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CN118918947B - 一种乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法 - Google Patents

一种乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法 Download PDF

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CN118918947B CN202411152803.9A CN202411152803A CN118918947B CN 118918947 B CN118918947 B CN 118918947B CN 202411152803 A CN202411152803 A CN 202411152803A CN 118918947 B CN118918947 B CN 118918947B
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Abstract

本发明公开了一种乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法，属于遗传标记检测领域，包括以下步骤：S1、血液样采集；S2、提取冷冻的抗凝血液中的DNA，得到含有游离DNA的溶液；S3、DNA质控检测；S4、对全基因组DNA进行完全酶切，回收插入设定长度的酶切片段，建库，得到基因组数据库；S5、对基因组数据库进行双末端测序，以获得全基因组SNPs；S6、分析羊毛用性状与全基因组SNPs之间的GWAS。本发明采用上述乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法，通过将基因型与羊的毛用性状进行关联分析，可揭示羊高产高效毛用性状的遗传基础，从而加快了超细毛品系选育进程，提高选育稳定性。

Description

一种乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法
技术领域
本发明涉及遗传标记检测领域，尤其涉及一种乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法。
背景技术
自20世纪90年代开始，由于大量进口澳毛使国内羊毛价格跌落，细毛羊养殖效益下降，加上肉羊市场逐渐成熟，对毛用羊产业形成冲击，养羊业的重点逐步由产毛转向产肉，而产肉效益进一步增加对羊毛产业的影响，使得养殖户开始选择饲养羊毛质量差且产羔数多的土种羊，追求产肉。如何应对这种市场的冲击，通过育种手段，选育出既能产毛又能产肉的新品种，实现“保毛增肉”、“肉毛兼收”的效果，不仅对稳定细毛羊产业优势至关重要，也是我国养羊业未来发展的方向问题。
2003年吉林省某公司利用南非肉用美利奴羊，与导入澳血的东北细毛羊开展杂交，制定了培育肉毛兼用的肉用美利奴羊新品种选育计划，经过15年系统选育，于2018年通过了国家畜禽新品种审定，命名为“乾华肉用美利奴羊”，该品种的特点是既产肉又产毛，肉毛兼用，生产性能达到了国际先进水平。
同时，全基因组关联分析是通过统计学手段将覆盖全基因组的单核苷酸多态性标记与表型进行关联分析，以检测最可能影响相关表的遗传变异。全基因组关联分析是现阶段探索绵羊育种中数量性状主效基因的关键技术，也是分析数量性状遗传机制的主要途径。相比于传统的数量性状基因组定位，基于SNP、表型进行的全基因组关联分析，具有可以检测出对表型影响较小的关联变异和可以在相对较窄的基因组区域探索关联变异的优势。
随着基因分型技术的进步和遗传统计学的发展，已有大量研究者利用全基因组关联分析进行QTL定位以及绵羊生长性状候选基因鉴定，尽管已有报道绵羊生长性状相关全基因组关联分析，然而毛用性状为数量性状，受微效多基因影响，故并不适用于上述分析方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法，通过将基因型与羊的毛用性状进行关联分析，可揭示羊高产高效毛用性状的遗传基础，从而加快了超细毛品系选育进程，提高选育稳定性。
为实现上述目的，本发明提供了一种乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法，包括以下步骤：
S1、血液样采集：对乾华肉用美利奴羊进行静脉抽血，得到羊全血样，并将羊全血样置于液氮保存后，转移至设定温度下得到冷冻的抗凝血液，备用；
S2、提取冷冻的抗凝血液中的DNA，得到含有游离DNA的溶液；
S3、DNA质控检测：分别步骤S2所述溶液中DNA的浓度、纯度和含量，若满足设定要求，则执行步骤S4；
S4、采用限制性内切酶对全基因组DNA进行完全酶切，回收插入设定长度的酶切片段，按照dd-RAD的方式建库，得到基因组数据库；
S5、利用NGS技术基于Illumina NovaSeq测序平台，对基因组数据库进行双末端测序，以获得全基因组SNPs；
