CN116814807A - 一种苏紫猪产仔性状相关全基因组SNPs筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种苏紫猪产仔性状相关全基因组SNPs筛选方法，组织样采集后提取DNA，DNA质控检测合格后，进行Illumina全基因组猪50K SNPs芯片检测，质控后得到有效数据用于后期的变异检测；然后进行全基因组关联分析：进行猪产仔表型性状与全基因组SNPs之间的GWAS分析；建立GWAS分析模型：y＝μ+Xb+u+e；对苏紫猪GWAS分析结果中的差异显著性水平P值采用Bonferroni校正，并使用R软件中的qqman绘制曼哈顿图和Q‑Q图。本发明利用Illumina全基因组猪50K SNPs芯片检测了苏紫猪的基因组，并与这些猪的总产仔数、产活仔数性状进行了关联分析。解决试验猪高产仔数关键位点和基因的筛选，研究结果将进一步揭示猪高产仔性状的遗传基础，提高猪育种效率和经济效益有较大的借鉴意义。
Description
技术领域
本发明属于畜牧业中的生物育种技术领域，具体涉及一种苏紫猪产仔性状相关全基因组SNPs筛选方法，能筛选到影响猪产仔数的全基因组SNPs，为猪产仔数性状的育种提供帮助。
背景技术
产仔数是养猪生产中一个重要的育种性状、繁殖性状和经济性状，而总产仔数和产活仔数一直是种猪选育中最常记录的两个产仔数指标。
由于产仔数遗传力较低且又是伴性性状，利用常规的育种方法选育难度较大，且进展缓慢。随着分子生物学的发展，全基因组SNPs分子标记逐渐应用于猪产仔数的选择育种中。利用全基因组SNPs分子标记，可以进行全基因组关联分析(Genome-wideassociation study,GWAS)和全基因组选择育种(Genomic selection)。GWAS是利用全基因组范围内筛选出的高密度分子标记(现大多为SNP)进行试验群体的全基因组扫描，再通过统计学方法将扫描所得的分子标记基因型与表型性状关联分析，最后鉴定出影响表型性状的相关分子标记和候选基因。近年来已在奶牛和生猪育种生产上得到广泛的应用，其中在猪上，研究人员利用全基因组关联分析技术在嵊县花猪、金华猪群体分别筛选了160个和124个达到显著性水平的SNP。
本发明拟解决实验猪高产仔数关键位点和基因的筛选，研究结果将进一步揭示猪高产仔性状的遗传基础，提高猪育种效率和经济效益有较大的借鉴意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种苏紫猪产仔性状相关全基因组SNPs筛选方法，筛选到影响猪产仔数的全基因组SNPs，为猪产仔数性状的育种提供帮助。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种苏紫猪产仔性状相关全基因组SNPs筛选方法，包括如下步骤：
S1、确定试验样品：苏紫猪能繁母猪；
S2、组织样采集：对试验样品统一采集耳组织样得到猪组织样，置于-20℃冰箱保存、备用；
S3、DNA提取：将步骤S2采集的猪组织样剪碎，加入组织裂解液中，上下颠倒至混匀，然后加入蛋白酶K至浓度200μg/mL，50℃-55℃水浴锅内消化过夜，得到消化好的耳组织样溶液；
S4、在消化好的耳组织样溶液中加入与之等体积苯酚抽提，12000rpm离心10min，第一次取上清；在第一次取得上清液中加入与之等体积苯酚和氯仿抽提，苯酚和氯仿的体积比为1:1，12000rpm离心10min，第二次取上清；在第二次取得上清液中加入与之等体积氯仿抽提，12000rpm离心10min，第三次取上清；在第三次取得上清液中加入其两倍体积的无水乙醇沉淀DNA，12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀物；
S5、用70％乙醇快速洗涤步骤S4得到的沉淀物后常温晾干，然后用30μl灭菌双蒸水溶解DNA；0.7％的琼脂糖电泳初步检测DNA的浓度和纯度，紫外分光光度仪测定DNA含量，至此，DNA提取完成；
