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CN115151267A - 用于免疫治疗的组合物和方法 - Google Patents

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CN115151267A
CN115151267A CN202080090036.7A CN202080090036A CN115151267A CN 115151267 A CN115151267 A CN 115151267A CN 202080090036 A CN202080090036 A CN 202080090036A CN 115151267 A CN115151267 A CN 115151267A
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乔治·库科斯
梅丽塔·艾文
安吉尔·德耶稣·科里亚·奥索里奥
文森特·佐伊特
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Ludwig Institute for Cancer Research Ltd
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Abstract

本发明涉及通过细胞免疫疗法(例如通过过继转移肿瘤特异性基因修饰的淋巴细胞亚群)产生和/或增加免疫应答的方法和组合物。本发明提供了包含基因修饰的淋巴细胞的组合物，其表达具有调节免疫系统和先天性及适应性免疫响应能力的至少两个转基因。

Description

用于免疫治疗的组合物和方法
交叉引用
本申请请求2019年11月14日提交的申请号为62/935308的美国临时专利的根据《美国法典》第35卷第119(e)条享有的优先权。上述申请通过引用全部并入本文。
技术领域
本发明一般涉及治疗受试者癌症或肿瘤的组合物和方法，更具体地，涉及通过调节受试者的免疫系统治疗受试者癌症或肿瘤的组合物和方法。
背景技术
过继性细胞转移或过继性细胞治疗(ACT)是治疗癌症患者的一种有希望的治疗方法。然而，它面临着两大障碍：癌症患者体内转移细胞的短期生存状况和恶性免疫抑制肿瘤微环境。
为了克服这些限制，提出了几种选择。例如，一些试验测试了白细胞介素2(IL-2)和ACT的同时施用。IL-2是一种强效的免疫刺激剂；因此，它可以增强免疫反应，提高转移细胞的存活率。然而，由于与IL-2相关的毒性，这种方法是不成功的。美国专利7381405描述了为了ACT制备可以分泌IL-2的IL-2转导的淋巴细胞的方法。这种方法基于这样的假设，即淋巴细胞会分泌自己的生长因子(如IL-2)，从而减少对体内生存的其他外源因子的依赖。尽管在体外环境中取得了成功的结果，但临床试验确定了这种方法是无效的。IL-2转导的淋巴细胞在治疗癌症方面并不比未转导的淋巴细胞更有效(Heemskerk等人.,Human GeneTherapy,2008)。
嵌合抗原受体(CAR)T细胞的出现为改善ACT提供了有用的工具TRUCKs(T cellsredirected foruniversal cytokine killing)(国际公布文本WO 2017/108805)和Armored CAR(美国专利10124023)是CAR T细胞的代表性示例，它们分别还被设计用于分泌重组白细胞介素-12(IL-12)和CD40L。然而，这些策略也有缺点。例如，在TRUCK上，高转基因IL-12产量限制了T细胞的扩增并增加了凋亡，显示了有限的治疗效果。此外，到目前为止，armored CAR T细胞的临床应用仅限于液体肿瘤。
实体肿瘤及其微环境给ACT疗法的成功带来了一系列挑战。这些挑战包括肿瘤的有效转运和渗透和克服肿瘤介导的免疫抑制。尽管做出了许多努力，但最先进的ACT疗法并不能在免疫抑制实体瘤微环境中提供长期疗效的功能持久性。
因此，迫切需要鉴别可以为细胞提供功能持久性和/或可以改变细胞因子环境以克服免疫抑制性肿瘤微环境的新的ACT疗法。
发明内容
本发明在多个方面解决了上述需求。在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含至少表达两个转基因(例如，治疗性转基因)的多个转基因淋巴细胞，用于调节受试者的免疫系统。
在一些实施方案中，转基因选自抗体、抗体片段、受体、诱饵、检查点阻断调节剂、细胞因子、趋化因子、激素、细胞消除标签及其组合。
在一些实施方案中，所述诱饵选自PD1、CTLA4、LAG3、VEGFR1、TIM3、TIGIT和SIRPα诱饵。在一些实施方案中，所述诱饵是PD1诱饵。在一些实施方案中，所述PD-1诱饵是PD-1IgG4(例如PD-1IgG4 Fc)诱饵。
在一些实施方案中，所述细胞因子选自LIGHT或其变体/片段、IL-33或其变体/片段、IL-2或其变体/片段、IL-15或其变体/片段、IL-12或其变体/片段，和CD40L或其变体/片段。在一些实施方案中，所述细胞因子是突变细胞因子。
在一些实施方案中，所述细胞消除标签选自tEGFR、Her2、CD20和CD19。
在一些实施方案中，所述至少两个转基因包含PD-1诱饵或其变体/片段、IL-2变体/片段、LIGHT或其变体/片段、IL-33或其变体/片段和CD40L或其变体/片段中的两个或多个。在一些实施方案中，所述至少两个转基因还包含截断EGFR(tEGFR)或其变体/片段、截断HER2(tHER2)或其变体/片段，或CD20或其变体/片段。在一些实施方案中，所述PD-1诱饵或其变体/片段和tEGFR或其变体/片段(或tHER2或其变体/片段、CD20或其变体/片段、CD19或其变体/片段)包含在同一载体上。
在一些实施方案中，所述至少两个转基因包括：(a)PD-1诱饵或其变体和tEGFR或其变体；(b)PD-1诱饵或其变体和IL-2变体；(c)PD-1诱饵或其变体和LIGHT或其变体；(d)PD-1诱饵或其变体和IL-33或其变体；(e)PD-1诱饵或其变体和CD40L或其变体；(f)PD-1诱饵或其变体、IL-2变体和IL-33或其变体；(g)PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和IL-2变体；(h)PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和LIGHT或其变体；(i)PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和IL-33或其变体；(j)PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和CD40L或其变体；(k)PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体、IL-2变体和IL-33或其变体；(l)PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体、IL-2变体和CD40L或其变体；或(m)PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体、IL-33变体和CD40L或其变体。
在一些实施方案中，所述PD-1诱饵包含SEQ ID NO:1-4、6-17、42、44、47-48和51-52中任一条的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-4、6-17、42、44、47-48和51-52中任一条具有至少80％一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述IL-2变体包含SEQ ID NO:21-23中任一条的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21-23中任一条具有至少80％一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述IL-33包含SEQ ID NO:25和27中任一条的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25和27中任一条具有至少80％一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述LIGHT包含SEQ ID NO:28-29和31中任一条的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28-29和31中任一条具有至少80％一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述CD40L包含SEQ ID NO:32-34、36和38中任一条的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:32-34、36和38中任一条具有至少80％一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述tEGFR包含与SEQ ID NO:40具有至少80％一致性的氨基酸序列或SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HER2包含与SEQ ID NO:45具有至少80％一致性的氨基酸序列或SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD20包含与SEQ ID NO:49具有至少80％一致性的氨基酸序列或SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述转基因包含选自VEGF、TGF-B、4-1BB、CD28、CD27、NKG2D、PD1、PDL1和CTLA4抗体的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体为PD1抗体。
在一些实施方案中，所述多个淋巴细胞包括至少两个淋巴细胞亚群。在一些实施方案中，所述多个淋巴细胞由两个淋巴细胞亚群组成。在一些实施方案中，所述多个淋巴细胞的每个亚群至少表达一个转基因。在一些实施方案中，所述至少两个转基因彼此不同。
在一些实施方案中，所述多个淋巴细胞包括：(i)至少表达两个转基因的第一亚群；和(ii)至少表达两个转基因的第二亚群，其中所述第一亚群的至少一个转基因不同于第二亚群的转基因，或其中第一亚群的至少一个转基因与第二亚群的转基因相同。
在一些实施方案中，(i)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和IL-2变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和LIGHT或其变体；(ii)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和IL-2变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和IL-33或其变体；(iii)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和IL-2变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和CD40L或其变体；(iv)所述第一亚群至少表达一个PD-1诱饵或其变体和LIGHT或其变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和LIGHT或其变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和CD40L或其变体；或(vi)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和IL-33或其变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和CD40L或其变体。
在一些实施方案中，所述第一亚群或第二亚群还表达tEGFR或其变体、截断HER2(tHER2)或其变体、CD20或其变体、或CD19或其变体。
在一些实施方案中，(i)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和IL-2变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和LIGHT或其变体；(ii)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和IL-2变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和IL-33或其变体；(iii)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和IL-2变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和CD40L或其变体；(iv)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和LIGHT或其变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和IL-33或其变体；(v)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和LIGHT或其变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和CD40L或其变体；或(vi)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和IL-33或其变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和CD40L或其变体。
在一些实施方案中，所述第一亚群或第二亚群还表达tEGFR或其变体、tHER2或其变体、或CD20或其变体。
在一些实施方案中，以约1:1至约1:100的比值组合所述两个亚群。在一些实施方案中，以约1:1的比值组合所述两个亚群。
在一些实施方案中，所述淋巴细胞是自体的。在一些实施方案中，所述淋巴细胞是肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述淋巴细胞表达重组T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，所述重组T细胞受体(TCR)表现出对NY-ESO1、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGEA-10、MAGE-C2、SSX2、MAGE-A12或其组合的反应性。
同样在本发明范围内的是一种药物组合物，其包含有效量的上述的组合物和药物可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含第二治疗剂。
本发明还提供了一种试剂盒，其包含有效量的上述的组合物。
在另一方面，本发明提供了制备上述的组合物的方法。该所述方法包括：(a)提供多个淋巴细胞；(b)向所述多个淋巴细胞引入编码至少两个转基因的核酸分子，以获得多个基因改造的淋巴细胞；和(c)在细胞培养基中扩增所述多个经基因改造的淋巴细胞。
可选地，所述方法包括：(a)提供多个淋巴细胞；(b)向所述多个淋巴细胞引入两个或多个核酸分子，所述两个或多个核酸分子中的每一个编码至少一个转基因，从而获得多个基因改造的淋巴细胞；和(c)在细胞培养基中扩增所述多个经基因改造的淋巴细胞。
在一些实施方案中，所述至少两个转基因包含PD-1诱饵、IL-2变体/片段、LIGHT或其变体/片段、IL-33或其变体/片段和CD40L或其变体/片段中的两个或多个。在一些实施方案中，所述至少两个转基因还包含tEGFR或其变体/片段。在一些实施方案中，所述PD-1诱饵或其变体/片段和所述tEGFR或其变体/片段(或所述tHER2或其变体/片段，CD20或其变体/片段，或CD19或其变体/片段)包含在同一载体上。
在一些实施方案中，所述方法包括：(a)向第一多个淋巴细胞引入编码至少两个转基因的第一核酸分子，以获得第一多个基因改造的淋巴细胞；和(b)将编码至少两个转基因的第二核酸分子引入第二多个淋巴细胞，以获得第二多个基因改造的淋巴细胞。
在一些实施方案中，所述方法还包括在引入第一核酸的步骤后在细胞培养基中扩增第一多个淋巴细胞，或在引入第二核酸的步骤后在细胞培养基中扩增第二多个淋巴细胞。
在一些实施方案中，所述方法还包括以约1:1和约1:100(例如，1:1)之间的预定比例将第一多个基因改造的淋巴细胞与第一多个基因改造的淋巴细胞组合。
在一些实施方案中，所述细胞培养基是限定的细胞培养基。在一些实施方案中，所述细胞培养基包含新抗原肽。
在又一方面，本发明还提供了治疗受试者的癌症/肿瘤或慢性感染的方法。所述方法包括向需要的受试者施用有效治疗量的组合物或药物组合物，如上所述。
在一些实施方案中，所述癌症选自黑色素瘤、肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、微卫星高度不稳定型(MSI-high)肿瘤、头颈部肿瘤、肾癌和乳腺癌。
在一些实施方案中，通过静脉输液施用所述组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二治疗剂。在一些实施方案中，所述第二治疗剂是抗癌剂或抗肿瘤剂。在一些实施方案中，在所述第二治疗剂之前、之后或同时向受试者施用所述组合物或药物组合物。
前述发明内容并非旨在定义本发明的每个方面，其他部分中描述了其他方面，例如以下的具体实施方式。整个文档旨在作为一个统一的公开内容进行关联，并且应当理解，本文描述的所有特征的组合都是可预期的，即使在本文档的同一句话、段落或章节中没有发现这些特征的组合。通过以下具体实施方式，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，在指示本发明的具体实施方案的同时，具体实施方式和具体实施例仅以例证的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将从所述具体实施方式中变得显而易见。
附图说明
图1A、1B、1C和1D(统称为“图1”)是一组图，显示OT-1CD8+-T细胞可以通过基因工程化分泌PD1 IgG4诱饵与IL-2变体(称为IL-2V)、LIGHT、IL-33或CD40L结合使用。图1A显示，OT-1CD8+-T细胞经过基因改造，可以分泌PD1 IgG4和mutIL2。通过FACS测定转导效率(图1A；左图)，并通过ELISA评估分泌(图1A；中图和右图)。图1B显示，OT-1CD8+-T细胞经过基因改造，可以分泌PD1 IgG4和LIGHT。通过FACS测定转导效率(图1B；左图和左中图)，并通过ELISA评估分泌(图1B；右图和右中图)。图1C显示，OT-1CD8+-T细胞经过基因改造，可以分泌PD1 IgG4和IL-33。通过FACS测定转导效率(图1C；左图和左中图)，并通过ELISA评估分泌(图1C；右中图和右中图)。图1D显示，OT-1CD8+-T细胞经过基因改造，可分泌PD1 IgG4和CD40L。通过FACS测定转导效率(图1C；左中图和左中图)，并通过ELISA评估分泌(图1D；右图和右中图)。
图2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G和2H(统称为“图2”)是一组图，显示过继性转移经基因修饰的OT-1CD8+-T细胞，以分泌三种免疫调节因子的组合，在没有预处理的情况下，显著改善了大型B16-OVA肿瘤的肿瘤控制。图2A和2B显示了接受分泌PD-1IgG4、IL-2V和LIGHT的OT-1CD8+-T细胞的小鼠的肿瘤生长曲线(图2A)和总生存率曲线(图2B)。图2C和2D显示了接受分泌PD-1IgG4、IL-33和LIGHT的OT-1CD8+-T细胞的小鼠的肿瘤生长曲线(图2C)和总生存率曲线(图2D)。IgG4、IL-33和光。图2E和2F显示了接受分泌PD-1IgG4、IL-33和IL-2V和LIGHT的OT-1CD8+-T细胞的小鼠的肿瘤生长曲线(图2E)和总生存率曲线(图2F)。实验采用盲法进行，每组6只动物。图2G和图2H显示了接受分泌PD-1IgG4、IL-2V和CD40L的OT-1CD8+-T细胞的小鼠的肿瘤生长曲线(图2G)和总生存率曲线(图2H)。使用log-rank mantel-cox模型进行生存分析。使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis)检验比较各组与接受UTOT-1CD8+-T细胞的小鼠在第27天的肿瘤生长情况。使用邓恩检验进行多重比较校正*p<0.05、**p<0.001、**p<0.0001。
图3A、图3B、图3C、图3D、图3E、图3F、图3G、图3H、图3I、图3J和图3K是一组图，显示正交T细胞工程化通过扩增过继性转移的CD8+T细胞和调动内源性抗肿瘤免疫来改善免疫功能正常宿主的ACT疗效。图3A显示了实验设计。图3B是瀑布图，显示了从第17天开始肿瘤体积的变化。以每只动物在第1次ACT作用后至少12天观察到的最佳反应(最小肿瘤体积)进行计算(*肿瘤接种后24天，**肿瘤接种后31天)。肿瘤客观缓解率(ORR)包括完全缓解(CR；肿瘤体积减少100％)和部分缓解(PR；肿瘤改变≤-30％)。图3C、图3D、图3E和图3F显示，如图所示，患有B16-OVA肿瘤的小鼠可以使用工程化或未经转化的OT1细胞进行治疗；然后在第17天和第24天收集肿瘤，并通过流式细胞术进行细胞定量。数据来自三个独立实验(n>＝5只动物/组)。图3C显示了第24天CD8+TIL的总数。图3D显示了第17天和第24天CD45.1+OT1的总数。图3E显示了第17天和第24天内源性CD45.1neg CD8 TILs的总数。图3F显示了第24天内源性和外源性TCF1+CD8+TIL的总数。图3G显示了第24天各实验组肿瘤切片的代表性免疫荧光显微照片，显示了OT1和内源性TCF1+CD8+TIL。填充三角形：TCF1+OT1，空心三角形：TCF1negOT1，白色箭头：TCF1+内源性CD8+TIL。图3H显示了，如上所述，将PD1d/2V/33+OT-1细胞施用于B16 OVA荷瘤CD8KO小鼠或用药物FTY720以100μg/小鼠处理后的wtC57BL6小鼠(从第一次细胞转移的两天前开始，每三天腹腔注射施用一次)。图3I显示，如上所述，对患有B16-OVA肿瘤的小鼠进行处理，然后在第24天收获肿瘤，并通过流式细胞术进行Treg定量。数据来自三个独立实验(n>＝5只动物/组)。所示为CD8+/Treg比值的条形图。图3J和3K显示，在存在或不存在250μg/小鼠的从第一次细胞转移前1天开始，每3天维持一次，腹腔注射施用所示表面标志物发特异性消耗抗体的情况下，用PD1d/2V/33+OT-1细胞处理的B16-OVA荷瘤小鼠，随时间的推移，肿瘤生长得到了控制；CD4组(维持到肿瘤接种后第55天)(图3J)和Ly6G组(图3K)。图3H、图3J和图3K显示了两个独立实验(n＝6只动物/每组)中的代表性实验。采用Brown Forsythe和Welch方差分析试验，结合Tukey试验，以纠正多重比较，对图3C、图3D、图3E和图3F中的不同组和图3H、图3J和图3K中的肿瘤体积进行比较。采用带有Welch校正的双尾学生t检验比较第17天和第24天(D和F)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001。
图4A、图4B、图4C、图4D、图4E、图4F和图4G是一组图，表明正交工程化诱导了一个新的效应样CD8 T细胞亚群，不同于末端耗竭状态和暂时性CX3CR1+效应样T细胞。图4A显示了实验设计。患有B16-OVA肿瘤的小鼠如上所述进行处理；然后在第17天和第24天收集肿瘤，通过FACS分类获得富含CD8+TIL的CD45+细胞悬浮液，并使用10X基因组学对单细胞测序。图4B显示了一个UMAP图，描绘了细胞异质性的低维表达和无监督聚类结果，其中等高线图描绘了每种处理的高细胞密度区域。图4C显示了TILPRED预测的CD8 T ILs状态(顶部)和火山图(底部)，描绘了GzmC+C5和GzmCneg终末耗竭细胞之间显著差异表达的基因。图4D显示了PD-1d/2V/33(第24天)TIL在使用ProjecTILs的参照TIL图上的投影。在右边，雷达图显示了投影的重要T细胞标志物的表达水平和参照耗竭T细胞状态。图4E显示了描绘特定标记簇的点图。图4F显示了Gzmc+C5和Gzmcneg C4细胞的CD8 TIL-Tox敲除基因特征富集分析(GSEA)。图4G显示，在肿瘤细胞接种后的第12天和第15天，患有B16-OVA肿瘤小鼠用工程化或未转化的OT1细胞处理。在第24天收集肿瘤或脾脏(PD1d/2V/33OT1)，并通过流式细胞术检测颗粒酶C的细胞内表达。显示了两个独立实验的总结，(n>＝5只动物/组)(UT：未转导)。采用单因素方差分析和Dunnet检验对多重比较进行校正。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001。
