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CN111534605A - 一种基于snp基因型的单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的鉴定方法 - Google Patents

一种基于snp基因型的单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的鉴定方法 Download PDF

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CN111534605A
CN111534605A CN202010504913.2A CN202010504913A CN111534605A CN 111534605 A CN111534605 A CN 111534605A CN 202010504913 A CN202010504913 A CN 202010504913A CN 111534605 A CN111534605 A CN 111534605A
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王红艳
史植文
李笑天
李成涛
王一
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Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
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Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
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Abstract

本发明涉及一种基于SNP基因型的单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的鉴定方法，具体是分析双胞胎中父亲为纯合子、母亲为杂合子的SNP基因型相似程度，若相似度～50％，判断为异卵双胞胎，反之，若相似度超过90％以上，则判断为非异卵双胞胎。若鉴定为非异卵双胞胎，则进一步分析：若在双胞胎中完全一致，则判定为单卵双胞胎；反之，若相似度90％<x<100％，则判断为第二极体参与受精双胞胎。本发明属首次提出该种新颖巧妙的鉴定方法，填补了单卵、异卵和第二极体参与受精双胞胎的鉴定在医学和司法鉴定中的空白，灵敏度、准确度高，样本易于获取，操作简单，分析效率高，非常适合广泛用于司法/医学鉴定等领域。

Description

一种基于SNP基因型的单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参 与受精双胞胎的鉴定方法
技术领域
本发明涉及人类遗传学技术领域，具体地说，是一种基于SNP基因型的单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的鉴定方法。
背景技术
双胞胎现象常见，传统的分类方法将其分为同卵双胞胎和异卵双胞胎。异卵双胞胎分类目前没有争议，就是在同一个月经周期排出2颗卵子，分别与不同的精子结合受精发育成两个具有各自的绒毛膜、羊膜腔和胎盘，与非双胞胎兄弟姐妹一样具有～50％相同遗传物质的独立个体。单卵双胞胎形成传统的分裂机制近年来受到挑战：“半同卵双胞胎”的案例(来自母亲的基因完全一样，来自父亲的基因部分重合)和第二极体参与受精双胞胎的案例已有报道。目前对于单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的鉴定在医学和司法鉴定邻域中，仍处于一片空白。
文献(杨荣芝等，双胞胎鉴定10例.刑事技术2002年第3期)公开了血型检测和STR检测方法鉴定同卵和异卵双胞胎。
专利文献CN104053787A，公开日2014.09.17，公开了一种鉴定胎儿期双胞胎类型的方法，包括：对双胞胎胎儿的至少一个多态性位点进行分型，以便获得胎儿多态性型别；将所述胎儿多态性型别与父母的相应多态性位点型别进行比较；基于比较结果，确定所述双胞胎是否为异卵双胞胎。所述对双胞胎胎儿的至少一个多态性位点进行分型，以便获得胎儿多态性型别进一步包括步骤：从孕妇样品提取胎儿核酸样本；针对所述胎儿核酸样本，构建测序文库；对所述测序文库进行测序，以便得到测序结果；以及基于所述测序结果，确定所述胎儿多态性型别。所述多态性为选自STR、VNTR、RFLP、STS、SSCP、 CAPS、SNP的至少一种。该专利文献的实施例部分提供了基于STR多态性位点vWA、TPOX、D3S1358、D16S539、D5S818、CSF1P0、D11S2368、D2S1338、 D8S1179、D13S317、D21S1437、D16S3391、PentaE、D12S1064、D12S391、 D6S1043、D19S433鉴定得到双胞胎胎儿为异卵双胎的例子。