S6、DNA质控检测合格后，进行Illumina全基因组猪50K SNPs芯片检测，删除没有检测结果的SNP位点后得到的有效数据用于后期的全基因组SNPs基因型质控检测；
S7、SNPs基因型质控：SNPs基因型质控过程删除达到以下标准的个体或位点：分型缺失数>10％的位点、最小等位基因频率低于0.01的位点、哈代-温伯格检验P值<0.000001的位点，符合以上三条件中的任何一个，数据均会被删除；
S8、猪产仔性状表型统计：记录每头苏紫猪能繁母猪的耳号、样品号、出生日期、出生体重、乳头数、配种日期、产仔日期、胎次、总产仔数、产活仔数、产健仔数、活仔公猪数、活仔母猪数、弱仔数、死胎数、出生窝重、出生个体均重、断乳窝重和断乳头数；
S9、全基因组关联分析：进行猪全基因组SNPs基因型与产仔性状表型之间的GWAS分析；
建立GWAS分析模型：y＝μ+Xb+u+e；
其中，y表示苏紫猪产仔性状表型值；μ表示产羔数平均值；X表示固定效应矩阵，b为固定效应向量；u表示剩余多基因效应；e表示产仔表型值的随机残差，u和e均服从正态分布；
S10、显著SNPs鉴定：对苏紫猪GWAS分析结果中的差异显著性水平P值采用Bonferroni校正，并使用R软件中的qqman绘制曼哈顿图和Q-Q图，曼哈顿图上高于阈值线的SNPs即为苏紫猪产仔性状显著关联SNPs；
S11、候选基因注释：利用Ensembl网站的猪基因组序列Sscrofa11.1，对苏紫猪产仔性状显著关联SNPs前后40kb范围内定位的候选基因进行筛选，再利用Ensembl网站基因注释工具和Pubmed文献数据库进行基因的功能注释，完成苏紫猪产仔性状相关全基因组SNPs筛选。
其中，步骤S9中，使用GEMMA软件中的混合线性模型，进行猪产仔表型性状与全基因组SNPs之间的GWAS分析。
其中，与苏紫猪产仔性状显著关联的全基因组SNPs共有6个，分别为：CNC10013348、CNC10071931、CNC10110924、CNC10082712、CNC10082643和CNC10082645。
其中，全基因组范围内苏紫猪产仔性状的8个候选基因，包括：ENSSSCG00000004980、ENSSSCG00000002260、ENSSSCG00000026251、ENSSSCG00000009457、RAP1GDS1、ENSSSCG00000009188、ENSSSCG00000009188、BMPR1B和PDLIM5。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
本发明利用Illumina全基因组猪50K SNPs芯片检测了苏紫猪的基因组，并与这些猪的总产仔数、产活仔数性状进行了关联分析。进一步对获得的显著关联SNPs染色体物理位置100kb范围的基因进行筛选挖掘，最后对这些候选基因进行GO功能和KEGG通路注释。解决试验猪高产仔数关键位点和基因的筛选，研究结果将进一步揭示猪高产仔性状的遗传基础，提高猪育种效率和经济效益有较大的借鉴意义。
附图说明
图1为本发明中苏紫猪总产仔数GWAS结果曼哈顿图和QQ-Plot图；
图2为本发明中苏紫猪产活仔数GWAS结果曼哈顿图和QQ-Plot图；
图3为本发明中苏紫猪活仔母猪数GWAS结果曼哈顿图和QQ-Plot图；
图4为本发明中苏紫猪弱仔数GWAS结果曼哈顿图和QQ-Plot图；
图5为本发明中苏紫猪死胎数GWAS结果曼哈顿图和QQ-Plot图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供一种苏紫猪产仔性状相关全基因组SNPs筛选方法，包括如下步骤：
S1、确定试验样品：苏紫猪能繁母猪；
S2、组织样采集：对试验样品统一采集耳组织样得到猪组织样，置于-20℃冰箱保存、备用；
S3、DNA提取：将步骤S2采集的猪组织样剪碎，加入组织裂解液中，上下颠倒至混匀，然后加入蛋白酶K至浓度200μg/mL，50℃-55℃水浴锅内消化过夜，得到消化好的耳组织样溶液；
