸、痕量物质、某些盐(诸如钾盐、钙盐、镁盐)以及废料诸如氨、乳酸盐、毒素和钠盐。培养基通常是促进所需细胞活性(诸如培养基中培养的细胞的活力、生长、增殖、分化)的基于水的溶液。培养基的pH值应该适合待生长的微生物。大多数细菌在pH 6.5-7.0时生长，而大多数动物细胞在pH7.2-7.4时生长旺盛。
如本文中所用，“中空纤维”是细长的管状膜，其可由聚合材料或其它材料特别制备，或者可商购获得。作为非限制性实例，可以根据本公开使用、修饰或改造的中空纤维和采用该中空纤维的系统包括在美国专利第9,738,918号、第9,593,359号、第9,574,977号、第9,534,989号、第9,446,354号、第9,295,824号、第8,956,880号、第8,758,623号、第8,726,744号、第8,677,839号、第8,677,840号、第8,584,536号、第8,584,535号和第8,110,112号(其每一篇均通过引用并入本文)中公开的那些。
“渗滤(DF)”意指稀释浓缩物并将稀释的浓缩物重新施加到膜上的过程。
“微滤(MF)”意指将液体/悬浮液输送至孔径为0.1至10μm的膜上的过程。
“纳米过滤(NF)”意指将液体/悬浮液输送到孔径为10至的膜上的过程，包括带电荷的膜，诸例如带负电荷的膜的使用。
“超滤(UF)”意指将液体/悬浮液输送到孔径为30至的膜上的过程。
如本文中所用，术语“方法(method)”或“方法(methods)”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或由其从已知方式、手段、技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。
贯穿本申请，各种实施方案可以以范围格式来呈现各种实施方案。应该理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应该被解释为对本发明范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，诸如从1至6的范围的描述应该被认为具有具体公开的子范围，诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。这适用于任何范围的宽度。
无论何时在本文中指出数值范围，其意指包括在指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语在第一指示数与第二指示数“之间变化(ranging)/变化(ranges)”和“从”第一指示数“变化(ranging)/变化(ranges)至”第二指示数在本文中可互换使用，并且意指包括第一和第二指示数以及其间的所有分数和整数。
本公开部分地提供了从细胞培养基中有效过滤废料并回收利用所述培养基用于大规模生物制造细胞、蛋白质或疫苗的改进的系统或方法。上文和本文公开的系统和方法将液体培养基中的必需物质与废料分离，并再生和回收利用所述培养基以供连续使用，从而提供具有成本效益的细胞培养基。虽然所述系统或方法可用于处理大量的液体制剂或组合物，但是本公开集中于使用这些系统和方法作为高效且简单的方式来将细胞培养基的废物组分与必需物质分离，并回收利用所述培养基以供连续使用。
因此，本公开的一个方面提供了用于回收利用细胞培养基的系统。在一些方面，该系统包括生物反应器和再生系统。在某些方面，生物反应器和再生系统是连通的。在一些方面，生物反应器和再生系统可以作为回路操作，例如，来自生物反应器的废培养基流入再生系统，并且再生培养基被反馈回生物反应器。在一些方面，再生系统独立于生物反应器，并且生物反应器包括用于收获废培养基以在再生系统中进一步处理的装置。在一些方面，所公开的再生系统包括过滤(MF或UF)和/或离心装置、超滤(UF)装置、酸化装置、渗透压调节装置、纳米过滤(NF)装置、中和装置中的一种或多种。在一些方面，系统还可包括用于收获细胞、产物和培养基组分中的一种或多种以供进一步处理的装置。
在一些方面，系统包括用于从生物反应器中移出细胞培养基的装置、用于过滤细胞培养基从而获得废培养基和浓缩培养基的装置。废培养基包含至少一种废料，并且基本上不含有任何细胞和大的蛋白质。当浓缩培养基循环回生物反应器时，进一步处理废培养基。
为了进一步处理废培养基，系统包括用于酸化废培养基的装置，和用于将酸化的废培养基进行纳米过滤，从而从废培养基中去除至少一种废料并获得至少一种废料减少的再生培养基的装置。再生培养基可以基本上不含有至少一种废料。在一些方面，系统可以任选地包括在酸化和纳米过滤之前对废培养基进行超滤的装置。进一步处理再生培养基并将其循环回到生物反应器中，从而细胞培养基得以回收利用。
在一些实施方案中，细胞培养基包含选自由以下各项组成的组的一种或多种物质：细胞、组织、营养物、补充剂、进料、氨基酸、肽、蛋白质、维生素、多胺、糖、碳水化合物、脂质、核酸、激素、脂肪酸、痕量物质和废料。作为非限制性的实例，细胞培养基可包含血细胞。
在一些实施方案中，废料是干扰在细胞培养基中培养的细胞的期望生长和/或期望分化的任何物质。例如，废料可抑制细胞生长和/或分化或诱导细胞死亡。在一些实施方案中，一种或多种废料包括但不限于氨、乳酸盐、毒素、钠盐、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、铵、活性氧和氮物质。作为非限制性实例，至少一种废料可包括氨、铵和/或乳酸盐。
在一些实施方案中，废料具有不大于60kDa，例如不大于55kDa、不大于50kDa、不大于45kDa、不大于40kDa、不大于35kDa、不大于30kDa、不大于25kDa、不大于20kDa、不大于15kDa或不大于10kDa的分子量。
在一些实施方案中，将细胞或组织的培养基过滤和回收利用，其中培养组织以用于抗体生产。通过过滤和回收利用，至少一种废料被从培养基中去除/减少，同时产生的(或分泌的)抗体被保留在培养基中。
在一些实施方案中，将细胞或组织的培养基过滤和回收利用，其中将组织在至少一个容器(例如，生物反应器)中培养用于培养肉生产。通过过滤和回收利用，至少一种干扰培养肉正常生长和/或导致细胞死亡的废料被从培养基中去除/减少，同时培养肉正常生长所需的营养物被保留在培养基中。
在一些实施方案中，过滤装置是常规流过滤(normal flow filtration)(NFF)系统。在一些实施方案中，过滤装置是切向流过滤(TFF)。在一些方面，过滤装置是TFF，例如交替切向流(ATF)系统。在一些方面，ATF包括微型过滤系统，例如当收获细胞时。在一些方面，ATF包括超级过滤系统。在一些方面，ATF包括至少一根中空纤维。在一些实施方案中，中空纤维壁的孔隙率分布被配置成保留具有微滤垢(microfiltration scale)保留能力的细胞。例如，孔隙率分布被配置成保留细胞和悬浮固体。在一些实施方案中，中空纤维壁的孔隙率分布被配置成具有超滤垢(ultrafiltration scale)保留能力。在一些方面，孔隙率分布被配置成以超滤垢保留能力保留细胞、病毒、某些生物分子如蛋白质。在一些实施方案中，中空纤维壁的孔隙率分布被配置成提供仅允许小于60kDa的分子通过的平均孔径和孔密度。
在一些实施方案中，为了允许培养基沿着中空纤维流动，每个中空纤维可被配置成具有至少0.1mm、或至少0.5mm、或至少0.75mm、高达5mm的内径。在一些实施方案中，每个中空纤维被配置成具有允许直径介于5微米与20微米之间的细胞和其它培养组分流动的内径。