专利文献CN107236808A，公开日2017.10.10，公开了一种检测DNA甲基化鉴别同卵双生子的方法，主要是对靶序列IGS3、IGS4、IGS5和IGS6进行焦磷酸测序，以焦磷酸测序仪灵敏度A为标准，若同卵双生子之间甲基化水平差值大于A，则认为双生子之间有差异；若同卵双生子之间甲基化水平差值小于或等于A，则认为双生子之间无差异。
文献(Lijuan Yuan,et al.Identification of the Perpetrator AmongIdentical Twins Using Next-Generation Sequencing Technology:A CaseReport.Forensic Sci Int Genet.2020Jan；44:102167.)公开了使用线粒体DNA区分单卵双胞胎。
文献(赵一霞等，MicroRNA分析技术在同卵双生子甄别中的可行性分析.刑事技术.2020年02期)公开了miRNA检测技术在同卵双生子甄别中的应用可行性。
总的来说，目前应用最成熟的为STR遗传标记检测：采用传统的基于短串联重复(Short tandem repeat，STR)遗传标记的法医亲子鉴定试剂盒，对双胞胎及其父母实施STR遗传标记鉴定，若双胞胎中来自母亲STR遗传标记不完全相同，则该对双胞胎为异卵双胞胎。然而，上述技术方案在实际应用中都存在严重的问题。具体地，如果采用传统的基于STR遗传标记进行单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的鉴定，存在极大的错误可能。目前市场上大部分商业化的STR遗传标记检测试剂盒仅仅检测～20个STR遗传标记位点。在这种情况下，根本无法对卵细胞和第二极体之间的遗传差异进行有效的鉴定；其次，若父母双方来自同一地方，受到遗传漂变的影响，其STR遗传标记的相似程度可能很高，导致无法准确判断双胞胎是否为异卵双胞胎。
目前未见关于本申请的基于SNP基因型的单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的鉴定方法。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于SNP基因型的单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的鉴定方法。
本发明的第二个目的是，提供一种嵌合型异卵双胞胎的鉴定方法。
本发明的第三个目的是，提供一种极体受精个体的鉴定方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案为：
一种基于SNP基因型的单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的鉴定方法，包括以下步骤：
S1.对双胞胎及其父母进行若干个SNP位点基因型的判断；
S2.筛选出父亲为纯合子，母亲为杂合子的SNP位点作为候选SNP位点；
S3.分析所述候选SNP位点在双胞胎中基因型的相似程度，判断双胞胎是否为异卵双胞胎：
若候选SNP基因型在双胞胎中的相似度～50％，判断双胞胎为异卵双胞胎，反之，若候选SNP基因型相似度超过90％以上，则判断为非异卵双胞胎；
若双胞胎鉴定为非异卵双胞胎，则对这些SNP候选位点进行下一步的分析：若候选SNP基因型在双胞胎中完全一致，则判定该双胞胎为单卵双胞胎；反之，若候选SNP基因型相似度90％<x<100％，则判断为第二极体参与受精双胞胎。
作为一个优选例，所述若干个SNP位点的数量至少为90万个。
作为另一优选例，所述对双胞胎及其父母进行若干个SNP位点基因型的判断基于的样本是口腔内擦拭物、尿液或血液。
作为另一优选例，所述对双胞胎及其父母进行若干个SNP位点基因型的判断，具体采用的方法是TaqMan探针法、SNaPshot法、HRM法、Mass Array 法或Illumina BeadXpress法。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案为：
一种嵌合型异卵双胞胎的鉴定方法，包括以下步骤：
S1.对双胞胎及其父母进行若干个SNP位点基因型的判断；
S2.筛选出父亲为纯合子，母亲为杂合子的SNP位点作为候选SNP位点；