图5A、图5B、图5C、图5D、图5E和图5F是一套图，显示正交工程化将TOX的表达与GzmC+TCF1neg CD8+TIL中的共抑制受体的表达解耦。图5A显示了第24天基于颗粒酶C和TCF1表达的外源性和内源性CD8+T细胞室分析。未从PD1d/33ACT后的肿瘤中获得OT1 TIL(UT：未转导)。图5B显示了评估TOX和表型标志物的设门策略。PD1d/2V不包括在统计分析中，因为CD8 TIL主要是TCF1+。图5C显示了PD-1在TCF1neg CD8+TIL细胞中的表面表达。图5D显示了TIM-3在PD-1+TCF1neg CD8+TIL中的表面表达，显示了对这两个表面标志物，从4个独立实验(PD1d/2V/33)或2个(其他组)获得的数据(n＝4或5只动物/每个实验，肿瘤接种后第24天)。图5E显示了PD-1+TCF1neg CD8+TIL中TOX的表达，显示了从2个独立实验(PD1d/2V/33，PD1d/33)或1个(其他组)获得的数据(n＝4或5只动物/每个实验，肿瘤接种后24天)。图5F显示了TCF1neg CD8 TIL中KLRG1的表面表达，显示了两个独立实验(n＝5只动物/每组)中的代表性实验。采用单因素方差分析(ANOVA)结合Dunnet检验对多重比较进行校正，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，**p<0.0001。从非荷瘤小鼠脾脏分离的原始OT-1T细胞用作FACS染色的内部阴性对照。
图6A、图6B、图6C、图6D、图6E、图6F、图6G、图6H和图6I是一套图，显示了GzmC+TCF1neg CD8+TIL是共抑制受体的表达无意义的多功能效应细胞。在第24天，对用基因工程化或未转导的(UT)OT1细胞处理的动物的OT1和内源性CD8 TIL进行分析，以量化PD-1+TCF1neg CD8+TIL中的效应分子。未从PD1d/33ACT后或UT的肿瘤中收集到OT1 TIL。PD1d/2V不包括在统计分析中，因为CD8 TIL主要是TCF1+。图6A显示了CD69的表面表达。图6B显示了Ki-67的细胞内表达。图6C显示了颗粒酶B的细胞内表达。图6D显示了颗粒酶B表达相对于从非荷瘤小鼠分离的原始OT-1T细胞的标准化MFI。图6E显示了颗粒酶B的共表达，图6F显示了用aCD3和aCD28抗体体外刺激4小时后TNFα和INFγ的细胞内表达。图6A和6B显示的数据来自2个独立实验(PD1d/2V/33，PD1d/33)或1个(其他组)(n＝4-6只动物/组)。图6C、图6D、图6E和图6F显示的数据从2个独立实验(PD1d/2V/33)或1个(其他组)(n＝4-6只动物/组)中获得。采用单因素方差分析(ANOVA)结合Dunnet检验对多重比较进行校正，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，**p<0.0001。从非荷瘤小鼠脾脏分离的原始OT-1T细胞用作FACS染色的内部阴性对照。图6G和图6H显示PD1d/2V/33+OT-1细胞处理的B16-OVA荷瘤小鼠在有或无250μg/只针对所示表面标志物的抗体的情况下，随时间的肿瘤生长控制，在细胞转移前1天开始腹腔注射施用，保持每3天一次最大6剂量；αPD-L1(图6G)和αPD-L1+αTIM3(图6H)。图6I显示了用PD1d/2V/33+OT1细胞或用分泌IL-2V和IL-33(无PD-1胞外域)的基因工程化OT1 T细胞处理的B16-OVA荷瘤小鼠随时间的肿瘤生长控制。与PD1d/2V/33类似，该组由表达IgG4/IL-33的OT-1细胞(无PD-1诱饵产生)与表达IgG4/IL-2V的OT-1细胞以1:1的比例混合而成。经FACS和ELISA证实，IgG4 Fc和IL-33的表达与PD1d/33(n＝8只动物/组)无显著差异。两个独立实验(n＝6只动物/组)中的代表性实验如图6G、6H和6I中的实验所示。从非荷瘤小鼠脾脏分离的原始OT-1T细胞用作FACS染色的内部阴性对照。
图7A、图7B、图7C和图7D是一套图，显示正交工程化驱动TOXneg/low GzmC+前体分化。图7A显示了对第24天收集的TCF1+CD8+TIL中PD-1的表达的分析。图7B显示了评估PD-1+TCF1+细胞中TOX的表达的设门策略(gating strategy)。图7C显示了对来自PD1d/2V的GzmC+PD-1+TCF1+CD8 TIL与GzmCnegPD-1+TCF1+CD8 TIL细胞中TOX表达的分析。图7A、7B和7C所示数据来自2个独立实验(n＝4-6只动物/组)。采用单因素方差分析(ANOVA)结合Dunnet检验对多重比较进行校正，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，**p<0.0001。图7D显示了在第24天从用PD1d/2V/33+OT1(3个独立实验，n>＝4只动物/组)处理的小鼠获得的TCF1+CD8+TIL中颗粒酶C的表达(将MFI标准化为原始OT1)与肿瘤接种后第12天获得的内源性TCF1+CD8 TIL(基线，n＝6只动物)和体外扩增后的TCF1+基因工程化OT1细胞的对比分析(ACT前，n＝14)。从非荷瘤小鼠脾脏分离的原始OT-1T细胞用作FACS染色的内部阴性对照。
图8A、图8B、图8C、图8D、图8E、图8F、图8G和图8H是一套图，显示了由正交工程化诱导的新型TCF1negCD8+TIL效应状态与肿瘤响应动态相关。图8A显示了实验设计。在肿瘤细胞接种后的第12天和第15天，对患有B16-OVA肿瘤的小鼠进行处理。在第17天、第24天和第38天收集肿瘤，通过FACS分类和使用10X Genomics进行单细胞测序获得富集于CD8+TIL中的CD45+细胞悬浮液。图8B显示了UMAP图，该图显示了细胞异质性的低维表现，和不同时间点仅PD1d/2V/33样本的无监督聚类结果，其中等高线图描绘了每种处理的高细胞密度区。聚类特定的标志物的点图被显示(底部)。图8C显示了使用ProjecTIL在参照TIL图上的聚类C5和C6的投影。独立成分IC26还将肿瘤控制期间观察到的独特聚类C5与逃逸期间获得的TIL显著分离。右下角：火山图显示了聚类C6和C5之间显著差异表达的基因。图8D显示了在肿瘤控制(第24天)和逃逸(第38天)期间收集的总CD8+TIL细胞中颗粒酶C的表达的分析。三_组合处理的小鼠脾脏中的CD8+T细胞和未治疗或UT OT1治疗的小鼠的CD8+TIL均被包含进对照组。从两个独立实验(PD1d/2V/33)中获得的数据被显示。图8E显示了在肿瘤控制(第24天)和逃逸(第38天)期间收集的总CD8+TIL中的OT1(CD45.1+)肿瘤内持久性的分析。图8F显示了基于PD-1和TCF1表达的在肿瘤控制(第24天)和逃逸(第38天)期间收集的外源性和内源性CD8+TIL的分析。用抗CD3和抗CD28抗体体外刺激4小时后，分析在肿瘤控制(第24天)或逃逸(第38天)期间收获的PD-1+TCF1neg CD8 TIL中颗粒酶B(图8G)、TNFα和INFγ(图8H)的细胞内表达。从2个独立实验(肿瘤对照)或1个(逃逸)中获得的数据(n＝4-6只动物/组)被显示。采用双尾学生t检验对两组进行比较。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001。从非荷瘤小鼠脾脏分离的原始OT-1T细胞用作FACS染色的内部阴性对照。
图9A、图9B、图9C和图9D是一套图，显示了PD-1诱饵变体和用PD-1诱饵变体和tEGFR转导的hCD8+T细胞的特征。图9A显示了可溶性单体PD1诱饵变体(细菌产物)对包被有人PDL1蛋白的板的滴定ELISA。用抗His标签抗体检测结合的PD1诱饵分子。PD-1诱饵变体4XMUT_M70与PD-L1的结合力是WT PD1诱饵的10倍，而变体6XDM与PD-L1的结合力是WT PD1诱饵的7.5倍。图9B显示逆转录病毒转导的CD8+T细胞的tEGFR和细胞内PD1诱饵的检测。图9C显示了共表达PD-1诱饵(变体)和tEGFR的NY-TCR(I53F)工程化CD8+T细胞产生IFNγ。以1:1的比例将工程化T细胞与不同PD-L1+靶肿瘤细胞(每种类型100000个细胞)共培养48小时。NA8和HLA/A2+NY-ESO-1-、SAOS2和A375是HLA/A2+NY-ESO-1+。48小时后收集上清液，1/25稀释，并使用来自Thermo的商用ELISA试剂盒评估是否存在IFNγ。所示为代表性T细胞供体的数据。在所有的试验中，变种都比WT PD-1诱饵表现更佳。图9D显示了转导为表达PD1诱饵(4XMUT_M70E)和tEGFR的人T细胞的ADCC试验结果。用铬标记具有PD1诱饵_tEGFR逆转录病毒的工程化CD8 T细胞。将工程化T细胞与抗EGFR抗体共培养，并与来自同一供体的不同比例的PBMC共培养。阴性对照是在4小时时评估的NT(未转导)T细胞杀伤。作为阳性对照，T细胞用盐酸处理。
图10A、图10B、图10C和图10D是一套图，显示了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)试验的结果，其中T细胞被工程化为表达tEGFR。图10A显示，tEGFR工程化的CD8+T细胞负载铬，并与PBMC以不同比例培养4-5小时，同时降低抗EGFR抗体西妥昔单抗的浓度。作为阴性对照，tCD30工程化T细胞与西妥昔单抗的最大浓度(100μg/ml)一起用于试验。释放的铬被用来测量裂解的T细胞。图10B和图10C显示了tHER2工程化CD8+T细胞的ADCC分析结果(左：赫赛汀(图10B)；右：赫赛莱(图10C))。图10D显示CD20工程化CD8+T细胞的ADCC分析结果。
图11A、图11B和图11C是一套图，显示了携带用于转导淋巴细胞的转基因的代表性结构。所述代表性结构分别携带PD-1诱饵和tEGFR(图11A)、CD40L变体(图11B)和IL-2变体(也称为IL-2V)(图11C)。
具体实施方式
本发明涉及通过细胞免疫疗法(例如通过过继转移肿瘤特异性基因修饰的淋巴细胞亚群)产生和/或增加免疫应答的方法和组合物。本发明提供了包含转基因淋巴细胞的组合物，其至少表达两个具有调节免疫系统和先天性及适应性免疫应答能力的转基因。本申请所公开的方法和组合物是平台技术的实施方案，称为增强T细胞性能的基因工程化(GEEP-TTM)。GEEP-TTM旨在提供具有增强抗肿瘤功能的基因工化程淋巴细胞，和开发此类淋巴细胞的方法。
A.组合物和试剂盒
在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含至少表达两个转基因(例如，治疗性转基因)的多个基因改造的淋巴细胞，用于调节受试者的免疫系统。
在一些实施方案中，淋巴细胞是外周血淋巴细胞(PBL)。在一些实施方案中，淋巴细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。淋巴细胞可以包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞源自CD34造血干细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞。淋巴细胞可以是自体的、同种异体的、同基因的或异种的。在一些实施方案中，淋巴细胞是自体的。在一些实施方案中，淋巴细胞是人类淋巴细胞。
在一些实施方案中，所述淋巴细胞可以是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，淋巴细胞可以表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述淋巴细胞可以表达重组T细胞受体(TCR)。CAR或TCR可以与癌症抗原结合。在一些实施方案中，CAR或TCR可以显示对NY-ESO1、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGEA-10、MAGE-C2、SSX2、MAGE-A12或其组合的反应性。
在一些实施方案中，所述转基因编码分子选自：可溶性受体、诱饵、显性负性突变体(dominant negative)、微环境调节剂、酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转位酶、激酶、转运体、修饰物、分子伴侣、离子通道、抗体、细胞因子、趋化因子、激素、DNA、核酶、生物传感器、表观遗传修饰物、转录因子、编码RNA、非编码RNA、小RNA、长RNA、IRES元件或外泌体来源RNA。
在一些实施方案中，所述转基因编码至少两个分子选自：可溶性受体、诱饵、显性负性突变体、微环境调节剂、酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转位酶、激酶、转运体、修饰物、分子伴侣、离子通道、抗体、细胞因子、趋化因子、激素、DNA、核酶、生物传感器、表观遗传修饰物、转录因子、编码RNA、非编码RNA、小RNA、长RNA、IRES元件、外泌体来源RNA或其任何组合。
在一些实施方案中，所述由转基因编码的两个或多个分子通过自切割肽序列连接。在一些实施方案中，所述转基因表达由组成性激活的启动子调节。在一些实施方案中，所述转基因表达由诱导型启动子调节。在一些实施方案中，所述转基因表达由淋巴细胞的激活状态诱导。在一些实施方案中，通过整合活性γ逆转录病毒或慢病毒、DNA转位等将转基因引入淋巴细胞。
在一些实施方案中，所述转基因选自抗体、抗体片段、受体、诱饵、检查点阻断调节剂、细胞因子、趋化因子、激素、细胞消除标签及其组合。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段可以是VEGF、TGF-B、4-1BB、CD28、CD27、NKG2D、PD1、PDL1或CTLA4抗体。在一些实施方案中，所述抗体为PD1抗体。在一些实施方案中，所述诱饵可以是PD1、CTLA4、LAG3、VEGFR1、TIM3、TIGIT或SIRPα诱饵。在一些实施方案中，所述诱饵是PD1诱饵，例如PD-1 IgG4诱饵。
在一些实施方案中，所述细胞因子选自LIGHT或其变体/片段、IL-33或其变体/片段、IL-2或其变体/片段、IL-15或其变体/片段、IL-12或其变体/片段，和CD40L或其变体/片段。在一些实施方案中，所述细胞因子是突变细胞因子。
在一些实施方案中，所述细胞消除标签选自tEGFR、Her2、CD20和CD19。
在一些实施方案中，所述转基因包含PD-1诱饵或其变体/片段、IL-2变体/片段、LIGHT或其变体/片段、IL-33或其变体/片段和CD40L或其变体/片段中的两个或多个。在一些实施方案中，所述转基因还包含tEGFR或其变体/片段、tHER2或其变体/片段、CD20或其变体/片段或CD19或其变体/片段。
在一些实施方案中，所述PD-1诱饵或其变体/片段与细胞消除标签(CET)，例如tEGFR或其变体/片段、tHER2或其变体/片段、CD20或其变体/片段、和CD19或其变体/片段包含于同一载体上。
在一些实施方案中，所述至少两个转基因包括：(a)PD-1诱饵或其变体/片段和tEGFR或其变体/片段；(b)PD-1诱饵或其变体/片段和IL-2变体/片段；(c)PD-1诱饵或其变体/片段和LIGHT或其变体/片段；(d)PD-1诱饵或其变体/片段和IL-33或其变体/片段；(e)PD-1诱饵或其变体/片段和CD40L或其变体/片段；(f)PD-1诱饵或其变体/片段、IL-2变体/片段和IL-33或其变体/片段；(g)PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段和IL-2变体/片段；(h)PD-1诱饵或其变体/片段，tEGFR或其变体/片段，和LIGHT或其变体/片段；(i)PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段和IL-33或其变体/片段；(j)PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段、和CD40L或其变体/片段；(k)PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段、IL-2变体/片段和IL-33或其变体/片段；(l)PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段、IL-2变体/片段和CD40L或其变体/片段；或(m)PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段、IL-33变体/片段和CD40L或其变体/片段。
在一些实施方案中，所述PD-1诱饵包含SEQ ID NO:1-4、6-17、42、44、47-48和51-52中任一条的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-4、6-17、42、44、47-48和51-52中任一条具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述IL-2变体包含SEQ ID NO:21-23中任一条的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21-23中任一条具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述IL-33包含SEQ ID NO:25和27中任一条的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25和27中任一条具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述LIGHT包含SEQ ID NO:28-29和31中任一条的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28-29和31中任一条具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述CD40L包含SEQ ID NO:32-34、36和38中任一条的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:32-34、36和38中任一条具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述tEGFR包含与SEQ ID NO:40具有至少80％一致性的氨基酸序列或SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述HER2包含与SEQ ID NO:45具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)一致性的氨基酸序列或SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述CD20包含与SEQ ID NO:49具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)一致性的氨基酸序列或SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
也在本发明范围内的是新型PD-1诱饵变体，其包含与SEQ ID NO:6-17、42、44、47-48和51-52中任一条具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)一致性的氨基酸序列或SEQ ID NO:6-17、42、44、47-48和51-52中任一条的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少两个淋巴细胞亚群。例如，所述组合物可以包括基因修饰的两个、三个、四个、五个或更多个淋巴细胞亚群。基因修饰的每个淋巴细胞亚群可以至少表达一个转基因。例如，基因修饰的每个淋巴细胞亚群可以表达两个、三个、四个、五个或更多转基因。
在一些实施方案中，所述组合物包含两个基因修饰的淋巴细胞亚群，其中每个亚群至少表达一个转基因。在一些实施方案中，所述组合物包含两个基因修饰的淋巴细胞亚群，其中每个亚群表达两个转基因。在一些实施方案中，所述组合物包含三个基因修饰的淋巴细胞亚群，其中每个亚群至少表达一个转基因。在一些实施方案中，所述组合物包含四个基因修饰的淋巴细胞亚群，其中每个亚群至少表达一个转基因。在一些实施方案中，所述组合物包含五个或更多基因修饰的淋巴细胞亚群，其中每个亚群至少表达一个转基因。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少两个基因修饰的淋巴细胞亚群，其中每个亚群至少表达两个转基因，并且其中每个亚群共享一个转基因。在一些实施方案中，所述组合物包含至少两个基因修饰的淋巴细胞亚群，其中每个亚群至少表达两个转基因，并且其中每个亚群表达不同的转基因。
在一些实施方案中，所述多个淋巴细胞可以包括：(i)至少表达两个转基因的第一亚群；和(ii)至少表达两个转基因的第二亚群，其中第一亚群的至少一个转基因不同于第二亚群的转基因，或者其中第一亚群的至少一个转基因与第二亚群的转基因相同。在一些实施方案中，淋巴细胞的所述组合物可以在结合第一亚群和第二亚群后表达三个转基因。
在一些实施方案中，(i)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段和IL-2变体/片段，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段和LIGHT或其变体/片段；(ii)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段和IL-2变体/片段，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段和IL-33或其变体/片段；(iii)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段和IL-2变体/片段，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段和CD40L或其变体/片段；(iv)所述第一亚群至少表达一个PD-1诱饵或其变体/片段和LIGHT或其变体/片段，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段和IL-33或其变体/片段；或(v)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段和LIGHT或其变体/片段，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段和CD40L或其变体/片段；或(vi)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段和IL-33或其变体/片段，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段和CD40L或其变体/片段。
在一些实施方案中，所述第一亚群或所述第二亚群还表达tEGFR或其变体、tHER2或其变体、CD20或其变体或CD19或其变体。
