CN119265322B - 一种与鸡蛋重性状相关的cspg4基因分子标记引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与鸡蛋重性状相关的CSPG4基因分子标记引物及其应用，属于生物技术领域。本发明通过以待测鸡的基因组DNA为模板，采用特异性引物对其进行PCR扩增，然后将该PCR扩增产物进行Sanger测序和SNP分子标记基因分型，进而对鸡开产蛋重性状选择。T/T基因型鸡的开产蛋重高于T/G和G/G基因型个体，T/G基因型鸡的开产蛋重高于G/G基因型个体。通过淘汰T/G和G/G基因型个体，保留T/T基因型个体，其有益效果是该分子标记作为鸡育种的遗传标记，选育开产蛋重较大且均匀的鸡；可高效快速地鉴定鸡开产蛋重性状，提高鸡群蛋重的整齐度，为鸡的早期选育提供科学依据，对于鸡育种具有重要价值。

Description

一种与鸡蛋重性状相关的CSPG4基因分子标记引物及其应用

技术领域

本发明涉及一种与鸡蛋重性状相关的CSPG4基因分子标记引物及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

蛋重是鸡蛋品质的重要评价指标，在蛋结构评估与蛋分级中扮演着关键角色。蛋重的大小不仅影响鸡蛋的食用价值，还影响其种用价值，因此蛋重的选育是必不可少的。影响蛋重的因素主要有体重和日龄等，其中蛋重与产蛋日龄呈正相关的趋势，随着母鸡日龄的增加，蛋重也随之增加直至产蛋中期慢慢趋于平缓。开产蛋重还影响开产初期乃至整个产蛋周期的鸡蛋品质，通过提高开产蛋重对产蛋性状进行改良，选育出优秀的鸡只显得尤为重要。利用分子标记来准确鉴定影响鸡开产蛋重性状的基因，将其运用到早期的育种选择中，选育开产蛋重较大的群体，可以优化整个产蛋期的鸡蛋质量，提高资源利用效率。影响鸡开产蛋重的生理因素主要有鸡的开产日龄、开产体重和产蛋阶段等，开产蛋重和体重的大小影响着开产初期乃至整个产蛋周期的产蛋质量，且蛋重与鸡的日龄呈正相关。CSPG4基因在胚胎发育过程中帮助细胞迁移和分化，可能影响胚胎的发育从而引起蛋重的变化。CSPG4基因还可能与卵巢中一个重要的通路密切相关，在卵巢中被上调表达，可能调控排卵过程，为CSPG4基因与繁殖性状之间的关联提供了新的见解。尚未见报道CSPG4基因在鸡繁殖性状中的研究。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种与鸡蛋重性状相关的CSPG4基因分子标记引物及其应用，快速检测筛选鸡的蛋重。

本发明测量了母鸡的蛋重，利用全基因组重测序技术进行SNP基因分型，通过全基因组关联分析筛选得到与鸡开产蛋重性状显著相关的CSPG4基因分子标记，为鸡开产蛋重性状选育提供了新的基因和分子标记资源。

本发明通过以下技术方案解决技术问题：首先提供一种与鸡蛋重性状相关的CSPG4基因分子标记引物，所述分子标记引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述分子标记位于鸡参考基因组GRCg7b版本10号染色体上第2731932位碱基处，碱基突变为T或G。序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示第199位碱基。

本发明进一步提供上述分子标记引物的应用，用于鸡开产蛋重性状相关的SNP基因型的检测。检测方法包括以下步骤，

第一步、提供待测鸡DNA样品，用分子标记引物对进行PCR扩增，得到扩增产物，所述扩增产物长度为305bp，含有鸡10号染色体第2731932位碱基；

第二步、将PCR产物进行Sanger测序；

第三步、根据第二步的测序结果判断鸡10号染色体第2731932位碱基SNP分子标记基因型。

其中，第一步所述的分子标记引物对的脱氧核糖核苷酸序列为：

上游引物：5’-TTTGACCCCAGATGAGAGGAGT-3’（SEQ ID NO: 1）

下游引物：5’-GTAGGAGCGCACGGAATAAAGT-3’（SEQ ID NO: 2）

其反应体系终浓度25 μl计，

待测鸡DNA 50 ng

2 x Accurate Taq Master Mix 12.5 μl

上游引物 1 μl

下游引物 1 μl

灭菌水 补充至 25 μl。

所述的PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30循环；72℃延伸2min；4℃保存；扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示，扩增产物长度为305bp，包含鸡10号染色体第2731932位碱基。