多孔中空纤维壁的作用是防止营养物和其它必需物质穿过。这通过选择孔隙率分布以提供最佳孔径和孔密度来实现。可以选择每根中空纤维以具有相同的孔隙率分布。尽管孔径(截断尺寸)可以不是恒定的，但平均而言，孔径应选择为防止高分子量物质通过，同时允许小分子即低分子量废料容易且高效地通过。在一些实施方案中，截断孔径不大于或小于60kDa(并且不同于或大于0kDa)。在一些实施方案中，平均孔径使得分子量介于10kDa与60kDa之间的物质可以通过。在一些实施方案中，平均孔径使得具有介于10kDa与20kDa之间、10kDa与25kDa之间、10kDa与30kDa之间、10kDa与35kDa之间、10kDa与40kDa之间、10kDa与45kDa之间、10kDa与50kDa之间、10kDa与55kDa之间、15kDa与60kDa之间、20kDa与60kDa之间、25kDa与60kDa之间、30kDa与60kDa之间、35kDa与60kDa之间之间、40kDa与60kDa之间、45kDa与60kDa之间或者介于50kDa与60kDa之间的分子量的物质可以通过。在一些实施方案中，截断孔径不大于10kDa。
孔密度，即内部纤维壁的每单位表面积的孔隙数量，可根据中空纤维的孔隙率而变化。在一些实施方案中，内部纤维壁的至少10％是透孔的。也就是说，孔密度至少为每根中空纤维壁表面的10％。
在一些实施方案中，过滤装置包括密度离心。作为非限制性实例，离心机是以8400×g运行的连续盘式叠层密封离心机。在一些实施方案中，离心机以介于1000与2000×g之间、介于1000与6000×g之间、介于1000与8000×g之间、介于1000与10,000×g之间或介于1000与20,000×g之间的速率运行。
细胞培养基包含营养物、必需物质和废料，其中需要分离来从培养基中除去废料。必需物质和营养物根据其尺寸与废料区别开来，因为废料是分子量低于(或不大于)60kDa的物质，而必需物质和营养物是分子量大于或等于61kDa的物质。
对于上文和本文公开的细胞培养物回收利用系统，浓缩培养基包含细胞和用于细胞生长和/或分化的必需物质，并在通过过滤装置后循环回到生物反应器中。
当浓缩培养基循环回生物反应器时，废培养基进行进一步处理。进一步处理可包括超滤、纳米过滤、渗透压调节和/或pH调节(例如，酸化和/或中和)中的一种或多种。
在一些实施方案中，例如当ATF包括微尺度过滤(例如具有0.22um的截断值)时，可能需要在酸化前从废培养基中移除生物分子如蛋白质。在此类和其它类似的情况下，可能需要在酸化之前添加超滤装置。
在一些实施方案中，酸化废培养基的方法包括使废培养基经过阳离子交换柱。在一些实施方案中，阳离子交换柱包含至少一种阳离子树脂。作为非限制性实例，阳离子交换柱可包含AmberLite FPC88。
在一些实施方案中，酸化废培养基的方法包括向其中加入酸。在一些实施方案中，可加入酸来酸化废培养基。作为非限制性实例，酸可以是HCl、硫酸、硝酸、磷酸、碳酸、柠檬酸或乙酸。在一些实施方案中，酸化的废培养基具有小于4的pH值。在一些实施方案中，酸化的废培养基具有为4.5、或4、或3.5、或3、或2.5、或2、或1.5的pH值或任何中间pH值。作为非限制性实例，酸化的废培养基的pH值约为2。
酸化的废培养基然后经过纳米过滤，以进一步分离培养基中的废料和剩余的必需物质。在一些实施方案中，纳米过滤也以渗滤模式进行，其包括在纳米过滤之前用去离子水预稀释酸化的废培养基。在一些实施方案中，纳米过滤具有约150至约300Da，例如约150至约200Da、约150至250Da、约200至约250Da、约200至约300Da、约250至约300Da的分子量截断值。
在一些实施方案中，在纳米过滤后从酸化的废培养基中回收废料。废料包括但不限于氨、铵和乳酸盐。在一些实施方案中，这些组分被进一步分别地和回收。这些回收的单独的组分诸如氨、铵盐和乳酸盐可具有商业价值，可以作为单独产品出售。
纳米过滤后，获得再生介质，其包含葡萄糖和分子量大于150Da的脂肪酸。通过中和其pH值来进一步处理这种再生培养基。在一些实施方案中，中和方法包括将再生培养基经历阴离子交换柱。在一些实施方案中，阴离子交换柱包含至少一种阴离子树脂。作为非限制性实例，阴离子交换柱可包含FPA55、IRA410、IRA67或HPR4800。作为非限制性实例，阴离子交换柱可包含FPA55。
在一些实施方案中，可加入碱来中和再生培养基的酸性。作为非限制性实例，碱可以是NaOH、碳酸氢钠、氢氧化钾、氢氧化镁或氢氧化钙。在一些实施方案中，再生培养基的pH被调节至pH>6。作为非限制性实例，再生培养基的pH值约为7。
在一些实施方案中，再生培养基的渗透压被调节至低于360毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)水。作为非限制性实例，再生培养基的渗透压约为280mOsm/kg。
在一些实施方案中，在pH中和并经过阴离子交换柱后，在循环回到生物反应器中之前用水稀释再生培养基。在过滤和回收利用之后，上文和本文公开的系统提供回收利用的培养基，与进入系统的培养基中的废物分子的量相比，其包含少于30％，例如少于20％，少于10％，少于5％，少于2％或任何更小或更大百分比值的中间值的废物分子。在一些实施方案中，与进入系统的培养基中的所选营养物或其它必需物质的量相比，回收利用的培养基包含超过60％，例如超过70％，超过80％，超过90％，超过95％或任何更小或更大百分比值的中间值的所选营养物或其它必需物质。
在一些实施方案中，除了浓缩培养基和再生培养基之外，系统还可包括用于向生物反应器添加新鲜培养基的装置。在一些方面，新鲜培养基可占总添加培养基的约10％至约20％，或约20％至约30％，或约30％至约40％，或约40％至约50％，或约50％至约60％，或约60％至约70％，或约70％至约80％，或约80％至约90％，或约90％至约100％。
在一些实施方案中，细胞培养基是使用泵灌注到过滤装置(例如，中空纤维)中的含有动物细胞的悬浮液。所述泵可以是正排量泵(positive displacement pump)，其用于推动悬浮液通过过滤装置，或者在推动悬浮液进入过滤装置与将其抽出进入生物反应器之间交替。在一些实施方案中，细胞由于其尺寸而与营养物一起保留。在一些实施方案中，使用过滤器将动物细胞保留在生物反应器中，并且仅将培养基引入过滤装置。
对于上文和本文所述的任何回收利用细胞培养基的系统，将生物质在细胞培养基中扩增以生产可食用肉/培养肉。在高细胞密度下，细胞生长会受到营养物缺乏或产生的具有抑制作用的代谢物的存在的限制。因此，在高细胞密度下，持续补充营养物和减少抑制物是维持细胞对数期的关键策略。在灌注过程中加入新鲜培养基可以提供营养并稀释生物反应器中的抑制物浓度，但是这需要大量的新鲜培养基，并且对于食品技术工艺来说太昂贵。在灌注过程中回收利用培养基可以提供未被细胞完全消耗的营养物，并在一定程度上减少所需的新鲜培养基的体积。然而，抑制物也将被回收到生物反应器中。可以优化与生物反应器集成的培养基再生和再生系统，以选择性地除去这些抑制性代谢物，同时保留培养基中的必需营养物。该系统提供了具有成本效竞争力的细胞培养基，例如用于可食用肉/培养肉的大规模生产。
本公开的另一个方面提供了用于回收利用细胞培养基的方法。这种方法包括从生物反应器中移出细胞培养基；过滤细胞培养基，从而获得废培养基和浓缩培养基；任选地对废培养基进行超滤；酸化废培养基；以及对酸化的废培养基进行纳米过滤，从而从废培养基中除去至少一种废料并获得再生培养基。在该方法中，在过滤时，废培养基包含至少一种废料，并且基本上不含有任何细胞和大的蛋白质，并且浓缩培养基减少或基本上不含有至少一种废料。当浓缩培养基循环回生物反应器时，进一步处理废培养基。