在一些实施方案中，(i)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段和IL-2变体/片段，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段和LIGHT或其变体/片段；(ii)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段和IL-2变体/片段，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段和IL-33或其变体/片段；(iii)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段和IL-2变体/片段，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段和CD40L或其变体/片段；(iv)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段和LIGHT或其变体/片段，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段和IL-33或其变体/片段；(v)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段和LIGHT或其变体/片段，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段和CD40L或其变体/片段；或(vi)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段和IL-33或其变体/片段，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体/片段、tEGFR或其变体/片段和CD40L或其变体/片段。
如本文所用，术语“变体”指与第二分子(也称为“母体”分子)相关的第一分子。变异分子可以从母体分子衍生、分离、基于母体分子或与母体分子同源。本文所用蛋白质的“功能变体”指至少部分保留该蛋白质活性的该蛋白质的变体。功能性变体可以包括突变体(可以是插入、缺失或替换突变体)，包括多晶型等。功能性变体中还包括此类蛋白质与另一种通常不相关的核酸、蛋白质、多肽或肽的融合产物。功能变异可以是自然发生的，也可以是人为的。
在一些实施方案中，转基因变体可以包括一个或多个保守修饰。具有一个或多个保守修饰的转基因变体可以保留期望的功能特性，其可以使用本领域已知的功能分析进行测试。
如本文所用，术语“保守序列修饰”指不显著影响或改变含有所述氨基酸序列的所述蛋白质的结合特性的氨基酸修饰。这种保守的修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过本领域已知的标准技术引入修饰，例如定点突变和PCR介导的突变。保守氨基酸替换是指将氨基酸残基替换为具有类似侧链的氨基酸残基。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)；不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)；非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)；β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)；芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)包括一个或多个保守修饰。具有一个或多个保守修饰的Cas蛋白质可以保留期望的功能特性，其可使用本领域已知的功能分析进行测试。
如本文所用，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等于两个序列之间的一致性百分比。两个序列之间的一致性百分比是序列共享的相同位置数(即位置的同源性百分比＝相同位置数/位置总数×100)的函数，考虑到间隙的数量和每个间隙的长度，需要引入间隙以实现两个序列的最佳对齐。序列的比较和两个序列之间的一致性百分比的确定可以使用数学算法来完成，如以下非限制性实施例所述。
可以使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4:11-17(1988))的算法确定两个氨基酸序列之间的一致性百分比，所述算法已被引入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残基表，间隙长度罚分为12，间隙罚分为4。此外，可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))算法确定两个氨基酸序列之间的一致性百分比，所述算法已被引入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，gap权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4，5，或6。
术语“同源物”或“同源的”，当用于一种多肽时，指的是两种多肽之间的高度序列一致性，或三维结构之间的高度相似性，或活性位点和作用机制之间的高度相似性。在一些实施方案中，同源物与参考序列具有大于60％的序列一致性，更优选地大于75％的序列一致性，并且仍然更优选地大于90％的序列一致性。应用于多肽的术语“基本一致性”是指两个肽序列在最佳对齐时，如通过程序GAP或BESTFIT使用默认gap权重，共享至少75％的序列一致性。
本文所用的肽或多肽“片段”指长度小于全长的肽、多肽或蛋白质。例如，肽或多肽片段可以具有至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约10个、至少约20个、至少约30个、至少约40个氨基酸的长度或其单个单位长度。例如，片段长度可以是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多氨基酸。肽片段的大小没有上限。然而，在一些实施方案中，肽片段长度可以小于约500个氨基酸、小于约400个氨基酸、小于约300个氨基酸或小于约250个氨基酸。
与所述转基因具有显著一致性的变体、突变体和同源物也在本发明的范围内。例如，此类变体和同源物可以与本文所述的转基因序列具有至少约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列一致性。
在一些实施方案中，所述转基因变体是融合多肽，其包含与融合伙伴融合(例如，N端或C端融合)的转基因序列。在一些实施方案中，所述融合伙伴包含人类免疫球蛋白多肽序列的片段(例如，CH3结构域；或部分或全部的Fc区域，例如IgG4Fc)。例如，PD-1或其变体/片段、IL-2或其变体/片段、IL-33或其变体/片段、CD40L或其变体/片段或LIGHT或其变体/片段可以通过连接体(linker)，例如IgG4Fc或其变体/片段，直接或间接地N端或C端融合或连接到融合伙伴。
术语“融合多肽”或“融合蛋白”指通过将两个或多个多肽序列连接在一起而产生的蛋白质。本发明中包含的融合多肽包括嵌合基因构建体的翻译产物，所述嵌合基因构建体将编码第一多肽的核酸序列与编码第二多肽的核酸序列连接以形成单个开放阅读框。换句话说，“融合多肽”或“融合蛋白”是由两种或两种以上的蛋白质组成的重组蛋白，所述蛋白质通过肽键或几个肽连接在一起。所述融合蛋白还可以包含两个结构域之间的肽连接体。
已知通过其结合抑制或降低免疫应答的免疫抑制多肽包括CD47、PD-1、CTLA-4及其相应配体，包括SIRPα、PD-L1、PD-L2、B7-1和B7-2。这种多肽存在于肿瘤微环境中，并抑制对瘤细胞的免疫反应。在各种实施方案中，通过转基因抑制、阻断或拮抗免疫抑制多肽和/或其配体的相互作用增强免疫应答细胞的免疫应答。在一个方面，转基因可以作为抑制/检查点分子的基因敲除，包括但不限于PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、VISTA、TIM-3和CBL-B。
已知通过结合刺激或增加免疫反应的共刺激多肽包括CD28、OX-40、4-1BB、CD27和NKG2D及其相应配体，包括B7-1、B7-2、OX-40L、4-1BBL、CD70和NKG2D配体。这种多肽存在于肿瘤微环境中，并激活对瘤细胞的免疫反应。在各种实施方案中，通过转基因促进、刺激或激动促炎多肽和/或其配体可以增强免疫应答细胞的免疫应答。
在一些实施方案中，转基因是细胞因子或生长因子。术语“生长因子”和“细胞因子”是指以自分泌、旁分泌或内分泌方式控制细胞活动的信号分子。它们通过与特定受体结合并激活相关的下游信号通路发挥其生物学功能，进而调节细胞核中的基因转录并最终刺激生物反应(Nicola N.Oxford；New York:Oxford University Press；1994)。生长因子和细胞因子影响多种生理过程，如细胞增殖、分化、凋亡、免疫或造血反应、形态发生、血管生成、新陈代谢、伤口愈合和维持成年生物体内的组织稳态。历史上，生长因子被认为是对细胞生长和增殖有积极影响的生物部分，而细胞因子通常被认为具有免疫或造血反应。然而，随着不同研究领域的融合，发现“细胞因子”和“生长因子”可以具有相似的功能，因此，这些术语在本文中可以互换使用。
TGF-β超家族：TGF-β超家族包括TGF-β蛋白、骨形态发生蛋白(BMP)、生长分化因子(GDF)、胶质源性神经营养因子(GDNF)、激活素、抑制素、Nodal、Lefty和苗勒氏管抑制因子(MIS)。TGF-β超家族成员是多种生物过程的多功能调节器，如形态发生、胚胎发育、成体干细胞分化、免疫调节、伤口愈合、炎症和癌症。
(1)BMP样家族：(BMP(即BMP1-10、BMP-15)、GDF(即GDF1-15)、AMH
(2)GDNF样家族：GDNF、Artemin、Neuturin和Persephone
(3)TGF-β样家族：TGF-β(即TGF-β-1、TGF-β-2、TGF-β-3)、激活素(即激活素A/AB/B、抑制素A/B)、Nodal
表皮生长(EGF)因子：EGF家族成员包括EGF、TGF-α、神经调节蛋白、双调蛋白、β细胞素等。所述EGF家族的成员以其刺激细胞增殖、分化和存活的能力而闻名。下调该家族成员及其受体与肿瘤发生密切相关(Herbst RS.International Journal of RadiationOncology,Biology,Physics 2004,59(2Suppl):21-26)。
血小板衍生生长因子(PDGF)：血小板衍生生长因子(PDGF)是强效的促有丝分裂和趋化蛋白。目前有四种已知的PDGF蛋白质由四个基因编码(PDGFA、PDGFB、PDGFC和PDGFD)。PDGF以二硫键连接的同源二聚体或异源二聚体的形式分泌，包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD和PDGF-AB。有两种已知的PDGF受体具有内在酪氨酸激酶活性；PDGFRα和PDGFRβ均可形成异二聚体和同二聚体。配体结合促进受体二聚化、自磷酸化和随后激活多个下游细胞内信号级联。通过PDGFRα发出的信号对面部骨骼、毛囊、精子发生、少突胶质细胞和星形胶质细胞的发育和肺和肠绒毛的发育至关重要，而通过PDGFRβ发出的信号对血管、肾脏和白色脂肪细胞的发育至关重要(Heldin CH.Cell Commun Signal 2013,11:97)。
成纤维细胞生长因子(FGF)家族：在人类中，已经鉴定出FGF家族的22个成员，它们全都是肝素结合蛋白。与细胞表面相关的硫酸乙酰肝素蛋白多糖的高亲和力相互作用对于受体酪氨酸激酶介导的FGF信号转导至关重要(Ornitz DM,ItohN.Genome Biology 2001,2(3):REVIEWS3005)。FGF是一种多功能蛋白，主要是促有丝分裂的，但也具有调节的、形态学的和内分泌的作用。FGF参与胚胎发育过程(Heldin CH:Targeting the PDGF signalingpathway intumortreatment.Cell Commun Signal 2013,11:97)，成熟组织/系统血管生成(Kim BS等人.Biochemical andbiophysical research communications2014，450(4)：1333-1338)，角质形成细胞组织(Tsuboi R,et al.The Journal ofInvestigativeDermatology 1993,101(1):49-53)和伤口愈合过程(Lee JG,Kay EP.InvestigativeOphthalmology&Visual Science 2006,47(4):1376-1386)。
胰岛素样生长因子(IGF)：胰岛素样生长因子(IGF)是与胰岛素具有高度序列相似性的蛋白质。IGF受体是一种二硫键连接的异源四聚体跨膜蛋白，具有细胞质酪氨酸激酶结构域。胰岛素样生长因子受体有两种类型，即IGFI-R and IGFII-R。IGF的可用性可由IGF结合蛋白1-6调节(Griffeth RJ等人，Basic and clinical andrology 2014,24:12)。IGF的主要作用是促进细胞生长。事实上，垂体生长激素的大部分作用是由IGF介导的，主要是IGF-1。生长激素刺激许多组织，尤其是肝脏，合成和分泌IGF-1，进而刺激包括骨骼在内的大多数组织的肥大(细胞大小增加)和增生(细胞数量增加)。IGF还可以诱导神经元存活，保护软骨细胞，并激活骨细胞(Brahmkhatri VP等人，BioMed research international2015,2015:538019)。
血管内皮生长因子(VEGF)：VEGF是内皮细胞特有的同源二聚体糖蛋白生长因子(Ferrara N，Gerber HP，LeCouter.Nature Medicine 2003，9(6)：669-676)。它们调节血管生成和血管通透性，尤其是在胚胎发生、骨骼生长和生殖功能期间。它们在造血过程中也发挥着重要作用。VEGF信号主要通过酪氨酸激酶VEGFR1和VEGFR2，并刺激细胞存活、增殖、迁移和/或粘附(Ferrara N.Endocrine Reviews 2004,25(4):581-611)。血管内皮生长因子的下调与肿瘤、眼内新生血管疾病和其他疾病有关(Ferrara N等人，Nature Medicine2003,9(6):669-676)。VEGF基因家族的成员包括VEGF/VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盘生长因子(PlGF)(PlGF)(Holmes DI,Zachary I.Genome Biology2005,6(2):209)。
肝细胞生长因子(HGF)：HGF由间充质细胞分泌，作为一种多功能细胞因子作用于主要来源于上皮和内皮的细胞。它通过HGFR激活酪氨酸激酶信号级联来调节细胞生长、细胞运动和形态发生(Okada M等，Pediatric Research 2004,56(3):336-344)。HGF已被证明在胚胎器官发育、成体器官再生和伤口愈合中发挥重要作用。此外，其刺激有丝分裂、细胞运动和基质侵袭的能力使其在血管生成和肿瘤发生中发挥中心作用(Sharma NS等人，FASEB 2010，24(7)：2364-2374)。
肿瘤坏死因子(TNF)：已知参与肿瘤细胞凋亡的细胞因子最初被归类为肿瘤坏死因子(或TNF家族)下。所有TNF家族成员共享一个三聚体、保守的C末端结构域，称为“TNF同源结构域”或THD。负责受体结合的THD在家族成员中共享约20–30％的序列一致性。尽管大多数配体是以膜结合蛋白的形式合成的，但可溶性形式可以通过限制性蛋白酶酶解产生(Bodmer JL等人，Trends in Biochemical Sciences 2002,27(1):19-26)。所述家族的前两名成员是TNFα和TNFβ。迄今为止，已鉴定出19种TNF超家族配体和32种TNF超家族受体。虽然许多TNF超家族成员促进或抑制细胞凋亡，但它们也调节先天性和适应性免疫系统的关键功能，包括自然杀伤细胞激活、T细胞共刺激和B细胞稳态和激活(Croft M.NatureReviews Immunology2009，9(4)：271-285)。LIGHT(与淋巴毒素同源，表现出可诱导表达，并与HSV糖蛋白D竞争使疱疹病毒侵入介体，一种由T淋巴细胞表达的受体)是TNF配体超家族的II型跨膜糖蛋白。LIGHT在未成熟的DC和活化的T细胞上表达，并与3种不同的受体结合，即疱疹病毒侵入介体(HVEM)、淋巴毒素-β受体(LTβR)和诱饵受体3/TR6。与HVEM结合后，LIGHT会共同刺激T细胞，加速增殖和细胞因子的产生。另一个示例是CD154，也称为CD40配体或CD40L。它是一种主要在活化T细胞上表达的蛋白质，是TNF分子超家族的成员。它与抗原呈递细胞上的CD40结合，从而根据靶细胞类型产生多种效应。另一个示例是Fas配体(FasL或CD95L或CD178)。Fas配体/受体相互作用在免疫系统的调节和癌症的进展中起着重要作用。
白细胞介素(ILs)：白细胞介素是一大类免疫调节蛋白，在免疫应答期间调节免疫或造血系统中细胞的生长、分化和激活。根据其区别结构特征，已知的ILs可分为四大类，包括：；IL1样细胞因子、I类螺旋细胞因子(IL4样、γ链和IL-6/12样)、II类螺旋细胞因子(IL-10样和IL-28样)和IL-17样细胞因子(表1)。
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干扰素(IFN)：IFN是一组信号蛋白，由宿主细胞产生并释放，以应对病毒、细菌、寄生虫或肿瘤细胞等病原体的存在。干扰素也有免疫调节功能；它们抑制B细胞活化，增强T细胞活性，增加自然杀伤细胞的细胞破坏能力。在包括人类在内的动物中，已经鉴定出20多种不同的IFN基因和蛋白质。它们通常分为两类：I型IFN和II型IFN。I型IFN也称为病毒性IFN，包括IFN-α、IFN-β和IFN-ω。II型IFN也称为免疫干扰素(IFN-γ)。病毒性IFN是由病毒感染诱导的，而II型IFN是由有丝分裂或抗原刺激诱导的。大多数类型的病毒感染细胞能够在细胞培养中合成I型IFN。相比之下，IFN-γ仅由免疫系统的某些细胞合成，包括自然杀伤细胞、CD4 Th1细胞和CD8细胞毒性抑制细胞(Samuel CE.Clinical Microbiology Reviews2001,14(4):778-809,table ofcontents)。
在一些实施方案中，转基因是诱饵受体。“诱饵受体”指能够有效识别和结合特定生长因子或细胞因子的受体，但在结构上不能发出信号或激活预期受体复合物。它作为一种抑制剂，与配体结合，防止其与常规受体结合。
在一些实施方案中，转基因是可溶性诱饵。“可溶性诱饵”是指从细胞中表达和分泌的多肽，它与不同细胞上的特定受体结合，从而抑制其天然配体与该受体的结合。可溶性诱饵的非限制性示例包括PD1诱饵、CTLA-4诱饵、LAG3诱饵、VEGFR1诱饵、TIM3诱饵、TIGIT诱饵和SIRPα诱饵。在一个实施方案中，PD-1诱饵由淋巴细胞表达和分泌，并且这种PD-1诱饵通过占据抗原呈递细胞(APC)上PD-L1的结合位点，从而抑制T细胞上的天然PD-1与抗原呈递细胞(APC)上的PDL-1的结合而抑制T细胞的免疫抑制信号，从而增强T细胞的免疫应答。
PD-1诱饵：PD-1是肿瘤微环境中T淋巴细胞的强负调控因子。在一个实施方案中，通过逆转录病毒转导产生表达PD-1显性负缺失突变体(PD-1诱饵的非限制性示例)的T细胞。这种PD-1诱饵增加了抗原特异性T细胞对表达同源抗原的肿瘤细胞响应的IFN-γ分泌。在另一个实施方案中，将与PDL-1具有更高结合亲和力的PD-1胞外域(PD-1诱饵的非限制性示例)的可溶性片段作为PDL-1的竞争性拮抗剂施用。可溶性PD-1胞外域变体的非限制性示例在Maute等人(Maute等人，PNAS 2015Nov 24；112(47):E6506-E6514)被公开。在又一实施方案中，包含融合到人IgG4(PD-1IgG4)Fc区域的PD1胞外域的PD-1诱饵分子可以用于增强体内肿瘤控制。在另一个实施方案中，这种PD-1诱饵可以由TIL表达和分泌。
如本发明所述，PD-1诱饵也可以通过基于计算的合理设计生成，以开发PD-1胞外域的结合和/或溶解度增强变体。例如，在细菌表达系统中产生的重组可溶性蛋白中评估预测可增加PD-1与PD-L1结合亲和力的单个和多个氨基酸替换。所述变体可以通过直接滴定ELISA与感兴趣的平板捕获的PD-L1变体结合进行评估，然后将所述变体克隆到逆转录病毒载体中，以评估T细胞的分泌。在细菌产生过程中表现出低溶解性的PD-1诱饵被丢弃，因为通常低溶解性对应于T细胞的无产量或低产量。
由工程化人T细胞产生的PD-1诱饵也包含Fc部分(例如IgG4Fc)，以增加蛋白质的亲和力和稳定性。人原代T细胞产生的PD1-Fc诱饵可以用ELISA进行评估。为了评估功能性，建立了一种共培养分析方法，其中，人原代T细胞共工程化以表达A2/NY-ESO-1T细胞受体(TCR)以允许肿瘤细胞识别(通过慢病毒转导)，和表达PD1-Fc诱饵和细胞表面tEGFR(编码在双顺反子逆转录病毒载体中)。这些共转导T细胞(或仅包含TCR或PD1诱饵的对照T细胞)与PDL1pos靶肿瘤细胞共培养。评估共培养上清液中存在的IFNγ水平，以确定最佳PD-1诱饵变体(即，IFNγ水平越高，PD1诱饵在靶肿瘤细胞表面阻断PD-L1的效果越好)。4XMUT_M70和6XDM属于PD1-Fc诱饵变体，显示出与PD-L1的高结合亲和力和高溶解性(图9A-D)。
细胞消除标签(CET)：所述转基因，如PD1-Fc诱饵，可以从还编码CET，如tEGFR、tHER2、CD20或CD19(图10A-D)的双顺反子逆转录病毒载体组成性表达。所述CET的目的有四个。首先，它可以作为一种评估转导效率的手段，第二，如有必要，它可以用于富集工程细胞(在包被抗EGFR的珠上)。第三，它可以作为一种追踪植入后患者体内的工程化T细胞的手段(从抽取的血液样本或肿瘤活检通过FAC)。最后，如果西妥昔单抗患者出现毒性，它可以通过ADCC用作消除标签。一种截短的人类EGFR多肽(huEGFRt)，不含细胞外N端配体结合域和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但保留天然氨基酸序列、I型跨膜细胞表面定位和药物级抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗(Erbitux)的构象完整的结合表位，被Want等人描述(Wang X等人，Blood.2011Aug 4；118(5):1255-63.Epub 2011Jun 7)。CETADCC的其他示例可能包括tHER2(含赫赛汀或赫赛莱)、CD20(含利妥昔单抗)和CD19。Griffioen等人(Griffioen等人，Haematologica.2009Sep；94(9):1316-20)对CD20作为CET进行了描述。Budde等人(Budde等人，Blood 2013；122(21)：1660)和Annesley等人(Annesley等人，Annesley et al.,Blood2019；134(Supplement_1):223)对CD19作为CET进行了描述。
LIGHT：LIGHT是TNF配体超家族的一种II型跨膜糖蛋白(Mauri的人，Immunition1998年1月；8(1)：21-30)。它在未成熟树突状细胞和活化T细胞上表达(Tamada K等人，JImmunol.2000Apr 15；164(8):4105-10)，并与3种不同的受体结合，即疱疹病毒进入介体(HVEM)、淋巴毒素-β受体(LTβR)和诱饵受体3/TR6。在与HVEM结合后，光会共同刺激T细胞，并加速增殖和细胞因子的产生(Tamada等人，Nat Med.2000年3月；6(3)：283-9)。在一个实施方案中，LIGHT蛋白可以被工程化以从TIL表达和分泌。
IL-33：细胞因子是炎症性肿瘤微环境中细胞间的中心介质，其中白细胞介素-33(IL-33)被认为是细胞损伤后释放的一种报警素。IL-33被发现是IL-1细胞因子家族的一员。IL-1基因家族包含11个成员(IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-18、IL-36RA、IL-36α、IL-37、IL-36β、IL-36γ、IL-38、IL-33)，它们通过在白细胞和内皮细胞上表达整合素，诱导促炎细胞因子的复杂网络，并调节和启动炎症反应(白细胞介素-1在炎症性疾病的发病机制和治疗中的作用)(Dinarello CA.,Blood.2011Apr 7；117(14):3720-32)。肿瘤的发展过程可以触发抗肿瘤免疫反应。1型免疫反应是细胞介导免疫的关键组成部分，包括肿瘤诱导的产生IFN-γ的Th1细胞、细胞毒性T淋巴细胞、NK T细胞和γδT细胞，以限制肿瘤生长和转移(Galon J等人，Science.2006年9月29日；313(5795)：1960-4.)。由于炎症是恶性肿瘤的另一个重要组成部分，IL-33可以在改善癌症监测和抗肿瘤免疫方面发挥作用。在本发明的一个实施方案中，IL-33可以被工程化以从TIL表达和分泌。
