CN119570941A - 与脊尾白虾繁殖性状相关的SNP标记Ec62238及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个与脊尾白虾繁殖性状相关的SNP标记Ec62238及其应用，属于甲壳动物遗传育种技术领域，根据所述SNP标记Ec62238设计出检测引物SEQ ID NO.1‑2，分型引物SEQ ID NO.3‑5；所述SNP标记Ec62238所在的基因序列如SEQ ID NO.6所示，所述基因序的5’端第601个位点，其碱基为G或A，所述SNP标记Ec62238位于脊尾白虾的第24号染色体上。本发明还提供所述检测引物和分型引物在脊尾白虾繁殖性优良品种选育中的应用，该分子标记进行高繁殖力脊尾白虾的筛选或高繁殖力良种选育，能够节约成本和缩短育种周期。

Description

与脊尾白虾繁殖性状相关的SNP标记Ec62238及其应用

技术领域

本发明属于甲壳动物遗传育种技术领域，具体涉及一种与脊尾白虾繁殖性状相关的SNP标记Ec62238及其应用。

背景技术

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)隶属于长臂虾科(Palaemonidae)、白虾属(Palaemon)。脊尾白虾肉质细嫩、味道鲜美，具有较高的市场价值。近年来，作为新兴的养殖品种发展迅速，成为我国江苏、浙江、山东等省沿海滩涂地区主要的特色水产养殖品种。繁殖性状是虾类养殖业最重要的经济性状之一，较高的繁殖力对于优良养殖品种的扩繁与生产具有较为重要的意义。然而，脊尾白虾的抱卵量远低于其他经济虾类，且脊尾白虾养殖苗种主要依靠捕捞野生亲虾或养殖亲本自繁等方式获得，亲虾繁殖能力低下、苗种品质差，导致养殖的脊尾白虾常因苗种问题表现出生长速度慢、抗病力差等，制约了脊尾白虾养殖产业的发展。因此，通过遗传改良的方法提高脊尾白虾的繁殖性能是脊尾白虾养殖产业持续发展的重要举措。

脊尾白虾具有繁殖周期短的优点，一般2-3个月可繁殖一代，且同一尾雌虾可连续多次抱卵繁殖。衡量雌虾繁殖性能高低的重要指标主要包括抱卵量和产量次数等，具有不同遗传背景的群体其繁殖性能存在显著差异。

分子标记辅助育种(Molecular marker-assisted breeding,MAS)采用与目标基因紧密连锁的分子标记，筛选具有特定基因型的个体，并结合常规育种方法选育优良品种，相比于传统的育种方法，分子标记辅助育种具有明显的优势，可缩短育种年限，不受水产动物生长阶段的影响，不受外界环境的影响，可在任何环境条件下进行分子标记选择。分子标记辅助育种的前提是得到目标基因的功能标记或紧密连锁标记，需要对目标基因进行基因定位或克隆。

全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)是指在全基因组层面开展分子标记与目标性状关联研究，通过对大规模群体DNA样本进行全基因组高密度分子标记分型，寻找与目标性状相关的遗传标记的研究方法。GWAS是识别与动植物重要经济性状相关遗传变异的有效工具，明确了关键遗传区域和候选基因，这些区域和候选基因可能是进一步研究和育种计划的目标。随着基因组测序技术的飞速发展、测序成本的降低，GWAS已经成为动植物重要复杂性状研究的重要方法。GWAS分析为甲壳动物经济性状提供了候选的分子标记和功能基因，为分子标记辅助选择育种在甲壳动物育种中的应用奠定了重要基础。

发明内容

为了克服现有传统育种技术在脊尾白虾高繁殖力性状选育中的不足，本发明的目的在于提供了一种与脊尾白虾繁殖性状相关SNP标记Ec62238及其应用，利用该分子标记进行高繁殖力脊尾白虾的筛选或高繁殖力良种选育，能够节约成本和缩短育种周期。

为实现上述发明目的，本发明是通过如下技术方案来实现的：

本发明首先提供了SNP标记Ec62238在脊尾白虾繁殖性优良品种选育中的应用，根据所述SNP标记Ec62238设计出检测引物SEQ ID NO.1-2，分型引物SEQ ID NO.3-5；所述SNP标记Ec62238所在的基因序列如SEQ ID NO.6所示，所述基因序的5’端第601个位点，其碱基为G或A，所述SNP标记Ec62238位于脊尾白虾的第24号染色体上。