S4、在消化好的耳组织样溶液中加入与之等体积苯酚抽提，12000rpm离心10min，第一次取上清；在第一次取得上清液中加入与之等体积苯酚和氯仿抽提，苯酚和氯仿的体积比为1:1，12000rpm离心10min，第二次取上清；在第二次取得上清液中加入与之等体积氯仿抽提，12000rpm离心10min，第三次取上清；在第三次取得上清液中加入其两倍体积的无水乙醇沉淀DNA，12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀物；
S5、用70％乙醇快速洗涤步骤S4得到的沉淀物后常温晾干，然后用30μl灭菌双蒸水溶解DNA；0.7％的琼脂糖电泳初步检测DNA的浓度和纯度，紫外分光光度仪测定DNA含量，至此，DNA提取完成；
S6、DNA质控检测合格后，进行Illumina全基因组猪50K SNPs芯片检测，芯片检测后进行初步质控，把一些没有检测结果的SNP位点删除后得到的有效数据用于后期的全基因组SNPs基因型质控检测；
其中，DNA质控合格的判定标准为：DNA浓度要求大于50ng/μl,体积大于30μl.DNA纯度要求,260/280在1.7～2.0之间。
Illumina SNP芯片的制备过程包括样品制备、芯片制备和数据分析三个步骤。
1、对样品进行DNA提取和纯化，然后将DNA片段连接到芯片上的特定探针上。
2、探针是一种含有两个互补DNA序列的短链分子，其中一个序列与靶DNA片段互补，另一个序列与荧光探针互补。当样品DNA与探针配对时，荧光信号被激发并检测。
3、在芯片制备过程中，探针被排列成阵列，每个探针只对应一个SNP位点。每个阵列包含数以万计的探针，可以同时检测数以万计的SNP位点。
4、在数据分析阶段，荧光信号被记录下来，计算机程序分析荧光信号的大小和颜色，以确定每个样品的基因型。
S7、SNPs基因型质控：SNPs基因型质控过程删除达到以下标准的个体或位点：分型缺失数>10％的位点、最小等位基因频率低于0.01的位点、哈代-温伯格检验P值<0.000001的位点，符合以上三条件中的任何一个，数据均会被删除；
S8、猪产仔性状表型统计：记录每头苏紫猪能繁母猪的耳号、样品号、出生日期、出生体重、乳头数、配种日期、产仔日期、胎次、总产仔数、产活仔数、产健仔数、活仔公猪数、活仔母猪数、弱仔数、死胎数、出生窝重、出生个体均重、断乳窝重和断乳头数；
S9、全基因组关联分析：进行猪全基因组SNPs基因型与产仔性状表型之间的GWAS分析；
建立GWAS分析模型：y＝μ+Xb+u+e；
其中，y表示苏紫猪产仔性状表型值；μ表示产羔数平均值；X表示固定效应矩阵，b为固定效应向量；u表示剩余多基因效应；e表示产仔表型值的随机残差，u和e均服从正态分布。
步骤S9中，使用GEMMA软件中的混合线性模型，进行猪产仔表型性状与全基因组SNPs之间的GWAS分析。
S10、显著SNPs鉴定：对苏紫猪GWAS分析结果中的差异显著性水平P值采用Bonferroni校正，并使用R软件中的qqman绘制曼哈顿图和Q-Q图，曼哈顿图上高于阈值线的SNPs即为苏紫猪产仔性状显著关联SNPs。
上述的R软件是Meta分析中常用的一款软件，基于其开源的特点，R具备了强大的可拓展性，适用于很多领域的研究与应用。
S11、候选基因注释：利用Ensembl网站的猪基因组序列Sscrofa11.1，对苏紫猪产仔性状显著关联SNPs前后40kb范围内定位的候选基因进行筛选，再利用Ensembl网站基因注释工具和Pubmed文献数据库进行基因的功能注释，完成苏紫猪产仔性状相关全基因组SNPs筛选。
其中，与苏紫猪产仔性状显著关联的全基因组SNPs共有6个，分别为：CNC10013348、CNC10071931、CNC10110924、CNC10082712、CNC10082643和CNC10082645。