IL-2：白细胞介素-2(IL-2)是最早被发现具有分子特征的细胞因子之一。它主要被证明支持T细胞和NK细胞的生长和扩增。IL-2在1992年被批准用于临床，但其受体生物学的精确描述仍在研究中。系统高剂量(HD)IL-2处理在黑色素瘤和肾癌患者中产生持久的反应，但仅在相对较小的一部分患者中产生。此外，系统性HD IL-2处理可诱发显著毒性，还限制其临床相关性。IL-2在体外促进T细胞和NK细胞的激活和扩增。在一个实施方案中，IL-2或其功能变体可被工程化以从TIL表达和分泌。这样的TIL还可以被改造以分泌额外的转基因。
CD40L：作为免疫共刺激分子，CD40和其配体CD40L可以相互补充。此前的研究表明，CD40和CD40L在体液和细胞免疫中起着关键作用，CD40和CD40L的表达与各种疾病的发生和发展密切相关(Elgueta等人，Immunol Rev 2009；229:152-172)。CD40被发现在膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌和其他肿瘤中高度表达(Hussain等人，Br J cancer 2011；88:586)。CD40L作为CD40的主要配体，主要表达于活化的CD4+T细胞表面。当CD40与CD40L结合时，CD40L可以激活T淋巴细胞和Fas介导的肿瘤细胞凋亡途径。
在另一方面，上述经基因修饰的淋巴细胞可以并入适于施用的药物组合物中。所述药物组合物通常包含基本上分离/纯化的淋巴细胞和适于对受试者施用形式的医药上可接受的载体。医药上可接受的载体部分由正在施用的特定组合物和用于施用所述组合物的特定方法来确定。所述药物组合物通常是完全按照美国食品和药物管理局的所有良好操作规范(GMP)规定配方制造的。
术语“医药上可接受”、“生理上可耐受”指的是可以互换使用的组合物、载体、稀释剂和试剂，包括能够施用于或施用到受试者上的材料，不会产生程度达到禁止施用所述组合物的不良生理效应。例如，“医药上可接受的赋形剂”包括可用于制备通常安全、无毒且合意的药物组合物的赋形剂，并且包括可接受用于兽医用途和人类医药用途的赋形剂。
此类载体或稀释剂的示例包括但不限于水、盐水、林格氏液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。此类介质和化合物用于医药活性物质的用途在本领域是众所周知的。除非任何常规介质或化合物与所公开的组合物不相容，否则可以预期其在所述组合物中的用途。在一些实施方案中，诸如抗癌或抗肿瘤的第二治疗剂也可以并入药物组合物中。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散体和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物必须是无菌的，并且应该是以易于注射程度存在的液体。它必须在制造和储存条件下保持稳定，并且必须防止细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以保持合适的流动性，例如，通过使用卵磷脂等涂层，在分散的情况下保持期望的粒径，和通过使用表面活性剂。
在一些实施方案中，所述组合物包括上述的基因修饰的淋巴细胞和任选的冷冻保护剂(例如甘油、DMSO、聚乙二醇)。
本文所述的组合物或药物组合物可以在试剂盒中提供。在一个实施方案中，所述试剂盒包括(a)包含所述组合物的容器和任选地(b)信息材料。所述信息材料可以是描述性、指导性、营销性或与本文所述方法有关的其他材料和/或为治疗收益而使用的制剂。例如，试剂盒可以包括生产说明、使用的治疗方案和施用周期。在一个实施方案中，所述试剂盒还包括附加治疗剂(例如，检查点调节剂)。所述试剂盒可以包括一个或多个容器，每个容器中装有不同的试剂。例如，所述试剂盒包括包含所述组合物的第一容器和用于额外治疗剂的第二容器。
所述容器可以包括单位剂量的药物组合物。除了所述组合物之外，所述试剂盒还可以包括其他成分，例如溶剂或缓冲液、佐剂、稳定剂或防腐剂。
所述试剂盒任选地包括适于施用所述组合物的装置，例如注射器或其他合适的递送装置。所述设备可以预先装载一种或两种药剂，也可以是空的，但适合装载。
B.制备组合物的方法
在另一方面，本发明还提供了制备上述组合物的方法。所述方法包括：(a)提供多个淋巴细胞；(b)向所述多个淋巴细胞引入编码至少两个转基因的核酸分子，以获得多个基因修饰的淋巴细胞；和(c)在细胞培养基中扩增所述多个基因修饰的淋巴细胞。
在一些实施方案中，所述方法可以包括：(a)提供多个淋巴细胞；(b)向所述多个淋巴细胞引入两个或多个核酸分子，所述两个或多个核酸分子中的每一个编码至少一个转基因，从而获得多个基因修饰的淋巴细胞；和(c)在细胞培养基中扩增所述多个基因修饰的淋巴细胞。
在一些实施方案中，所述转基因包含PD-1诱饵、IL-2变体/片段、LIGHT或其变体/片段、IL-33或其变体/片段和CD40L或其变体/片段中的两个或多个。在一些实施方案中，所述转基因还包含tEGFR或其变体/片段。在一些实施方案中，PD-1诱饵或其变体/片段和tEGFR或其变体/片段(或tHER2或其变体/片段、CD20或其变体/片段、或CD19或其变体/片段)被包含在同一载体上。
在一些实施方案中，所述至少两个转基因包括：(a)PD-1诱饵或其变体和tEGFR或其变体；(b)PD-1诱饵或其变体和IL-2变体；(c)PD-1诱饵或其变体和LIGHT或其变体；(d)PD-1诱饵或其变体和IL-33或其变体；(e)PD-1诱饵或其变体和CD40L或其变体；(f)PD-1诱饵或其变体、IL-2变体和IL-33或其变体；(g)PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和IL-2变体；(h)PD-1诱饵或其变体，tEGFR或其变体，和LIGHT或其变体；(i)PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体、IL-33或其变体；(j)PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体、CD40L或其变体；(k)PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体、IL-2变体和IL-33或其变体；(l)PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体、IL-2变体和CD40L或其变体；或(m)PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体、IL-33变体和CD40L或其变体。
在一些实施方案中，所述方法可以包括：(a)将编码至少两个转基因的第一核酸分子引入第一多个淋巴细胞，以获得第一多个基因工程淋巴细胞；和(b)将编码至少两个转基因的第二核酸分子引入第二多个淋巴细胞，以获得第二多个基因工程淋巴细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括以约1:1和约1:100之间(例如，1:1、1:2、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100)的预定比例将第一多个基因工程淋巴细胞与第一多个基因工程淋巴细胞组合。
在一些实施方案中，所述方法包括：a)在不同的淋巴细胞亚群中引入转基因，其中每个亚群至少表达一个转基因，和b)将至少两个淋巴细胞亚群结合。在一些实施方案中，每个亚群至少表达根据上述实施方案的两个转基因。在一些实施方案中，所述淋巴细胞的组合物至少表达三种不同的转基因。
在一些实施方案中，获得上述肿瘤特异性基因修饰的淋巴细胞亚群的组合物的方法可在体外或离体进行。更具体形式的方法可以如PCT/EP2018/080343中的公开，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，所述方法可以另外包括在引入第一核酸的步骤后在细胞培养基中扩增第一多个淋巴细胞，或在引入第二核酸的步骤后在细胞培养基中扩增第二多个淋巴细胞。
术语“培养”或“扩增”指在细胞可以增殖同时避免衰老的条件下维持或培养细胞。例如，细胞可以在任选含有一种或多种生长因子(即生长因子鸡尾酒)的培养基中培养。在一些实施方案中，所述细胞培养基是确定的细胞培养基。所述细胞培养基可以包括新抗原肽。可以建立稳定的细胞系，以允许细胞继续繁殖。
a.淋巴细胞
在本文所述淋巴细胞的扩增和基因修饰之前，获得来自受试者来源的淋巴细胞。淋巴细胞可以从多种来源获得，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。如本文所述，可以使用任何数量的本领域可用的淋巴细胞系。淋巴细胞可以使用任何数量的本领域技术人员已知的技术，例如FicollTM分离，从受试者采集的一单位血液中获得。个体的循环血细胞通过单采获得。单采产物通常含有淋巴细胞，包括T淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、B淋巴细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。通过单采获得的细胞可以清洗，以去除血浆部分，并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中，用于后续处理步骤。所述细胞可以用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。可选地，洗涤溶液可以缺少钙，可以缺少镁，或者可以缺少许多(不是全部)二价阳离子。正如本领域普通技术人员容易理解的那样，清洗步骤可以通过本领域技术人员已知的方法实现，例如根据制造商的说明书使用半连续式自动流动离心机(例如，Cobe 2991 cell processo、Baxter CytoMate或e1Haemonetics cell Saver 5)。洗涤后，细胞可以在多种生物相容性缓冲液中再悬浮，例如，无Ca2+、无Mg2+的PBS、勃脉力A(PlasmalyteA)或其他含或不含缓冲液的盐水溶液。可选地，可以去除单采样品中不需要的成分，并将细胞直接重新悬浮在培养基中。
如本文所述，淋巴细胞可通过红细胞裂解和单核细胞的消耗从外周血中分离，例如通过PERCOLLTM梯度离心或逆流离心洗脱。如果需要，还可以通过阳性或阴性选择技术分离特定亚群的淋巴细胞，例如T淋巴细胞(即Cd3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+或CD45RO+T淋巴细胞)。例如，T淋巴细胞可以通过与抗CD3/抗CD28偶联磁珠(即3x28)孵育来分离，例如
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M-450 CD3/CD28 T，孵育时间足够长(即30分钟到24小时)，以阳性选择期望的T淋巴细胞。对于从白血病患者中分离T淋巴细胞，使用更长的孵育时间(例如24小时)可以增加细胞性能。与其他细胞类型相比，任何T淋巴细胞较少的情况，例如从肿瘤组织或免疫功能低下的个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，都可以使用更长的培养时间来分离T淋巴细胞。本领域技术人员认识到，也可以使用多轮选择。执行选择程序，在激活和扩增过程中使用‘未选择’的细胞可以是合意的。“未选择的”细胞也可以进行新一轮的选择。
通过阴性选择富集淋巴细胞群(例如T淋巴细胞)可以使用针对阴性选择细胞的独特表面标记的抗体组合进行。一种方法是通过负磁免疫粘附或流式细胞术，使用针对负选择细胞中存在的细胞表面标志物的单克隆抗体鸡尾酒，对细胞进行分选和/或选择。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体通常包括抗CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。可选地，通过抗C25偶联磁珠或其他类似选择方法消耗调节性T淋巴细胞。
用于刺激的淋巴细胞也可以在清洗步骤后冷冻。不希望受到理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过消除细胞群中的粒细胞和某种程度上的单核细胞，提供了一种更均匀的产物。清洗步骤去除血浆和血小板后，细胞可以悬浮在冷冻溶液中。尽管本领域已知许多溶液和冷冻参数，并且在这种情况下将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％的右旋糖酐40和5％的葡萄糖人白蛋白和7.5％的DMSO或31.25％的PlasmalyteA、31.25％的5％葡萄糖、0.45％的NaCl、10％右旋糖酐40和5％葡萄糖的培养基，20％的人白蛋白血清和7.5％的DMSO的培养基或其他含有例如Hespan和PlasmaLyteA的合适的细胞冷冻培养基。然后可将细胞以每分钟1℃的速率在-80℃下冷冻，并储存在液氮储罐的汽相中。可以使用其他受控冷冻方法，也可以在-20℃或液氮中立即进行非受控冷冻。
冷冻保存的细胞可以按本文所述解冻和洗涤，并在使用本发明所述的方法激活前在室温下静置一小时。如本文所述，淋巴细胞可以被扩增、冷冻并在以后使用。如本文所述，可以在诊断为如本文所述的特定疾病后不久，但在任何治疗之前从患者收集样本。在任何数量的相关治疗模式之前，可以从受试者的血样或单采中分离细胞，包括但不限于使用诸如那他珠单抗、依法利珠单抗、抗病毒剂、化疗、放疗、免疫抑制剂(immunosuppressiveagents)例如环孢素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其他免疫消融剂(immunoablatories)例如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228和辐射。这些药物抑制钙依赖性钙调神经磷酸酶(例如环孢素和FK506)或抑制对生长因子(雷帕霉素)诱导的信号传导非常重要的p70S6激酶(Liu等人，Cell 66:807-8151991；Henderson等人，Immun 73:316-321，1991，Bierer等人，Curr.Opin.Immun.，5:763-773，1993)。这些细胞可以从患者身上分离出来，并冷冻起来，以便以后与骨髓或干细胞移植、使用化疗药物(如氟达拉滨)、放射治疗外照射(XRT)、环磷酰胺或抗体(如OKT3或CAMPATH)进行T淋巴细胞消融术治疗(例如，在移植之前、同时或之后)一起使用。如本文所述，可以在治疗前分离细胞，并可以冷冻细胞以在B淋巴细胞消融治疗(例如与CD20反应的试剂(例如利妥昔单抗))后的处理中使用。
在对淋巴细胞(例如T淋巴细胞)进行基因修饰以表达期望的转基因之前或之后，通常可以使用诸如美国专利6352694、6534055、6905680、6692964、5858358、6887466、6905681、7144575、7067318、7172869、7232566、7175843、5883223、6905874、6797514、6867041，和专利号为20060121005的美国专利申请公布中所述方法激活和扩增淋巴细胞。
b.载体
转基因可以通过各种方法导入淋巴细胞。这些方法包括但不限于使用整合活性γ-逆转录病毒或慢病毒进行细胞转导，和DNA转位。
多种载体可以用于转基因的表达。某些病毒通过受体介导的内吞作用感染细胞或进入细胞，并整合到宿主细胞基因组并稳定高效地表达病毒基因的能力，使它们成为将外源核酸转移到细胞中的诱人候选病毒。因此，在某些实施方案中，使用病毒载体将编码一个或多个转基因或其片段的核苷酸序列引入宿主细胞以进行表达。所述病毒载体可以包含编码一个或多个可操作地连接到一个或多个控制序列(例如启动子)的转基因或其片段的核苷酸序列。可选地，所述病毒载体可以不包含控制序列，而是依赖宿主细胞内的控制序列来驱动转基因或其片段的表达。可以用于递送核酸的病毒载体的非限制性示例包括腺病毒载体、AAV载体和逆转录病毒载体。
例如，腺相关病毒(AAV)可用于将编码一个或多个转基因或其片段的核苷酸序列引入宿主细胞以进行表达。AAV系统已经在前面描述过，并且在本领域中是众所周知的(Kelleher andVos，Biotechniques，17(6)：1110-71994；Cotten等人，Proc Natl Acad SciUSA,89(13):6094-6098,1992；Curiel,Nat Immun,13(2-3):141-64,1994；Muzyczka，Curr-Top Microbiol Immunol，158:97-1291992)。例如，第5139941号和4797368号美国专利中描述了有关rAAV载体的生成和使用的细节，每个专利均通过引用完整并入本文用于所有目的。
在一些实施方案中，逆转录病毒表达载体可以用于将编码一个或多个转基因或其片段的核苷酸序列引入宿主细胞以进行表达。这些系统已经在前面描述过，并且在本领域中是众所周知的(Nicolas and Rubinstein,In,Rodriguez and Denhardt,eds.,Stoneham:Butterworth,pp.494-513,1988；Temin,In:Gene Transfer,Kucherlapati(ed.),NewYork:Plenum Press,pp.149-188,1986)。在哺乳动物细胞中进行真核表达的载体包括AD5、pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等，和使用例如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV和β-肌动蛋白等启动子从例如痘苗病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等病毒系统衍生的载体。
逆转录病毒和合适的包装系的组合也可以被使用，衣壳蛋白将在感染目标细胞方面发挥作用。通常，细胞和病毒将在培养基中孵育至少24小时。然后，在某些应用中，允许细胞在在分析之前在培养基中短时间生长，例如24-73小时，或至少两周，也允许细胞生长五周或更长时间。常用的逆转录病毒载体有“缺陷”，即无法产生生产性感染所需的病毒蛋白。载体的复制需要在包装细胞系中生长。逆转录病毒的宿主细胞特异性由包膜蛋白env(pl20)确定。所述包膜蛋白由包装细胞系提供。包膜蛋白至少有三种类型，即嗜生态型、双嗜性型和异嗜性型。包装有嗜生态型包膜蛋白的逆转录病毒，例如MMLV，能够感染小鼠和大鼠大多数细胞类型。嗜生态型包装细胞系包括BOSC23。携带双嗜性包膜蛋白，例如4070A的逆转录病毒能够感染大多数哺乳动物，包括人类、狗和小鼠的细胞类型。双嗜性包装细胞系包括PA12和PA317。包装有异嗜性包膜蛋白的逆转录病毒，例如AKR env，能够感染除小鼠细胞外的大多数哺乳动物细胞类型。载体可以包括随后必须移除的基因，例如使用重组酶系统，例如Cre/Lox，或表达它们的细胞(例如，通过包括允许选择性毒性的基因，例如疱疹病毒TK、BCL-xs等)来摧毁的基因。合适的诱导型启动子在期望的靶细胞类型中被激活，无论是转染细胞还是其后代。
用于本发明所述载体的非限制性示例包括逆转录病毒载体SFG.MCS和辅助质粒RD114、Peg-Pam3(Arber等人，J Clin Invest 2015 Jan 2；125(1):157-168),lentiviralvector pRRL,and helper plasmids R8.74 and pMD2G(e.g.,Addgene Plasmid#12259)、慢病毒载体pRRL和辅助质粒R8.74和pMD2G(例如Addgene质粒#12259)。在一些实施方案中，可以使用睡美人转座子系统(Deniger等人，2016Mol Ther.Jun；24(6)：1078-1089)。在一些实施方案中，转基因可以通过在细胞穿过小开口时使其变形、破坏细胞膜并允许材料插入细胞中而被引入细胞，例如电穿孔法(Xiaojun等人，2017 Protein Cell,8(7):514-526)或Cell
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法。这种编码转基因的RNA的电穿孔方法允许这种转基因在细胞中瞬时表达，从而限制工程细胞的毒性和其他不良影响(Barrett等人，2011 Hum Gene Ther.Dec；22(12)：1575-1586)。
在一些实施方案中，基因组编辑技术，例如CRISPR/Cas9系统、designer zincfingers,、转录激活样效应(TALE)或归巢巨核酶，可以用于在免疫细胞中诱导转基因的表达。一般而言，“CRISPR/Cas9系统”统称为转录本和其他参与表达或指导CRISPR相关(“Cas”)基因活性的元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或tracrRNA活性部分)，tracr配对序列(包括“直接重复”和内源性CRISPR系统中tracrRNA处理的部分的直接重复)、指导序列(内源性CRISPR系统的背景下也称为“间隔区”)或来自CRISPR基因座的其他序列和转录本。CRISPR系统的一个或多个元件可以衍生自I型、II型或III型CRISPR系统。可选地，CRISPR系统的一个或多个元素可以来自包含内源性CRISPR系统的特定生物体，例如化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。一般来说，CRISPR系统的特征是在靶序列(在内源性CRISPR系统的背景下也称为前间隔序列)的位点促进CRISPR复合物的形成。
在一些实施方案中，通过用编码一个或多个转基因或其功能片段和CA9或其功能片段的载体(例如慢病毒载体)转染淋巴细胞来引入基因修饰。在一些实施方案中，可以使用一个、两个或多个载体将一个或多个转基因或其功能片段和CA9或其功能片段引入免疫细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。生产包含外源载体和/或核酸的细胞的方法在本领域是众所周知的。例如，Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,NewYork)。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、微珠，和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内释放载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体为脂质体。脂质制剂用于将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可与脂质相关。与脂质相关联的核酸可以被包裹在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸相关联的结合分子与脂质体结合，包埋在脂质体中，与脂质体形成复合物，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质结合，以悬浮液形式包含在脂质、内容物中或在与胶束形成的复合物中，或以其他方式与脂质结合。与脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以存在于双层结构中，如胶束或具有“折叠”结构。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，可以是天然的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴，和含有长链脂肪烃及其衍生物的化合物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二苯乙烯基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从密苏里州圣路易斯的Sigma获得；双十六烷基磷酸酯(“DCP”)可以从K&K实验室(纽约州普莱恩维尤)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从Avanti Polar Lipids公司(伯明翰，亚拉巴马州)获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质储备溶液可以在约-20℃储存。氯仿作为唯一溶剂使用，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是一个通用术语，包括由双层或封闭脂质聚集体形成的各种独特的多层脂质载体。脂质体可以被描述为具有囊泡结构，具有磷脂双层膜和内部水介质。多层脂质体由多层脂质通过水介质分离而成。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。在形成封闭结构之前，脂质成分经历了自我重排，并在脂质双层之间捕获溶解水和溶质(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5:505-10)。然而，也包括在溶液中具有不同于正常囊泡结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构，或者只是作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了Lipofectamine-核酸复合物。
