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CN116334248A - 一种地方鸡遗传资源保护与品种鉴定的液相芯片及其应用 - Google Patents

一种地方鸡遗传资源保护与品种鉴定的液相芯片及其应用 Download PDF

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CN116334248A
CN116334248A CN202310366819.9A CN202310366819A CN116334248A CN 116334248 A CN116334248 A CN 116334248A CN 202310366819 A CN202310366819 A CN 202310366819A CN 116334248 A CN116334248 A CN 116334248A
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CN
China
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chicken
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phase chip
identification
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Application number
CN202310366819.9A
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韩威
周成浩
殷建玫
朱云芬
李国辉
张会永
薛倩
蒋一秀
赵振华
黄华云
苏一军
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Jiangsu Institute Poultry Sciences
Original Assignee
Jiangsu Institute Poultry Sciences
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Abstract

本发明公开了一种地方鸡遗传资源保护与品种鉴定的液相芯片及其应用，涉及家禽遗传资源保护、评价与鉴定领域。本发明选取26个代表性地方鸡资源，融合公共数据库中原鸡序列信息；基于资源保护与品种鉴定重点应用方向，优选在染色体上分布均匀的位点23K，研发出地方鸡遗传资源保护与品种鉴定液相芯片“酉芯一号”，其具有目标区域数据覆盖度和均一性好、基因分型检出率高、芯片数据升级灵活等特点，极大地降低了基因组分型成本，有利于芯片的规模化应用；尤其是芯片数据分析方法标准化，显著提升了地方鸡资源评价与鉴定的准确性、科学性。

Description

一种地方鸡遗传资源保护与品种鉴定的液相芯片及其应用
技术领域
本发明涉及家禽遗传资源保护、评价与鉴定领域，特别是涉及一种地方鸡遗传资源保护与品种鉴定的液相芯片及其应用。
背景技术
我国是世界上家禽遗传资源最为丰富的国家之一，由于多样化的地理生态环境，经过长期的驯养和选择，形成了丰富多彩的地方鸡品种资源，现有地方鸡品种115个(《国家畜禽遗传资源品种名录(2021年版)》)，这些优良品种及其蕴含的巨大基因资源是种业创新和产业可持续发展的重要物质基础。
各级政府历来重视资源保护，由于品种数量多、分布广，我国地方鸡品种资源实行分级保护，主要采用“原产地(保种场)保护”和“异地(基因库)保护”两种活体保护方式。目前，28个鸡种被列入国家重点保护品种名录，建有国家级鸡保种场24个、国家级鸡基因库3个，各省(自治区、直辖市)也建成了一定数量的保种场。但是，长期以来我国各级地方鸡保种场、基因库保种效果评价方法各异，包括常规表型数据(生长性能、繁殖性能、肉蛋品质等)比较分析、利用系谱记录或微卫星DNA、线粒体mtDNA等分子标记计算遗传统计量，但常规表型数据易受环境、批次及营养水平影响且可用的指标较少，FAO推荐的鸡微卫星DNA标记约30对，mtDNA序列长度也仅约1200bp，其所代表的基因组信息极为有限，导致难以在统一的标准尺度下科学评价群体状况和变化。同样，在品种鉴定上，由于地方鸡种间普遍存在无序杂交利用，加之国外品种的冲击，部分品种已严重杂化，因此，如何精准鉴定地方鸡种资源亦是迫切需要解决的难题。