全基因组范围内苏紫猪产仔性状的8个候选基因，包括：ENSSSCG00000004980、ENSSSCG00000002260、ENSSSCG00000026251、ENSSSCG00000009457、RAP1GDS1、ENSSSCG00000009188、ENSSSCG00000009188、BMPR1B和PDLIM5。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。
一种苏紫猪产仔性状相关全基因组SNPs筛选方法，包括如下步骤：
S101、试验动物和样品采集：试验猪来自于江苏省某实验猪场，为379头苏紫猪能繁母猪。
S102、实验猪按猪场常规进行饲喂和管理，同时在自由采食及饮水条件下，注意进行疾病的防治和行为体况的观察。
S103、对379头试验猪统一进行耳组织样的采集，得到猪组织样，然后置于干冰中冷冻保存，回到实验室后置于-20℃冰箱保存，用于提取基因组DNA。
S104、DNA提取：将约2mg猪组织样剪碎，分别加入600μl组织DNA提取液(组织裂解液)，上下颠倒10次混匀；加入蛋白酶K(20mg/mL)6μL，使其至终浓度200μg/mL，50～55℃水浴锅内消化过夜，得到消化好的耳组织样溶液；
S105、在消化好的耳组织样溶液中加入等体积(606μL)苯酚抽提，12000rpm离心10min，第一次取上清(≤700μL)；在第一次取得上清液中加入等体积苯酚和氯仿抽提，苯酚：氯仿的体积比为1：1，12000rpm离心10min，第二次取上清(≤700μL)；在第二次取得上清液中加入等体积氯仿抽提，12000rpm离心10min，第三次取上清(≤500μL)；在第三次取得上清液中加入两倍体积的无水乙醇沉淀DNA，12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀物。
S106、用至少500μl 70％乙醇快速洗涤步骤S4得到的沉淀物，重复两次(为防止DNA溶解，此步操作应快速进行)；常温晾干，用30μl灭菌双蒸水(或TE溶液)溶解DNA；0.7％的琼脂糖电泳初步检测浓度和纯度，紫外分光光度仪测定DNA含量，至此，DNA提取完成。
S107、DNA经过质控检测合格之后，进行Illumina全基因组猪50K SNPs芯片检测，质控后共得到1.75Gb的有效数据，用于后期的全基因组SNPs基因型质控检测。
步骤S104-步骤107针对每头试验猪的样品分开做。
S108、SNPs基因型质控检测：SNPs基因型质控过程将删除达到以下标准的个体或位点，分型缺失数>10％的位点、最小等位基因频率低于0.01的位点、哈代-温伯格检验P值<0.000001的位点。凡是符合以上三条件中的任何一个，数据均会被删除。
S109、表型数据统计：选用的379头苏紫猪母猪均有详细的产仔数记录，这些记录包括：耳号、样品号、出生日期、出生体重、乳头数、配种日期、产仔日期、胎次、总产仔数、产活仔数、产健仔数(大于0.7kg)、活仔公猪数、活仔母猪数、弱仔数、死胎数、出生窝重、出生个体均重(kg)、断乳窝重和断乳头数(表1)。
表1苏紫猪各胎次产仔数统计
S110、全基因组关联分析(Genome-wide association studies,GWAS)：本研究使用GEMMA软件中的混合线性模型，进行猪产仔表型性状与全基因组SNPs之间的GWAS分析。
GWAS分析模型如下：y＝μ+Xb+u+e。
其中：y表示苏紫猪产仔性状表型值；μ表示产羔数平均值；X表示固定效应矩阵，b为固定效应向量；u表示剩余多基因效应；e表示产仔表型值的随机残差，u和e均服从正态分布。
在经SNP质控之后，在18对(36条)常染色体上一共得到45258个SNP标记，用于实验猪(苏紫猪)产仔数的全基因组关联分析研究。这些苏紫猪所有胎次各繁殖性状使全基因组关联到的显著SNP数量和候选基因数量显示，活仔母猪数、弱仔数、死胎数，这三个性状均有显著的SNP和候选基因。