无论采用何种方法将外源核酸引入宿主细胞，宿主细胞中是否存在重组DNA序列都可以通过一系列测试来确认。此类检测包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”检测，例如Southern和Northern杂交、RT-PCR和PCR；生物化学检测，例如测定特定肽的存在或不存在，例如通过免疫手段(ELISA和Western blot)或通过本文所述的检测以识别本发明范围内的药剂。
C.治疗方法
本发明还提供了一种治疗癌症或肿瘤的方法。所述方法包括向需要的受试者施用有效治疗量的上述组合物或药物组合物。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用，无论受试者是否已经或正在接受任何形式的治疗。如本文所用，术语“受试者(subject)”和“受试者(subjects)”可以指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如，牛、猪、骆驼、骆驼、羊驼、马、山羊、兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人灵长类动物(例如，猴子，例如食蟹猴、黑猩猩等)和人类)。受试者可能是人类或非人类。在更示范性的方面，哺乳动物是人类。
在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述受试者患有癌症。在一些实施方案中，所述受试者免疫耗尽。
如用于描述本发明的，“癌症”、“肿瘤”和“恶性肿瘤”均等同于组织或器官的增生。如果所述组织是淋巴或免疫系统的一部分，恶性细胞可以包括循环细胞的非实体瘤。其他组织或器官的恶性肿瘤可以产生实体瘤。本发明的所述方法可以用于治疗淋巴细胞、循环免疫细胞和实体瘤。
可以治疗的癌症包括未血管化或实质上未血管化的肿瘤，和血管化肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(如血液肿瘤，如白血病和淋巴瘤)或可以包括实体瘤。可以用本发明所述组合物治疗的所述癌症类型包括但不限于癌、母细胞瘤和间质细胞癌，和某些白血病或恶性淋巴肿瘤、良恶性肿瘤和恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。还包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
血液癌是血液或骨髓的癌症。血液的(或血源性)癌症的示例包括白血病，包括急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性髓性(myelocytic)白血病、急性髓细胞(myelogenous)白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红细胞白血病)、慢性白血病(如慢性髓性(粒细胞)白血病、慢性髓细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病)，真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓发育不良。
实体瘤是通常不含囊肿或液体区域的异常组织肿块。实体瘤可以是良性的，也可以是恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤，例如肉瘤和癌，包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和中枢神经系统肿瘤(如胶质瘤)(如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)，胶质母细胞瘤(也包括星形细胞瘤、中枢神经系统淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。
在一些实施方案中，所述癌症选自黑色素瘤、肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、微卫星高度不稳定型肿瘤、头颈部肿瘤、肾癌和乳腺癌。
所述药物组合物如上所述可以适合于待治疗(或预防)疾病的方式施用。施用的数量和频率将由患者的病情、患者疾病的类型和严重程度等因素决定，尽管合适的剂量可以通过临床试验确定。
当指示“免疫有效量”、“有效抗肿瘤量”、“有效肿瘤抑制量”或“治疗量”时，可由医师考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和患者的情况(受试者)的个体差异来确定要施用的本发明所述组合物的精确量。通常可以说明，包含本文所述淋巴细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/千克体重(例如105至106个细胞/千克体重)的剂量施用，包括这些区间内的所有整数值。在这些剂量下，淋巴细胞组合物也可以多次施用。可以使用免疫治疗中常见的输注技术施用于细胞(例如，见Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。医学领域的技术人员可以通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗，轻松确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
本发明所述组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括输注或注射(即，静脉注射、鞘内注射、肌肉注射、管腔内注射、气管内注射、腹腔注射或皮下注射)、经皮给药或本领域已知的其他方法。可以每两周施用一次、一周施用一次或更频繁，但在疾病或紊乱的维持阶段，施用频率可能会降低。在一些实施方案中，通过静脉输注施用所述组合物。
在某些情况下，使用本文所述方法或本领域已知的其他方法(其中淋巴细胞扩增至治疗水平)激活和扩增的细胞与(例如，在之前、同时或之后)任何数量的相关治疗模式一起施用给患者。本文还描述了淋巴细胞可以与化疗、放疗、免疫抑制剂例如环孢素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其他免疫消融剂，例如CAMPATH、抗癌抗体CD3或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射结合使用。
本发明所述组合物还可以与在骨髓移植(例如，之前、同时或之后)使用化疗剂(例如氟达拉滨)、放射治疗外照射(XRT)、环磷酰胺或抗体(例如OKT3或CAMPATH)进行T淋巴细胞消融术治疗一起施用于患者。本文中还描述了，所述组合物可以在B淋巴细胞的消融治疗后施用，例如与CD20反应的试剂，例如利妥昔单抗。例如，受试者可以接受高剂量化疗的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些情况下，移植后，受试者接受扩增后的淋巴细胞的输注，或在手术前后施用扩增后的淋巴细胞。
在一些实施方案中，所述方法还可以包括向受试者施用第二治疗剂。所述第二治疗剂是抗癌或抗肿瘤剂。在一些实施方案中，所述组合物在所述第二治疗剂(包括化疗剂和免疫治疗剂)之前、之后或伴随施用于受试者。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用有效治疗量的免疫检查点调节剂。免疫检查点调节剂的示例可以包括PD1、PDL1、CTLA4、TIM3、LAG3和TRAIL。所述检查点调制器可以与本发明的组合物同时、单独或伴随施用。
“化疗剂”是一种用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的示例包括烷基化剂，例如硫替帕和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类药物，如苯佐替派、卡波醌、甲基多巴和乌瑞替派；乙烯亚胺和甲胺，包括六甲密胺、三乙密胺、三聚磷酰胺、三乙烯硫膦酰胺和三羟甲密胺；乙酰精宁(尤其是布拉它辛和拉它辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓虫素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡泽来新和比折来新合成类似物)；隐藻素(尤其是隐藻素1和隐藻素8)；海兔毒素；duocarmycin(包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑制素；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、melphalan,、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；如nitrosureas、卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀等；抗生素，如烯二炔类抗生素(例如卡奇霉素，参见，例如，AgnewChem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994)；达内霉素，包括达内霉素A；埃斯培拉霉素；和新制癌菌素生色团和相关的生色蛋白烯二炔类抗生素生色团)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡拉比星、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素(chromomycin)、更生霉素、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泛霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁多柔比星(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷，5-FU；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)、丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯；抗肾上腺素，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲络司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；贝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲酯(edatraxate)；去氧胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依法磷酸(elfornithine)；依利醋氨；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；类美登素(maytansinoids)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫吡坦(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitrarine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
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丙亚胺(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其是T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、漆斑菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加息托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇(
Figure BDA0003710138170000382
Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)和多西他赛(doxetaxel)(
Figure BDA0003710138170000383
Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；去甲长春花碱(Navelbine)；米托恩醌；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；卡培他滨；和上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此定义中还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药，例如抗雌激素药和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、可莫昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和抗雄激素，例如氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和希罗达、吉西他滨、KRAS突变体共价抑制剂和戈舍瑞林；和上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。其他示例包括伊立替康、奥沙利铂和其他标准结肠癌方案。
“免疫治疗剂”可以包括用于治疗癌症的生物制剂。在一些实施方案中，所述免疫治疗剂可以包括免疫检查点抑制剂(例如，PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、VISTA、DKG-α、B7-H3、B7-H4、TIGIT、CTLA-4、BTLA、CD160、TIM1、IDO、LAIR1、IL-12或其组合的抑制剂)。所述免疫治疗剂的示例包括阿替利珠单抗、阿维单抗、博纳吐单抗、达雷妥尤单抗、西米普利单抗、德瓦鲁单抗、埃罗妥珠单抗、laherparepvec、伊匹单抗、纳武单抗、奥比妥珠单抗、奥法木单抗、pembrolizumab、西妥昔单抗和talimogene。
D.定义
为了帮助理解根据本发明所述的组合物和方法的具体实施方式，提供了一些明确的定义，以便于无歧义地公开本发明的各个方面。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献提供了本发明中许多术语的一般定义：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)；《剑桥科技词典》(沃克出版社，1988年)；遗传学词汇表，第五版，R.Rieger等人(编辑)，Springer Verlag(1991)；Hale&Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology(1991年)。如本文所用，除非另有规定，以下术语具有下文所赋予的含义。
如本文所用，“表达”指从DNA模板转录多核苷酸的过程(例如转录成mRNA或其他RNA转录本)和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录本和编码的多肽可以统称为“基因产物”如果所述多核苷酸来源于基因组DNA，则表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。
如本文所用，所述术语“重组体”指通过引入外源核酸分子而修饰的细胞、微生物、核酸分子或载体，或具有内源性核酸分子或基因的受控表达的细胞、微生物、核酸分子或载体。下调或改变为组成性改变，这种改变或修饰可以通过基因工程引入。例如，基因改变包括通过引入编码一种或多种蛋白质或酶的核酸分子(可以包括表达控制元件，如启动子)进行修饰，或添加、删除、替换另一种核酸分子，或细胞遗传物质的其他功能性破坏或功能性增加。示例性修饰包括衍生自参考分子或母体分子或其功能片段的异源或同源多肽的编码区中的修饰。
所述“转基因”或“治疗性转基因”，是指从可溶性受体、诱饵、诱饵受体、显性负性突变体、微环境调节剂、酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转位酶、激酶、转运体、修饰物、分子伴侣、离子通道、抗体、细胞因子、生长因子、趋化因子、激素、DNA、核酶、生物传感器、表观遗传修饰物、转录因子、编码RNA、非编码RNA、小RNA、长RNA、IRES元件或外泌体来源RNA。
本文所使用的术语“功能性变体”是指与野生型转基因具有实质性或显著序列一致性或相似性的修饰转基因，这种功能性变体保留其为变体的野生型转基因的生物活性。在一些实施方案中，使用转基因的功能变体。
本文所使用的术语“抗原识别受体”指能够激活免疫细胞(例如T细胞)以响应抗原结合的受体。示例性抗原识别受体可以是天然的或基因工程的TCR，或基因工程的TCR样mAbs(Hoydahl等人，Antibodies 20198:32)或其中肿瘤抗原结合域与能够激活免疫细胞(例如T细胞)的细胞内信号域融合的CAR。表达针对特定癌症抗原的天然TCR的T细胞克隆此前已被公开(Traversari等人，J Exp Med，1992 176:1453-7；Ottaviani等人，CancerImmunol Immunother,2005 54:1214-20；Chaux等人，J Immunol，1999 163:2928-36；Luiten and van der Bruggen，Tissue Antigens，2000 55:149-52；van der Bruggen等人，Eur J Immunol，1994 24:3038-43；Huang等人，J Immunol，1999 162:6849-54；Ma等人，Int J Cancer，2004 109:698-702；Ebert等人，Cancer Res，2009:1046-54；Ayyoub等人，JImmunol 2002 168:1717-22；Chaux等人，European Journal of Immunology，2001 31:1910-16；Wang等，Cancer Immunol Immunother，2007 56:807-18；Schultz等人，CancerResearch,2000 60:6272-75；Cesson等人,Cancer Immunol Immunother,2010 60:23-25；Zhang等，Journal of Immunology,2003 171:219-25；Gnjatic等人，PNAS，2003 100:8862-67；Chen等人，PNAS，2004)。在一个实施方案中，可以对此类TCR进行测序并将其基因工程化到TIL中，以用于过继性细胞治疗。在某些方面，识别MAGE-A1抗原、MAGE–A3抗原、MAGEA-10抗原、MAGE-C2抗原、NY-ESO-1抗原、SSX2抗原和MAGE-A12抗原的TCR可以基因工程化到TIL中，用于过继细胞治疗。在另一些实施方案中，带有TCR的基因工程化TIL还被工程化以分泌转基因。在其他实施方案中，使用CAR。在其他实施方案中，CAR还被改造以分泌转基因。
如本文所用，术语“抗体”不仅指完整的抗体分子，还指保留免疫原结合能力的抗体分子片段。此类片段在本领域中也是众所周知的，并且在体外和体内都经常使用。因此，如本文所用，术语“抗体”不仅指完整的免疫球蛋白分子，还指众所周知的活性片段f(ab′)2和fab.F(ab′)2和缺乏完整抗体的Fe片段的fab片段，从循环中清除得更快，并且可以与完整抗体的非特异性组织结合更少(Wahl等人，J.Nucl.Med.24:316-325(1983)。本发明的抗体包括全天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；fab，fab′，单链v区片段(scFv)，融合多肽和非常规抗体。
如本文所用，术语“单链可变片段”或“scFv”是免疫球蛋白重链(VH)和轻链(VL)可变区域的融合蛋白，共价连接以形成VH:：VL异二聚体。重链(VH)和轻链(VL)要么直接连接，要么通过肽编码连接子(例如，10、15、20、25个氨基酸)连接，连接VH的n端和VL的C端，或者VH的C端和VL的n端。连接子通常富含甘氨酸，以增加柔韧性，和丝氨酸或苏氨酸，以增加溶解性。尽管去除了恒定区并引入了连接子，但scFv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。如Huston等人所述，单链Fv多肽抗体可以从包含VH和VL编码序列的核酸中表达(Proc.Nat.Acad.Sci.，85:5879-58831988)。美国专利号5091513、5132405和4956778；和美国专利公开号20050196754和20050196754也可见。具有抑制活性的拮抗性单链抗体已经被描述(参见，例如，Zhao等人，Hybridoma(Larchmont)2008 27(6)：455-51；Peter等人，Jcachexia sarcopenia muscle 2012 Aug.12；Shieh等人，J Immunol 2009 183(4):2277-85；Giomarelli等人，Thromb Haemost 2007 97(6):955-63；Fife等人，J Clin Invst 2006116(8):2252-61；Brocks等人，Immunotechnology 1997 3(3):173-84；Moosmayer等人，Ther Immunol 1995 2(10:31-40)。具有刺激活性的激动性单链抗体已经被描述(参见Peter等人，J Bioi Chern 2003 25278(38)：36740-7；Xie等人，Nat Biotech 1997 15(8)：768-71；Ledbetter等人，Crit Rev Immunol 1997 17(5-6)：427-55；Ho等人，BiochimBiophysActa 2003 1638(3):257-66)。
本文所用的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指向患有紊乱(disorder)的受试者施用化合物或药物，目的是治疗、减轻、缓解、补救、延迟紊乱的发生、预防或改善紊乱、紊乱的症状、继发于紊乱的疾病(disease)状态或对紊乱的倾向。
在免疫应答的背景下，术语“激发”或“增强”指触发或增加免疫应答，例如免疫细胞靶向和/或杀死癌细胞或靶向和/或杀死病原体和病原体感染细胞(例如，EBV阳性癌细胞)的能力增加。
本文使用的术语“免疫应答”指任何类型的免疫应答，包括但不限于先天免疫应答(例如，激活Toll受体信号级联)，细胞介导的免疫应答(例如，由T细胞(例如，抗原特异性T细胞)和免疫系统的非特异性细胞介导的应答)和体液免疫应答(例如，由B细胞介导的应答(例如，通过产生和分泌抗体进入血浆、淋巴和/或组织液)。术语“免疫应答”是指包括受试者免疫系统对抗原和/或免疫原应答能力的所有方面(例如，对免疫原(例如病原体)的初始应答和适应性免疫应答产生的获得性(例如记忆)应答)。
如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中发生的事件，例如试管或反应容器、细胞培养等，而不是在多细胞生物体内。