所述SNP标记Ec62238的检测引物，所述检测引物的正向引物序列：5'-TACTTGGATGCCTCTGGTGT-3'(SEQ ID NO.1)，反向引物序列：5'-TTTAGTGTAGGTCTCGCTGATG-3'(SEQ ID NO.2)。

所述SNP标记Ec62238的分型引物，正向引物序列5'-ATCACCTCAGTAAGTAACCAGG-3'(SEQ ID NO.3)，或5'-ATCACCTCAGTAAGTAACCAGA-3'(SEQ ID NO.4)，反向引物序列5'-AAGTCTTTGTCTTGACCAGATG-3'(SEQ ID NO.5)。

本发明还提供所述检测引物在脊尾白虾繁殖性优良品种选育中的应用，所述的应用方法为利用所述引物对脊尾白虾的样本DNA进行PCR扩增，选择扩增出647bp目的片段的个体作为品种培育亲本，所述检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

本发明还提供SNP标记Ec62238分型引物在脊尾白虾繁殖性优良品种选育中的应用，所述的应用方法为利用所述引物对脊尾白虾的样本DNA进行荧光定量PCR扩增，根据扩增结果对脊尾白虾个体进行SNP标记分型，确定待测样品在Ec62238位点的基因型；选择该位点为GG基因型作为品种培育亲本，所述分型引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-5所示。

进一步，所述的分型引物对脊尾白虾进行分型的方法：利用第一引物和第二引物对分别对脊尾白虾个体进行PCR荧光定量，分析扩增结果，所述的第一引物对的正向引物序列5'-ATCACCTCAGTAAGTAACCAGG-3'(SEQ ID NO.3)，反向引物序列5'-AAGTCTTTGTCTTGACCAGATG-3'(SEQ ID NO.5)；所述第二引物对的正向引物序列5'-ATCACCTCAGTAAGTAACCAGA-3'(SEQ ID NO.4)，反向引物序列5'-AAGTCTTTGTCTTGACCAGATG-3'(SEQ ID NO.5)；当第一引物对的荧光定量PCR扩增循环数Ct值小于第二引物对的荧光定量PCR扩增循环数Ct值，且差值大于4，则该个体的基因型为GG基因型；当第一引物对的荧光定量PCR扩增循环数Ct值大于第二引物对的荧光定量PCR扩增循环数Ct值，且差值大于4，则该个体的基因型为AA基因型；若第一引物对的荧光定量PCR扩增循环数Ct值与第二引物对的荧光定量PCR扩增循环数Ct值的差值小于1，则该个体的基因型为GA基因型。

本发明与现有技术相比具有如下有益技术效果：利用本发明提供的分型引物能够筛选具有SNP标记Ec62238的GG基因型的脊尾白虾育种材料，所述SNP标记Ec62238的GG基因型个体的抱卵量、单位体长抱卵量、单位体重抱卵量性状显著的大于AA基因型和GA基因型的个体(P<0.05)；不仅能够快速获得稳定的繁殖性状突出的脊尾白虾，且不受脊尾白虾生长阶段、环境等限制，可以用于脊尾白虾的早期选育，降低亲本筛选的盲目性，节约了养殖成本，缩短了育种周期。具有良好且广泛的市场应用前景。

附图说明

图1为脊尾白虾繁殖性状(抱卵量)全基因组关联分析的曼哈顿图，紫色圆圈标记的为本发明筛选的分子标记，该标记位于脊尾白虾的第24号染色体上；

图2为脊尾白虾SNP标记Ec62238检测的扩增引物的PCR产物电泳图

图3为所述Ec62238标记荧光定量PCR反应的扩增曲线；基因型从上到下分别为GG、AA、GA基因型。

具体实施方式

以下的实施例对本发明作进一步描述，是对本发明进行说明而非对其加以限定。下述实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店可以购买得到的。

本发明的实施例基于全基因组关联分析筛选与脊尾白虾繁殖性状相关的SNP标记，对152尾脊尾白虾进行全基因组重测序，利用BWA软件将重测序的数据比对到脊尾白虾基因组上，获得所有个体的SNP位点信息，开展脊尾白虾抱卵量、相对抱卵量性状的全基因组关联分析研究，进一步经过大量筛选实验，最终筛选到与脊尾白虾抱卵量性状相关的SNP位点，位于第24号染色体的第69272350个碱基处，命名为Ec62238。利用TBtools软件提取该SNP位点上下游600bp的序列，具体的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