在一些实施方案中，细胞培养基包含选自由以下各项组成的组的一种或多种物质：细胞、组织、营养物、补充剂、进料、氨基酸、肽、蛋白质、维生素、多胺、糖、碳水化合物、脂质、核酸、激素、脂肪酸、痕量物质和废料。作为非限制性的实例，细胞培养基可包含血细胞。
在一些实施方案中，废料是干扰在细胞培养基中培养的细胞的期望生长和/或期望分化的任何物质。例如，废料可抑制细胞生长和/或分化或诱导细胞死亡。在一些实施方案中，一种或多种废料包括但不限于氨、乳酸盐、毒素、钠盐、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、铵、活性氧和氮物质。作为非限制性实例，至少一种废料可包括氨、铵和/或乳酸盐。
在一些实施方案中，废料具有不大于60kDa，例如不大于55kDa、不大于50kDa、不大于45kDa、不大于40kDa、不大于35kDa、不大于30kDa、不大于25kDa、不大于20kDa、不大于15kDa或不大于10kDa的分子量。
对于上文和本文公开的回收利用细胞培养基的方法，将细胞或组织的培养基过滤并回收，其中培养组织以用于抗体生产。通过过滤和回收利用，从培养基中去除/减少废料，同时产生的(或分泌的)抗体保留在培养基中。
对于上文和本文公开的回收利用细胞培养基的方法，将细胞或组织的培养基进行过滤和回收利用，其中将组织在至少一个容器(例如生物反应器)中进行培养以用于培养肉生产。通过过滤和回收利用，干扰培养肉正常生长和/或导致细胞死亡的废料得以从培养基中去除/减少，同时培养肉正常生长所需的营养物被保留在培养基中。
为了过滤离开生物反应器的细胞培养基，可使用至少一根中空纤维。在一些实施方案中，中空纤维壁的孔隙率分布被配置成提供仅允许小于60kDa的分子通过的平均孔径和孔密度。
为了允许培养基沿着中空纤维流动，每根中空纤维被配置成具有至少0.1mm、或至少0.5mm、或至少0.75mm、高达5mm的内径。在一些实施方案中，每根中空纤维被配置成具有允许直径介于5微米与20微米之间的细胞和其它培养组分流动的内径。
多孔中空纤维壁的作用是防止营养物和其它必需物质穿过。这通过选择孔隙率分布以提供最佳孔径和孔密度来实现。可以选择每根中空纤维以具有相同的孔隙率分布。尽管孔径(截断尺寸)可以不是恒定的，但平均而言，孔径应被选择以防止高分子量物质通过，同时允许小分子即低分子量废料容易且高效地通过。在一些实施方案中，截断孔径不大于或小于60kDa(并且不同于或大于0kDa)。在一些实施方案中，平均孔径使得分子量介于10kDa与60kDa之间的物质可以通过。在一些实施方案中，平均孔径使得具有介于10kDa与20kDa之间、10kDa与25kDa之间、10kDa与30kDa之间、10kDa与35kDa之间、10kDa与40kDa之间、10kDa与45kDa之间、10kDa与50kDa之间、10kDa与55kDa之间、15kDa与60kDa之间、20kDa与60kDa之间、25kDa与60kDa之间、30kDa与60kDa之间、35kDa与60kDa之间之间、40kDa与60kDa之间、45kDa与60kDa之间或者介于50kDa与60kDa之间的分子量的物质可以通过。在一些实施方案中，截断孔径不大于10kDa。
孔密度，即内部纤维壁的每单位表面积的孔隙数量，可根据中空纤维的孔隙率而变化。在一些实施方案中，内部纤维壁的至少10％是透孔的。也就是说，孔密度至少为每根中空纤维壁表面的10％。
细胞培养基包含营养物、必需物质和废料，其中需要分离以从培养基中除去/减少废料。必需物质和营养物根据其尺寸与废料区别开来，因为废料是分子量低于(或不大于)60kDa的物质，而必需物质和营养物是分子量大于或等于61kDa的物质。
对于上文和本文公开的细胞培养物回收利用方法，浓缩培养基包含细胞和用于细胞生长和/或分化的必需物质，并被循环回到生物反应器中以供连续使用。当浓缩培养基循环回生物反应器时，废培养基进行进一步处理。进一步处理可包括超滤、纳米过滤、渗透压调节和/或pH调节(例如，酸化和/或中和)中的一种或多种。
在一些实施方案中，例如当ATF包括微尺度过滤(例如具有0.22μm的截断值)时，可能需要在酸化前从废培养基中移除生物分子如蛋白质。在此类和其它类似的情况下，可能需要在酸化之前添加超滤装置。
在一些实施方案中，使废培养基经过阳离子交换柱。在一些实施方案中，阳离子交换柱包含至少一种阳离子树脂。作为非限制性实例，阳离子交换柱可包含AmberLiteFPC88。
在一些实施方案中，对废培养基进行酸添加以进行酸化。作为非限制性实例，酸可以是HCl、硫酸、硝酸、磷酸、碳酸、柠檬酸或乙酸。在一些实施方案中，酸化的废培养基具有小于4的pH值。作为非限制性实例，酸化的废培养基的pH值约为2。
酸化的废培养基然后经过纳米过滤，以进一步分离培养基中的废料和剩余的必需物质。在一些实施方案中，纳米过滤也以渗滤模式进行，其包括在纳米过滤之前用去离子水预稀释酸化的废培养基。在一些实施方案中，纳米过滤具有约150至约300Da，例如约150至约200Da、约150至250Da、约200至约250Da、约200至约300Da、约250至约300Da的分子量截断值。
在一些实施方案中，上文和本文所述的方法还可包括在纳米过滤后从酸化的废培养基中回收废料；分离废料的组分；以及回收单独的组分。在一些实施方案中，废料包括氨、铵和/或乳酸盐，并且回收的单独的组分可具有可以作为单独产品出售的商业价值。
纳米过滤后，获得再生培养基，其包含葡萄糖和分子量大于150Da的脂肪酸。进一步对这种再生培养基进行pH中和。在一些实施方案中，使再生培养基经历阴离子交换柱。在一些实施方案中，阴离子交换柱包含至少一种阴离子树脂。作为非限制性实例，阴离子交换柱可包含FPA55、IRA410、IRA67或HPR4800。作为非限制性实例，阴离子交换柱可包含FPA55。
在一些实施方案中，可加入碱来中和再生培养基的酸性。作为非限制性实例，碱可以是NaOH、碳酸氢钠、氢氧化钾、氢氧化镁或氢氧化钙。在一些实施方案中，再生培养基的pH被调节至pH>6。作为非限制性实例，再生培养基的pH值约为7。
在一些实施方案中，再生培养基的渗透压被调节至低于360毫渗摩尔/千克水(mOsm/kg)。作为非限制性实例，再生培养基的渗透压约为280mOsm/kg。
在一些实施方案中，在pH中和并经过阴离子交换柱后，在循环回到生物反应器中之前用水稀释再生培养基。在过滤和回收利用之后，上文和本文公开的方法提供了回收利用的细胞培养基，与过滤和回收利用之前细胞培养基中的废物分子的量相比，其包含少于30％，例如少于20％，少于10％，少于5％，少于2％或任何更小或更大百分比值的中间值的废物分子。在一些实施方案中，与过滤和回收利用之前细胞培养基中所选营养物或其它必需物质的量相比，回收利用的细胞培养基包含超过60％，例如超过70％，超过80％，超过90％，超过95％或任何更小或更大百分比值的中间值的所选营养物或其它必需物质。
在一些实施方案中，除了浓缩培养基和再生培养基之外，该方法还可包括向生物反应器加入新鲜培养基。在一些方面，新鲜培养基可占总添加培养基的约10％至约20％，或约20％至约30％，或约30％至约40％，或约40％至约50％，或约50％至约60％，或约60％至约70％或约70％至约80％。在一些方面，再生培养基可包括新鲜培养基和回收利用的培养基。
在一些实施方案中，细胞培养基是使用泵灌注到过滤装置(例如，中空纤维)中的含有动物细胞的悬浮液。所述泵可以是正排量泵，其用于推动悬浮液通过过滤装置，或者在推动悬浮液进入过滤装置与将其抽出进入生物反应器之间交替。在一些实施方案中，细胞由于其尺寸而与营养物一起保留。在一些实施方案中，使用过滤器将动物细胞保留在生物反应器中，并且仅将培养基引入过滤装置。