随着高通量测序技术的快速发展，已实现全基因组水平的单核苷酸多态变异(SNP)的高通量检测，并基于不同研究目标发展出多种测序策略，包括全因组重测序、简化基因组测序、外显子测序等。利用基因组测序技术筛选出目的SNP位点集，并设计探针研制芯片，是实现基因组SNP高通量分型的高效手段。当前，国内现已发布了两款鸡育种专用芯片，“京芯一号”和“凤芯一号”，其位点设计主要是考虑繁殖、肉蛋品质、饲料转化率、抗病抗逆等育种上重要经济性状相关功能基因效应位点；国外商业化鸡芯片是基于国外品种资源及近交系基因组信息，主要也是用于品种选育；地方鸡遗传资源保护与品种鉴定专用芯片一直是空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种地方鸡遗传资源保护与品种鉴定的液相芯片及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该液相芯片能够显著提升地方鸡资源评价与鉴定的准确性和科学性，为地方鸡遗传资源保护和精准鉴定提供了有力的核心技术支撑和保障。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种用于地方鸡遗传资源保护与品种鉴定的SNP位点组合，包括表2所示的SNP位点。
本发明还提供上述的SNP位点组合在制备地方鸡遗传资源保护与品种鉴定的液相芯片中的应用。
本发明还提供一种地方鸡遗传资源保护与品种鉴定的液相芯片，所述液相芯片包括一种探针组合，所述探针组合用于鉴别上述的SNP位点组合中各SNP位点的基因型。
本发明还提供上述的SNP位点组合或液相芯片在地方鸡遗传资源保护或品种鉴定中的应用。
本发明还提供一种地方鸡遗传资源保护评价方法，包括以下步骤：
(1)获取待检鸡个体的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为基础，构建得到测序文库；
(3)所述测序文库与上述的液相芯片进行探针杂交反应；
(4)对所述液相芯片捕获的序列测序后的基因型分型信息进行提取，形成基因型分型文件；
(5)根据所述基因型分型文件计算杂合度、核苷酸多态性、分子近交系数、群体有效含量和分化系数，得到评价结果。
本发明还提供一种地方鸡品种鉴定方法，包括以下步骤：
(1)获取待检鸡群的鸡个体的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为基础，构建得到测序文库；
(3)所述测序文库与上述的液相芯片进行探针杂交反应；
(4)对所述液相芯片捕获的序列测序后的基因型分型信息进行提取，形成基因型分型文件；
(5)根据所述基因型分型文件，以不同分支的其它鸡种为对比，计算所述待检鸡群的基因组分数，当所述待检鸡群的基因组分数大于0.90时，表示所述待检鸡群的纯合度高。
本发明公开了以下技术效果：
本发明选取26个代表性地方鸡资源(包括新遗传资源)，融合公共数据库中原鸡序列信息；基于资源保护与品种鉴定重点应用方向，优选在染色体上分布均匀的位点23K，研发出地方鸡遗传资源保护与品种鉴定液相芯片“酉芯一号”，其具有目标区域数据覆盖度和均一性好、基因分型检出率高、芯片数据升级灵活等特点，极大地降低了基因组分型成本，有利于芯片的规模化应用；尤其是芯片数据分析方法标准化，显著提升了地方鸡资源评价与鉴定的准确性、科学性，为地方鸡遗传资源保护和精准鉴定提供了有力的核心技术支撑和保障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为26个鸡种资源遗传结构标准框架(以红原鸡RJF为根)；
图2为23K核心SNP标记集在不同染色体上的分布；