实施例1：脊尾白虾重测序、遗传变异检测及全基因组关联分析

1、群体繁殖性状表型数据收集和统计分析

选取健康的、抱卵初期的脊尾白虾雌虾，收集其抱卵量、单位体长抱卵量、单位体重抱卵量等繁殖性状相关数据。对收集到的表型数据进行统计分析，包括最小值、最大值、平均值、标准差、变异系数等，结果如表1所示；

表1脊尾白虾繁殖性状表型数据统计分析

2、脊尾白虾肌肉组织的基因组DNA提取与检测

参照传统的酚氯仿的方法提取脊尾白虾肌肉组织的DNA。取脊尾白虾肌肉组织100mg于2ml离心管中，加入600μl裂解缓冲液，同时加入30μl蛋白酶K去除蛋白质，然后60℃温育1-2h，期间上下颠倒混匀数次，加速消化过程；待完全消化后，加入等体积(600μl)的酚氯仿异戊醇(25:24:1)，摇床低速混匀5min；室温12000g离心15min，吸取上清400μl，加入等体积冷的异丙醇(-20℃)，缓慢上下颠倒几次，待出现白色絮状的沉淀；室温12000g离心10min，待絮状沉淀聚集在离心管底部，去除离心管中液体，用95％的乙醇洗涤DNA两次，待完全干燥后用1×TE溶解DNA。1％琼脂糖胶检测DNA的质量，测定浓度后，4℃或者-20℃保存备用。

3、脊尾白虾全基因组重测序及遗传变异检测。

将检测合格的基因组DNA送至上海欧易生物医学科技有限公司进行质检并建库测序，利用Illumina二代测序平台进行全基因组重测序，获得原始下机数据。使用fastp软件对原始测序的raw reads进行质控，去掉含有接头序列的reads，去掉低质量的reads，最后得到高质量的clean data，进一步使用bwa软件将clean reads比对到参考基因组上；使用vcftools软件对SNP进行过滤筛选，使用SHAPEIT2软件将原始单倍型文件转换成分相的VCF文件。

4、脊尾白虾繁殖性状的全基因组关联分析。

利用EMMAX软件，采用混合线性模型，基于SNP检测结果和抱卵量性状对脊尾白虾进行全基因组关联分析，通过关联的显著性(P-value)，当-log10(P)>6时差异显著，筛选出潜在的候选SNPs，共筛选到与抱卵量性状相关的190个SNP位点(图1)，对这些位点所在的基因进行功能注释。从候选的SNP位点中选择了1个位点用于验证关联结果的准确性，该位点位于24号染色体的第69272350个碱基，与抱卵量性状的相关性为P-value＝2.24E-08。

实施例2：Ec62238标记与脊尾白虾繁殖性状的相关性的初步验证

采用荧光定量PCR方法对繁殖性状相关候选分子标记在152个个体的脊尾白虾群体中进行验证。所用脊尾白虾群体为全基因组关联分析的152个个体群体。利用基因分型引物对待测个体的DNA进行荧光定量PCR扩增曲线，根据扩增曲线结果统计每个个体的基因型，基于Tassel 5.0软件的广义线性模型GLM进行相关性分析。具体步骤如下：

1、Ec62238位点验证。

利用SNP标记Ec62238检测的扩增引物的正向引物序列：5'-TACTTGGATGCCTCTGGTGT-3'(SEQ ID NO.1)，反向引物序列：5'-TTTAGTGTAGGTCTCGCTGATG-3'(SEQ ID NO.2)，随机对10个脊尾白虾的个体进行PCR扩增和测序，PCR扩增的体系为：模板DNA 2μl，上下游引物各1μl，2μl 10×LA PCR缓冲液II，1.6μl 2.5mM dNTP混合液，0.4μl5U/μl TaKaRa LA Taq和11μl无菌水。PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，60℃退火40s，72℃延伸20s，35个循环；72℃最终延伸3min。PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，获得每个个体在Ec62238位点的序列信息，验证突变位点与前期重测序的结果是否一致(图2)，所述检测引物扩增的目的片段为647bp。