S111、显著SNPs鉴定：苏紫猪所有胎次总产仔数、产活仔数、活仔母猪数、弱仔数和死胎数的全基因组关联分析(GWAS)结果如图1、图2、图3、图4和图5所示。其中，图1a、图2a、图3a、图4a和图5a为对应表型数据的曼哈顿图，图1b、图2b、图3b、图4b和图5b为对应表型数据的Q_Q图。
从曼哈顿图结果来看，总产仔数和活产仔数均没有SNPs达到Bonferroni校正的阈值线，活仔母猪数、弱仔数和死胎数分别有1、2、3个SNPs达到阈值线(图1a、图2a、图3a、图4a、图5a)。
从Q_Q图结果来看，总产仔数和产活仔数基本所有的P值观测值都等于小于期望值，而活仔母猪数、弱仔数和死胎数中，都存在P值观测值大于期望值的点，存在这样的点时，就表明存在达到阈值线的显著SNPs。由此可见，Q_Q图与曼哈顿图结果一致(图1a、图2a、图3a、图4a、图5a)。
S112、候选基因注释：利用Ensembl网站的猪基因组序列Sscrofa11.1，对苏紫猪产仔性状显著关联SNPs前后40kb范围内定位的候选基因进行筛选，再利用Ensembl网站基因注释工具和Pubmed文献数据库进行基因的功能注释，完成苏紫猪产仔性状相关全基因组SNPs筛选。
与苏紫猪产仔性状显著关联的SNP共有6个，分别为：CNC10013348、CNC10071931、CNC10110924、CNC10082712、CNC10082643和CNC10082645(表2)。
SNPs共注释到8个候选基因，分别为：ENSSSCG00000004980、ENSSSCG00000002260、ENSSSCG00000026251、ENSSSCG00000009457、RAP1GDS1、ENSSSCG00000009188、ENSSSCG00000009188、BMPR1B和PDLIM5(表2)。
表2苏紫猪各产仔性状SNP位点和候选基因数量统计
这些显著SNPs有的位于候选基因的内含子区，有的位于两个基因间。其中，CNC10013348、CNC10110924、CNC10082643这3个SNPs位于候选基因内含子区；CNC10071931、CNC10082712、CNC10082645这3个SNPs位于候选基因之间(表2、表3)。
这些显著SNPs注释到的8个候选基因中，大都集中在第8染色体，其次为第7染色体、第1染色体和第11染色体(表3)。
表3猪产仔数性状显著关联SNP的候选基因注释结果
本发明利用Illumina全基因组猪50K SNPs芯片检测了苏紫猪的基因组，并与这些猪的总产仔数、产活仔数性状进行了关联分析。进一步对获得的显著关联SNPs染色体物理位置100kb范围的基因进行筛选挖掘，最后对这些候选基因进行GO功能和KEGG通路注释。解决试验猪高产仔数关键位点和基因的筛选，研究结果将进一步揭示猪高产仔性状的遗传基础，提高猪育种效率和经济效益有较大的借鉴意义。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种苏紫猪产仔性状相关全基因组SNPs筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、确定试验样品：苏紫猪能繁母猪；
S2、组织样采集：对试验样品统一采集耳组织样得到猪组织样，置于-20℃冰箱保存、备用；
S3、DNA提取：将步骤S2采集的猪组织样剪碎，加入组织裂解液中，上下颠倒至混匀，然后加入蛋白酶K至浓度200μg/mL，50℃-55℃水浴锅内消化过夜，得到消化好的耳组织样溶液；
S4、在消化好的耳组织样溶液中加入与之等体积苯酚抽提，12000rpm离心10min，第一次取上清；在第一次取得上清液中加入与之等体积苯酚和氯仿抽提，苯酚和氯仿的体积比为1:1，12000rpm离心10min，第二次取上清；在第二次取得上清液中加入与之等体积氯仿抽提，12000rpm离心10min，第三次取上清；在第三次取得上清液中加入其两倍体积的无水乙醇沉淀DNA，12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀物；