S6、分析羊毛用性状与全基因组SNPs之间的GWAS。
优选的，步骤S1所述的设定温度为-80℃。
优选的，步骤S2具体包括以下步骤：
S21、将冷冻的抗凝血液置于常温条件下直至融化；
S22、向1.5ml离心管中加入200μl抗凝血液，再加入20μl的蛋白酶K，混合均匀；
S23、向1.5ml离心管加入200μl裂解液BLⅡ，涡旋振荡直至混合均匀，再置于70℃条件下水浴10min，直至1.5ml离心管内的溶液清亮；
S24、冷却后离心以去除离心管的管盖内壁上的水珠；
S25、向1.5ml离心管加入100μl的无水乙醇，涡旋振荡直至混合均匀，得到混合物；
S26、将混合物转移到吸附柱中离心，排出废液；
S27、向吸附柱中加入500μl的漂洗液BWⅠ离心，排出废液；
S28、向吸附柱中加入600μl的漂洗液BWⅡ，排出废液；
S29、重复步骤S28；
S210、空离后，开盖室温晾干；
S211、将吸附柱放入新的1.5ml离心管中，垂直悬空滴加150μl洗脱液BE，室温静置5min后离心，获得含有游离DNA的溶液。
优选的，步骤S26的离心条件为：12000rpm离心60s；
步骤S27的离心条件为：12000rpm离心30s；
步骤S28的离心条件为：12000rpm离心30s；
步骤S210和步骤S211的离心条件均为：12000rpm离心2min。
优选的，在步骤S3中，利用0.7％的琼脂糖电泳检测DNA的浓度和纯度，并利用紫外分光光度仪测定DNA含量；
检测完毕后将收集好的DNA溶液置于-20℃保存。
优选的，步骤S4具体包括以下步骤：
S41、比对到绵羊基因组：采用bwa mem程序将酶切过滤后的数据比对到参考基因组上，得到记载有比对结果的sam文件，并将sam文件进行排序并转换为bam文件；
S42、获取个体基因型信息：在比对的基础上进行基因型调用，构建个体的基因型数据集；
S43、注释SNP：对个体的基因型数据集中的个体的基因型信息对变异进行功能注释，确定SNP位于基因的编码区、非编码区或者调控区；
S44、群体结构分析：进行模型基础的群体混合分析，以划分个体到不同的遗传群体中，确定群体间和群体内的遗传关系，从而获得基因组数据库。
优选的，比对的参数均按照bwa mem的默认参数；
采用picard 1.107软件将sam文件进行排序并转换为bam文件。
优选的，步骤S6具体包括以下步骤：
S61、建立GWAS分析模型：
Y＝SNP+Gender+PCA+Kinship+e (1)
式中，SNP表示单核苷酸多态性，Gender表示性别，PCA表示主成分分析，Kinship表示亲缘关系，e表示残差；
S62、采用Bonferroni对GWAS分析结果中的差异显著性水平P值进行校正；
S63、使用R软件中的qqman绘制曼哈顿图和Q-Q图，以评估关联结果。
本发明具有以下有益效果：
1、为乾华肉用美利奴羊毛用性状选择提供标记；
2、可以加快超细毛品系选育进程，提高选育稳定性
3、揭示羊高产高效毛用性状的遗传基础，对乾华肉用美利奴羊毛用性状功能基因的挖掘具有重要的理论意义和参考价值。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明的一种乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法的流程图；
图2为本发明的实施例的SNP在染色体上分布图(以1Mb为窗口统计SNP个数)；
图3为本发明的实施例的毛细度全基因组关联分析结果图；
图4为本发明的实施例的毛长全基因组关联分析结果图；
图5为本发明的实施例的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes京都基因与基因组百科全书)富集分析结果图。
具体实施方式
为了使本发明实施例公开的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明实施例进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅仅用以解释本发明实施例，并不用于限定本发明实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。
需要说明的是，术语“包括”和“具有”及其任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或服务器不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
为寻找相关分子标记，补充乾华肉用美利奴羊生长发育相关QTL数据库，挖掘影响乾华肉用美利奴羊生长性状的遗传标记和功能基因，设计本发明：如所示，一种乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法，包括以下步骤：
S1、血液样采集：对乾华肉用美利奴羊进行静脉抽血，得到羊全血样，并将羊全血样置于液氮保存后，转移至设定温度下得到冷冻的抗凝血液，备用；
步骤S1所述的设定温度为-80℃。
S2、提取冷冻的抗凝血液中的DNA，得到含有游离DNA的溶液；