所述第三步中，判断标准是SNP位点为T/T基因型鸡的开产蛋重高于T/G和G/G基因型个体，T/G基因型鸡的开产蛋重高于G/G基因型个体。

本发明通过CSPG4基因分子标记检测鸡开产蛋重性状的基因型，得出T/T基因型鸡的开产蛋重高于T/G和G/G基因型个体，T/G基因型鸡的开产蛋重高于G/G基因型个体。通过以待测鸡的基因组DNA为模板，采用特异性引物对其进行PCR扩增，然后将该PCR扩增产物进行Sanger测序和SNP分子标记基因分型，基于该SNP分子标记的基因型可以实现对鸡开产蛋重性状进行选择。在育种中，可根据育种目标，通过淘汰T/G和G/G基因型个体，保留T/T基因型个体，其有益效果是该分子标记可以作为鸡育种的遗传标记，选育开产蛋重大的鸡；可以高效快速地鉴定鸡开产蛋重性状，并提高鸡群蛋重的整齐度，为鸡的早期选育提供科学依据，对于鸡育种具有重要价值。此外，本发明公开的检测方法简单易操作，在实验室即可开展。

附图说明

图1是开产蛋重全基因组关联分析的曼哈顿图。

图2是三种基因型PCR扩增产物的Sanger测序结果。

具体实施方式

以下实施例适用于鸡的育种，所举鸡的品种不限于下述实施例。

实施例1

本实施例测量了隐性白洛克母鸡的开产蛋重，利用第二代测序技术进行全基因组SNP基因分型，通过全基因组关联分析筛选得到与开产蛋重显著相关的CSPG4基因分子标记，结果如图1所示。

本实施例通过以下实验对鸡开产蛋重相关的CSPG4基因分子标记进行鉴定和应用。

1.表型测定和基因型检测

（1）实验材料及开产蛋重表型测定

选取隐性白洛克母鸡2284只，作为试验动物，在相同的饲养条件下饲养，整个过程采用自由饮食和饮水，开产时，记录每只鸡的蛋重，作为鸡开产蛋重的表型数据。

（2）基因组DNA的提取

对待测个体采用翅下静脉采血，抗凝处理后裂解，经蛋白酶K消化后，用饱和氯化钠方法提取，TE溶解之后-20℃保存。

（3）PCR扩增

以上述提取的基因组DNA为模板，对包含10号染色体第2731932位碱基的片段进行扩增。

上游引物：5’-TTTGACCCCAGATGAGAGGAGT-3’（SEQ ID NO: 1）

下游引物：5’-GTAGGAGCGCACGGAATAAAGT-3’（SEQ ID NO: 2）

反应体系终浓度（25μl）为：

待测DNA 50 ng

2 x Accurate Taq Master Mix 12.5 μl

上游引物 1 μl

下游引物 1 μl

灭菌水 补充至 25 μl。

PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30循环；72℃延伸2min；4℃保存；取10μl用于琼脂糖检测，扩增得到单一目的条带长度为305bp的扩增产物，且含鸡10号染色体第2731932位碱基位点的SNP分子标记。扩增产物序列如下：

SEQ ID NO:3

TTTGACCCCAGATGAGAGGAGTGCTGGGGGAGCATCTCAGCCCGGCTGCAGCACGCAGAGAGCAGGAGAGCCCTGCAGTGAGGAGCTGCAGCGGCGCAGCGCGTTGTTGTTGTTGGGTCCCATCCTGAGCGCAGCGCTCAGTTTTTCCTCGGCTCATTTCTATTTAAGAGCTTAGGGGAAAACTTGAGCAAGAGGCCGTGGCTCGGCACGCCGCCTCCAAACACTGCGCTGCAGCTCACGGCTTGGCAGGGCTCAGGCAAACCGGCTGCACCTCGGGAAAGGCACTTTATTCCGTGCGCTCCTAC

SEQ ID NO:4

TTTGACCCCAGATGAGAGGAGTGCTGGGGGAGCATCTCAGCCCGGCTGCAGCACGCAGAGAGCAGGAGAGCCCTGCAGTGAGGAGCTGCAGCGGCGCAGCGCGTTGTTGTTGTTGGGTCCCATCCTGAGCGCAGCGCTCAGTTTTTCCTCGGCTCATTTCTATTTAAGAGCTTAGGGGAAAACTTGAGCAAGAGGCCGGGGCTCGGCACGCCGCCTCCAAACACTGCGCTGCAGCTCACGGCTTGGCAGGGCTCAGGCAAACCGGCTGCACCTCGGGAAAGGCACTTTATTCCGTGCGCTCCTAC