对于上文和本文所述的任何回收利用细胞培养基的方法，回收利用的细胞培养基可用于生产培养肉。在一些实施方案中，在细胞培养基中扩增生物质以生产可食用肉/培养肉。这些方法为大量生产可食用肉/培养肉提供了具有成本效益的细胞培养基。营养物的缺乏和在使用过的培养基中产生的具有抑制作用的代谢物的存在可以是获得生产培养肉所需的高细胞密度的限制因素。持续补充营养物和减少抑制物是维持高培养密度的关键策略。在灌注过程中加入新鲜培养基可以提供营养物并稀释生物反应器中的抑制物浓度，但是这需要大量的新鲜培养基，并且对于食品技术工艺来说太昂贵。在灌注过程中回收利用的培养基可以提供未被细胞完全消耗的营养物，并在一定程度上减少所需的新鲜培养基的体积。然而，抑制物也将被回收到生物反应器中。可以优化与生物反应器集成的培养基再生和再生系统，以选择性地除去这些抑制性代谢物，同时保留培养基中的必需营养物。
本公开的一些方面提供了用于在生物反应器中扩增细胞的方法。该方法包括在包含营养物和废物分子的细胞培养基中培养组织；以及根据上文和本文公开的方法回收利用细胞培养基，以减少废物分子的量或从培养基中除去废物分子。在一些实施方案中，扩增的细胞用于生产培养肉。
本公开的又一些方面提供了用于从患者血液中减少或去除废产物的方法。该方法包括使用透析从患者获得血液；过滤血液以获得含有废产物的无蛋白血浆；以及根据上文和本文公开的方法回收无蛋白血浆，以减少废产物的量或从血浆中除去废产物。
具体实施形式
以下实施例以举例说明的方式而不是以限制的方式提供。
实施例1：细胞培养物回收利用/再生系统
图1A或图1B中说明了过滤和回收利用细胞培养基的系统或方法。这种再生系统可用于过滤和回收利用不同类型的细胞培养基。例如，可用于细胞疗法、蛋白质或疫苗生产、组织移植或培养肉生产的细胞/组织的悬浮培养物可以通过该系统或方法进行过滤和回收利用。
图1A是再生系统的示意图。作为概述，将来自生物反应器的废培养基通过装有30kDa MWCO的中空纤维过滤。中空纤维渗透物流至再生系统。首先通过流入阳离子交换柱和/或加入酸来酸化废培养基。废培养基酸化后，其进入纳米过滤阶段(150-300MWCO)，并且纳滤滞留物流在中和稀释后回收到生物反应器中。纳米过滤滞留物流在中和和稀释后回收到生物反应器中。可以通过在纳米过滤阶段之前引入水来使用渗滤模式。
更具体地说，如图1A所示，再生系统包括用于在其中培养细胞或组织的生物反应器1，被配置成将灌注溶液或细胞培养基输送或进料至生物反应器的输送装置。进料任选且优选地是连续的。
再生系统还包括用于从生物反应器1中移出细胞培养基的装置，随后是用于过滤细胞培养基(例如，分别为图1A和图1B中的中空纤维或离心机2或7)，从而获得废培养基和浓缩培养基的装置。废培养基包含干扰所需细胞生长和/或分化，并且基本上不含有细胞或大的蛋白质的一种或多种废料，而浓缩培养基包含细胞和用于细胞生长和/或分化的一种或多种其它必需物质。
中空纤维2包括用于防止营养物和其它必需物质穿过的多孔壁。这通过选择孔隙率分布以提供最佳孔径和孔密度来实现。可以选择每根中空纤维以具有相同的孔隙率分布。尽管孔径(截断尺寸)可以不是恒定的，但平均而言，孔径应被选择以防止高分子量物质通过，同时允许小分子即低分子量废料容易且高效地通过。在该系统中，中空纤维壁的孔隙率分布被配置成提供仅允许小于30kDa的分子通过的平均孔径和孔密度。因此，废培养基包含小于30kDa的一种或多种废料。
过滤后，将浓缩培养基循环回生物反应器中，同时对废培养基进行进一步处理。如其中所示，该系统还包括用于酸化废培养基的装置(例如，阳离子交换柱3)和用于将酸化的废培养基进行纳米过滤的装置5。在纳米过滤之前，废培养基具有小于4，优选约为2的pH值。纳米过滤也以渗滤模式进行，所述包括在纳米过滤之前用去离子水预稀释酸化的废培养基(参见，再生罐4)。
在一些情况下，例如当使用微尺度过滤装置或低速离心收获细胞时，或者当ATF使用微尺度过滤时，可以在酸化废培养基之前任选地加入超滤步骤8(图1C)，以分离废培养基中的蛋白质。
如所显示的，纳米过滤5具有约150Da至约300Da的分子量截断值。纳米过滤后，废料(即滤液)与废培养基中剩余的必需物质分离，并获得废料减少的再生培养基。
滤液可包含氨、铵盐、乳酸盐和/或低分子量的氨基酸。其可经历进一步的方法来分离和回收单独的组分。回收的单独的组分可具有可以作为单独产品出售的商业价值。
再生培养基可含有高分子量的氨基酸和葡萄糖，并通过流经阴离子交换柱6被进一步中和，随后在用水稀释后循环回到生物反应器1中。
图1B是另一个再生系统的示意图。综上所述，将来自生物反应器1的废培养基以8400×g或更快的速度通过连续盘式叠层离心机7过滤。离心机的轻相由流向再生系统的废培养基组成，同时固相被连续收获。在一些情况下，在酸化之前，对废培养基进行超滤(见图1C，但在此处使用离心机收获细胞)以分离废培养基中的蛋白质。然后通过流入阳离子交换柱3和/或加入酸来酸化废培养基。废培养基酸化后，其进入纳米过滤阶段5(150-300MWCO)，将纳米过滤滞留物流在中和和稀释后回收到生物反应器1中。可以通过在纳米过滤阶段之前引入水来使用渗滤模式。
离心机7包括快速旋转的滚筒，其使用离心力将轻物质与重物质分离。可以选择离心机的类型和速度，以支持特定流速和对培养基中的组分施加离心力的特定旋转速度。在该系统中，8400×g的旋转速度被配置成分离30kDa至150kDa的细胞和大的蛋白质聚集体。因此，废培养基包含小于30kDa的一种或多种废料。
过滤后，可收获重相或将其作为浓缩培养基循环回生物反应器，同时对废培养基进行进一步处理。如其中所示，该系统还包括用于酸化废培养基的装置(例如，阳离子交换柱3)和用于将酸化的废培养基进行纳米过滤的装置5。在纳米过滤之前，废培养基具有小于4，优选约2的pH值。纳米过滤也以渗滤模式进行，所述包括在纳米过滤之前用去离子水预稀释酸化的废培养基(参见，再生罐4)。
实施例2：整合入细胞生长生物反应器系统中的再生过程
为了估计再生对生物反应器中细胞生长的影响并确保再生过程是可适用的，使用DMEM培养基在2L生物反应器(Twin B,Sartorius，细胞群是永生化成纤维细胞，SCF-2)中生长培养的细胞群，并用集成的再生系统进行测试。最初从补料分批阶段开始细胞生长。在补料分批阶段，向生物反应器中进料细胞消耗的必需营养物(例如，葡萄糖和谷氨酰胺)。补料分批阶段之后是灌注阶段。在灌注阶段，用不同的培养基替换含有产生的代谢物(诸如乳酸盐和铵)的生物反应器培养基，同时将细胞保留在生物反应器中。由于抑制性代谢物的减少和通过确保足够的营养物来源，灌注使得能够以高细胞密度生长。使用三种不同的培养基来源：新鲜培养基(图2A)、回收利用的培养基与新鲜培养基的混合物(图2B)和再生培养基(图2C)。
使用交替切向流(ATF,Repligen)过滤系统(30kDa)将细胞保留在灌注阶段的过程中。可对含有比ATF截断值小的分子的废培养基进行回收利用或再生，分别如图2B和图2C所示。当再生时(图2C)时，在将pH调节至pH 2后，将灌注液进料至再生储存罐中。FPC88最初被用作阳离子交换床以调节pH至pH 2的值。阳离子交换过程之后是使用DK膜(Suez)的纳米过滤过程。纳米过滤的操作压力为10巴，回收率为71％。然后将酸化的生物反应器废物从再生储存罐转移到纳米过滤系统。更具体地说，如图2C所示，将来自生物反应器的废培养基通过装有30kDa MWCO的中空纤维过滤。将中空纤维渗透物引导至再生系统。首先通过流入阳离子交换柱和/或加入酸来酸化废料。废物酸化后，其进入NF阶段(150-300MWCO)。通过在NF阶段之前引入水来使用渗滤模式。然后分别使用氢氧化钠和去离子水，根据中性pH(pH 7)和渗透压(300mOsm/kg)重新平衡富含氨基酸和葡萄糖的浓缩物，并将NF滞留物流回收到生物反应器系统中。