如本文所用，术语“体内”指在多细胞生物体内发生的事件，例如非人类动物。
本文中使用的术语“疾病”通常与术语“紊乱”和“状况”(如在医疗状况中)是同义词，可与之互换使用，因为它们都反映了人体或动物身体或其损害正常功能的一个部位的异常状况，通常通过区别体征和症状来表现，并导致人类或动物的寿命或生活质量降低。
本文使用的术语“降低(decrease)”、“减少(reduced)”、“减少(reduction)”、“减少(decrease)”或“抑制”通常均指统计显著量的降低。然而，为免生疑问，“减少(reduced)”、“减少(reduction)”或“降低”或“抑制”指与对照水平相比降低至少10％，例如，降低至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或高达并包括100％的降低(例如，与对照样品相比缺失水平)，或任何与对照水平相比在10-100％之间的降低。
如本文所用，术语“调节”意指生物状态的任何变化，即增加、降低等。
本文使用的术语“增加(increased)”、“增加(increase)”或“增强”或“激活”通常均指静态显著量的增加；为避免任何疑问，术语“增加(increased)”、“增加(increase)”或“增强”或“激活”指与对照水平相比至少增加10％，例如至少增加约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％，或与对照水平相比至少约90％或高达并包括100％的增加或10-100％之间的任何增加，或与对照水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加，或在2倍和10倍之间或10倍以上的任何增加。
术语“有效量(effective amount)”、“有效剂量(effective dose)”或“有效剂量(effective dosage)”被定义为足以达到或至少部分达到预期效果的量。药物或治疗剂的“有效治疗量”或“有效治疗剂量”是指当单独使用或与另一种治疗剂结合使用时，通过疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期的频率和持续时间的增加，促进疾病消退的任何药物量，或预防由于感病性造成的损伤或残疾。药物的“有效预防量”或“有效预防剂量”是指当单独或与另一种治疗剂联合施用于有发展为疾病或疾病复发风险的受试者时，抑制疾病发展或复发的药物量。治疗或预防剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力可使用技术熟练者已知的各种方法进行评估，例如在临床试验期间对人体受试者进行评估，在预测人类疗效的动物模型系统中进行评估，或通过在体外测试中测试所述药剂的活性进行评估。
剂量通常表示为与体重有关。因此，以[g，mg，或其他单位]/kg(或g，mg等)表示的剂量通常指的是[g，mg，或其他单位]“每千克(或g，mg等)体重”，即使没有明确提及“体重”一词。
术语“药剂”在本文中用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子(例如核酸、抗体、蛋白质或其部分，例如肽)或由生物材料，例如细菌、植物、真菌或动物(尤其是哺乳动物)细胞或组织制成的提取物。此类药剂的活性可能使其适合作为“治疗剂”，即在受试者体内局部或全身起作用的生物、生理或药理学活性物质。
术语“治疗剂”、“具有治疗能力的药剂”或“治疗剂”可以互换使用，指的是施用于受试者后赋予某种有益效果的分子或化合物。所述有益效果包括启用诊断测定；疾病、症状、紊乱或病理状况的改善；减少或预防疾病、症状、紊乱或状况的发生；通常抵抗疾病、症状、紊乱或病理状况。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的“联合”疗法旨在包括以协调方式施用两种或两种以上治疗剂，并且包括但不限于伴随施用。具体而言，联合治疗包括联合施用(例如，联合制剂的施用或单独治疗组合物的同时施用)和连续或顺序施用，前提是一种治疗剂的施用以某种方式取决于另一种治疗剂的施用。例如，一种治疗剂只可以在施用不同的治疗剂并允许其在规定的时间段内起作用后施用。例如，见Kohrt等人，(2011)Blood117:2423。
“样本”、“测试样本”和“患者样本”可以在本文中互换使用。样本可以是血清、尿液、血浆、羊水、脑脊液、细胞(例如抗体产生细胞)或组织的样本。此类样品可以从患者处获得后直接使用，或可通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、干扰成分灭活、添加试剂等方式进行预处理，以本文所述的某种方式或本领域已知的其他方式改变样品的性质。本文所使用的术语“样品”和“生物样品”通常指被测试和/或怀疑含有感兴趣的分析物(例如抗体)的生物材料。所述样本可以是来自受试者的任何组织样本。所述样品可以包含来自受试者的蛋白质。
本文所使用的术语“抑制”和“拮抗”意指以可测量的量减少或完全防止分子、反应、相互作用、基因、mRNA和/或蛋白质的表达、稳定性、功能或活性。抑制剂是一种化合物，例如与蛋白质、基因和mRNA结合，部分或完全阻断刺激、降低、阻止、延迟激活、失活、脱敏或下调蛋白质、基因和mRNA稳定性、表达、功能和活性，例如拮抗剂。
组合物的“肠外”施用包括，例如皮下注射(s.c.)、静脉注射(i.v.)、肌肉注射(i.m.)或胸骨内注射，或输液技术。
如本文所用，术语“药物组合物”是指本发明中使用的至少一种化合物与其他化学成分，例如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂的混合物。所述药物组合物有助于向生物体施用所述化合物。
如本文所用，术语“医药上可接受”指的是一种材料，例如载体或稀释剂，其不会消除组合物的生物活性或性质，且相对无毒，即，可以将所述材料施用于个体，而不会造成不良生物效应或以有害方式与组合物所含的任何组分相互作用。
术语“医药上可接受的载体”包括医药上可接受的盐、医药上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料，涉及将本发明所述化合物携带或输送到受试者内或向受试者输送，以使其可以执行其预期功能。通常，这些化合物从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一个器官或身体的一部分。每种盐或载体必须在与配方的其他成分相容的意义上是“可接受的”，并且不对受试者造成损害。可用作医药上可接受载体的材料的一些示例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓蜡；花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；乙二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；稀释剂；造粒剂；润滑剂；粘合剂；崩解剂；润湿剂；乳化剂；着色剂；脱模剂；涂层剂；甜味剂；调味剂；香料；防腐剂；抗氧化剂、塑化剂；胶凝剂；增稠剂；硬化剂；定型剂；悬浮剂；表面活性剂；保湿剂；载体；稳定剂和用于药物制剂的其他无毒兼容物质，或其任何组合。如本文所用，“医药上可接受的载体”还包括与所述化合物的活性相容且为受试者生理上可接受的任何及所有涂层、抗菌剂和抗真菌剂、吸收延迟剂等。补充活性化合物也可以并入所述组合物。
这里需要注意的是，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“a”、“an”和“the”包括复数引用。
除非另有说明，否则所述术语“包括”、“包含”、“含有”或“具有”及其变体意指包含其后列出的项目及其等价物和附加主题。
短语“在一个实施方案中”、“在各种实施方案中”、“在一些实施方案中”等被重复使用。这些短语不必须指同一实施方案，但除非上下文另有规定，否则它们可以指代同一实施方案。
术语“和/或”或“/”是任何项目、所述项目的任何组合或与所述项目相关的全部术语。
“基本上”一词并不排除“完全”，例如，从Y中“基本上不含”的成分可以从Y中完全不含。必要时，可以从本发明的定义中省略“基本上”一词。
如本文所用，术语“大约(approximately)”或“大约(about)”应用于一个或多个感兴趣的值时，指的是与所述参照值类似的值。在一些实施方案中，术语“大约(approximately)”或“大约(about)是指落在所述参照值的任一方向上(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值的范围，除非另有说明或从上下文中明显看出(除非该数字将超过可能值的100％)。除非本文另有指示，否则术语“大约”旨在包括接近所述范围的值，例如重量百分比，就其在单个成分、组合物或实施方案的功能性而言等效。
应当理解，本文提供的值和范围，这些值和范围所包含的所有值和范围都意味着包含在本发明的范围内。此外，本申请还考虑了落在这些范围内的所有值和一个值范围的上限或下限。
如本文所用，术语“每个”用于指代项目集合时，旨在识别集合中的单个项目，但不一定指代集合中的每个项目。若明确的披露或上下文明确要求，则可能出现例外情况。
使用本文提供的任何及所有示例或示例性语言(例如，“例如”)仅旨在更好地说明本发明，且不构成对本发明范围的限制，除非另有要求。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何非权利要求保护的元素对本发明的实施至关重要。
除非本文另有说明或上下文另有明确矛盾，否则本文所述的所有方法均以任何适当的顺序进行。对于所提供的任何方法，所述方法的步骤可以同时或顺序发生。当所述方法的步骤按顺序发生时，除非另有说明，否则这些步骤可以按任何顺序发生。
在方法包括步骤组合的情况下，除非本文另有说明，否则步骤的每个组合或子组合都包含在本发明的范围内。
本文引用的每份出版物、专利申请、专利和其他参考文献，在与本公开内容不抵触时，均以引用的方式全部并入。本文公开的出版物仅用于在本发明申请日之前公开。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借先前的发明提前发布。此外，提供的发布日期可能与实际发布日期不同，这可能需要独立确认。
应当理解，本文描述的示例和实施方案仅用于说明目的，据此进行的各种修改或改变被建议给本领域技术人员，并被包括在本申请的精神和权限和所附权利要求的范围内。
E.实施例
实施例1
本示例描述了后续实施例中使用的材料和方法。
小鼠和细胞系
6周龄的雌性C57BL/6小鼠从Harlan(Harlan，荷兰)购买，并按照指南安置在洛桑大学(UNIL,Epalinges,Switzerland)的动物设施中。C57BL/6OT-1CD45.1+和C57BL/6CD8a-/-小鼠被Hogquist KA等人(Hogquist KA等人，Cell 76(1):17-27 PubMed:8287475MGI:J:92867)和Fung-Leung WP等人(Fung-Leung等人，Cell 65(3):443-9PubMed:1673361MGI:J:68956)描述。所有体内实验均按照瑞士沃州的消费者和兽医事务局(SCAV)的批准进行。
表达卵清蛋白的B16黑色素瘤细胞系(B16-OVA)以前是通过逆转录病毒转导B16产生的。F10细胞系购自ATCC，在添加10％胎牛血清(FCS)、100U/ml青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的DMEM中单层生长。细胞每周传代两次，以维持其在指数级生长条件下，并常规检测支原体污染。来源于永生化正常人胚肾(HEK)细胞的逆转录病毒生态包装细胞系Phoenix Eco保存在RPMI 1640谷氨酰胺培养基中，并添加10％热灭活FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml硫酸链霉素。
从ATCC(CRL-3216)购买人胎肾(HEK)293T细胞，并在RPMI 1640谷氨酰胺培养基(Invitrogen)、10％FBS(在56℃下热灭活30分钟；Gibco)、1％青霉素/链霉素(ThermoFisher Scientific)中培养。HEK 293T细胞用于产生逆转录病毒和慢病毒颗粒。HLA-A2.1pos/NY-ESOpos黑色素瘤细胞系Me275和A375，和HLA-A2.1pos/NY-ESOneg细胞系NA8(从UNIL Department of Oncology获得)在添加了10％FBS和1％青霉素/链霉素的IMDM中培养。
双顺反子表达盒的设计
包含MSCV长末端重复序列(LTR)的逆转录病毒载体pMSGV1(基于小鼠干细胞病毒(MSCV)的剪接gag载体)被用作所有构建体的骨架。表达盒通常编码小鼠IgG-κ链区域V-IIIMOPC 321(例如，Uniprot ID:P01650)(SEQ ID NO:20)的信号肽，然后编码小鼠PD-1的N端胞外域(例如，Uniprot ID:Q02242残基S21-Q167，C83S)(SEQ ID NO:1)与人IgG4_Fc(例如，Uniprot ID:P01861.1，残基P104-K327)(SEQ ID NO:19)融合，此处称为PD-1.IgG4诱饵。限制点AgeI和EcoRI分别位于第一部分的5'和3'端。第二部分遵循T2A序列，由小鼠干扰素β的信号肽(例如Uniprot ID:P01575.1)(SEQ ID NO:39)和编码以下分子之一的基因串组成：小鼠IL-33(例如Uniprot ID:Q8BVZ5.1，残基S109-I266)(SEQ ID NO:27)，小鼠LIGHT(例如Uniprot ID:Q9QYH9.1，残基D72-V239)(SEQ ID NO:31)，小鼠CD40L(例如，Uniprot ID:P27548，残基M112-L260)(SEQ ID NO:33)和无α突变体IL-2(例如，Uniprot ID:P60568.1，残基A21-T153，突变体：R58A、F62A、Y65A、E82A和C145S)(SEQ ID NO:23)。限制位点MluI和SalI分别位于第二部分的5'端和3'端。因此，在各自克隆后，获得了以下构建体：PD-1.IgG4_T2A_IL-2V、PD-1.IgG4_T2A_IL-33、PD-1.IgG4_T2A_LIGHT、PD-1.IgG4_T2A_CD40L和IgG4_T2A_CD40L。所有基因串均由GeneArtAG进行小鼠密码子优化和合成，所有构建体在MSGV载体中克隆后均由MicrosynthAG进行完全测序。
如图11A-C所示，编码PD1诱饵和截短EGFR的由小核糖核酸病毒衍生的2A序列分离的密码子优化基因串、CD40配体诱饵和IL-2变体从GeneArt(ThermoFisher Scientific)订购,并克隆到逆转录病毒载体pSFG(用于组成性表达)或pSFG-SIN(自失活)中，以在NFAT启动子下进行基于激活的基因表达。所述载体在Stellar感受态细胞(E.coli HST08，#636763，Takara)中扩增，并在序列确认(Microsynth AG)后用质粒mini/maxi prep试剂盒(Genomed)纯化。
编码HLA/A2:NY-ESO-1肽T细胞受体(TCR)的基因串，包括TCRα23和TCRβ13.1，从GeneArt(ThermoFisher Scientific)订购。TCRα和TCRβ链通过密码子优化，并通过小核糖核酸病毒衍生的2A序列分离。所述基因串被整合到慢病毒载体pRRL中，其中3′长末端重复序列的大部分U3区被删除，导致3′长末端重复序列(SIN)自失活。
慢病毒的生产
将10×106HEK 293T细胞接种于带有RPMI完全培养基(RPMI 1640谷氨酰胺培养基(Invitrogen)、10％FBS(Gibco)、1％青霉素/链霉素的T150细胞培养瓶中。大约24小时后(70-80％融合)，使用107μl Turbofect和2mL Optimem培养基(51985026，Invitrogen)的混合物，用7μg的pVSV-g(VSV糖蛋白表达质粒)、18μg的R874(Rev和Gag/Pol表达质粒)和15μg的pRRL转基因质粒转染细胞。在室温下孵育30分钟后，将DNA混合物添加到细胞顶部，并将体积调整至总共30ml。24小时后，更新培养基，并在转染48小时后收集病毒上清液。通过超速离心浓缩病毒颗粒，并将其重新悬浮于400μl的RPMI完全培养基中。制备每支Eppendorf管100-200μl的数个等分的病毒，并在-80℃下储存。
逆转录病毒的生产
在使用Turbofect(Thermo Fisher Scientific)转染14.4μg pCL Eco逆转录病毒包装载体和21.4μg pMSGV转移质粒24小时前，将Phoenix Eco细胞以1×107每T-150组织培养瓶接种于25ml培养基中。使用JETSTAR 2.0质粒Maxiprep试剂盒(Genomed)纯化所有质粒。对于转染混合物，在Optimem 2ml中制备3∶1比例的Turbofect：质粒，在RT下孵育30min。然后从含有80-90％融合的Phoenix Eco细胞的T-150细胞培养瓶中取出培养基，应用转染混合物并孵育1分钟，然后添加25ml新鲜培养基。转染48小时后收集病毒上清液，然后添加25ml新鲜培养基。24小时后再次进行第二次收集。用Beckman JS-24转子(BeckmanCoulter)在4℃下以24000g超速离心法将两种SN中的病毒颗粒浓缩2小时，并悬浮在0.5mL小鼠T细胞培养基中，然后测定病毒滴度。最后，将逆转录病毒等分，在干冰上冷冻，并在-80℃下储存。
在另一个实施例中，将10×106HEK 293T细胞接种在17ml的RPMI、10％胎牛血清(FBS，Gibco)、1％青霉素/链霉素(ThermoFisher Scientific)中，在37℃的T150细胞培养瓶中过夜。第二天(在85-95％融合率的293T细胞下)，制备120μl的turbofect(LifeTechnologies)和3μl的OptiMem(每T150细胞培养瓶)的混合物，然后与逆转录病毒质粒结合：22μg的PamPeg、7μg的RDF-RD114、18μg编码感兴趣基因的的SFG或SFG-SIN。轻轻地从293T细胞中取出培养基，用将逆转录病毒质粒混合物吸打到293T细胞上。休息5分钟后，再轻轻添加16ml培养基。在37℃下孵育过夜。第二天，对培养基进行更新，第二天(48小时)，通过超速离心(24000x g，2小时)从过滤的上清液中收集病毒。将新鲜培养基添加到293T细胞中，在72小时后第二次收集病毒。在这两天，制备每支Eppendorf管100-200μl的数个等分的病毒，并在-80℃下储存。
小鼠T细胞转导
原代小鼠OT-1细胞是使用小鼠用Pan T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Bioteccat#130-095-130)，从6-10周龄CD45.1+阳性的OT-1C57BL/6小鼠的分离的脾脏单细胞悬浮液中分离出来的，并在添加了10％热灭活FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、1mM丙酮酸、50μM BME和10mM非必需氨基酸的RPMI 1640谷氨酰胺培养基中培养(T细胞培养基)。
培养物的细胞密度保持在0.5-1×106个细胞/ml，每隔一天用新鲜T细胞培养基更新一次，直到第15天(培养基在第3天之前仅添加10IU/ml的人无α突变IL-2，然后再与10ng/ml的hIL-7/IL-15一同添加)。在第7天，通过细胞内流式细胞术分析评估分子的细胞表达，并通过ELISA评估其在上清液中的存在。最后，在细胞转移前根据PD-1.IgG4诱饵的转导效率调整工程化OT-1T细胞。从Miltenyi Biotec获得重组人IL-7和人IL-15。
将分离的原始OT-1T细胞以1×106/ml接种于24孔培养板的T细胞培养基中，并用αCD-3/αCD-28Ab包被的微珠(Invitrogen)和10IU/ml人类无α突变IL-2刺激。激活24小时后，首次用逆转录病毒以10倍感染率(MOI)转导T细胞。该转导在非组织培养级24孔培养板(Becton Dickinson Labware)中进行，该培养板在4℃条件下用20mg/ml的recombinantretronectin(retronectin；Takara)预包被过夜，洗涤，在RT下用2％牛血清白蛋白(BSA)在PBS中封闭30分钟，然后进行最终洗涤。添加逆转录病毒(250μl)后，在32℃下以2000xg离心培养板1.5小时。吸取125μl上清液，并将1×106个活化T细胞转移到每个包被孔中。将培养板在1200rpm下离心10分钟，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。按照上述方案，在激活后48小时进行第二次转导。第7天，通过细胞内流式细胞术分析评估分子的细胞表达，并通过ELISA评估其在上清液中的存在。最后，基于细胞转移前PD-1.IgG4诱饵的表达对工程化OT-1T细胞进行调整。
培养物的细胞密度保持在0.5-1×106个细胞/ml，每隔一天用新鲜T细胞培养基更新一次，直到第15天，按照优化的体外扩增方案生成CD44+CD62L+TCF1+中央记忆CD8 T细胞。在第3天之前，T细胞培养基中仅添加10IU/ml的人无α突变IL-2，然后再与10ng/ml的hIL-7/IL-15一起添加，直到培养结束。从Miltenyi Biotec获得重组人IL-7和人IL-15。
人T细胞的纯化和活化
根据经批准的大学机构审查委员会协议，在获得书面同意的情况下，从瑞Transfusion Interrégionale CRS SA(Epalinges，瑞士)购买了健康供者单采和血沉棕黄层。外周血单个核细胞(PBMC)采用Lymphoprep(干细胞技术)密度梯度离心制备，CD8+或CD4+T细胞采用CD8或CD4磁性微球(Miltenyi)按照制造商的方案进行负性分离。在人IL-2(GlaxoSmithKline)存在下，用抗CD3/CD28微珠(Invitrogen)以2:1的微珠：T细胞比例刺激分离的CD8+和CD4+T细胞。
人T细胞慢病毒和逆转录病毒转导
在激活24小时后，通过在培养基(MOI 20)中直接添加病毒颗粒来进行T细胞的慢病毒转导，并通过伴随添加Lentiboost(Sirion Biotech)来扩增。T细胞的逆转录病毒转导在激活后48小时进行。将T细胞转移到预先用逆转录病毒颗粒以2000×g进行自旋1.5小时的接种的retronectin-包被板上。第二天，从retronectin-包被板中取出T细胞。激活后5天移除抗CD3/抗CD28微珠(Thermo Fisher Scientific)，然后将T细胞维持在添加了10％热灭活FBS(Gibco)、1％青霉素/链霉素、10ng/ml人IL-7(Miltenyi)和10ng/ml IL-15(Miltenyi)，浓度为0.5-1×106T细胞/ml的RPMI 1640谷氨酰胺(Thermo Fisher)中。
慢病毒和逆转录病毒共转导人T细胞
对于共转导，在添加浓缩慢病毒(100μl)和可选地添加1μl Lentiboost(SirionBiotech)以提高转导效率之前，对人T细胞进行纯化和珠活化(每48孔：0.5×106T细胞+1×106抗CD3/抗CD28珠+50IU/ml IL-2)18-22小时。第二天，将转导的T细胞转移到预先用逆转录病毒颗粒以2000×g进行自旋1.5小时的接种的retronectin包被的板上。第二天，将T细胞转移到组织培养皿中。在第五天，去除珠子，将T细胞转移到更大的孔中，并提供添加有10ng/ml IL-15和10ng/ml IL-7的新鲜培养基。每2-3天提供新鲜培养基加细胞因子。从第7-10天开始，可通过流式细胞术测定共转导效率。
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的逆转录病毒转导