（4）Sanger测序和基因分型

分别将各个样本的PCR产物进行Sanger测序，获得的不同基因型测序峰图如图2所示。

2.相关性分析

选取2284只开产蛋重表型记录清晰的隐性白洛克母鸡个体进行相关性分析。采用R 4.2统计绘图软件的ANOVA检验函数进行统计检验，选择两两之间平均值比较模式对试验鸡群的基因型和开产蛋重性状进行统计检验，P<0.05表明差异显著。结果如表1所示，三种基因型鸡的开产蛋重差异显著（P<0.05）。T/T基因型个体的开产蛋重平均值为48.61g，高于T/G基因型个体的47.88g（P<0.05）和G/G基因型个体的47.51g（P<0.05）。T/G基因型个体的开产蛋重，高于G/G基因型个体（P<0.05）。结果表明鸡10号染色体第2731932位碱基处位点与鸡开产蛋重性状表型显著关联，可根据实际育种目标，选育T/T基因型个体以选育开产蛋重较大的鸡，提高整体的开产蛋重及整齐度，提高选育效率。

表1 CSPG4基因分子标记基因型与开产蛋重的关联分析

注：同列数据肩标相同字母表示差异不显著，肩标不同字母表示差异显著（P<0.05）。

实施例2

不同品种基因型频率

1.血液样品采集

使用翅下静脉采血法采集洛岛红蛋鸡、白来航蛋鸡、科宝肉鸡、茶花鸡、福建河田鸡、狼山鸡、溧阳鸡、广西麻鸡、杏花鸡、广西乌骨鸡、广西三黄鸡、北京油鸡、大骨鸡、大围山微型鸡、文昌鸡、武定鸡、瓢鸡、胡须鸡和藏鸡19个品种的血液样品-20℃保存备用。

2.提取基因组 DNA

取第1步得到的组织样品，采用Omega的组织基因组 DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体方法参照Omega 提供的标准操作流程。

3.基因型的检测

以第2步得到的基因组DNA为模板，采用F核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和R核苷酸序列(SEQ ID NO:2)组成的引物对进行PCR扩增和Sanger测序得到个体的 T/T基因型、T/G基因型和G/G基因型。

4.结果分析

洛岛红蛋鸡和白来航蛋鸡是常见的商业蛋鸡品种，产蛋率高，蛋重适中均匀。科宝肉鸡是常见的商业肉鸡品种，体型大，产蛋性能较差。茶花鸡、福建河田鸡、狼山鸡、溧阳鸡、广西麻鸡、杏花鸡、广西乌骨鸡、广西三黄鸡、北京油鸡、大骨鸡、大围山微型鸡、文昌鸡、武定鸡、瓢鸡、胡须鸡和藏鸡是中国知名的地方鸡品种。蛋鸡的蛋重通过长期选育，蛋重的开产蛋重相对肉鸡更加均匀，且前期蛋重增加较快，以上结果表明，可用该位点作为分子标记进行蛋重选育。见表2。

表2 CSPG4基因分子标记在不同品种中的等位基因频率分布

除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (3)

1.一种与鸡蛋重性状相关的CSPG4基因SNP引物的应用，其特征在于：将所述SNP引物用于鸡开产蛋重性状检测，所述SNP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述SNP位于鸡参考基因组GRCg7b版本10号染色体上第2731932位碱基处，碱基突变为T或G；SNP位点为T/T基因型鸡的开产蛋重高于T/G和G/G基因型个体，T/G基因型鸡的开产蛋重高于G/G基因型个体。

2.根据权利要求1所述与鸡蛋重性状相关的CSPG4基因SNP引物的应用，其特征在于：检测方法包括以下步骤，

第一步、提供待测鸡DNA样品，用SEQ ID NO:1-2所示的SNP引物进行PCR扩增，得到扩增产物，所述扩增产物长度为305bp，含有鸡参考基因组GRCg7b版本10号染色体第2731932位碱基；

第二步、将PCR产物进行Sanger测序；

第三步、根据第二步的测序结果判断鸡参考基因组GRCg7b版本10号染色体第2731932位碱基SNP基因型。

3.根据权利要求2所述与鸡蛋重性状相关的CSPG4基因SNP引物的应用，其特征在于：反应体系终体积25 μl计，

待测鸡DNA 50 ng

2 × Accurate Taq Master Mix 12.5 μl

上游引物 1 μl

下游引物 1 μl

灭菌水 补充至 25 μl；

所述的PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30循环；72℃延伸2min； 4℃保存；所述扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。