S5、用70％乙醇快速洗涤步骤S4得到的沉淀物后常温晾干，然后用30μl灭菌双蒸水溶解DNA；0.7％的琼脂糖电泳初步检测DNA的浓度和纯度，紫外分光光度仪测定DNA含量，至此，DNA提取完成；
S6、DNA质控检测合格后，进行Illumina全基因组猪50K SNPs芯片检测，删除没有检测结果的SNP位点后得到的有效数据用于后期的全基因组SNPs基因型质控检测；
S7、SNPs基因型质控：SNPs基因型质控过程删除达到以下标准的个体或位点：分型缺失数>10％的位点、最小等位基因频率低于0.01的位点、哈代-温伯格检验P值<0.000001的位点，符合以上三条件中的任何一个，数据均会被删除；
S8、猪产仔性状表型统计：记录每头苏紫猪能繁母猪的耳号、样品号、出生日期、出生体重、乳头数、配种日期、产仔日期、胎次、总产仔数、产活仔数、产健仔数、活仔公猪数、活仔母猪数、弱仔数、死胎数、出生窝重、出生个体均重、断乳窝重和断乳头数；
S9、全基因组关联分析：进行猪全基因组SNPs基因型与产仔性状表型之间的GWAS分析；
建立GWAS分析模型：y＝μ+Xb+u+e；
其中，y表示苏紫猪产仔性状表型值；μ表示产羔数平均值；X表示固定效应矩阵，b为固定效应向量；u表示剩余多基因效应；e表示产仔表型值的随机残差，u和e均服从正态分布；
S10、显著SNPs鉴定：对苏紫猪GWAS分析结果中的差异显著性水平P值采用Bonferroni校正，并使用R软件中的qqman绘制曼哈顿图和Q-Q图，曼哈顿图上高于阈值线的SNPs即为苏紫猪产仔性状显著关联SNPs；
S11、候选基因注释：利用Ensembl网站的猪基因组序列Sscrofa11.1，对苏紫猪产仔性状显著关联SNPs前后40kb范围内定位的候选基因进行筛选，再利用Ensembl网站基因注释工具和Pubmed文献数据库进行基因的功能注释，完成苏紫猪产仔性状相关全基因组SNPs筛选。
2.根据权利要求1所述的苏紫猪产仔性状相关全基因组SNPs筛选方法，其特征在于，步骤S9中，使用GEMMA软件中的混合线性模型，进行猪产仔表型性状与全基因组SNPs之间的GWAS分析。
3.根据权利要求1所述的苏紫猪产仔性状相关全基因组SNPs筛选方法，其特征在于，与苏紫猪产仔性状显著关联的全基因组SNPs共有6个，分别为：CNC10013348、CNC10071931、CNC10110924、CNC10082712、CNC10082643和CNC10082645。
4.根据权利要求1所述的苏紫猪产仔性状相关全基因组SNPs筛选方法，其特征在于，全基因组范围内苏紫猪产仔性状的8个候选基因，包括：ENSSSCG00000004980、ENSSSCG00000002260、ENSSSCG00000026251、ENSSSCG00000009457、RAP1GDS1、ENSSSCG00000009188、ENSSSCG00000009188、BMPR1B和PDLIM5。
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| CN118918947A (zh) * | 2024-08-21 | 2024-11-08 | 吉林农业大学 | 一种乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法 |
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| CN118918947B (zh) * | 2024-08-21 | 2025-01-24 | 吉林农业大学 | 一种乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法 |
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