图3是第四示例性中试规模系统的示意图，该系统在一些情况下可以任选地用于生产与图2C中的再生系统整合的永生化成纤维细胞SCF-2细胞。此处使用了不同的截断过滤膜，并且其省略了阳离子交换步骤。该平台在纳米过滤阶段之前仅使用盐酸来调节pH。然而，在本实施例中，使用图2C中的配置。
使用三种不同的灌注系统进行比较以测试细胞生长。将浓缩物的pH和渗透压分别调节至pH 7和300mOsm/kg。图4A显示了使用三种不同灌注系统(利用新鲜培养基的灌注、利用回收利用的培养基与新鲜培养基的混合物的灌注和利用再生培养基与新鲜培养基的混合物的灌注)的2L生物反应器中细胞生长随时间的变化。三条不同曲线的滞后时间介于2与4天之间。仅使用新鲜培养基的灌注在15天后达到1.1x107个细胞/mL。使用回收利用的培养基与新鲜培养基的混合物的灌注在9天后达到6.5x107个细胞/mL。第10天的细胞密度类似于第9天的细胞密度。使用再生培养基与新鲜培养基的混合物的灌注在11天后达到1.03x107个细胞/mL的细胞密度。
图4B中给出了谷氨酰胺、谷氨酸盐、葡萄糖、乳酸盐、铵、钠和渗透压的再生减少。发现谷氨酰胺降低了19％，谷氨酸盐降低了9％，乳酸盐降低了26％，铵降低了58％，钠降低了10％，渗透压降低了3％。在再生阶段，葡萄糖浓缩了36％。
表1比较了三次灌注运行。使用回收利用的或再生的培养基节省了35％的新鲜培养基，并将最大灌注速率从26L/天降低至10L/天。
表1：使用三种不同灌注进料的细胞生长运行之间的比较。
图5A-图5C永生化成纤维细胞SCF-2细胞中试规模生产的实例。使用50kDa ATF系统将细胞在270L BR中生长，在灌注阶段存在高达50％的再生。每次生产运行产生介于1.6kg与3.6kg之间的用于实验室测试的生物质固体。这些运行中的细胞密度范围为1.1x107至1.8x107个细胞/mL。将如图5A-图5C所示的从运行中产生的生物质送去进行营养分析，并与商品鸡胸肉和鸡脂进行比较(见表2)。生物质的水分含量高于鸡胸肉和鸡脂。蛋白质含量为鸡胸肉的85％(分别为73-76g/100g和85g/100g)。钠含量为426mg/100g至636mg/100g，比商品鸡的量低至少82％。胆固醇的范围为1521mg/100g，并且比在商品鸡中发现的值高一个数量级。饱和脂肪值为6g/100g至8g/100g，高于鸡胸肉的值(2g/100g)，但低于鸡脂中发现的值(21g/100g)。二噁英和PCB、抗生素、杀虫剂和三聚氰胺低于检测限。
表2.三个中试规模生产运行中产生的生物质的营养分析
| 鸡胸肉 | 运行I | 运行II | 运行III | 鸡脂 | |
| 水分(g/100g) | 74％ | 96％ | 96％ | 97％ | 44％ |
| 蛋白质(g/100g) | 85 | 73 | 73 | 76 | 10 |
| 灰分(g/100g) | 5 | 6 | 5 | 5 | 2 |
| 钠(mg/100g) | 759 | 616 | 636 | 426 | 753 |
| 胆固醇(mg/100g) | 266 | 1741 | 2344 | 1521 | 144 |
| 水解脂肪(g/100g) | 7 | 15 | 26 | 20 | 67 |
| 饱和脂肪(g/100g) | 2 | 6 | 8 | 7 | 21 |
| 二噁英和PCB | <0.2 | <0.2 | <0.2 | <0.2 | <0.2 |
| 抗生素 | ND | ND | ND | ND | ND |
| 杀虫剂 | ND | ND | ND | ND | ND |
| 三聚氰胺 | ND | ND | ND | ND | ND |
图6中提供了运行I的氨基酸保留值。大多数氨基酸富集了至少2％。丙氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、谷氨酸和赖氨酸的浓度下降不到10％(分别为9％、2％、5％、3％和6％)。甘氨酸浓度降低了13％。
实施例3：离子交换处理中树脂类型的选择
树脂再生和预处理：在吸附测试前再生这些研究中使用的离子交换(IEX)树脂。使用3-5倍床体积的7％ HCl(Sigma-Aldrich)，使用30-45min的接触时间，再生归类为阳离子树脂类型(强酸阳离子)的树脂。使用3-5倍床体积的4％ NaOH(Sigma-Aldrich)，使用30-45min的接触时间，再生归类为阴离子树脂(强或弱碱阴离子)的树脂。再生过程之后是用过量去离子水的漂洗步骤，直至流出物的渗透压小于3mOsm/kg，pH为中性。
树脂床筛选：使用不同类型的树脂及其组合来研究乳酸盐、铵和钠的吸附。使用掺有乳酸钠(Sigma-Aldrich)、氯化铵(Sigma-Aldrich)和氯化钠(Sigma-Aldrich)的DMEM培养基(DMEM-高葡萄糖，Sigma-Aldrich)进行筛选。进行了两种类型的IEX实验。在多孔板中进行筛选测试。达到平衡后(30min后)测试乳酸盐、铵和渗透压的降低。以120rpm搅拌该板。另外，还在填充柱中测试了乳酸盐、铵和渗透压的降低。乳酸盐、铵和渗透压水平分别通过Accutrend Plus(Roche)、Flex 2(Nova Biomedical)和Fiske Micro-Osmometer Model210测量。
强/弱碱阴离子型树脂旨在降低乳酸盐水平，而强酸阳离子型树脂旨在降低渗透压和铵水平。另外，还测试了混合床的几种组合，其中一些是强/弱碱阴离子型和强酸阳离子型的混合物(55:45％wt)，而其它为商业化的混合床(MB400、Zalion、MR300和MB20)。
测试了两种类型的阳离子树脂而未将这些树脂与阴离子树脂类型(FPC88和IRA210)组合的情况下。在这些情况下，乳酸盐吸附为零。还仅使用阴离子树脂类型(FPA55)测试了乳酸盐吸附，并显示出其相对较低的减少(10.5％)。将阳离子和阴离子树脂类型以混合床的形式组合，显示了超过30％的FPC88与IRA67、IRA400和IRA400的组合显示出超过30％(分别为31.6％、31.0％和37.7％)的乳酸盐吸附；以及超过30％的FPA55与Dowex C、HPR1200和Amberlyst 36的组合显示出超过30％(分别为31.7％、30.0％和30.0％)的乳酸盐吸附。对于FPC88与FPA55、Lweatit 64、AmberJet 4200、Lewatit MP-62、Lewatit 1065、IRA-410和HPR4800的混合床(分别为26.8％、21.6％、20.5％、22.9％、26.2％、22.5％和25.0％)；FPA55与Dowex MSC的混合床(26.7％)；FPC23与HPR4800和IR210的混合床(分别为26.7％和20.6％)；以及MB400、Zalion和MR300的混合床(分别为20.9％、23.9％和22.1％)，给出了超过20％的乳酸盐吸附。