2、基因型检测。

利用正向引物：5'-ATCACCTCAGTAAGTAACCAGG-3'(SEQ ID NO.3)，或5'-ATCACCTCAGTAAGTAACCAGA-3'(SEQ ID NO.4)和反向引物：5'-AAGTCTTTGTCTTGACCAGATG-3'(SEQ ID NO.5)，对每一个脊尾白虾个体进行荧光定量PCR扩增，PCR扩增的体系为：模板DNA1μl，上下游引物各1μl，2×ChamQTM SYBR Color qPCR 10μl，50×ROX II 0.4μl和6.6μl无菌水。荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃30s；95℃10s，60℃30s，72℃40s，40个循环；95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s。根据荧光定量PCR扩增曲线，对每个个体在Ec62238位点的基因型进行分型。获得每个个体在Ec62238位点的基因型，结果如图3所示，当正向引物SEQ IDNO.3和反向引物(SEQ ID NO.5)的荧光定量PCR扩增循环数Ct值小于正向引物SEQ IDNO.4和反向引物(SEQ ID NO.5)的荧光定量PCR扩增循环数Ct值，且差值大于4，则该个体的基因型为GG基因型；当正向引物SEQ ID NO.3和反向引物(SEQ ID NO.5)的荧光定量PCR扩增循环数Ct值大于正向引物SEQ ID NO.4和反向引物(SEQ ID NO.5)的荧光定量PCR扩增循环数Ct值，且差值大于4，则该个体的基因型为AA基因型；若正向引物SEQ ID NO.3和反向引物(SEQ ID NO.5)的荧光定量PCR扩增循环数Ct值与正向引物SEQ ID NO.4和反向引物(SEQID NO.5)的荧光定量PCR扩增循环数Ct值的差值小于1，则该个体的基因型为GA基因型。

3、Ec62238位点与抱卵量性状的相关性分析。

利用Tassel 5.0软件的广义线性模型GLM进行Ec62238位点与抱卵量性状的相关性分析。Ec62238位点与抱卵量性状显著相关，Ec62238标记对抱卵量性状的表型解释率为3.29％(表2)。利用单因素方差分析比较不同脊尾白虾基因型个体间的差异显著性，发现GG基因型的脊尾白虾的抱卵量显著高于GA、AA基因型脊尾白虾的抱卵量(P<0.05)。

表2Ec62238不同基因型对脊尾白虾抱卵量性状的影响

实施例3：利用Ec62238标记筛选高繁殖力脊尾白虾雌虾

本发明获得的SNP标记Ec62238能够用来辅助选育脊尾白虾高繁殖力品种，应用步骤简单来说为：随机选择脊尾白虾雌虾，提取待测试样品的DNA并将其作为模板，使用实施例2的分子标记Ec62238的扩增引物进行PCR扩增，并将PCR产物进行测序，如果测序结果中分子标记Ec62238的基因型为GG，则测试脊尾白虾样品可以选择作为培育脊尾白虾高繁殖力品种的亲本。

具体的操作步骤如下：

1、所用脊尾白虾群体为日照海辰水产有限公司养殖场养殖的40个脊尾白虾全同胞家系，从中随机选出96个脊尾白虾个体，收集其抱卵量、单位体长抱卵量、单位体重抱卵量等繁殖性状相关数据。进一步取其肌肉组织，提取每个个体的基因组DNA。

2、对每个脊尾白虾的样品进行SNP分型检测。利用正向引物：5'-ATCACCTCAGTAAGTAACCAGG-3'(SEQ ID NO.3)，或5'-ATCACCTCAGTAAGTAACCAGA-3'(SEQ IDNO.4)和反向引物：5'-AAGTCTTTGTCTTGACCAGATG-3'(SEQ ID NO.5)，对每一个脊尾白虾个体进行荧光定量PCR扩增。根据荧光定量PCR扩增曲线，对每个个体在Ec62238位点的基因型进行分型。

3、利用单因素方差分析比较Ec62238标记不同基因型脊尾白虾雌虾繁殖性状之间的差异显著性。结果表明，具有GG基因型的脊尾白虾雌虾，其抱卵量性状显著大于GA基因型和AA基因型的个体(P<0.05)(表3)。因此，选择GG基因型的雌虾为高繁殖力新品种选育的亲本，可以显著提高脊尾白虾的繁殖力。Ec62238标记可以广泛应用于高繁殖力脊尾白虾雌虾的个体的筛选，且不受其生长、繁殖季节的限制。