步骤S2具体包括以下步骤：
S21、将冷冻的抗凝血液置于常温条件下直至融化；
S22、向1.5ml离心管中加入200μl抗凝血液，再加入20μl的蛋白酶K，混合均匀；
S23、向1.5ml离心管加入200μl裂解液BLⅡ，涡旋振荡直至混合均匀，再置于70℃条件下水浴10min，直至1.5ml离心管内的溶液清亮；
S24、冷却后离心以去除离心管的管盖内壁上的水珠；
S25、向1.5ml离心管加入100μl的无水乙醇，涡旋振荡直至混合均匀，得到混合物；
S26、将混合物转移到吸附柱中离心，排出废液；
步骤S26的离心条件为：12000rpm离心60s；
S27、向吸附柱中加入500μl的漂洗液BWⅠ离心，排出废液；
步骤S27的离心条件为：12000rpm离心30s；
S28、向吸附柱中加入600μl的漂洗液BWⅡ，排出废液；
步骤S28的离心条件为：12000rpm离心30s；
S29、重复步骤S28；
S210、空离后，开盖室温晾干；
S211、将吸附柱放入新的1.5ml离心管中，垂直悬空滴加150μl洗脱液BE，室温静置5min后离心，获得含有游离DNA的溶液。
步骤S210和步骤S211的离心条件均为：12000rpm离心2min。
S3、DNA质控检测：分别步骤S2所述溶液中DNA的浓度、纯度和含量，若满足设定要求，则执行步骤S4；
在步骤S3中，利用0.7％的琼脂糖电泳检测DNA的浓度和纯度，并利用紫外分光光度仪测定DNA含量；
检测完毕后将收集好的DNA溶液置于-20℃保存。
S4、采用限制性内切酶对全基因组DNA进行完全酶切，回收插入设定长度的酶切片段，按照dd-RAD(digest restriction site-associated DNA sequencing)的方式建库，得到基因组数据库；
步骤S4具体包括以下步骤：
S41、比对到绵羊基因组：采用bwa mem程序将酶切过滤后的数据比对到参考基因组上，得到记载有比对结果的sam文件，并将sam文件进行排序并转换为bam文件；比对的参数均按照bwa mem的默认参数；采用picard1.107软件将sam文件进行排序并转换为bam文件。
在本实施例中，采用“FixMatelnformation”命令确保所有的Paired-endreads信息之间的一致性。
且由于InDel附近的reads最容易出现Mapping错误，为了尽量减少由于Mapping错误导致的SNP，需要对InDel附近的reads重新进行比对，以提高SNPCalling的准确性，采用GATK程序中的IndelRealigner命令对所有InDel附近的reads进行重新比对，以提高SNP预测的准确率。
S42、获取个体基因型信息：在比对的基础上进行基因型调用，构建个体的基因型数据集；
S43、注释SNP：对个体的基因型数据集中的个体的基因型信息对变异进行功能注释，确定SNP位于基因的编码区、非编码区或者调控区；
S44、群体结构分析：进行模型基础的群体混合分析，以划分个体到不同的遗传群体中，确定群体间和群体内的遗传关系，从而获得基因组数据库。
S5、利用NGS技术(Next-Gieneration Sequencing第二代测序技术)基于IlluminaNovaSeq测序平台，对基因组数据库进行双末端测序，以获得全基因组SNPs；
S6、分析羊毛用性状与全基因组SNPs之间的GWAS(全基因组关联研究)。
步骤S6具体包括以下步骤：
S61、建立GWAS分析模型：
Y＝SNP+Gender+PCA+Kinship+e (1)
式中，SNP表示单核苷酸多态性，Gender表示性别，PCA表示主成分分析，Kinship表示亲缘关系，e表示残差；
S62、采用Bonferroni对GWAS分析结果中的差异显著性水平P值进行校正；
S63、使用R软件中的qqman绘制曼哈顿图和Q-Q图，以评估关联结果。
实施例
在本实施例中，进行随机选取2020年1月～2021年8月出生的个体200只(公羊55只和母羊145只)，测量毛长、毛细度、污毛重，同时采集血样。
利用本发明所述乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法对上述个体进行分析毛用性状相关全基因组SNPs的筛选，并利用vcftools软件按MAF小于0.05和缺失率大于0.2对筛选的SNPs进行过滤，一共得到了335,682个SNPs用以进行11个表型性状的全基因组关联分析，所用的模型为Y＝SNP+Gender+PCA+Kinship+e；然后根据LD衰减，确定显著位点前后500,000bp区域作为与性状显著关联的候选基因区域，查找候选基因。
表1毛细度筛选结果表
表2毛长筛选结果表
结合表1、表2以及图2－图5可知，毛细度筛选出5个显著SNPs，分别在3，9，9，13，19号染色体上：毛长筛选到3个显著SNPs，分别在15,18,25号染色体上，污毛重未筛选到显著SNPs。细度、毛长性状共鉴定到AVPR1A、RXYLT1、SRGAP1、LOC114116487(GSDML)、GSDMC、LOC11411645FAM49B、ASAP1、TRNAG-CCC-64、RIDA、RPL30、LOC114116536、ERICH5、LAPTM4B、MTDH、NIPAL2、POP1、MATN2等47个毛用性状相关基因。
