CN118127185B - PRLR基因中分子标记g.39080534G>A在检测山羊产羔数性状中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于山羊分子标记辅助选择技术领域，具体涉及PRLR基因中分子标记g.39080534G>A在检测山羊产羔数性状中的应用。本发明山羊PRLR基因中的分子标记，可用于检测山羊产羔数性状，辅助选育产羔数较多的山羊，可以显著提高育种效率。实施例结果表明，g.39080534G＞A位点GG基因型母羊个体，能够获得更多的产羔数。此外，本发明检测山羊产羔数性状的方法检出率高、耗时短，便于产业应用。

Description

PRLR基因中分子标记g.39080534G＞A在检测山羊产羔数性状 中的应用

技术领域

本发明属于山羊分子标记辅助选择技术领域，具体涉及PRLR基因中分子标记g.39080534G＞A在检测山羊产羔数性状中的应用。

背景技术

我国山羊饲养历史悠久，是常见的居民肉食来源。羊肉具有健康、安全的营养特性，随着消费者对于健康饮食要求的不断增长，使得羊肉在肉类消费中的比重不断上升。提高羊肉年产量最直接的方法便是增加产羔个数，故研究如何通过选育来提高山羊产羔性能，对于提升山羊生产繁殖效益具有十分重要的意义。

标记辅助选择(marker assisted selection，MAS)是在动物分子遗传学和现代分子生物技术的飞速发展下诞生的一种以遗传变异为原理，用来寻求提高动物遗传力方法的一种现代分子技术。目前，可用于遗传学研究的分子标记方法有生化标记和DNA标记两种，但生化标记存有许多限制，所以DNA标记法成为了基因遗传研究中广受欢迎的方法。DNA分子标记法是在DNA水平上分析的遗传标记，这些标记被用来分析物种、群体和个体之间的遗传多态性以及识别与动物经济价值性状密切相关的分子标记。

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组中存在的单个核苷酸的突变，这些突变可以导致核苷酸序列的多样性。单核苷酸多态性(SNP)的特点包括位点多样性、广泛分布、遗传稳定性高、代表性强、易于检测、分析快捷。因此，借助SNP对山羊优良性状进行辅助选择，将有利于我国山羊产业的可持续发展。PCR-RFLP是一种可对多态性位点进行基因分型的技术，其原理是扩增不同个体同一DNA序列时，由于碱基突变引起限制性内切酶识别位点发生变化，存在多态性的DNA序列在内切酶作用后可产生不同的DNA序列片段，经电泳可将大小不同的条带分开，从而可完成各基因型的鉴定。

催乳素受体(PRLR)是催乳素(PRL)的特异性受体，属于催乳素受体超家族的一员，通过与PRL结合调控雌性动物繁殖性能，该基因的突变会影响雌性动物到达初情期的年龄。PRLR基因首先在大鼠上被发现，紧接着在小鼠上也被发现，学者们对其他动物的PRLR基因进行了克隆，如在猴、牛、马、猪、鸡、鹅等动物上也发现了PRLR基因。国内外研究人员就PRLR基因对畜禽泌乳和繁殖性状的影响展开大量研究。如PRLR基因侧翼区一处SNP突变与疆岳驴平均泌乳量和乳蛋白显著相关，可作为乳用型疆岳驴选育的有效DNA标记。此外，PRLR基因也可作为羔产仔数和海门山羊选育的重要候选基因。迄今为止，尚无有关山羊PRLR基因作为楚宝黑头羊产羔性状的分子标记的研究的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PRLR基因中的分子标记在检测山羊产羔数性状中的应用，该应用可以辅助选育山羊产羔数性状。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了PRLR基因中的分子标记在检测山羊产羔数性状中的应用，所述分子标记山羊为基因组Capra hircusARS1中g.39080534处G＞A碱基突变。

本发明还提供了一种山羊PRLR基因中的分子标记在检测山羊产羔数性状的应用，所述分子标记为山羊基因组中如SEQ ID NO:1所示序列的5’端第317位G＞A碱基突变。

本发明提供了一种检测山羊产羔数性状的方法，所述方法包括检测山羊基因组Capra hircusARS1中g.39080534位点处G＞A碱基突变。

本发明提供了一种检测山羊产羔数性状的方法，所述方法包括检测山羊基因组中如SEQ ID NO:1所示序列的5’端第317位G＞A碱基突变。

优选的，上述检测方法包括利用引物对进行PCR扩增，所述引物对的序列如SEQ IDNO:2-3所示。

优选的，所述PCR扩增的反应程序为：98℃预变性45s；98℃变性10s；退火温度设置为55℃，时长为30s；72℃延伸25s；变性、退火、延伸的循环数为34次；72℃终延伸5min。