图7显示FPC88床的渗透压降低了25.8％。当这种类型的树脂与阴离子树脂类型混合时，FPC88与FPA55、Lewatit 64、WA30、Lewatit MP-62、Lewatit 1065、IRA67、IRA400和HPR4800的混合物的渗透压降低超过40％(分别为42.0％、41.8％、40.6％、44.0％、40.4％、45.0％、45.6％和45.9％)。IR120的渗透压降低为24.3％。当该树脂与IR96和FPA55混合时，渗透压降低超过40％(分别为41.8％和41.4％)。MB400、Zalion、MR300和MB20的混合床分别显示了21.0％、34.7％、35.4％和36.4％的渗透压降低。对于FPC23与FPA55和HPR4800的混合床，渗透压降低至超过50％(分别为53.2％和50.9％)。仅对FPC88和FPA55的混合床测试到铵减少，显示减少了58.1％。
图8显示了在掺有乳酸钠和氯化钠的DMEM培养基中使用AmberLite FPC88的树脂床的平衡pH。在树脂不存在的情况下，pH为7.6，并且当加入树脂块时逐渐降低。pH值在树脂浓度为7.5重量％时达到饱和，pH值为1.2。
实施例4：膜类型和pH值对纳米过滤的影响
这些研究中的纳米过滤(NF)是使用几个螺旋缠绕的膜(表1)进行，所述膜具有2.3-2.6m2的活性面积。有时在NF处理之前，通过加入HCl(Sigma-Aldrich)或通过填充的阳离子交换柱，将经过滤的培养基酸化。纳米过滤也以渗滤模式进行。在渗滤中，在NF阶段之前用去离子水预稀释培养基。通过Flex 2(Nova Biomedical)分析取自NF进料、浓缩物和渗透物的样品。
表3.纳米过滤膜
| 膜 | 制造商 |
| DK | Suez |
| NF-270 | DuPont |
| NFX | Synder |
| TS40 | TriSep |
| DL | Suez |
| MPS | Koch |
| NFS | Synder |
测试了几种类型的纳米过滤(NF)膜(表3)在pH 2、4和7时的乳酸盐、铵和渗透压降低(图9)。另外，还测量了葡萄糖、谷氨酰胺和谷氨酸盐的浓度，以估计这些膜的选择性。图9显示当pH值低时，乳酸盐的去除得以增强。例如，使用DL膜的乳酸盐去除率在pH 7时为3.8％，而对于pH 4，其为41.9％，在pH 2时为49.2％。使用TS40膜的乳酸盐去除率在pH 7时仅为1.9％，而在对于pH 4，其为21.5％，在pH 2时为42.9％。
图9显示，对于所有筛选的膜，对于pH 7给出了最小的铵减少。筛选显示，在pH 2和pH 4时，DK(47.2-47.3％)、NF-270(48.1-49.6％)、DL(48.9-50.6％)和MPS(36.0-34.9％)的铵去除率相似。对于NFX，给出了局部最佳的铵去除率(42.8％)。对于TS40膜，在pH 2时的铵去除率(48.1％)高于在pH 4时的铵去除率(43.1％)。NF筛选测试表明，对于所有筛选的NF膜，最低渗透压去除是在pH 7时。对于DK、NFX、DL和MPS，在pH 2和pH 4时的渗透压降低是相似的(分别为34.7-35.9％、29.5-30.4％和36.8-27.2％)。NF270、TS40和MPS的渗透压降低在pH 2时最大(分别为34.5％、28.8％和26.0％)。对于所有筛选的膜，谷氨酰胺去除率小于5.4％。对于所有测试的pH值，在所有筛选的膜中，经DK的谷氨酸盐去除率最高(对于pH2、4和7，分别为8.8％、7.7％和12.5％)。在NFX在pH 2(11.4％)以及MPS在pH4(12.8％)的情况下也观察到谷氨酸的显著去除。对于这两种氨基酸，没有观察到随pH变化的显著趋势。除DL在pH 4和2时(分别为8.4％和8.2％)和MPS在pH 2(14％)时的情况外，葡萄糖去除率低于5.4％。
在DL膜上测试了pH对NF分离的影响(图10)。乳酸盐的去除随着pH的不断降低而增加，而在pH 6.1与3.9之间观察到主要效果(对于pH 7.5、6.1、3.9、3.1和2.0，分别为3.8％、16.3％、41.9％、45.8％和49.2％)。铵的去除在pH 3.1时表现出局部最佳(对于pH 7.5、6.1、3.9、3.1和2.0，分别为37.7％、45.1％、48.9％、52.2％和50.6％)。在pH 7.5(31.0％)时，渗透压降低最少，对于更加酸性的pH(36.7-37.2％)，情况类似。在pH 7.5(3.9％)时，葡萄糖的去除率最低，并且对于较低的pH(8.0％-8.6％)，情况类似。与乳酸盐、铵和渗透压相比，谷氨酰胺的去除率相对较低(高至5.2％)。谷氨酰胺的去除率在pH 3.1时显示局部最大值(5.2％)。谷氨酸盐的去除率高达7.1％，并且在所述pH范围内没有观察到明显的趋势。
测试了酸化机制对纳米过滤性能的影响(图11)。在NF阶段使用IEX或HCl预处理的乳酸盐去除率相似(对于用IEX和HCl预处理的NF，分别为44.9％和49.0％；以及对于用IEX和HCl预处理的渗滤，分别为70.6％和73.5％)。渗滤将总乳酸盐减少从49.0％(对于NF)提高到73.5％(对于使用HCl预处理的渗滤)，以及从使用IEX和NF的53.3％的总减少提高到使用IEX和渗滤的78.1％。阳离子交换柱中铵的减少类似于使用NF以及HCl预处理时的减少(分别为52.0-50.4％和48.1％)。通过进行渗滤，使总铵减少从48.1％(对于NF)提高到70.2％(对于使用HCl预处理的渗滤)，并且当预处理为IEX时从69.6％提高到87.8％。当预处理为HCl时，对于NF和渗滤，渗透压降低相似。渗透压降低从26.2％(对于NF)提高到47.3％(使用渗滤)。在IEX处理时几乎除去了葡萄糖(高达6.5％)。然而，葡萄糖的总减少高达28.2％。在IEX处理时，谷氨酰胺和谷氨酸盐的去除率为10.5-29.1％，总去除率高达43.6％(在经IEX预处理的渗滤过程中观察到最大去除率)。
实施例5：超滤的效果
如下测试超滤的效果：从生物反应器中收获初始培养基，用UF10(TriSepTM)膜进行超滤。UF是通过将培养基回收通过膜来运行的。通过经过0.22μm PVDF过滤器(8.5cm2)的流动试验来测试NF阶段之前UF的效果。将培养基在1.5巴的恒压下进料通过微过滤器。在该分析之前，所有样品都保持在37℃。在通过加入盐酸将pH降低至2.8后，用DK膜进行纳米过滤。将每次处理(具有和不具有先前的超滤步骤)的浓缩物流中和至pH 7.1，并稀释至300mOsm/kg。在280nm处测量BSA浓度(NanoDrop One,Thermo Scientific)。图12代表再生阶段的进料以及具有和不具有先前的UF阶段的再生培养基的蛋白质含量。UF将BSA浓度从4.7mg/mL降至检测限以下。在NF阶段浓缩该培养基后，BSA浓度为0.8mg/mL(减少83％)。在无UF阶段的情况下重复该过程，BSA浓度为2.9mg/mL(减少38％)。
测试UF预先步骤对通过微过滤器的流速的影响(图13)。用UF预过滤的再生培养基的流速几乎是恒定的(R2＝0.9908)。平均流速为22.5mL/min。用UF预处理的再生培养基的平均流速为2.4mL/min。该样品的流速从0.4min后的14.3mL/min下降至3.2min后的0.8mL/min。未用UF过滤的再生培养基的平均流速为0.8mL/min。在这种情况下，流速从0.6min后的3.4mL/min下降至3.1min后的0.5mL/min。
对实施例2-5的讨论
生长培养基可能含有毒性水平的几种废物，诸如乳酸盐和铵。由于pH控制回路的作用，细胞中乳酸的产生也间接导致渗透压增加。IEX处理能够通过在阳离子树脂上吸附铵和钠，以及在阴离子树脂上吸附乳酸盐和氯化物来降低这些毒性作用。然而，这种处理并不是仅对这些废料有选择性的。其也可能吸收生长因子，诸如氨基酸或维生素。