图3为两个群体LD连锁不平衡衰减图；其中，A为LS，B为RD；
图4为两个群体有效含量的历史波动；其中，A为LS，B为RD；
图5为两个群体基因组选择信号分析；
图6为实施例3构建的聚类图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中，用于群体评价和鉴定的分子统计量计算方法如下：
遗传多样性和遗传分化指标：杂合度Ho/HE、核苷酸多态性π、分化系数Fst、选择信号检测(Fst和θπ检验)等采用PopGen和PLINK软件，以100kb为窗口、10kb位step进行滑步计算。
系谱近交系数：系谱近交系数FPED按照常规数量遗传学通径理论计算。
分子近交系数：基于长片段纯合ROH、位点纯合原理，使用PLINK软件分别计算两种近交系数FROH和FHOM。FROH的计算参数设置为：长度100～1000kb，SNP个数/ROH>30,最小SNP密度>500kb/SNP，最大间隔长度<1000kb。FHOM的计算根据实际纯合位点比例计算。
通过分析分子近交系数FROH>100、FHOM与系谱近交系数FPED的相关性，结果表明分子FROH>100与FHOM两者极显著相关(P<0.01)，FROH、FHOM与系谱近交系数FPED亦极显著相关(P<0.01)。但是FROH>100和FHOM是基于不同计算原理，两者数值大小没有可比性，因此通过拟合方法进行数据标准化，标准化后的数据值可直接比较评估。
分子亲缘系数：使用VCFtool软件计算两种分子亲缘系数kin1和kin2，kin1和kin2之间极显著相关(P<0.01)，通过比较其对系谱固有亲缘关系组合的检出效果，发现kin1对狼山高近交实验组中的全同胞、半同胞组合具有最高的检出率(>90.0％)，表明kin1对亲缘关系的估算更为准确。
LD连锁不平衡分析和群体有效含量Ne：使用软件PopLDdecay(https://github.com/BGI-shenzhen/PopLDdecay)进行LD分析。参数设置为：-Out Pair LD 5。采用PSMC软件的成对顺序马尔科夫链模型Pairwise SMC Model方法，根据具有不同杂合位点密度的基因组片段推断出有效群体大小及历史的波动。世代间隔和核酸突变率参数设置为：g＝1，u＝0.2×10-8。
遗传聚类分析：采用FASTtree软件的最大似然法ML或STRUCTURE软件无监督混合模型的贝叶斯算法Bayesian inference，构建的遗传进化树与品种地理分布和形成历史相一致。
基因组分数GF(genome fraction)：使用Admixture或STRUCTURE软件的无监督混合模型模式，采用贝叶斯算法Bayesian inference，参数设置为：K值设定后重复运行500次获得个体基因组分数矩阵，所有个体的基因组分数(特征值)在所属品种中均大于0.90，具有很高的品种个体鉴别率。
实施例1
1、液相芯片SNP位点的筛选
(1)代表性鸡种资源血液样品采集。综合考虑品种生态地理区域分布、经济类型及特殊性状等多方面因素，选取文昌鸡、藏鸡、茶花鸡、边鸡、静原鸡、北京油鸡、仙居鸡、狼山鸡、金湖乌凤鸡、汶上芦花鸡、东乡绿壳蛋鸡、河南斗鸡等26个代表性地方鸡种资源作为芯片开发的基础素材，极大程度地代表了我国地方鸡种资源的遗传特征特性。26个鸡种中，24个鸡种每个品种选择标准个体30个，元宝鸡个体8个，独龙鸡个体10个，其中独龙鸡序列来源于NCBI数据库(见表1)。除独龙鸡外，其余地方鸡种资源均来源于国家地方鸡种基因库(江苏)的纯种保种群体(试验测定群)，确保不会出现杂交群体的干扰。
对上述实验个体采用无菌翅静脉采血1mL，加入柠檬酸钠抗凝剂混匀，-80℃保存备用。
表1液相芯片设计囊括的鸡种资源信息
Figure BDA0004167036560000051
Figure BDA0004167036560000061
(2)DNA样品提取。常规酚-氯仿法提取所有品种基因组DNA。将获得的DNA进行质检，包括荧光分度计检测DNA样品浓度，电泳检测DNA的完整性，包括DNA有无降解，是否存在蛋白质和RNA等其他杂质污染。采用Qubit 2.0对DNA样品进行准确定量，选取质量≥1μg的样品用于下一步建库测序。将合格样品置于-80℃保存，以备建库测序使用。