优选的，上述检查方法还包括酶切分型，所述酶切分型是将SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列用限制性内切酶BmgB I进行酶切处理。

优选的，酶切后的产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测。

本发明还提供了一种检测山羊产羔数的试剂盒，包括如SEQ ID NO.2～3所示的引物对。

优选的，所述山羊为楚宝黑头羊。

有益效果：

本发明山羊PRLR基因中的分子标记，可用于检测山羊产羔数性状，辅助选育产羔数较多的山羊，可以显著提高育种效率。此外，本发明检测山羊产羔数性状的方法检出率高、耗时短，便于产业应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为楚宝黑头羊PRLR基因片段SEQ ID NO:1的凝胶电泳结果图。

图2为实施例1BmgB I-RFLP检测结果图，图中泳道:M道是DL2000Marker，第2、3道AA型，第4、5、6、7道为GA型。

具体实施方式

本发明提供了一种PRLR基因中分子标记g.39080534G＞A在检测山羊产羔数性状中的应用，所述分子标记为基因组序列信息版本号为Capra hircus ARS1中的g.39080534处G＞A碱基突变。该分子标记也是山羊基因组中如SEQ ID NO:1所示序列的5’端第317位G＞A碱基突变。该突变为等位突变，优选的，GG基因型母羊个体的产羔数量最多。

本发明还提供了上述标记的检测方法，以及检测引物和试剂盒。检测引物优选为如SEQ ID NO:2-3所示的引物对。

本发明对检测山羊基因组中如SEQ ID NO:1所示序列的5’端第317位G＞A碱基突变的方式不做限定，可以是基因测序等方式，优选为酶切分型的方式。酶切分型所用的酶为限制性内切酶BmgBI。

所述检查方法利用PCR扩增方法对目标序列进行扩增，所述PCR扩增的反应程序为：98℃预变性45s；98℃变性10s；退火温度设置为55℃，时长为30s；72℃延伸25s；变性、退火、延伸的循环数为34次；72℃终延伸5min。

本发明中所述山羊可以是包含本发明所述分子标记的任意羊种，优选为楚宝黑头羊。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明实施例中涉及到的生产工艺、实验方法或检测方法，若无特别说明，均为现有技术中的常规方法，且其名称和/或简称均属于本领域内的常规名称，在相关用途领域内均非常清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。

本发明实施例中使用的各种仪器、设备、原料或试剂，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过正规商业途径购买获得的常规产品，也可以按照本领域技术人员熟知的常规方法进行制备。

实施例1

山羊PRLR基因SNP检测片段(SEQ ID NO:1)的获得及多态位点检测方法

1、山羊基因组DNA的提取

选择麻城黑山羊改良所得肉羊——楚宝黑头羊为试验动物，样本来源于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所种羊场。采用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司生产)提取山羊全基因组DNA，具体步骤参照试剂盒说明书。对所得基因组DNA进行浓度和质量检测，标上编号置于-80℃冰箱内保存备用。

2、SNP遗传标记检测片段的获得

(1)PCR扩增

根据山羊PRLR基因组序列(Gene ID:102175649)设计引物，引物序列信息如下：

上游引物(SEQ ID NO:2)：CATGGAGCAAGGCGTGAA(5’→3’)

下游引物(SEQ ID NO:3)：GTTGGGTAGTGTCATTCTAATCCTGT(5’→3’)

使用以上引物对楚宝黑头羊基因组DNA进行PCR扩增。反应体系见表1：

表1PCR反应体系

PCR反应程序设置为：98℃预变性45s；98℃变性10s；退火温度设置为55℃，时长为30s；72℃延伸25s；循环数固定，34×；72℃终延伸5min；12℃，1min。4℃保存PCR扩增产物。

扩增产物为山羊PRLR基因片段，其序列如SEQ ID NO:1所示，共970bp，凝胶电泳结果如图1所示。

此序列中第317位碱基处发生了G/A碱基突变，通过NEB网站在线检测，该突变导致限制性内切酶BmgB I酶切位点发生变化，A突变的出现导致了BmgB I酶切位点发生变化，当该碱基为G时，酶切位点出现；当该碱基为A时，酶切位点消失。该位点在山羊ESRRA基因外显子9上。