筛选测试显示了以下几种有前途的阴离子型树脂用于去除乳酸盐：IRA410、IRA67、HPR4800和FPA55。渗透压去除筛选试验表明，当混合这种类型的树脂时，混合FPC88与阴离子类型的树脂总是比单独使用FPC88实现更好的渗透压降低。当使用两种不同类型的树脂(阴离子和阳离子)时，这些结果可指出协同效应。由于培养基中的阳离子与这些质子交换，所以预载有质子的阳离子树脂降低了pH值。另一方面，预载有羟基的阴离子树脂由于培养基中阴离子与预载羟基的交换而提高了pH值。吸附的动力学可能与pH动力学相关。当使用仅由FPC88组成的床时，pH降低得非常快(强酸活性基团，磺酸)，并达到早期平衡，即限制因素是pH值。另一方面，与向培养基中加入羟基的阴离子树脂类型的组合，推迟了平衡并允许阳离子的交换持续更长的滞留时间；因此，更多的阳离子被吸附在树脂上。因此，限制因素转移到树脂的活性位点的数量。
谷氨酰胺和谷氨酸盐是具有相似大小(146Da)但其分子电荷不同的两种氨基酸的实例(在pH 2时，谷氨酸盐相较于谷氨酰胺不太可能被发现为阳性的)。在基于阳离子交换和纳米过滤的再生过程中，谷氨酰胺的减少高于谷氨酸盐的减少。因此，谷氨酰胺与谷氨酸盐保留之间的差异与其分子大小无关，而是与其分子电荷相关。由于阳离子分子被氢交换到培养基中，使用载氢树脂的阳离子交换降低了pH值。因此，一些分子改变了它们的分子电荷，并且它们对阳离子交换床的亲和力将受到影响。由于谷氨酰胺在pH 2时更可能呈阳性，因此其对FPC88的亲和力更高。
彼此主要区别在于其MWCO和其活性层聚合物的纳米过滤膜，在本研究中用于除去废料诸如乳酸盐、铵和渗透压，同时还旨在保留生长因子诸如氨基酸。纳米过滤性能主要受膜类型和pH设定值影响。所有筛选的成员都显示出令人满意的乳酸盐去除率(在pH 2时至少为44.7％)。NFX和MPS的铵和渗透压降低有限(铵降低不到37％，而其它膜至少为43.5％；渗透压降低不到30％，而其它膜的摩尔渗透浓度至少降低34.5％)。TS40和NFS仅受摩尔渗透压降低的限制。
乳酸、氨和氨基酸的解离度是pH依赖性的。例如，在pH降低至低于乳酸盐的pKa(3.8)的情况下(Ecker等人，2012,Journal of Membrane Science,389:389-398)，带中性电荷的乳酸的存在高于带负电荷的乳酸根离子的存在。而对于高于3.8的pH，存在比乳酸更多的乳酸根离子。pH值也会影响膜的有效孔径。在高于膜的等电点的pH值时(例如，对于DL为4.8，对于DK为4.0)(Chandrapala等人，2016,Separation and PurificationTechnology,160:18-27)，膜上的羧基带负电荷。因此，羧基与有效孔径之间有更多的静电排斥，并且有效孔径增大。在pH低于膜的等电点时，羧基不带电；因此，有效孔径减小。由于溶解的离子与膜侧基之间的电荷相互作用以及有效孔径的变化，这两种pH效应改变了膜分离。结果是在更酸性的pH值下乳酸盐去除更明显。由于孔径效应，当降低pH时，对葡萄糖的选择性增加。
决定纳米过滤方法中分子保留的另一个关键参数是分子大小。甘氨酸和丙氨酸是两种最小的氨基酸(分别为75Da和89Da)。这两种氨基酸的保留率在所有其它氨基酸中是最低的(分别为87％和91％)。
发现再生过程的选择性与pH条件相关。发现为最佳的pH范围可能导致培养基中存在的蛋白质变性。变性破坏了蛋白质的空间排列及其非共价相互作用。因此，蛋白质的活性及其溶解度可能会改变。为了避免这些负面影响，需要分离蛋白质。蛋白质分离可通过超滤(UF)进行。与未用UF过滤的再生培养基相比，用UF预过滤的再生培养基的蛋白质含量低72％。此外，蛋白质分离阶段消除了微过滤器的堵塞，这在无菌条件下有时是需要的。
在高细胞密度下，细胞生长会受到营养物缺乏或产生的具有抑制作用的代谢物的存在的限制。例如，乳酸盐抑制细胞生长。此外，为了克服由于细胞产生乳酸而导致的培养基pH降低，通常加入碱性溶液作为生物反应器pH控制回路的一部分；因此，渗透压(其为额外的限制因素)增加了。因此，在高细胞密度下，持续补充营养物和减少抑制物是维持细胞对数期的关键策略。在灌注过程中进料新鲜培养基可以提供营养物并稀释生物反应器中的抑制物浓度，但这可能需要大量的新鲜培养基，并且对于食品技术过程来说过于昂贵。在灌注过程中回收利用培养基可以提供未被细胞完全消耗，并在一定程度上减少所需的新鲜培养基的体积的营养物。然而，抑制物也将被回收到生物反应器中。培养基再生可被优化成选择性地去除这些抑制性代谢物，同时将必需营养物保留在培养基中。
对于2L生物反应器灌注过程，使用三种不同的进料来测试灌注模式。。回收利用培养基减少了对新鲜培养基的需求量；然而，最大细胞密度仅为使用新鲜培养基的灌注的59％。较早进入稳定期的一个可能原因是诸如乳酸盐、铵和渗透压等抑制物的存在。回收利用相似比例的再生培养基允许细胞生长达到与新鲜进料灌注相似的细胞密度。再生处理使乳酸盐和铵分别降低了26％和58％，并使细胞能够持续生长。
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Claims (75)
1.一种用于回收利用细胞培养基的系统，所述系统包括：
a)用于从生物反应器中移出细胞培养基的装置；
b)用于过滤所述细胞培养基，从而获得废培养基和浓缩培养基的装置，其中所述废培养基包含至少一种废料，并且基本上不含细胞和大的蛋白质，并且被进一步处理，其中所述浓缩培养基被循环回到所述生物反应器中；
c)用于酸化所述废培养基的装置；和
d)用于对所述酸化的废培养基进行纳米过滤，从而从所述废培养基中除去至少一种废料，并获得减少或基本不含所述至少一种废料的再生培养基的装置，其中所述再生培养基被进一步处理并循环回到所述生物反应器中，从而回收利用所述细胞培养基。
2.权利要求1的系统，其中所述细胞培养基包含选自由以下各项组成的组的一种或多种物质：细胞、组织、营养物、补充剂、进料、氨基酸、肽、蛋白质、维生素、多胺、糖类、碳水化合物、脂质、核酸、激素、脂肪酸、痕量物质和废料。
3.权利要求2的系统，其中所述细胞培养基包含血细胞。
4.权利要求2或3的系统，其中所述至少一种废料干扰所述细胞的期望生长和/或期望分化。
5.权利要求2的系统，其中所述细胞培养基包含为抗体生产或培养肉生产而培养的组织。
6.前述权利要求中任一项的系统，其中所述过滤装置包括至少一根孔隙截断值高达60kDa的中空纤维。
7.权利要求6的系统，其中所述至少一根中空纤维具有孔密度为所述中空纤维内壁表面的至少10％。
8.权利要求1至5中任一项的系统，其中所述过滤装置包括连续离心。
9.权利要求8所述的系统，其中所述离心机以1000至20,000×g，优选以8400×g操作，从而从所述废培养基中去除细胞和大的蛋白质。
10.权利要求8或9的系统，其中所述离心连续地从所述生物反应器中移除细胞团，从而在所述回收利用周期中保持恒定的细胞密度。
11.前述权利要求中任一项的系统，其中所述至少一种废料具有不大于60kDa的分子量。
12.权利要求11的系统，其中所述至少一种废料包括氨、乳酸盐、毒素、钠盐、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、铵、活性氧和氮物质或它们的组合。
13.权利要求12的系统，其中所述至少一种废料包括氨、铵和/或乳酸盐。
14.权利要求1的系统，其中所述浓缩培养基包含细胞和用于细胞生长和/或分化的必需物质。
15.权利要求1的系统，其中所述用于酸化所述废培养基的装置包括使所述废培养基经历阳离子交换柱和/或向所述废培养基中加入酸。