(3)基因组RAD-seq建库测序。质检合格的DNA样品采用ddRAD建库方式，构建长度范围在300～500bp的Pair-end文库，采用EcoRI(G^AATTC)和NlaIII(Hin1IICATG^)双酶切进行简化基因组RAD-seq测序，方案如下：(1)取基因组DNA 500ng，加入0.6U EcoRI(NEB)、T4 DNA连接酶(NEB)、ATP(NEB)和EcoRI接头(含区分样品的Index序列)在37℃下反应3h，65℃退火1h。然后加限制性内切酶NlaIII(NEB)和NlaIII接头在37℃下反应3h。反应结束后在65℃PCR仪中放置30min失活内切酶。(2)使用琼脂糖凝胶电泳对连接产物进行片段选择，选择400～600bp回收酶切产物。(3)使用Qubit3.0(Life Technology)对回收产物进行DNA定量，等量混合各个样品。(4)使用Illumina TruSeq试剂盒对混合产物进行DNA文库构建。
(4)测序数据质控。对测序得到的原始序列(双端序列)进行数据评估，得到各个样品的原始reads，使用BWA MEM0.7.15软件将reads比对到鸡参考基因组(GRCg6a，Gallus_gallus.GRCg6a.dna.toplevel.fa)。对原始reads测序数据进行质量控制，利用GATKSamtools程序对原始测序数据进行质量控制，对正确率99％的碱基数目比例Q20≥95％进行过滤；通过GATK软件进行SNP检测，双酶切基因组测序的覆盖深度≥60％，SNP在所有样品中单核苷酸多态性检出率(Call rate)≥70％，最小等位基因频率MAF≥0.05；在此基础上，进一步单个鸡种中SNP的检出率≥90％。
基于上述质控，筛选出26个鸡种资源基因组SNP标记约4.7M。
2、用于品种保护与鉴定的核心SNP位点集筛选
(1)26个品种的精细遗传结构分析。基于筛选出的26个鸡种资源全部4.7M基因组SNP标记位点，对所有个体采用GCTA软件进行PCA主成分分析，同时采用MEGA、STRUCTURE、PHYLIP等软件，基于遗传距离(DA、Dr)法、最大似然法ML、模型聚类法Model-based、贝叶斯法Bayesian inference和邻接法NJ等多种遗传聚类方法构建遗传进化树。通过综合分析，以最大似然法ML和贝叶斯法Bayesian inference构建的遗传结构图与品种地理分布、基因流及形成历史相一致，基于此构建出“品种遗传结构标准框架”，精细定位了各品种间遗传结构和分支组成(图1)。7个大的分支，包括分支1：独龙鸡、大围山微型鸡、瓢鸡、藏鸡、茶花鸡，分支2：文昌鸡、惠阳胡须鸡，分支3：金湖乌凤鸡，分支4：萧山鸡、鹿苑鸡，分支5：天津猴鸡、汶上芦花鸡、元宝鸡、琅琊鸡、狼山鸡、寿光鸡，分支6：静原鸡、北京油鸡、边鸡、大骨鸡，分支7：东乡绿壳蛋鸡、安义瓦灰鸡、白耳黄鸡、仙居鸡、固始鸡、河南斗鸡。
(2)23K品种“核心SNP标记集”筛选。在芯片设计中，若使用所有4.7M位点用于资源保种和鉴定，检测成本太高，因此需要筛选出核心SNP标记集，有利于芯片产品的大规模开发和高效使用。
按照染色体均匀分布原则挑选10.1K共享位点：位点缺失率Miss rate<0.1、杂合度Het<0.3、最小等位基因频率Maf>0.1，个体在所属品种分支的基因组分数Genomefraction>0.8。基于这些10.1K位点进行遗传结构分析，品种遗传结构和分支没有改变。
进一步针对遗传距离较近的7个品种，分别计算每个品种△MAF值top100(900个)的位点，利用测序数据验证；利用该0.9K的位点进行遗传结构分析，可以对遗传关系较近的7个品种做到精细区分。选择0.9K位点作为品种鉴定目的补充。
进一步针对7个分支筛选特异性位点，分支间两两对比为纯合不一致位点12K，能够实现分支的精细区分。