多态位点检测方法-BmgBI-RFLP检测

取10μL的PCR产物于PCR管中，向其中加入0.2μL限制性内切酶BmgB I、1μL10×buffer和3.8μLddH₂O，37℃酶切(1～16)小时，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察并记录酶切结果。当此位置碱基均为A(即发生突变时)，酶切位点完全消失，酶切后只观察到一条带(970bp)，记为AA基因型；当此位置G和A碱基均存在时(即表现为杂合突变)，酶切结果为三条带(317bp+653bp+970bp)，记为GA基因型，结果如图2所示。

实施例2

本发明所述分子标记在山羊群体中的多态性分布检测

本实施例在楚宝黑头羊群体中检测山羊PRLR基因上g.39080534G＞A位点进行多态性检验，检测结果如表2所示。

表2山羊PRLR基因g.39080534G＞A位点基因型频率与基因频率

由表2结果可知：山羊PRLR基因g.39080534G＞A位点在楚宝黑头羊群体中存在三种基因型个体，即GG、GA、AA基因型，其中以纯合GG型为优势基因型，等位基因G的基因频率为0.98。经卡方检验，该位点的基因型分布不符合哈代-温伯格平衡状态。

实施例3

本发明的分子标记与山羊产羔性状的关联性验证

选择500头楚宝黑头羊为试验材料，样本采集、相关产羔信息均来自湖北省农业科学院畜牧兽医研究所种羊场。使用PCR-BmgBI-RFLP进行多态性检验，并分析对应不同基因型个体与其产羔性状之间的相关性。采用SAS统计分析软件中的GLM程序进行分子标记不同基因型个体性状间的关联分析，采用模型为：

模型1：Y＝总体均值+基因型+羊场环境效应+残差

模型2：Y＝总体均值+加性效应+显性效应+羊场环境效应+残差。

其中，Y为性状表型值。加性效应＝(纯合子1-纯合子2)/2，用1、0、-1分别代表纯合子1、杂合子、纯合子2；显性效应＝杂合子-(纯合子1+纯合子2)/2，用1、-1、1分别代表纯合子1、杂合子、纯合子2。统计分析结果如表3所示：

表3PRLR基因g.39080534G＞A与产羔数的相关分析

注：表中第一列数据表示同一胎次总产羔窝数。以上数值均为最小二乘值±标准误。同行比较中，不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。

由表3可知，在楚宝黑头羊群体中，对于头胎产羔数，GG纯合个体相较于AA纯合突变个体高出0.67头(P＜0.05)；对于平均产羔数，GG纯合个体相较于AA纯合突变个体高出0.47头(P＜0.05)。因此，g.39080534G＞A位点GG基因型母羊个体，能够获得更多的产羔数。

由以上实施例可知本发明提供的PRLR基因中分子标记g.39080534G＞A能够应用于检测山羊产羔数性状。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (8)

1.PRLR基因中的分子标记在检测楚宝黑头羊产羔数性状中的应用，其特征在于，所述分子标记是山羊基因组Capra hircusARS1中g .39080534处G>A碱基突变；所述产羔数为头胎产羔数和/或平均产羔数；所述分子标记的GG基因型对应的山羊产羔数高于GA或AA型对应的山羊产羔数。

2.PRLR基因中的分子标记在检测楚宝黑头羊产羔数性状中的应用，其特征在于，所述分子标记为山羊基因组中如SEQ ID NO:1所示序列的5’端第317位G>A碱基突变；所述产羔数为头胎产羔数和/或平均产羔数；所述分子标记的GG基因型对应的山羊产羔数高于GA或AA型对应的山羊产羔数。

3.一种检测楚宝黑头羊产羔数性状的方法，其特征在于，所述方法包括检测山羊基因组Capra hircusARS1中g .39080534位点处G>A碱基突变；所述产羔数为头胎产羔数和/或平均产羔数；其中GG基因型对应的山羊产羔数高于GA或AA型对应的山羊产羔数。

4.一种检测楚宝黑头羊产羔数性状的方法，其特征在于，所述方法包括检测山羊基因组中如SEQ ID NO:1所示序列的5’端第317位G>A碱基突变；所述产羔数为头胎产羔数和/或平均产羔数；其中GG基因型对应的山羊产羔数高于GA或AA型对应的山羊产羔数。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述检测楚宝黑头羊产羔数性状的方法包括利用引物对进行PCR扩增，所述引物对的序列如SEQ ID NO:2-3所示。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：98℃预变性45s；98℃变性10s；退火温度设置为55℃，时长为30s；72℃延伸25s；变性、退火、延伸的循环数为34次；72℃终延伸5min。

7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述检测楚宝黑头羊产羔数性状的方法还包括酶切分型，所述酶切分型是将SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列用限制性内切酶BmgB I进行酶切处理。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述检测方法还包括，酶切后的产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测。