16.权利要求15的系统，其中所述阳离子交换柱包含至少一种阳离子树脂。
17.权利要求16的系统，其中所述阳离子交换柱包含AmberLite FPC88。
18.权利要求15的系统，其中所述酸选自由以下各项组成的组：HCl、硫酸、硝酸、磷酸、碳酸、柠檬酸和乙酸。
19.权利要求15至18中任一项的系统，其中所述酸化的废培养基具有小于4的pH值。
20.权利要求19的系统，其中所述酸化的废培养基具有约为2的pH值。
21.权利要求1的系统，其中所述纳米过滤也以渗滤模式进行，所述渗滤模式包括在纳米过滤之前用去离子水预稀释所述酸化的废培养基。
22.权利要求21的系统，其中所述纳米过滤具有约150Da至约300Da的分子量截断值。
23.权利要求22的系统，其中从纳米过滤后的所述酸化的废培养基中回收所述废料，其中所述废料包括氨、铵和/或乳酸盐，其中分别地分离和回收所述组分。
24.权利要求1的系统，其中所述再生培养基包含葡萄糖和分子量大于150Da的脂肪酸。
25.权利要求1的系统，其中通过在步骤(d)中中和其pH的装置来进一步处理所述再生培养基。
26.权利要求25的系统，其中所述中和装置包括使所述再生培养基经历阴离子交换柱。
27.权利要求26的系统，其中所述阴离子交换柱包含至少一种阴离子树脂。
28.权利要求27的系统，其中所述阴离子交换柱包含FPA55。
29.权利要求25的系统，其中所述中和装置包括向所述再生培养基中添加碱。
30.权利要求29的系统，其中所述碱选自由以下各项组成的组：NaOH、碳酸氢钠、氢氧化钾、氢氧化镁和氢氧化钙。
31.权利要求25至30中任一项的系统，其中所述再生培养基的pH被调节至pH>6。
32.权利要求31的系统，其中所述再生培养基具有约7的pH。
33.权利要求25至32中任一项的系统，其中所述再生培养基的渗透压被调节至小于360毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)水。
34.权利要求33的系统，其中所述再生培养基具有约280mOsm/kg的渗透压。
35.前述权利要求中任一项的系统，其中在所述细胞培养基中扩增生物质以产生培养肉。
36.权利要求1的系统，其在(c)之前任选地包括超滤装置。
37.一种用于回收利用细胞培养基的方法，所述方法包括：
a)从生物反应器中移出细胞培养基；
b)过滤所述细胞培养基，从而获得用于进一步处理的废培养基和用于再循环的浓缩培养基，其中所述废培养基包含至少一种废料并且基本上不含细胞和大的蛋白质；
c)酸化所述废培养基；以及
d)将所述酸化的废培养基进行纳米过滤，从而从中除去所述至少一种废料，并获得减少或基本不含所述至少一种废料的用于再循环的再生培养基，从而回收利用所述细胞培养基。
38.权利要求37的方法，其中所述细胞培养基包含选自由以下各项组成的组的一种或多种物质：细胞、组织、营养物、补充剂、进料、氨基酸、肽、蛋白质、维生素、多胺、糖类、碳水化合物、脂质、核酸、激素、脂肪酸、痕量物质和废料。
39.权利要求38的方法，其中所述细胞培养基包含血细胞。
40.权利要求38或39的方法，其中所述废料干扰所述细胞的期望生长和/或期望分化。
41.权利要求38的方法，其中所述细胞培养基包含为抗体生产或培养肉生产而培养的组织。
42.权利要求37至41中任一项的方法，其中在步骤(b)中，将所述细胞培养基通过至少一根孔隙截断值高达60kDa的中空纤维过滤。
43.权利要求42的方法，其中所述至少一根中空纤维具有孔密度为所述中空纤维内壁表面的至少10％。
44.权利要求37至41中任一项的方法，其中通过连续离心过滤所述细胞培养基。
45.权利要求44的方法，其中以1000至20,000×g，优选以8400×g操作所述离心机，从而从所述废培养基中去除细胞和大的蛋白质。
46.权利要求44或45的方法，其中所述离心连续地从所述生物反应器中移除细胞团，从而在所述回收利用期中保持恒定的细胞密度。
47.权利要求37至46中任一项的方法，其中所述至少一种废料具有不大于60kDa的分子量。
48.权利要求47的方法，其中所述至少一种废料包括氨、乳酸盐、毒素、钠盐、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、铵、活性氧和氮物质或它们的组合。
49.权利要求48的方法，其中所述至少一种废料包括氨、铵和/或乳酸盐。
50.权利要求37的方法，其中所述浓缩培养基包含细胞和用于细胞生长和/或分化的必需物质。
51.权利要求37的方法，其中在步骤(3)中，使所述废培养基经历阳离子交换柱和/或酸的添加。
52.权利要求51的方法，其中所述阳离子交换柱包含至少一种阳离子树脂。
53.权利要求52的方法，其中所述阳离子交换柱包括AmberLite FPC88。
54.权利要求51的方法，其中所述酸选自由以下各项组成的组：HCl、硫酸、硝酸、磷酸、碳酸、柠檬酸和乙酸。
55.权利要求51至54中任一项的方法，其中所述酸化的废培养基具有小于4的pH值。
56.权利要求55的方法，其中所述酸化的废培养基具有约2的pH值。
57.权利要求37的方法，其中所述纳米过滤也以渗滤模式进行，所述渗滤模式包括在所述纳米过滤之前用去离子水预稀释所述酸化的废培养基。
58.权利要求57的方法，其中所述纳米过滤具有约150Da至约300Da的分子量截断值。
59.权利要求58的方法，其还包括：
a)从纳米过滤后的所述酸化的废培养基中回收所述废料，其中所述废料包括氨、铵和/或乳酸盐；
b)分离所述废料的组分；以及
c)回收单独的组分。
60.权利要求37的方法，其中所述再生培养基包含分子量大于150Da的脂肪酸和葡萄糖。
61.权利要求37的方法，其中在步骤(4)中进一步中和所述再生培养基的pH。
62.权利要求61的方法，其中使所述再生培养基经历阴离子交换柱。
63.权利要求62的方法，其中所述阴离子交换柱包含至少一种阴离子树脂。
64.权利要求63的方法，其中所述阴离子交换柱包含FPA55。
65.权利要求61的方法，其中将碱添加到所述再生培养基中用于中和。
66.权利要求65的方法，其中所述碱选自由以下各项组成的组：NaOH、碳酸氢钠、氢氧化钾、氢氧化镁和氢氧化钙。
67.权利要求61至66中任一项的方法，其中所述再生培养基的pH被调节至pH>6。
68.权利要求67的方法，其中所述再生培养基具有约7的pH。
69.权利要求61至68中任一项的方法，其中所述再生培养基的渗透压被调节至低于360毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)水。
70.权利要求69的方法，其中所述再生培养基具有约280mOsm/kg的渗透压。
71.权利要求40至70中任一项的方法，其中所述细胞培养基用于生长培养肉。
72.权利要求37的方法，其在步骤c之前还包括超滤步骤。
73.一种用于在生物反应器中扩增细胞的方法，所述方法包括：
a)在包含营养物和废物分子的细胞培养基中培养细胞；以及
b)按照权利要求36至69中任一项的方法回收利用所述细胞培养基，以减少废物分子的量或从所述培养基中去除所述废物分子。
74.权利要求73的方法，其中所述扩增的细胞用于生产培养肉。
75.一种用于从患者血液中减少或去除废产物的方法，所述方法包括：
a)使用透析从所述患者获得血液；
b)过滤血液以获得含有废产物的无蛋白血浆；
c)按照权利要求36至67中任一项的方法回收利用所述无蛋白血浆，以减少废产物的量或从所述血浆中去除所述废产物。
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