进一步针对筛选的23K核心SNP标记集，随机选取26个品种中的部分个体(30％～60％)进行遗传结构和聚类分析，仍没有改变品种间遗传结构和分支组成，也没有个体从所属品种分支中分离出来。
因此，筛选出的23K核心SNP标记集证实为26个品种(包括分支组成)的表征等位基因。23K核心SNP标记集在不同染色体上的分布见图2，具体位置信息见表2。
表223K核心SNP标记集的位置信息
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Figure BDA0004167036560000941
3、液相芯片制备与使用
(1)液相探针设计与合成：针对筛选出的23K核心SNP标记集，基于每个SNP位点上、下游序列对应设计两条探针序列，自核心位点上游100bp起，每10bp作为一个步移，110～120bp为一个探针，构建该位点的探针池，对探针池中的探针序列利用隐马尔可夫规则在鸡的参考基因组(GRCg6a)上进行同源性比对，并计算每条探针的GC含量，选取GC含量在30％～70％之间，且探针在鸡参考基因组上同源性最小的2条，作为该位点的候选探针以2×覆盖捕获核心SNP。利用核酸合成仪合成23K SNP的所有探针，构成“酉芯一号”液相芯片。
(2)样品基因组DNA提取：采用常规酚-氯仿(或高通量)DNA提取试剂盒进行样品DNA的提取。
(3)基因组DNA片段化及末端修复加A：DNA投入量20ng，GenoBaitsEndRepairBuffer4μL，GenoBaitsEnd Repair Enzyme 2.6μL，加入Nuclease-freewater至反应体系为20μL。涡旋震荡混匀后简短离心。37℃孵育20min，72℃孵育20min后，4℃保存。
(4)测序文库构建：从PCR仪中取出小管加入2μL的GenoBaitsUltraDNAligase、8μL的GenoBaitsUltraDNALigaseBuffer和4μLGenoBaitsAdaptor，补水至40μL后放置于PCR仪上22℃反应60min，完成测序接头的连接。向连接产物中加入48μL的GenoPrepDNACleanBeads对连接产物进行纯化，纯化后利用0.65+0.2倍磁珠进行片段筛选，保留插入片段在300～350bp的连接产物。向反应体系中加入10μL的GenoBaits PCR MasterMix和10μL的Barcode，随后进行文库扩增。将扩增产物至于磁力架上静置3min，向反应体系中加入100μL的体积分数80％的乙醇，静置30秒后移除上清，至乙醇完全挥发后完成文库纯化。
(5)液相芯片杂交捕获：取500ng完成构建的测序文库，加入5μLGenoBaitsBlockI和2μLGenoBaitsBlockII，置于EppendorfConcentratorplus真空浓缩仪上在≤70℃的温度下蒸干至干粉。向干粉管中加入8.5μL的GenoBaits2×HybBuffer、2.7μLGenoBaitsHybBufferEnhancer、2.8μLNuclease-FreeWater，利用移液器吸打混匀后放置于PCR仪上95℃温育10min，取出PCR管加入3μL已合成的地方鸡遗传资源保护与鉴定用芯片“酉芯一号”液相探针，旋涡震荡混匀后放置于ABI 9700PCR仪上65℃温育2h，完成探针杂交反应。
(6)文库质检与测序：利用瀚辰光翼Arrayer500对DNA浓度进行测定，利用琼脂糖凝胶电泳检测文库DNA的片段大小是否在300～400bp之间。构建好的文库利用华大MGI-T7测序仪进行测序。
(7)基因型数据分析：测序数据经过FastQC(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/project)质控后，利用BWA(bio-bwa.sourceforge.net)的固有参数将测序数据回帖到鸡参考基因组(GRCg6a)，利用GATK软件(software.broadinstitute.org/gatk)进行SNP鉴定，利用Perl角本对23K核心SNP集的基因型分型信息进行提取，形成最终的基因型分型文件结果。