S3.分析其中一个双胞胎个体的候选SNP位点的基因型和等位基因频率，如所述双胞胎个体中候选SNP位点等位基因频率分布不是经典的0/0.5/1，还额外具有至少一种等位基因频率，则所述双胞胎为嵌合型异卵双胞胎。
作为一个优选例，所述鉴定方法还包括计算嵌合程度的步骤。
作为另一优选例，所述若干个SNP位点的数量至少为90万个。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案为：
一种极体受精个体的鉴定方法，包括以下步骤：
S1.对被鉴定个体及其父母进行若干个SNP位点基因型的判断；
S2.筛选出父亲为纯合子，母亲为杂合子的SNP位点作为候选SNP位点；
S3.分析被鉴定个体中候选SNP位点的基因型和等位基因频率，如超过 90％的候选SNP位点等位基因频率分布于0/0.5/1附近，则所述被鉴定个体为极体受精个体。
作为一个优选例，所述若干个SNP位点的数量至少为90万个。
需要说明的是，本发明中，对SNP位点及检测SNP位点的芯片检测方法不作特别限定，只要是能够以基因的序列信息为依据，且检测足够多的SNP 位点即可(～90万个或以上)。
本发明优点在于：
1、首次巧妙地提出从SNP位点中筛选出父亲为纯合子，母亲为杂合子的 SNP位点作为候选SNP位点，通过分析这些候选SNP位点在双胞胎中基因型的相似程度，得出受精时卵子所处状态，进而判断双胞胎是单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的方法，填补了单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的鉴定在医学和司法鉴定中的空白。
2、从鉴定对象上来说，本发明的方法可以鉴定出嵌合体的异卵双胞胎(异卵双胞胎在发育过程由于某些生理原因发生细胞的混合：比如造血干细胞通过脐带循环系统相互混合)和单卵双胞胎(两个精子使同一个卵细胞受精)，也可以鉴定极体参与受精的双胞胎。由于传统方法的局限性，这两类特殊类型的双胞胎群体可能被大大低估。
3、能保证100％的待测双胞胎均能够得到正确的分类，灵敏度和准确度高。即使样本为口腔内擦拭物、尿液等的含有较多杂质的样本，其结果的准确性也不会受到影响。
4、检测基于口腔脱落细胞、膀胱脱落细胞或外周血单核游离细胞的DNA，检测样本易于获取。
5、鉴定方法操作简单，分析效率高。
6、基于以上各优点，本发明的方法非常适合广泛用于司法/医学鉴定等应用领域，所获得的检验结果可作为有效的医学/法律证据。
附图说明
附图1是实施例2的双胞胎1号染色体上父亲纯合子、母亲杂合子的候选 SNP等位基因频率分布。
附图2是实施例3的双胞胎1号染色体上父亲纯合子、母亲杂合子的候选 SNP等位基因频率分布。
附图3-8是实施例3的候选SNP位点的基因型和等位基因频率分析表。
附图9-12是实施例3的候选SNP位点的等位基因频率验证表。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本实施例提供一种基于SNP基因型的单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的鉴定方法，包括以下步骤：
S1.提取待检测双胞胎及其父母的基因组DNA，测定DNA浓度，并统一标准化；
S2.在样本中加入适量的NaOH使DNA变性为单链，经中和后加入全基因组扩增试剂，在37℃恒温条件下过夜孵育；
S3.扩增后的产物，经过可控的且不需要凝胶电泳的酶解处理，成为片段化的DNA；
S4.通过加入异丙醇沉淀DNA片段，片段化的DNA在4℃下离心富集，从而得以纯化；
S5.沉淀后的DNA在空气中干燥后，加入杂交缓冲试剂使DNA沉淀重新溶解；
S6.利用设计好的SNP芯片进行杂交，置于杂交炉内反应过夜；
S7.洗去未杂交的和非特异杂交的DNA，以便后续的染色和延伸。以捕获到的DNA为模板，在芯片上进行单碱基的延伸反应，在芯片上加上可检测的标签基团，从而区分样本的SNP类型；
S8.将处理好的芯片放入扫描仪中，利用激光激发芯片上单碱基延伸产物的荧光基团，扫描仪获取由荧光基团发出的荧光，并生成高分辨率的图片。通过软件分析进行等位基因分型；
S9.分析双胞胎之间SNP位点基因型的差异度，并确立检验假设：
假设A：待定双胞胎为异卵双胞胎；
假设B：待定双胞胎为非异卵双胞胎；
通过分析比较双胞胎之间SNP基因型的差异，确定假设A是否成立：当双胞胎为异卵双胞胎时(两个卵子和两个精子分别受精形成子代)，通过比较双胞胎基因组上～90万个SNP位点中父亲为纯合子，母亲为杂合子的候选SNP 基因型在双胞胎中的相似度是否～50％，判断双胞胎是否为异卵双胞胎。反之，若候选SNP基因型相似度超过90％以上，则判断为非异卵双胞胎；