需要说明的是，在图5中，通过Rich factor、FDR值和富集到此pathway(通路)上的基因个数衡量富集程度，Rich factor指该通路中富集到的候选基因个数与注释到的基因个数的比值，且Rich factor越大，表示富集程度越大。FDR(伪发现率)一般取值范围0-1，越趋近于零，表示富集越显著。
对携带上述毛用性状相关基因的个体进行选育后，进行横交固定并以携带上述毛用性状的个体作为基础群，建立超细毛品系。
因此，本发明采用上述乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法，通过将基因型与羊的毛用性状进行关联分析，可揭示羊高产高效毛用性状的遗传基础，从而加快了超细毛品系选育进程，提高选育稳定性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、血液样采集：对乾华肉用美利奴羊进行静脉抽血，得到羊全血样，并将羊全血样置于液氮保存后，转移至设定温度下得到冷冻的抗凝血液，备用；
S2、提取冷冻的抗凝血液中的DNA，得到含有游离DNA的溶液；
S3、DNA质控检测：分别步骤S2所述溶液中DNA的浓度、纯度和含量，若满足设定要求，则执行步骤S4；
S4、采用限制性内切酶对全基因组DNA进行完全酶切，回收插入设定长度的酶切片段，按照dd-RAD的方式建库，得到基因组数据库；
步骤S4具体包括以下步骤：
S41、比对到绵羊基因组：采用bwa mem 程序将酶切过滤后的数据比对到参考基因组上，得到记载有比对结果的sam文件，并将sam文件进行排序并转换为bam文件；
S42、获取个体基因型信息：在比对的基础上进行基因型调用，构建个体的基因型数据集；
比对的参数均按照bwa mem 的默认参数；
采用picard 1.107软件将sam文件进行排序并转换为bam文件；
S43、注释SNP：对个体的基因型数据集中的个体的基因型信息对变异进行功能注释，确定SNP位于基因的编码区、非编码区或者调控区；
S44、群体结构分析：进行模型基础的群体混合分析，以划分个体到不同的遗传群体中，确定群体间和群体内的遗传关系，从而获得基因组数据库；
S5、利用NGS技术基于Illumina NovaSeq测序平台，对基因组数据库进行双末端测序，以获得全基因组SNPs；
S6、分析羊毛用性状与全基因组SNPs之间的GWAS；
步骤S6具体包括以下步骤：
S61、建立GWAS分析模型：
（1）
式中，表示单核苷酸多态性，表示性别，表示主成分分析，表示亲缘关系，表示残差；
S62、采用Bonferroni对GWAS分析结果中的差异显著性水平P值进行校正；
S63、使用R软件中的qqman绘制曼哈顿图和Q-Q图，以评估关联结果。
2.根据权利要求1所述的一种乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法，其特征在于：步骤S1所述的设定温度为-80℃。
3.根据权利要求1所述的一种乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法，其特征在于：步骤S2具体包括以下步骤：
S21、将冷冻的抗凝血液置于常温条件下直至融化；
S22、向1.5ml离心管中加入200μl抗凝血液，再加入20μl的蛋白酶K，混合均匀；
S23、向1.5ml离心管加入200μl裂解液BLⅡ，涡旋振荡直至混合均匀，再置于70℃条件下水浴10min，直至1.5ml离心管内的溶液清亮；
S24、冷却后离心以去除离心管的管盖内壁上的水珠；
S25、向1.5ml离心管加入100μl的无水乙醇，涡旋振荡直至混合均匀，得到混合物；
S26、将混合物转移到吸附柱中离心，排出废液；
S27、向吸附柱中加入500μl的漂洗液BWⅠ离心，排出废液；
S28、向吸附柱中加入600μl的漂洗液BWⅡ，排出废液；
S29、重复步骤S28；
S210、空离后，开盖室温晾干；
S211、将吸附柱放入新的1.5ml离心管中，垂直悬空滴加150μl洗脱液BE，室温静置5min后离心，获得含有游离DNA的溶液。
4.根据权利要求3所述的一种乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法，其特征在于：步骤S26的离心条件为：12000rpm离心60s；
步骤S27的离心条件为：12000rpm离心30s；
步骤S28的离心条件为：12000rpm离心30s；
步骤S210和步骤S211的离心条件均为：12000rpm离心2min。
5.根据权利要求1所述的一种乾华肉用美利奴羊毛用性状相关全基因组SNPs筛选方法，其特征在于：在步骤S3中，利用0.7％的琼脂糖电泳检测DNA的浓度和纯度，并利用紫外分光光度仪测定DNA含量；
检测完毕后将收集好的DNA溶液置于-20℃保存。
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