(8)芯片检出率测试：随机选取19个品种(其中，14个为芯片设计中囊括的品种，5个为芯片设计中未使用的品种(实验组))，每个品种10～30个个体，共计378个样品(见表3)，全部来自于国家地方鸡种基因库(江苏)。翅静脉采血后提取基因组DNA，按照上述方法进行液相探针杂交、文库测序检测，结果见表3。结果显示，SNP位点平均检出率为99.95％。充分证实了“酉芯一号”液相芯片位点的高检出率、高可靠性。
表3“酉芯一号”液相芯片位点检出率测试
品种名称 液相芯片囊括品种 样品数量(个) 检出率(％)
BE白耳黄鸡 是 20 99.89
BJ边鸡 是 10 99.97
CH茶花鸡 是 20 99.96
DG大骨鸡 是 20 99.97
GS固始鸡 是 10 99.98
HX惠阳胡须鸡 是 10 99.97
WC文昌鸡 是 20 99.96
WH安义瓦灰鸡 是 20 99.97
WS汶上芦花鸡 是 20 99.97
WX大围山微型鸡 是 20 99.91
XS萧山鸡 是 10 99.90
JH金湖乌凤鸡 是 10 99.95
PJ瓢鸡 是 10 99.97
SG寿光鸡 是 30 99.96
LSI狼山近交试验组 否 30 99.96
QY清远麻鸡 否 29 99.96
MC麻城绿壳蛋鸡 否 30 99.92
CR崇仁麻鸡 否 29 99.96
SY丝羽乌骨鸡 否 30 99.94
/ / 合计378 平均99.95％
(9)分子统计量计算方法的标准化：选取国家地方鸡种基因库(江苏)组建的狼山鸡高近交实验群体LSI进行分子统计量计算的标准化，狼山鸡高近交实验群体每世代采用全同胞或半同胞交配方式继代扩繁，每个个体均有连续的近10个世代完整系谱记录。选择30个个体，翅静脉采血后提取基因组DNA，按照上述方法进行液相探针杂交、文库测序检测，位点的检出率为99.96％(见表3：LSI)。
实施例2原产地保种场与基因库狼山鸡保种群的保护效果评价
(1)样品采集：原产地和基因库两个狼山鸡保种群，分别按照家系选取10个公鸡、10～20个母体。翅静脉采血1.0mL，柠檬酸钠(ACD)抗凝，-20℃保存备用。
(2)DNA提取：采用高通量DNA提取试剂盒进行样品DNA的提取。
(3)基因组DNA片段化及末端修复加A：DNA投入量20ng，GenoBaitsEndRepairBuffer4μL，GenoBaitsEnd Repair Enzyme 2.6μL，加入Nuclease-freewater至反应体系为20μL。涡旋震荡混匀后简短离心。37℃孵育20min，72℃孵育20min后，4℃保存。
(4)测序文库构建：从PCR仪中取出小管加入2μL的GenoBaitsUltraDNAligase、8μL的GenoBaitsUltraDNALigaseBuffer和4μLGenoBaitsAdaptor，补水至40μL后放置于PCR仪上22℃反应60min，完成测序接头的连接。向连接产物中加入48μL的GenoPrepDNACleanBeads对连接产物进行纯化，纯化后利用0.65+0.2倍磁珠进行片段筛选，保留插入片段在300～350bp的连接产物。向反应体系中加入10μL的GenoBaits PCR MasterMix和10μL的Barcode，随后进行文库扩增。将扩增产物至于磁力架上静置3min，向反应体系中加入100μL的体积分数80％的乙醇，静置30秒后移除上清，至乙醇完全挥发后完成文库纯化。
(5)液相芯片杂交捕获：取500ng完成构建的测序文库，加入5μLGenoBaitsBlockI和2μLGenoBaitsBlockII，置于EppendorfConcentratorplus真空浓缩仪上在≤70℃的温度下蒸干至干粉。向干粉管中加入8.5μL的GenoBaits2×HybBuffer、2.7μLGenoBaitsHybBufferEnhancer、2.8μLNuclease-FreeWater，利用移液器吸打混匀后放置于PCR仪上95℃温育10min，取出PCR管加入3μL已合成的地方鸡遗传资源保护与鉴定用芯片“酉芯一号”液相探针，旋涡震荡混匀后放置于ABI9700PCR仪上65℃温育2h，完成探针杂交反应。