S10.第二极体也可以参与精子的受精(一个卵子加第二极体和两个精子分别受精形成子代)，若双胞胎是由卵细胞和第二极体参与受精的受精卵发育而来，这种双胞胎其母系来源的遗传物质相似度非常高，仅有的遗传差异主要来自于减数分裂I期同源染色体非姐妹染色单体发生的交叉互换。进一步确立检验假设：
假设C：待定双胞胎为单卵双胞胎；
假设D：待定双胞胎为第二极体参与受精双胞胎；
通过比较双胞胎基因组上～90万个SNP位点中父亲为纯合子，母亲为杂合子的候选SNP基因型在双胞胎中的相似度是否完全相同：若候选SNP基因型在双胞胎中完全一致，则判定该双胞胎为单卵双胞胎；反之，若候选SNP基因型相似度90％<x<100％，则判断为第二极体参与受精双胞胎。
实施例2
本实施例提供了本发明方法的一个应用实例。
2019年复旦大学附属妇产科医院出生一对双胞胎，该双胞胎在生产前通过 B超检查，发现为单绒毛膜双胞胎。根据传统观点，他们是来源于同一枚受精卵的分裂，是同卵双胞胎。但是出生后，医务人员发现该双胞胎性别不一致。依据本发明所提供的方法实施单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的鉴定。
步骤一，提取DNA：
采用市售的DNA提取试剂盒(基因组DNA小量提取试剂盒，上海莱枫生物科技有限公司)，提取双胞胎及其父母的基因组DNA。
步骤二，STR遗传标记验证：采用市售的STR检测试剂盒(
Figure BDA0002526181140000061
21 System，Promega)，对该双胞胎家系进行STR遗传标记检测，检测结果显示，两个双胞胎STR标记呈现异常状态：部分STR位置具有3个或4个不同的STR 标记，提示该双胞胎是嵌合型双胞胎。
步骤三，进行SNP芯片检测：
对于双胞胎及父母双方的基因组DNA，采用市售的SNP芯片 (HumanOmniZhongHua-8，和卓生物科技有限公司)检测的方法进行建库，所检测的SNP芯片位点～90万个，保证其在基因组上的覆盖密度。
步骤四，SNP芯片扫描：
将处理好的芯片放入扫描仪(iScan芯片扫描仪，和卓生物科技有限公司) 中，利用激光激发芯片上单碱基延伸产物的荧光基团，扫描仪获取由荧光基团发出的荧光，并生成高分辨率的图片。由此所得的数据直接导入软件 (GenomeStudio 2.0，illumina)进行分析，从而就得到每个样本的SNP分型数据。
步骤五，确定用于后续分析的SNP等位基因位点：
以父亲为纯合子、母亲为杂合子的SNP位点作为候选SNP位点，分析其中一个双胞胎的该类SNP位点的基因型和等位基因频率。统计作图分析该类 SNP等位基因频率，发现该双胞胎母系来源的杂合SNP位点等位基因频率除包含正常人的0/0.5/1分布外，还额外具有四种等位基因频率(见图1)。
步骤六，得出鉴定结论：
基于该双胞胎家系的SNP芯片及STR分析结果，认为该双胞胎为嵌合型异卵双胞胎个体。具体地，如果是同卵双胞胎的话，其候选SNP位点等位基因频率分布应该为经典的0/0.5/1；但是该双胞胎的候选SNP位点检测结果有7 种等位基因频率，说明其母源性杂合SNP位点的两个等位基因同时传递给了子代。其外周血中嵌合程度约为0.45(根据额外四种等位基因频率计算，公式为：P嵌合程度＝(0.5-|BAF-0.5|)/(1-BAF)。该双胞胎外周血经核型分析其XX/XY比例为125：95。
本实施例说明本发明的方法除了可以鉴定异卵双胞胎，还能鉴定其嵌合程度。
实施例3
本实施例提供了本发明方法的另一应用实例。
2013年复旦大学附属儿科医院收治一名雌雄同体患者，该患者膀胱脱落细胞核型分析结果为XX/XY(比例为104：96)。根据传统观点，该雌雄同体患者来源于XX受精卵和XY受精卵的嵌合，是一种特殊的异卵双胞胎。依据本发明所提供的方法实施单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的鉴定。
步骤一，提取DNA：
采用市售的DNA提取试剂盒(基因组DNA小量提取试剂盒，上海莱枫生物科技有限公司)，提取雌雄同体患者及其父母不同组织(口腔，血液及膀胱脱落细胞)的基因组DNA。
步骤二，STR遗传标记验证：
采用市售的STR检测试剂盒(
Figure BDA0002526181140000071
21System，Promega)，对该双胞胎家系进行STR遗传标记检测，检测结果显示，雌雄同体患者母系来源的 STR标记完全相同。初步表明该雌雄同体患者的形成并非来自于两个不同的卵细胞，可能为同一个卵细胞或为第二极体参与受精。
步骤三，进行SNP芯片检测：
对于雌雄同体患者及父母双方的基因组DNA，采用市售的SNP芯片(HumanOmniZhongHua-8，和卓生物科技有限公司)检测的方法进行建库，所检测的SNP芯片位点～90万个，保证其在基因组上的覆盖密度。