解冻TIL预先是从分离的患者肿瘤碎片中扩增出来。在48孔板中，在500μl RPMI、10％FBS和25μl GMP级TransAct(1:20，Miltenyi Biotech)和6000IU/ml IL-2中刺激0.5×106TIL。非组织培养板在4℃下包被retronectin(Takara Bio，将1mg/ml稀释50倍，每48孔250μl)，过夜。第二天，去除retronectin，并在37℃下用500μl RPMI、10％FBS(Gibco)、1％青霉素/链霉素封闭30分钟。随后，去除培养基，并在50μl培养基中添加50-100μl浓缩逆转录病毒，然后在25℃下2000g下旋转1小时。然后去除上清液，添加TIL，并在25℃下1000g下旋转10分钟。在37℃下孵育过夜，然后转移到48孔的组织培养板上，添加新鲜培养基。第5天，将TIL转移到更大孔的板中，并添加新鲜培养基(RPMI、10％FBS(Gibco)、1％青霉素/链霉素、6000IU/ml IL-2)。在第7-10天评估转导效率。从第5天开始，每2-3天提供一次新鲜培养基。
流式细胞术分析
所有FACS数据均在LCRII流式细胞仪(BD)上采集，并使用FlowJo软件进行分析。根据制造商关于排除死细胞的说明，使用可固定的aqua-dead染料L34965或L34975(Invitrogen)。以下抗体用于T细胞染色：抗-Vb13.1:PE(IM2292，BD Bioscience)，抗-IFNγ:PeCy7(502527，Biolegend)。四聚体(A2/NY-ESO-1157-165；内部生产)染色用于评估TCR转导效率。
流式细胞术分析以评估基因工程化T细胞的免疫调节因子的表达
将转导一周后的基因工程化OT-1T细胞与50μl Live/Dead Fixable aqua dead在室温下在PBS中孵育30分钟，洗涤，然后在4℃下用50μl FCR封闭试剂(克隆2.4G2 BDPharmingen)再次孵育30分钟。再次洗涤细胞，并在4℃下用针对抗CD3(145-2C11，Invitrogen)、CD8α(53-6.7，BioLegend)和CD45.1(A20，BioLegend)抗体的表面标志物再孵育30分钟。对于细胞内染色，使用以下抗体：用于检测PD-1.IgG4诱饵的抗人hIgG4-Fc(Abcam，克隆号：HP6025)和抗鼠IL-33(eBioscience，克隆号：396118)。表面染色后，根据制造商的建议，基因工程化的OT-1细胞清洗两次，并使用FoxP3转录因子染色缓冲液套件(Invitrogen)固定/透化。为了检测每个分子，细胞还清洗并在室温下用各自的抗体孵育30分钟。将细胞洗涤并重新悬浮在添加有2％BSA和0.01％叠氮化物(FACS缓冲液)的PBS中，通过BD流式细胞仪LSRII流式细胞仪获得FACS缓冲液，并使用FlowJo软件v11(Tree Star公司)进行分析。
流式细胞术分析评估细胞内细胞因子或PD1-Fc诱饵或CD40L诱饵的产生
为了通过FACS评估细胞内细胞因子的产生或PD1诱饵或CD40L诱饵的产生，在圆底96孔板(或具有抗CD3/抗CD28珠)中，用板包被的抗CD3(5μg/ml)和可溶性抗CD28(2μg/ml)抗体的组合激活每孔50000个活T细胞7小时。为了防止蛋白质分泌，在检测开始1.5小时后，以1:400的稀释度向孔中加入Golgi stop(BD Biosciences)。根据制造商的说明，使用标准固定/透化试剂盒(BD Biosciences)固定和透化T细胞，然后评估其转导效率或产生感兴趣分子的能力。抗Fc抗体用于检测诱饵。使用针对感兴趣的细胞因子(IL-2、IFN-γ)的特异性抗体。
ELISA评估基因工程化T细胞的免疫调节因子的分泌
在激活和转导一周后，将106个基因工程化OT-1T细胞接种在1mL无血清RPMI培养基中72小时。然后收集SN并测试每个分子。对于PD1.IgG4，使用一种具有以下设置的改良ELISA。板包被有抗小鼠PD1抗体(R&D,AF1021,2μg/m)，与SN一起孵育。用抗hIgG4-HRP抗体(Abcam，ab99817，稀释度1:1000)检测PD1.IgG4。
对于IL-2V，使用具有以下设置的改良ELISA。用抗人IL-2抗体(R&D，AF-202-NA，3μg/ml)包被板，与上清液一起孵育，用生物素化多克隆抗人IL-2抗体(Invitrogen，13-7028-81，稀释度1:500)，然后用链霉亲和素HRP(BioLegend，稀释度1:1000)检测IL-2V。来自OT-1T细胞的SN被转导以表达融合分子TIM-3.IgG4或IL-2V作为阴性对照。为了检测LIGHT、IL-33和CD40L，使用了三种商用ELISA试剂盒：R&D开发的小鼠LIGHT/TNFSF14DuoSet ELISA(DY1794-05)、BioLegend开发的LEGEND MAXTM小鼠IL-33 ELISA试剂盒(436407)、NovusBiological开发的小鼠CD40Ligand/TNFSF5 ELISA试剂盒(NBP1-92662)。
荷瘤小鼠的过继细胞移植
用0.05％胰蛋白酶收集B16-OVA肿瘤细胞，洗涤后再悬浮在PBS中进行注射。将1×105肿瘤细胞皮下注射到7周龄C57BL/6小鼠的右侧。在第11天(肿瘤平均体积100-200mm3)，将小鼠重新分组，以获得实验组之间的相对肿瘤平均体积，其中n≥5只小鼠/组。在第12天和第15天，小鼠经静脉注射转移5×106基因工程化CD44+CD62L+TCF1+OT-1T细胞或对照未转导的OT-1处理。每周对小鼠进行三次监测，由独立研究人员以盲法通过卡尺测量肿瘤长度(L；最大纵向测量值)和宽度(W；最大横向测量值)。肿瘤体积(V)用公式：V＝(L x W2)/2计算。绘制肿瘤平均体积/组±SD。一旦肿瘤达到1000mm3，或者根据规定，如果小鼠感到痛苦或垂死，则将其处死。
用ELISA评估基因工程化T细胞免疫调节因子的分泌。
转导一周后，将1×106基因工程化OT-1T细胞接种在24孔板中，在1mL无血清RPMI培养基中72小时。然后收集SN并通过ELISA测试每个分子。PD1.IgG4国产-ELISA：包衣抗体：抗小鼠PD-1(R&D，AF1021，2μg/ml)，检测抗体：抗hIgG4-HRP(Abcam，ab99817，稀释度1:1000)。IL-2V国产ELISA：包衣抗体：抗人IL-2(R&D，AF-202-NA，3μg/m)，二抗生物素化多克隆抗人IL-2(Invitrogen，13-7028-81，稀释度1:500)，链霉亲和素HRP(BioLegend，稀释度1:1000)。来自OT-1T细胞的SN被转导以表达融合分子TIM-3.IgG4或IL-2V作为阴性对照。为了检测IL-33，使用BioLegend(436407)开发的商用LEGEND MAXTM小鼠IL-33ELISA试剂盒。
铬释放试验测量ADCC
将自体PBMC解冻，以1×106/ml的浓度放置，并在10ng/ml GM-CSF存在下以每孔3ml的浓度添加到6孔板中。第二天，用50μCi铬-51装载0.5×106EGFR+T细胞，重新悬浮，并放入37℃水浴中约1小时。然后将T细胞洗涤两次，并以400000个细胞/ml的浓度悬浮，并转移每孔50μl的T细胞(＝2000个细胞)。制备了300μg/ml或30μg/ml的西妥昔单抗(抗EGFR抗体)。向T细胞中添加50μl西妥昔单抗，并在37℃下培养30分钟。在RPMI、10％FBS(Gibco)、1％青霉素/链霉素中以1.2×106个细胞/ml的浓度收获PBMC(效应细胞)。制备1/3稀释的效应PBMC(1.2×106、0.4×106、1.33×106和0.42×106PBMC/ml)，并将50μl添加到含有tEGFR+T细胞和抗EGFR抗体的孔中。设置了效应细胞与靶细胞的不同比例(30:1、10:1、3:1、1:1，一式三份)。作为阳性对照，向T细胞中加入1x TritonX(＝最大铬释放量)。设置所有阴性对照(仅培养基，T细胞无PBMC，T细胞加PBMC但无抗体等)。以1500rpm的转速旋转板，并在37℃下放置4-5小时。将50μl上清液转移到lumaplate孔中，并让其干燥过夜。第二天，用topCounter评估铬水平。
共培养试验和ELISA测量细胞因子的产生
以1×106TCR+T细胞/ml的浓度制备用于表达PD1诱饵加截断EGFR(和所有对照T细胞条件)的共工程化的TCR-T细胞，并以1×106细胞/ml的浓度制备肿瘤细胞。将每种T细胞和肿瘤细胞100μl合并在96孔圆形底板中。将板在1500rpm下旋转1分钟，并在37℃下孵育48-72小时。根据制造商的建议，通过ELISA(Invitrogen)评估上清液中的IFN-γ水平。
共培养试验和ELISA以评估PD1和CD40L诱饵的分泌
在最终体积为200μL的完全RPMI培养基中，每孔将1×106原代UTD和共转导T细胞(工程化以表达NYTCR并分泌PD1诱饵加tEGFR)与1×106靶细胞在96孔圆形底板中共培养，一式两份。将板在1500rpm下旋转1分钟，并在37℃下孵育。24小时后，收集共培养上清液，并通过捕获板结合的抗PD1抗体或板结合的人PD-L1蛋白来测试PD1 Fc融合诱饵分子的存在。用抗IgG Fc抗体检测结合的PD1 Fc诱饵分子。除使用商用ELISA试剂盒(Invitrogen)外，使用相同的条件评估上清液中分泌的CD40L诱饵。
免疫亚群耗尽、检查点阻断和FTY720处理。
从治疗前1天开始，每三天通过腹腔给予250μg/剂量的耗尽抗体以耗尽特定的细胞亚群：带有α-小鼠CD4的CD4 T细胞(克隆GK1.5，BioXCell)，带有α-小鼠NK1.1的NK细胞(克隆PK136，BioXCell)，带有α-小鼠Ly6G的中性粒细胞(克隆1A8，BioXCell)。对于检查点阻断，每三天向小鼠腹腔注射250μg/剂量的α-小鼠PD-L1(BioXcell，10F.962)和α-小鼠TIM-3(BioXcell，RMT3-23)。为了阻断次级淋巴器官的淋巴细胞迁移，制备了从SIGMA获得的FTY720储备溶液(在DMSO中为10mg/ml)，然后在施用前在水中稀释至1mg/ml。最后，从治疗前2天开始，每三天腹腔注射100μg该药物。PBMC流式细胞术证实了免疫细胞的耗尽和隔绝(FTY720)。
制备用于流式细胞术和体外再刺激细胞因子产生的单个肿瘤细胞悬浮液、抗体。
在第一次过继细胞转移后5天和12天切除肿瘤，并使用商用小鼠肿瘤分离试剂盒(Miltenyi Biotec，130-096-730)结合机械分离与细胞外基质的酶降解，将肿瘤分离成单细胞悬浮液。单细胞悬浮后，将2.5×106个活细胞接种在96孔板中，并在室温下与50μlLive/Dead Fixable aqua dead在PBS中孵育30分钟，然后通过在4℃下与50μl纯化抗CD16/CD32单克隆抗体(克隆2.4G2 BD Pharmingen)孵育30分钟封闭Fc受体。然后在4℃条件下，用50μl FACS缓冲液中的感兴趣的荧光色素偶联单克隆抗体对细胞进行30分钟染色。随后，将细胞洗涤两次，并使用FoxP3转录因子染色缓冲液套件(Invitrogen)固定/透化以细胞内染色。使用LSRII细胞仪和FlowJo软件对染色细胞进行分析。
使用了以下抗体：CD45.1(cloneA20，BioLegend)；CD3(clone 145-2C11，Invitrogen)，CD4(clone GK1.5，BioLegend)；CD8(clone 53.6.7，BioLegend)，FOXP3(clone FJK-16S，Invitrogen)，NK1.1(clone PK136，BioLegend)，CD44(clone IM7，BioLegend)，PD-1(clone 29F.1A12，BioLegend)，LY6C(clone HK1.4，BioLegend)，颗粒酶C(clone SFC1D8，BioLegend)，TCF1(clone C63D9，Cell Signaling Technology)，抗兔IgG(H+L)，F(ab')2Fragment(AF488或PE偶联(Cell Signaling Technology))，颗粒酶B(cloneGB11，Novul BioLegend)，CD69(clone H1.2F3，BioLegend)，TIM-3(clone RMT3-23，BioLegend)、CD137/4-1BB(clone 17B5，Invitrogen)、KLRG1(clone 2F1/KLRG1，BioLegend)、KI67(clone 16A8，BioLegend)、IFNg(clone XM61.L，Invitrogen)、TNFa(clone MP6-XT22，BioLegend)、TOX(clone TXRX10，Invitrogen)、CD45(clone 30-F11，BioLegend)，
荧光减一(FMO)对照使用抗体组进行平行染色，并依次省略一种抗体。FMO染色作为以下抗体的对照：TCF1、Ki67、4-1BB、颗粒酶B、TNFa、IFNg、PD-1和TIM-3。同型对照用于颗粒酶C染色(clone HTK888，BioLegend)。Precision Count BeadsTM(BioLegend)用于获取流式细胞仪采集期间的细胞绝对计数。
为了检测细胞因子的产生，单个肿瘤细胞悬浮液(2.5×106个活细胞)在用1μg/ml孔包被抗小鼠CD3(clone 17A2，Invitrogen)和2μg/ml可溶性抗小鼠CD28(clone 37.51，Invitrogen)的24孔板中，在BrefeldinA(5μg/ml)存在下体外再刺激4h。如上所述，细胞在固定和透化之前进行表面染色，然后进行细胞内染色。
免疫荧光标记和显微镜检查
为了进行免疫组织化学分析，分离肿瘤组织，并将其固定在含1％PFA的PBS中的中过夜，第二天(过夜)用30％蔗糖浸润，然后将其包埋并冷冻在OCT化合物中。在SuperfrostPlus slides载玻片(Fisher Scientific)上收集低冰冻切片，风干，并与含有BSA、正常小鼠血清、正常驴血清(Sigma)和0.1％triton的封闭溶液预培养。然后，然后用含0.1％triton的PBS稀释一抗，4℃标记过夜。在用含有0.1％triton的PBS清洗后，二级试剂在含有0.1％triton的PBS中稀释，并在室温下应用45分钟。最后，在用PBS和0.1％triton进行额外清洗后，使用DAPI(Sigma)对细胞核进行染色，然后用PBS清洗并在DABCO(国产)中封片。图像由ZeissAxioImager Z1显微镜和AxioCam MRC5相机采集。使用Fiji(NIH)或AdobePhotoshop处理图像。小鼠组的曝光和图像处理是相同的，可以直接比较。
用于CD8/CD45.1/CD105标记的抗体(ab)：1°ab：大鼠-小鼠CD8a(clone53-6.7)、兔-小鼠CD105(clone MJ7/18)、小鼠-小鼠CD45.1 Biotin(clone A20.1)。2°试剂：驴-鼠Alexa 488(Invitrogen，#A21208)，驴-兔Cy3(Jackson ImmunoResearch#711-165-152)，链霉亲和素APC(Biolegend，#405207)。
用于CD8-CD45.1-TCF1标记的抗体(ab)：1°ab：大鼠-小鼠CD8a(53-6.7)，兔-小鼠TCF-1(Cellsignalling,clone C63D9)，#2203)，小鼠-小鼠CD45.1 Biotin(cloneA20.1)。2°ab：驴-大鼠Alexa 488(Invitrogen，#A21208)，驴-兔Cy3(Jackson ImmunoResearch#711-165-152)，链霉亲和素APC(Biolegend，#405207)。
单细胞RNA-seq分析。
筛选CellRanger生成的聚合UMI计数矩阵，以选择高质量的CD8 TIL转录组。首先，检测到500到5000个基因、2000到30000个UMI计数、线粒体含量低于5％、核糖体蛋白质含量百分比低于50％的细胞被保留下来。接下来，CD8 T细胞被筛选为表达Cd2、Cd8a和CD8b1(>＝1UMI)但不表达Cd4(0UMI)的细胞。还去除了表达Cd14、Csf1r、Cd19、Spi1、Foxp3、H2-Aa和H2-Ab1的细胞，获得了1788个高质量的CD8 TIL转录组。
对于降维，首先使用带有默认参数的Seurat 3.1.1vst方法(Stuart等人，Cell,vol.177,issue 7,p1888-1902.e21,June 13,2019)识别高变异度基因(HVG)。接下来，将线粒体、核糖体蛋白编码基因和细胞周期基因(携带Gene Ontology term GO:0007049的基因)从一系列HVG中移除，剩余的HVG(1649)被缩放为均值＝0，方差＝1。标准化HVG用于使用PCA的第一步降维，第二设置使用UMAP(在Seurat v3.1.1中实现)对前10个主成分(其他参数默认)进行降维。使用Seurat的共享最近邻方法进行聚类，使用默认参数的FindNeighbor和FindClusters(分辨率＝0.2)。以默认参数使用TILPRED对CD8 TIL状态监督分类(https://github.com/carmonalab/TILPRED；Santiago J.Carmona等人，OncoImmunology,9:1(2020))。使用FindAllMarkers和MAST v1.10鉴定聚类差异表达基因(Finak，G等人，Genome Biol 16278(2015))，参数为min.pct＝0.25、logfc.threshold＝0.25。为了比较Gzmc cluster和传统耗竭cluster，通过将“分辨率”参数增加到0.3，对初始“耗竭”聚类(origin‘exhausted’cluster)进行了子聚类。使用FindAllMarkers和MAST v1.10评定提炼的耗竭cluster和Gzmc cluster之间的差异表达分析，参数为min.pct＝0.1和logfc.threshold＝0.25。这些cluster与TOX-KO signature的基因集富集分析(Scott，A.C.等人，Nature 571，270–274(2019))使用clusterProfiler软件包v3.12中的GSEA函数计算(Guangchuang Yu等人，OMICS:A Journal of Integrative Biology.May 2012.284-287)，使用默认参数，并使用前200个差异表达的聚类基因，其p值<0.01，按降低的倍数变化排序。
统计分析
使用Shapiro-Will正态性检验评估数据的正态分布。使用双尾学生t检验比较两组(如果是正态分布且同方差)，或使用Welch校正的t检验(如果是正态分布但不是同方差)，如果数据不是正态分布，则使用非参数Mann-Whitney检验。为了比较两个以上的组，采用了类似的策略。如果不存在正态分布，则使用Kruskal-Wallis检验。如果是正态分布和同方差，则使用单向ANOVA检验；如果是正态分布但不是同方差，则使用Brown-Forsythe和WelchANOVA检验。多重比较校正采用Dunn检验(Kruskal Wallis检验)、Dunnet检验(单向ANOVA检验)和Tukey检验(Brown Forsythe检验)。生存分析采用log-rank秩Mantel-Cox模型。Pearson相关检验用于计算TCF1+OT-1肿瘤内CD8 T细胞数量与肿瘤浸润OT-1总数量之间的相关性。所有这些统计分析均采用GraphPad Prism 8.0进行，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001***p<0.0001。
使用肿瘤接种后第17天肿瘤体积的变化(％)对肿瘤控制进行统计分析。计算每只动物在第一次作用后至少12天观察到的最佳缓解(最小肿瘤体积)。根据每组小鼠总数计算处理组的客观缓解率和临床收益率，因为(1)客观缓解包括完全缓解(CR；肿瘤体积减少100％)和部分缓解(PR；≤肿瘤变化-30％；(2)临床收益包括CR、PR和疾病稳定(-30％<肿瘤变化)≤+20％)。
使用精确逻辑回归计算变量“客观缓解”和“临床收效”的预测概率。还使用线性回归分析作为连续变量的肿瘤变化值。低于0.05的P值被认为具有统计学意义。
实施例2
PD1诱饵分子克隆到含有IL-2V、LIGHT或白细胞介素33(IL-33)序列的逆转录病毒构建体中：每个构建体都经过密码子优化，只针对两个被自裂解肽T2A分离的分子进行编码。因此，至少有四种不同的结构可用：i)PD1.IgG4_T2A_IL-2V，同时表达PD1诱饵和IL-2V；ii)PD1.IgG4_T2A_LIGHT，表达PD1诱饵和LIGHT；iii)PD1.IgG4_T2A_IL-33，表达PD1诱饵和IL-33；和iv)PD1.IgG4_T2A_CD40L，表达PD1诱饵和CD40L。
图1示出了用设计的构建体转染和转导OT-1T细胞的效率。在每种受试组分中，细胞都示出了每种表达的分泌蛋白的高效的转导和高分泌水平。
使用特异性ELISA，也证实了工程化OT-1T细胞可以分泌每种特定的免疫调节因子组合PD1.IgG4_T2A_IL-2V，PD1.IgG4_T2A_LIGHT；和PD1.IgG4_T2A_IL-33和PD1.IgG4_T2A_CD40L。
结果表明，T细胞可以成功地工程化以表达两种不同的外源性分泌蛋白。这些细胞通过持续表达和大量分泌各自的外源性分泌蛋白而表现出先进的特性。
实施例3
如图2A和2B所描绘的，用分泌PD1.IgG4、LIGHT和IL-2V的OT-1T细胞的ACT显著改善了大型B16-OVA肿瘤的控制。这种联合策略在ACT后诱导肿瘤消退，与未转化的OT-1T细胞相比，提高了总体存活。如图2C和2D所描绘的，使用分泌PD1.IgG4、LIGHT和IL-33的OT-1T细胞也显著改善了大型B16-OVA肿瘤的控制。这种联合策略示出了比PD1.IgG4、LIGHT联合策略更好的抗肿瘤活性。与未转染的OT-1T细胞相比，IgG4、LIGHT和IL-33组合策略提高了总体存活。
过继转移分泌PD1.IgG4、IL-2V和IL-33的OT-1T细胞，与未转染的OT-1T细胞相比，总体存活几乎翻了一番，并且，与其他联合策略相比，总体存活延长了10天或更多(图2F)。如图2G和2H所描述的，使用分泌PD1.IgG4、IL-2V和CD40L的OT-1T细胞的ACT,显著改善了大型B16-OVA肿瘤的控制。这种联合策略在ACT后诱导肿瘤消退，与未转化的OT-1T细胞相比，提高了总体存活。
总之，T细胞可以被基因工程化以分泌免疫调节因子的组合来控制晚期肿瘤。上述实施例还强调了混合具有相同抗原特异性但具有不同分泌特性的T细胞群以获得免疫调节因子的高阶组合的治疗可行性。这种方法的一个重要优点是增加了安全性，因为这些分子在肿瘤微环境中大量分泌(也就是说，它们没有被系统地应用)。
实施例4
过继免疫疗法提供了重新编程T细胞和肿瘤微环境的机会。如本实施例所示，具有IL-2Rβγ结合的IL-2变体、PD1诱饵和IL-33的正交工程化过继转移的T细胞对转移的和内源性CD8+细胞重新编程，在免疫功能正常的宿主中实现了细胞自主的T细胞扩增、植入和肿瘤控制。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)采用了一种新的效应状态，不同于典型的TOX驱动的耗竭，其特征是TOX抑制、大量颗粒酶C、效应分子、存活和细胞前体标志物。受IL-2变体和IL-33之间相互作用的动态驱动，处于这种状态的TIL将持久性与TOX驱动的耗竭分开，并成功地控制了肿瘤。因此，在没有宿主免疫细胞清除的情况下进行合理的T细胞工程化，既可以优化过继转移T细胞的重新编程，又可以将内源性免疫调动到与肿瘤控制相容的新状态。
据推测，T细胞可以被赋予内在特性，使其能够在没有免疫细胞清除的情况下自主地达到必要的扩增，并达到与中等免疫原性肿瘤的植入和排斥相容的期望功能状态。在本发明中，试图通过正交组合工程化来修饰T细胞，即引入其产物可以产生有利扰动的基因，从而重新编程T细胞，并使T细胞能够重新编程TME中的适应性和先天免疫。PD-1/PD-L1抑制途径以分泌型PD-1诱饵(PD1d)为靶点，即包含与人类IgG4的Fc区连接的小鼠PD-1胞外域的融合分子。为了支持T细胞扩增，运用了一种不与高亲和力IL-2Rα链(CD25)结合的人IL-2变体(IL-2V)(T.Carmenate等人，Journal of immunology 190,6230-6238(2013)；G.Rojas等人,Scientific Reports 9,800(2019))。与野生型IL-2相比，该分子的重要优势包括毒性降低和调节性T细胞(Treg)的隔绝作用降低。也有人假设，与驱动终端效应分化的野生型IL-2不同，IL-2V会促进CD8+T细胞干细胞化，这是ACT的一个有利特征(J.G.Crompton等人，Immunol Rev 257，264-276(2014))。最后，为了在肿瘤中产生有利的炎症信号，运用了IL-33。构建了两个逆转录病毒载体，一个编码可溶性PD1d和IL-2V(PD1d/2V模块)，另一个编码可溶性PD1d和小鼠IL-33(PD1d/33模块)。CD8+T细胞分别被携带一个或另一个模块的逆转录病毒转导，然后以1:1的比例汇集，生成赋有三重组合(PD1d/2V/33)的ACT鸡尾酒。此外，OT1 T细胞被用于治疗免疫活性受体小鼠的晚期B16-OVA黑色素瘤。如下图所示，本实施例研究了这些干预可能导致的CD8+T细胞状态，和在没有预处理免疫细胞清除或外源性细胞因子支持的情况下，实现T细胞植入和肿瘤消退所期望的CD8+T细胞状态。