(6)文库质检与测序：利用瀚辰光翼Arrayer500对DNA浓度进行测定，利用琼脂糖凝胶电泳检测文库DNA的片段大小是否在300～400bp之间。构建好的文库利用华大MGI-T7测序仪进行测序。
(7)基因型数据分析：测序数据经过FastQC(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/project)质控后，利用BWA(bio-bwa.sourceforge.net)的固有参数将测序数据回帖到鸡参考基因组(GRCg6a)，利用GATK软件(software.broadinstitute.org/gatk)进行SNP鉴定，利用Perl角本对23K核心SNP集的基因型分型信息进行提取，形成最终的基因型分型文件结果。
统计分析和保种群评价：按照制定的“分子统计量标准化方法”，计算杂合度Ho、核苷酸多态性π、分子近交系数FROH和分化系数Fst，结果见表4。
结果表明：“酉芯一号”液相芯片的SNP位点检出率在基因库与保种场两个狼山鸡群体中均较高(>99.90％)，观察杂合度Ho分别为0.2310和0.2209，核苷酸多态性π分别为0.2479和0.2473，遗传多样性处于中度多态，且差异不显著(P>0.05)；近交系数FROH分别为0.0769和0.1087，处于较低水平，与LD连锁不平衡分析结果(图3)相一致，表明两个群体保种效果较好，采取的保种技术方法有效控制了近交水平。两个群体的有效含量Ne在延续历程中发生明显波动(图4)，近期内，群体有效含量维持在较为稳定的状态。两个狼山鸡群体平均分化系数Fst为0.0040，处于较低水平，整体上未发生显著分化；进一步地通过Fst和θπ检验进行选择信号分析，结果见图5，受选择的基因组区域阈值为Fst>0.048，log2θπratio<-1.37，在18号染色体上检测到显著受选择区域，涉及3个受选择候选功能基因，分别为MCHR1、CASKIN2和TMEM94，这为开展两个保种群体间血源补充提供了科学依据。
表4两个保种群遗传统计量计算
Figure BDA0004167036560000981
实施例3地方鸡资源鉴定
鉴定狼山鸡主产区一散养黑羽鸡群的纯度。
(1)样品采集：散养黑羽鸡群体随机选取10个公鸡、10个母体。翅静脉采血1.0mL，柠檬酸钠(ACD)抗凝，-20℃保存备用。
(2)DNA提取：采用高通量DNA提取试剂盒进行样品DNA的提取。
(3)基因组DNA片段化及末端修复加A：DNA投入量20ng，GenoBaitsEndRepairBuffer4μL，GenoBaitsEnd Repair Enzyme 2.6μL，加入Nuclease-freewater至反应体系为20μL。涡旋震荡混匀后简短离心。37℃孵育20min，72℃孵育20min后，4℃保存。
(4)测序文库构建：从PCR仪中取出小管加入2μL的GenoBaitsUltraDNAligase、8μL的GenoBaitsUltraDNALigaseBuffer和4μLGenoBaitsAdaptor，补水至40μL后放置于PCR仪上22℃反应60min，完成测序接头的连接。向连接产物中加入48μL的GenoPrepDNACleanBeads对连接产物进行纯化，纯化后利用0.65+0.2倍磁珠进行片段筛选，保留插入片段在300～350bp的连接产物。向反应体系中加入10μL的GenoBaits PCR MasterMix和10μL的Barcode，随后进行文库扩增。将扩增产物至于磁力架上静置3min，向反应体系中加入100μL的体积分数80％的乙醇，静置30秒后移除上清，至乙醇完全挥发后完成文库纯化。
(5)液相芯片杂交捕获：取500ng完成构建的测序文库，加入5μLGenoBaitsBlockI和2μLGenoBaitsBlockII，置于EppendorfConcentratorplus真空浓缩仪上在≤70℃的温度下蒸干至干粉。向干粉管中加入8.5μL的GenoBaits2×HybBuffer、2.7μLGenoBaitsHybBufferEnhancer、2.8μLNuclease-FreeWater，利用移液器吸打混匀后放置于PCR仪上95℃温育10min，取出PCR管加入3μL已合成的地方鸡遗传资源保护与鉴定用芯片“酉芯一号”液相探针，旋涡震荡混匀后放置于ABI9700PCR仪上65℃温育2h，完成探针杂交反应。