另外，Ec62238标记还可用于脊尾白虾群体遗传多样性等分析。

表3Ec62238标记与抱卵量性状的关联分析

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQ ID NO.6：

AACATTTTACATATTTCATAAATAACTTTTTAGCATTATTCCTCTCTCAGAAG

TGGCTAGCTAGTTAGTAAGACAGAACTCATTCCCTTGTAATTCATTTTCTTC

TTGTGAATGTCAATGAGGGGTTTGGCAAGATACCAATAACCTCTTGTTATAA

AACTAGGTGTATGATAGGGTTTCCCCATAGAGAACTGACCAGTACAATCTG

ATGTAAGGAGGCTGTAGTAAATTTTTACAAACATCCCATACACCTAAAGAA

TTTTATTACAATGCACCTCTTTCTTTCATCATATTCCATTACTGTTTAAAAAA

CTCATGTAAATATTTCACTTAATACTGGTATCAAAAAGAGTACTAAAAATTC

CAGACTACTTGGATGCCTCTGGTGTTGGCAATGATATCATCTAATGCAACAC

CTACCTCCTTCTCTATTCAATAATTATTTCCATAAATCTTACCTTTGAATCATA

AGCTATTAATTCAGAAGTGCAACCTTTTTGGCCTTAGAATGATTGAAACCA

AAAATTACTCTCCACATCATCCTCACATCCCTTAGGCAAACATAAGACTAAC

ATGCTGATCACCTCAGTAAGTAACCAGGTGAGTTGGTCTGAACAATTAACA

CTAACTAGTGCATCAGTTTAATTCAGTTATCTGCGTTTTTTACACAGCCTTTT

AGTGCCTAATTCCTTCCTAGTGGTAACATCTGGTCAAGACAAAGACTTTTT

ACTATAGTTCATTGTGAGGAATGTAAAGTAAGTCACCTAAGTTATAAGAAC

TTTCAACTTTCAAAGATATGAACTAGTTTGCGCAATAAATTAAAAATCATCT

ACACAAGTGAAAAGTATTTTAAAAATCAAATTACGTGGCTGGCTAGCCAAC

TGAAAATGCTGAAGGGTAAGGGGTGCTATTATAAGGTGGATGCCTACGCTG

CTTATGTTGGACTTTAGAACCTTCGAACTAAAGAACCCACACTTGGAACGA

GTCTCATTTTCATCAGCGAGACCTACACTAAACATTTATCAAAATCAGATAT

GAAAACCTATTCAGGTTATGTAGTTATCTTATTTACTTTGGATATAAGGATAT

GTATTCTTATCTTTTTATGGTGAGGGTTTGTGATGGGTTGAATTAGACAGGA

TTTATGAATTTGGGCTATCTAACTCAGCACCGAGGTCTGTGAGGCCATTTAG

CACCCAAG。

Claims (4)

1.SNP标记Ec62238在脊尾白虾繁殖性优良品种选育中的应用，其特征在于，根据所述SNP标记Ec62238设计出检测引物SEQ ID NO.1-2，分型引物SEQ ID NO.3-5；所述SNP标记Ec62238所在的基因序列如SEQ ID NO.6所示，所述基因序的5’端第601个位点，其碱基为G或A，所述SNP标记Ec62238位于脊尾白虾的第24号染色体上。

2.SNP标记Ec62238标记的检测引物在脊尾白虾繁殖性优良品种选育中的应用，其特征在于，所述的应用方法为利用所述检测引物对脊尾白虾的样本DNA进行PCR扩增，选择扩增出647bp目的片段的个体作为品种培育亲本，所述检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

3.SNP标记Ec62238的分型引物在脊尾白虾繁殖性优良品种选育中的应用，其特征在于，所述的应用方法为利用所述分型引物对脊尾白虾的样本DNA进行荧光定量PCR扩增，根据扩增结果对脊尾白虾个体进行SNP标记分型，确定待测样品在Ec62238位点的基因型；选择该位点为GG基因型作为品种培育亲本，所述分型引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-5所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用分型引物对脊尾白虾进行分型的方法：利用第一引物对和第二引物对分别对脊尾白虾个体进行PCR荧光定量，分析扩增结果，所述的第一引物对的正向引物序列SEQ ID NO.3，反向引物序列SEQ ID NO.5；所述第二引物对的正向引物序列SEQ ID NO.4，反向引物序列SEQ ID NO.5；当第一引物对的荧光定量PCR扩增循环数Ct值小于第二引物对的荧光定量PCR扩增循环数Ct值，且差值大于4，则该个体的基因型为GG基因型；当第一引物对的荧光定量PCR扩增循环数Ct值大于第二引物对的荧光定量PCR扩增循环数Ct值，且差值大于4，则该个体的基因型为AA基因型；若第一引物对的荧光定量PCR扩增循环数Ct值与第二引物对的荧光定量PCR扩增循环数Ct值的差值小于1，则该个体的基因型为GA基因型。