步骤四，SNP芯片扫描：将处理好的芯片放入扫描仪(iScan芯片扫描仪，和卓生物科技有限公司)中，利用激光激发芯片上单碱基延伸产物的荧光基团，扫描仪获取由荧光基团发出的荧光，并生成高分辨率的图片。由此所得的数据直接导入软件(GenomeStudio2.0，illumina)进行分析，从而就得到每个样本的SNP分型数据。
步骤五，确定用于后续分析的SNP等位基因位点：
以父亲为纯合子、母亲为杂合子的SNP位点作为候选SNP位点。分析雌雄同体患者该类SNP位点的基因型和等位基因频率。统计作图分析该类SNP 等位基因频率，发现该患者母系来源的杂合SNP位点等位基因频率绝大部分 (超过90％)分布于0/0.5/1附近(见图2)，290个SNP位点等位基因频率偏移至0.25/0.75附近(见图3-8)。
步骤六，PCR-free高通量测序验证候选SNP位点等位基因频率分布：
以步骤五中290个候选SNP位点作为靶标，采用PCR-free高通量测序的方法检测候选SNP位点的等位基因频率。测序结果发现，候选SNP位点中有 88个SNP位点的频率得到了验证(见图9-12)。
步骤七，得出鉴定结论：基于该雌雄同体患者家系的STR分析、SNP分析及PCR-free高通量测序验证结果，认为该雌雄同体患者为极其罕见的极体受精个体。
本实施例说明本发明的方法还可以鉴定极体参与受精的双胞胎。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于SNP基因型的单卵双胞胎、异卵双胞胎和第二极体参与受精双胞胎的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.对双胞胎及其父母进行若干个SNP位点基因型的判断；
S2.筛选出父亲为纯合子，母亲为杂合子的SNP位点作为候选SNP位点；
S3.分析所述候选SNP位点在双胞胎中基因型的相似程度，判断双胞胎是否为异卵双胞胎：
若候选SNP基因型在双胞胎中的相似度～50％，判断双胞胎为异卵双胞胎，反之，若候选SNP基因型相似度超过90％以上，则判断为非异卵双胞胎；
若双胞胎鉴定为非异卵双胞胎，则对这些SNP候选位点进行下一步的分析：若候选SNP基因型在双胞胎中完全一致，则判定该双胞胎为单卵双胞胎；反之，若候选SNP基因型相似度90％<x<100％，则判断为第二极体参与受精双胞胎。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述若干个SNP位点的数量至少为90万个。
3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述对双胞胎及其父母进行若干个SNP位点基因型的判断基于的样本是口腔内擦拭物、尿液或血液。
4.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述对双胞胎及其父母进行若干个SNP位点基因型的判断，具体采用的方法是TaqMan探针法、SNaPshot法、HRM法、Mass Array法或Illumina BeadXpress法。
5.一种嵌合型异卵双胞胎的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.对双胞胎及其父母进行若干个SNP位点基因型的判断；
S2.筛选出父亲为纯合子，母亲为杂合子的SNP位点作为候选SNP位点；
S3.分析其中一个双胞胎个体的候选SNP位点的基因型和等位基因频率，如所述双胞胎个体中候选SNP位点等位基因频率分布不是经典的0/0.5/1，还额外具有至少一种等位基因频率，则所述双胞胎为嵌合型异卵双胞胎。
6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，还包括计算嵌合程度的步骤。
7.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，所述若干个SNP位点的数量至少为90万个。
8.一种极体受精个体的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.对被鉴定个体及其父母进行若干个SNP位点基因型的判断；
S2.筛选出父亲为纯合子，母亲为杂合子的SNP位点作为候选SNP位点；
S3.分析被鉴定个体中候选SNP位点的基因型和等位基因频率，如超过90％的候选SNP位点等位基因频率分布于0/0.5/1附近，则所述被鉴定个体为极体受精个体。
9.根据权利要求8所述的鉴定方法，其特征在于，所述若干个SNP位点的数量至少为90万个。
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