(6)文库质检与测序：利用瀚辰光翼Arrayer500对DNA浓度进行测定，利用琼脂糖凝胶电泳检测文库DNA的片段大小是否在300～400bp之间。构建好的文库利用华大MGI-T7测序仪进行测序。
(7)基因型数据分析：测序数据经过FastQC(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/project)质控后，利用BWA(bio-bwa.sourceforge.net)的固有参数将测序数据回帖到鸡参考基因组(GRCg6a)，利用GATK软件(software.broadinstitute.org/gatk)进行SNP鉴定，利用Perl角本对23K核心SNP集的基因型分型信息进行提取，形成最终的基因型分型文件结果。
品种鉴定分析：以“酉芯一号”液相芯片囊括的狼山鸡，及不同分支的其它鸡种(随机选择20个个体)为对比，计算个体基因组分数(结果见表5)，散养黑羽鸡群所有20个个体在“酉芯一号”狼山鸡分支中的基因组分数平均为0.908，构建的聚类图(图6)也是如此，黑羽鸡群所有个体在“酉芯一号”狼山鸡分支聚为一类，没有任何个体分离出来，表明其为狼山鸡纯种，未发生杂化现象。
表5黑羽鸡群体基因组分数在标准品种(分支)中的分布
Figure BDA0004167036560000991
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种用于地方鸡遗传资源保护与品种鉴定的SNP位点组合，其特征在于，包括如下表所示的SNP位点：
Figure FDA0004167036550000011
Figure FDA0004167036550000021
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2.一种如权利要求1所述的SNP位点组合在制备地方鸡遗传资源保护与品种鉴定的液相芯片中的应用。
3.一种地方鸡遗传资源保护与品种鉴定的液相芯片，其特征在于，所述液相芯片包括一种探针组合，所述探针组合用于鉴别权利要求2所述的SNP位点组合中各SNP位点的基因型。
4.一种如权利要求1所述的SNP位点组合或权利要求3所述的液相芯片在地方鸡遗传资源保护或品种鉴定中的应用。
5.一种地方鸡遗传资源保护评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获取待检鸡个体的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为基础，构建得到测序文库；
(3)所述测序文库与权利要求3所述的液相芯片进行探针杂交反应；
(4)对所述液相芯片捕获的序列测序后的基因型分型信息进行提取，形成基因型分型文件；
(5)根据所述基因型分型文件计算杂合度、核苷酸多态性、分子近交系数、群体有效含量和分化系数，得到评价结果。
6.一种地方鸡品种鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获取待检鸡群的鸡个体的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为基础，构建得到测序文库；
(3)所述测序文库与权利要求3所述的液相芯片进行探针杂交反应；
(4)对所述液相芯片捕获的序列测序后的基因型分型信息进行提取，形成基因型分型文件；
(5)根据所述基因型分型文件，以不同分支的其它鸡种为对比，计算所述待检鸡群的基因组分数，当所述待检鸡群的基因组分数大于0.90时，表示所述待检鸡群的纯合度高。
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