正交T细胞工程化以细胞自主的方式提高ACT疗效
作为最初的工程化模块，PD-1诱饵的抗肿瘤潜力首次被评估。该分子在工程化OT1细胞中被良好表达和分泌，并在体外与固定有PD-L1的板结合(通过饱和PD-L1中和抗体进行竞争)。使用PD1d工程化OT1细胞的ACT在免疫细胞清除(辐射)小鼠体内显示出显著的抗肿瘤活性。接下来，我们检验了PD1d/2V或PD1d/33模块是否能有效地转导OT1细胞，从而分别同时分泌PD1d和IL-2V，或PD1d和IL-33。对PD1d的表达进行评定，获得了大于75％的转导效率，并且通过ELISA证实了所有分子的同时分泌。
接下来，在没有预处理免疫细胞清除的情况下进行正交工程化ACT(图3A)。在没有免疫细胞清除或外源性细胞因子的情况下，将具有约70％的TCM和约30％的TEM(效应记忆)表型的5×106未转导的OT1细胞，两次输液施用于患有可触及(100m3)肿瘤的小鼠，无法控制肿瘤生长(图3B)。用具有PD1d或IL-2V转导的相同剂量的OT1细胞对肿瘤生长的具有小但不显著的影响(图3B；表2和表3)，在相同条件下，没有证明双工程化PD1d/2V-OT1细胞更有效。用未转导的OT1细胞全身施用抗-(α)PD-L1抗体产生了与PD1d-OT1细胞相当的结果。类似地，与PD1d/33-OT1细胞一样，用IL-33转导的OT1细胞具有最小的效果。引人注目的是，与任何其他处理方法相比，PD1d/2V/33-OT1细胞(即1:1混合PD1d/2V和PD1d/33细胞)的治处理在统计学上显著优于其他处理方法(图3B；表2和3)。这种治疗方法的客观有效率(ORR)为85.7％，预测发生概率为83.3％(表2和表3)，而所有其他治疗方法的客观有效率(ORR)在0％到9％之间。最后，为了证实PD1d/2V/33-OT1细胞在没有免疫细胞清除和外源性细胞因子支持的情况下的有效性，早期处理小鼠(从第6天开始)使得肿瘤完全根除和治愈。
免疫功能正常宿主中的正交工程化导致过继转移CD8+细胞的细胞自主扩增并残余内源性抗肿瘤免疫
然后将双工程化PD1d/2V或PD1d/33的抗肿瘤效果与三工程化PD1d/2V/33OT1细胞进行比较(图3A)。在基线检查时(第12天)，未经处理的B16-OVA肿瘤呈现出适度的自发CD8+T细胞浸润，表现出CD44+抗原刺激的细胞的表型。过继转移的CD8+T细胞在4天内开始在肿瘤中积聚，到ACT后第5天(第17天)，用三工程化细胞处理的小鼠肿瘤已经显示出显著更高水平的CD8+T细胞植入。一周后(第24天)，发现PD1d/2V/33-OT1细胞处理的小鼠肿瘤中的CD8+TIL显著多于双工程化细胞处理的小鼠，而双工程化细胞治疗的小鼠肿瘤中的CD8+TIL则显著多于未转导的OT1细胞处理的小鼠(图3C)。聚焦于OT1(CD45.1+)TIL，观察到ACT两周后肿瘤中PD1d/2V/33-OT1细胞显著扩增(图3D)，而PD1d/2V-OT1和PD1d/33-OT1细胞分别表现出适度或最低水平的植入。因此，三工程化组合ACT的疗效与肿瘤中过继转移T细胞的独特扩增和肿瘤消退有关。
鉴于ACT是在完全免疫功能正常宿主中进行的，我们研究了内源性免疫效应细胞是否参与了其作用。引人注目的是，ACT两周后观察到的总CD8+TIL中约有50％或更多是内源性的(CD45.1neg CD45.2+)(图3E)。尽管在用PD1d/2V-OT1或PD1d/33-OT1细胞处理的肿瘤中观察到一些内源性TIL的扩增，但在用三工程化细胞处理的肿瘤中，这些扩增特别突出。
在CD8+T细胞室中存在表达TCF1转录因子的干细胞样细胞库之前已被认为与PD-1阻断后调动抗肿瘤(和慢性病毒感染)免疫的能力有关，而将此类前体细胞用于ACT可能会提高疗效。然而，TME条件不促进TCF1+CD8+TIL的存在或持续存在。值得注意的是，在转移三工程化PD1d/2V/33或双工程化PD1d/2V OT1细胞后，观察到TCF1+OT1+TIL的显著扩增(图3F和3G)，这表明只有这两种共享IL-2V的方法扩增了干细胞样室。重要的是，干细胞样TCF1+CD8+的扩增也发生在内源性TIL(图3F和3G)。在这些肿瘤中，10-20％的OT1和30-50％的内源性CD8+TIL在PD1d/2V/33-ACT后表达TCF1，并且观察到TCF1+OT1细胞的存在与OT1 TIL总数之间存在强烈的直接相关性。因此，包含IL-2V的工程化方法实现了促进干细胞化的条件，从而促进转移和内源性T细胞的持久性。
重要的是，基因工程化OT1细胞的有效肿瘤控制不仅与TCF1+CD8+TIL的增加有关，还与大量TCF1neg效应物样CD8+TIL有关——PD1d/2V/33-ACT单独满足这种条件(图3G)。事实上，在这些肿瘤中，80-90％的OT1 TIL和50-70％的内源性CD8+TIL是TCF1neg。重要的是，尽管在PD1d/2V-ACT后也出现了高频率的TCF1+CD8+TIL，但这些肿瘤中的TCF1neg CD8+TIL少得多，这表明IL-2V驱动了TCF1+CD8+TIL的扩增，但在没有IL-33共表达的情况下，这些细胞不太可能转变为TCF1neg状态，证实Tcf1抑制与效应分化有关。相比之下，PD1d/33-ACT与低TCF1+CD8+和高TCF1negCD8+TIL频率和总体TIL扩增不佳有关(图3F和3G)。
为了了解内源性T细胞在ACT后肿瘤控制中的作用，CD8基因敲除荷瘤小鼠在相同条件下用PD1d/2V/33-OT1细胞处理。观察到ACT的抗肿瘤效果在缺乏内源性CD8+T细胞的情况下丧失(图3H)。因此，内源性CD8+T细胞的参与对于有效的肿瘤控制至关重要。引人注目的是，肿瘤控制并不依赖于从淋巴结募集内源性T细胞，由共施用FTY720(一种从淋巴结中流出的损害淋巴细胞的药物)证明(图3H)。因此，通过三工程化ACT，可以利用和必要地原位扩增预先存在的内源性TIL，而不是将全身CD8+T细胞招募到肿瘤中。
接下来，评定ACT与肿瘤Treg的相互作用。通过转移细胞分泌IL-2V优先扩增CD8+而非Treg，与CD8+细胞的最大扩增一致，CD8/Treg比例在PD1d/2V/33-ACT之后最高(图3I)。CD4+TIL总完全扩增比CD8+TIL要少，在PD1d/2V/33-ACT之前，抗体介导的CD4+T细胞耗尽并没有损害，而是显著改善了肿瘤控制和小鼠存活(图3J)。
最后，研究了三工程化ACT是否调动了先天免疫。尽管肿瘤NK细胞在含有IL-2V的ACT后增加，尤其是PD1d/2V/33-ACT，但它们未能激活，并且它们是可有可无的。然而，重要的是，肿瘤的控制共同依赖中性粒细胞的调动和激活密切相关(图3K)。因此，正交工程化通过调动适应性和先天性免疫，在免疫功能正常宿主中实现肿瘤消退。虽然在携带血液肿瘤的淋巴充满(lymphoreplete)小鼠中，ACT介导的肿瘤控制的示例有限，但这是在没有任何支持性处理的情况下，首次证明ACT在晚期、免疫原性差的实体瘤中成功，S.K.Vodnala等人，Science 363，eaau0135(2019)。
由正交工程化诱导的肿瘤内GzmC+TCF1neg效应CD8+T细胞的新亚群独立于TOX持续存在
为了进一步了解与三工程化ACT肿瘤控制相关的TIL分子状态，和单个双工程化模块的影响，通过单细胞(sc)RNA-Seq分析TIL(图4A)。源自不同实验条件的CD8+TIL的无监督聚类分析揭示了五种不同的转录组状态(聚类C1到C5)(图4B)。为了解释结果，使用了TILPRED，一种机器学习工具，将细胞分配到之前描述的未处理的小鼠肿瘤中识别分子TIL状态(S.J.Carmona等人，OncoImmunology 9,1737369(2020))。研究发现，用非工程化OT1细胞处理的肿瘤的TIL呈现出与未处理肿瘤的TIL相似的特征，具有主要的祖细胞和终末耗竭细胞库(C4)和少循环(C3)、效应记忆(C2)和幼稚细胞(C1)(图4B和4C)。因此，在没有工程化和没有宿主条件的情况下，ACT不会影响TIL状态。PD1d/2V-ACT后，TIL表现出一个主要的幼稚样库(C1)，与上述TCF1+细胞的显著扩增相一致，还有一些额外的效应记忆(C2)、循环(C3)和前体和终末耗竭细胞(C4)。相反，在PD1/33-ACT之后，TIL表现出一种主要的效应记忆状态(C2)和一些循环细胞(C3)。因此，仅IL-2V或仅IL-33的局部表达分别将TIL重定向至幼稚样和效应记忆状态。此外，这两种细胞因子的结合导致了一种与肿瘤控制有关的全新状态(C5)，它分别脱离了每种细胞因子支持的任何一种状态。C5在反应期仅在的三工程化ACT TIL中发现，在任何其他肿瘤条件下均未见(图4B)。ProjecTIL还支持了这种状态的新颖性，ProjecTIL是一种将(sc)RNAseq数据投射到参照TIL图谱上的工具，它揭示了尽管聚类C1-C4中的细胞与先前描述的参照状态一致，但C5出现了一种新的状态，以前从未描述过，其特征是独特的效应样转录程序上调(图4D)。
包含TIL的C5主要由TILPRED和ProjecTIL确定，被广泛归类为“终末耗竭”CD8+细胞，与C4聚类中的TIL完全相同。事实上，这两个聚类中的细胞共有相对较高的共抑制受体基因表达，包括Pdcd1、Lag3、Tigit、Havcr2/TIM3和Entpd1/CD39，和共刺激受体和激活标记Tnfsfr9/4-1BB(图4E)。考虑到它们被UMAP分离，和ProjecTIL效应样转录程序的上调，差异表达分析被用于确定C5和C4终末耗竭TIL的不同分子特征。相对于典型终末耗竭细胞C4，C5TIL表现出独特的效应特征，与耗竭相关的转录因子Tox、bhlhe40和Batf和多个抑制性受体显著下调。值得注意的是，它还下调了Cx3cr1——一种短暂效应样耗竭细胞的独特标志物(图4C，下半部分；表3)。此外，C5 TIL显著上调效应细胞标志物，包括多种颗粒酶，最主要的是Gzmc，它构成C5特异性标志物(图4E)、抗凋亡基因Bcl2和Ly6c2，是与前体CD8+T细胞有关的标志物，在CX3CR1+短暂效应物样耗竭细胞中也不存在。与C4细胞相比，C5细胞在Tox基因敲除CD8 TIL信号中持续富集(图4F)。因此，FACS证实，大多数OT1(约80％)和内源性(约70％)CD8+TIL在反应期表达颗粒酶C(图4G)。在脾脏中未检测到GzmC+CD8+细胞，这表明重新编程的TME中的局部线索在肿瘤中特异性地驱使T细胞进入这种状态。重要的是，在基线时，剩下的实验组(图4G)和内源性CD8+TIL或体外扩增后的OT1细胞中，发现GzmC+CD8+T细胞的频率可以忽略不计，这表明PDd1/2V/33-ACT特异性地导致了TIL(包括内源性TIL)的深刻瘤内重编程，产生了一种新的CD8+T细胞效应表型，这显然需要IL-2V和IL-33之间的局部相互作用。
TOXneg/low GzmC+TCF1neg效应CD8+TIL是多功能细胞，具有共抑制受体的无意义表达
进一步表征了PD1d/2V/33-ACT后GzmC+效应CD8+TIL状态对肿瘤排斥反应的影响。设门策略(gating strategy)用于确定OT1和内源性室中的TCF1neg效应CD8+细胞。研究发现，PD1/2V/33-ACT后，大多数OT1和三分之二的内源性GzmC+CD8+TIL确实是TCF1neg效应细胞(从图5A可得)。然后将这些细胞与其他组的TCF1neg效应CD8+TIL进行比较(图5B)(可从PD1d/33-OT1、未转导OT1和未转导OT1 ACT加αPD-L1进行分析)，重要的是，所有这些细胞都是GzmCneg(图5A)。来自PD1d/2V/33-ACT和GzmCnegTCF1negCD8+效应OT1的大多数GzmC+TCF1negCD8+TIL和来自其他组的内源性TIL为PD-1+(图5C)，并且显著比例的这些细胞也是TIM3+(图5D)。值得注意的是，与(sc)RNA-seq数据一致，几乎没有OT1细胞表达TOX，只有约40％的内源性PD-1+GzmC+TCF1neg细胞表达TOX(图5E)。与Ly6c2是C5(GzmC+)和C4(GzmCneg)耗竭细胞之间差异表达最显著的基因之一一致，大多数PD1+GzmC+TCF1neg OT1和内源性TIL呈现出LY6C的高表达，LY6C是终末耗竭CD8+TIL中缺失的标志物。GzmC+TCF1neg OT1或内源性TIL也低表达/不表达KLRG1，KLRG1是一种短命效应细胞的标志物(图5F)。进一步表明来自PD1d/2V/33-ACT的TOXlow/neg GzmC+TCF1negCD8+TIL不是典型的终末衰竭细胞，发现大多数OT1和大约一半的内源性细胞表达CD69，提示近期TCR诱导激活(图6A)。此外，来自OT1和内源性隔室的TOXneg/lowGzmC+PD-1+TCF1negCD8+T细胞比其他组的TIL表达更多Ki-67(图6B)。最后，根据(sc)RNAseq分析(图6C和6D)，来自PD1/2V/33-ACT(但没有其他组)的大多数OT1和内源性CD8+TIL为GrzmB+。在这些PD-1+OT1细胞中，确认了一个重要部分，即双GzmChigh和GzmBhigh(图6E)，其在内源性细胞中未检测到。最后，对从PD1d/2V/33-ACT肿瘤消退过程中收集的PD-1+CD8+TIL进行体外CD3/CD28刺激的细胞因子应答检测。大约一半的OT1和内源性TIL在刺激时产生TNFα，一部分细胞同时产生TNFα和IFNγ(图6F)，显示出多功能效应特性。因此，三工程化ACT产生了一种独特的强大肿瘤排斥表型，即CD8+效应TIL不获得TOX程序。
为了检验在的独特TIL状态下，PD-1或TIM-3等共抑制受体是否与TOX耗竭程序解耦，和它们的抑制功能是否无关紧要，PD1d/2V/33-ACT与αPD-L1或双αPD-L1/αTIM3抗体结合。然而，没有观察到肿瘤控制的改善(图6G和6H)。因此，在IL-2V/IL-33组合工程化ACT背景下，PD-1阻断是完全不必要的。事实上，从PD-1_IgG4诱饵中移除PD-1胞外域不会通过仅具有激活的2V/33模块的ACT影响肿瘤控制(图6I)。这些数据共同表明，在免疫功能正常宿主中，T细胞与βγ结合的IL-2和IL-33的正交工程化能够产生一种新的效应TIL状态，这种状态赋有控制肿瘤的能力，其中TOX仍然受到抑制，且共抑制受体无意义表达。
正交工程化驱动TOXneg/lowGzmC+前体分化
与慢性病毒感染类似，CD8+T细胞介导的抗肿瘤应答(也在PD-1阻断后)可能由肿瘤内TCF1+PD-1+前体耗竭的CD8+T细胞维持，这些细胞具有干细胞样特性，表达TOX，TOX是一种转录因子，对这些细胞的产生和持续性至关重要。鉴于IL-2V在ACT背景下抑制TCF1neg细胞中的TOX的作用，研究了IL-2V是否也抑制TCF1+前体中的TOX程序。在PD1d/IL-2V/33-ACT后的应答阶段，检测到大量TCF1+CD8+TIL(图3F和3G)。所有这些细胞都表达GzmC(图5A)，大多数也是PD-1+(图7A)，但这些(OT1和内源性)大多是TOXneg(图7B和7C)。因此，在正交工程化ACT下，肿瘤反应性TCF1+前体已经使TOX程序失活并上调GzmC(图7D)。重要的是，PD1d/2V-ACT后TCF1+PD-1+CD8+TIL中TOX的下调也被发现，而PD1/33-ACT后相同TIL亚群中的显著表达表明IL-2V在TCF1+CD8+前体状态的水平上抑制TOX。
在PD1d/IL-2V-ACT后，确定了PD-1negTCF1+前体(OT1和内源性)的显著频率(图7A)。这些也是TOXneg，并表现出抗原刺激的TCM或TEM细胞的特征。因此，在IL-2V存在的情况下，肿瘤特异性TCF1+TIL并不完全是PD-1+前体耗竭细胞。然而，在仅存在IL-33的情况下，40％的内源性TCF1+PD-1negCD8+TIL为TOX+细胞，且大部分为TEM细胞。因此，可以得出结论，正交工程化重新编程TCF1+干细胞样室，以抑制TOX程序，并上调GzmC表达所预示的转录程序。重要的是，这两个程序似乎是独立的。IL-2V是以非TOX依赖的方式支持干细胞化和持久性的关键因素，而与IL-33的结合也需要触发前体CD8+TIL中GzmC+分化程序的激活。
GzmC+效应状态的动态演化
最后，评定了三工程化ACT后GzmC+TIL状态的动态演变。比较了从ACT后第5天(第17天)肿瘤应答后(第24天)和PD1d/2V/33-ACT初始应答后逃逸的(第38天)的肿瘤中收集的CD8+TIL的(sc)RNA-seq数据(图8A)。将逃逸时间点添加到所有之前的TIL中并不会改变之前描述的细胞的注释和集群分布。因此，ACT后早期，TIL主要分布在增殖(C3)、效应记忆(C2)和耗竭库(C4)中(图8B)。ACT后第12天，细胞在新的C5状态下迁移，与肿瘤消退相关。有趣的是，随后的进展与TIL从C5迁移到新的C6状态有关(图8B)。肿瘤逃逸时的新适应状态确实不同于与排斥相关的C5 GzmC+效应状态(图8B和8C)。正如所预期的阻断PD-1(或TIM-3)无法控制肿瘤(图6G、6H和6I)，逃逸细胞与C4的耗竭的终末分化细胞相距较远，表达的TOX明显低于这些细胞(图8B)。仅对PD1d/2V/33样本聚类可以提高分辨率，表明C6细胞更接近但不同于早期或ACT后应答期间观察到的典型效应记忆C2状态，并呈现较低的Fosl2、Bcl2、Gzma、Gzmb和Tnfrsf9(CD137)(图8B)。始终如一地，ProjecTIL分析揭示了逃逸阶段C6状态偏离了参照map效应记忆状态，下调了Fosl2驱动的效应基因程序。因此，逃逸不是由典型的耗竭介导的，细胞至少在很大程度上保留了PD1d/2V/33-ACT的TOX抑制程序特征，但GzmC(和GzmB)的表达缺失。
流式细胞术验证了上述观察结果。在三工程化ACT后，从第5天到第12天，聚类5的标志性GzmC+CD8+TIL细胞群在肿瘤中显著增加，与肿瘤消退一致(图8D)，而这些细胞在肿瘤逃逸时丢失。此外，观察到肿瘤进展时OT1细胞显著减少(图8E)，这与OT1和内源性TIL的TCF1neg群体收缩有关(图8F)。与C6状态一致，残留的CD8+TIL呈现PD-1neg/lo TEM样CD8+表型，与体外扩增的TEM样CD8+T细胞相比，颗粒酶B显著下调。最后，与在肿瘤控制期间收获的TCF1negPD-1+CD8+T细胞相比，在逃逸期间收获的TCF1negPD-1+CD8+T细胞表现出颗粒酶B表达和多功能性的丧失(图8G和8H)。因此，可以得出结论，最佳TIL效应状态与肿瘤响应动态有关。
讨论
这个实施例表明，在实体瘤ACT的背景下，正交组合T细胞工程化可以成功地克服宿主体内的稳态障碍，并在没有免疫细胞清除或外源性细胞因子支持的情况下，导致TIL和肿瘤微环境的深刻重新编程和肿瘤消退。在免疫功能正常宿主中进行ACT具有独特的优势，不仅因为它可以显著减少当前ACT的毒性和成本，还可以利用宿主的全谱免疫。这个实施例还表明，在这些情况下，内源性CD8+细胞(特别是预先存在的CD8+TIL)和中性粒细胞都被调动起来对抗肿瘤，并且对实现肿瘤消退至关重要。
最近使用高维计算分析的研究发现，在人类和小鼠肿瘤中存在多种类型的CD8+状态——幼稚、效应记忆、细胞毒性和耗竭(S.J.Carmona等人，OncoImmunology 9,1737369(2020))。虽然主要在人类样本中观察到的细胞毒性TIL状态主要在旁观者细胞中富集，但有大量证据表明，耗竭室富含肿瘤特异性CD8 TIL(A.M.van der Leun等人，NatureReviews Cancer 20218-232(2020))。值得注意的是，这一室是高度异质的，由沿分化轴分层排列的细胞状态的连续体形成，作为前体或终末耗竭的CD8+T细胞。尽管迄今为止，免疫检查点阻断(ICB)已经取得了重要的临床响应水平，但其效果主要基于诱导治疗前已经存在的耗竭的CD8 T细胞状态的变化，而不是诱导新的、未耗竭的效应样状态(J.-C.Beltra等人，Immunition 52825-841.e828(2020))。因此，CD8 TIL向这种“期望”效应状态的药理学重新编程代表了改善当前免疫治疗的临床响应的有效策略。
T细胞工程化提供了无限的机会来合理地重新编程TIL，并以旁分泌的方式重新编程TME。本实施例展示了使用仅与βγ链受体结合的IL-2变体，与刺激CD8+T细胞的PD-1阻断剂和IL-33(一种有效的先天免疫激活剂)一起来重新编程TME的正交工程化。这种结合导致外源性和内源性TIL都采用了一种新的效应状态，以多种颗粒酶(最主要的颗粒酶-C)的独特表达和TOX的抑制为特征，TOX是一种转录因子，在慢性病毒感染和癌症中对耗竭的CD8+T细胞群的产生和维持至关重要(A.C.Scott等人，Nature 571,270-274(2019))。这种状态与TME中显著的局部CD8+T细胞扩增、强效的效应功能和有效的肿瘤控制相关。在这一新程序下，PD-1和其他共抑制受体仍有表达，表明它们在持续抗原刺激背景下的上调并不严格依赖于TOX。此外，对PD-1和TIM3通路的药理学阻断证实，它们的表达在功能上无关紧要。
CD8+T细胞耗竭程序通过在TCF1祖细胞室中表达TOX稳定实施。然而，通过正交工程化扩增的TCF1+CD8状态保留TOX阴性，上调的颗粒酶-C，颗粒酶-C是在典型前体耗竭室中从未检测到的标志物。因此，该疗法诱导的祖细胞样细胞状态与在慢性病毒感染和癌症中一直被描述的TCF1+TOX+前体细胞状态不同。以类似的方式，通过正交工程化扩增的多功能GzmC+TCF1negPD-1+TOXlow/neg效应样状态不仅与典型的终末耗竭细胞状态(TOX+PD-1+CX3CR1negGzmneg)不同，还与短暂的效应样耗竭状态(CX3CR1+TIM3+PD-1+)不同。事实上，尽管TOX在这种状态下被下调，但它来自典型的GzmCnegTCF1+前体耗竭细胞，并不会显著上调Gzmc(J.-C.Beltra等人，Immunity 52,825-841.e828(2020))。此外，它表达Cx3cr1和Klrg1，在正交工程化诱导的GzmC+效应状态下，它们显著下调。此外，CD4+T-help细胞是形成CX3CR1+效应状态所必需的。然而，在这种方法背景下，这些细胞是有害的。因此，我们假设TCF1+和TCF1neg GzmC+CD8+TIL分别代表一种新的非TOX依赖性CD8+T细胞分化程序的前体和效应状态。
TOX的治疗性操作已成为消除癌症患者背景下T细胞耗竭的一种有希望的策略。最近，已经证明TOX基因敲除或TOX2基因缺失可以改善CAR-T细胞的功能，而TOX基因杂合性缺失可增强抗肿瘤T细胞响应(H.Seo等人，Proceedings ofthe National Academy ofSciences 116,12410-12415(2019)；O.Khan等人，Nature 571,211-218(2019))。这个示例证明了一种替代的、新的方法来治疗性靶向TOX，以诱导非耗竭的、高功能的CD8+效应状态。事实上，研究表明，IL-2V不仅在转移的T细胞中，而且在内源性CD8+T细胞瘤内室中，促进了CD8 T细胞的干细胞化并抑制TOX。而IL-33，可能是通过TME的重新编程间接驱动Gzmc上调、Tcf1抑制，从而导致CD8+T细胞分化为多功能效应细胞。这种最佳TIL状态在肿瘤逃逸时丢失，由此产生的EM样状态不仅不同于效应GzmC+，而且也不同于典型的效应记忆CD8 TIL状态。因此，肿瘤逃逸到正交工程化T细胞并不是通过TOX驱动的耗竭程序的重新激活介导的，而是由于缺乏肿瘤内CD8+T细胞向最佳GzmC+效应CD8+状态分化。这与PD-1阻断使耗竭的CD8+T细胞恢复活力是一个关键区别，后者在肿瘤逃逸期间重新获得耗竭表型。
总之，本实施例示出了在没有预处理、细胞因子治疗或其他支持(例如，疫苗接种)的情况下，针对ACT的CD8+T细胞的正交联合工程化，特别是分泌不与CD25和警报素IL-33结合的IL-2变体，可以控制晚期黑色素瘤。虽然联合T细胞治疗没有疗效，但CD4耗尽可使患者长期存活已被证明，这表明Treg在疾病进展中发挥作用，从而为额外的联合干预提供了机会。因此，本发明展示了联合工程T细胞临床转化的潜力，用于重新编程TME，并诱导赋有控制晚期、免疫原性差的实体瘤能力的高功能CD8+状态。
表2：各治疗组的观察到的缓解和客观缓解及临床收益的预测概率。
Figure BDA0003710138170000681
Figure BDA0003710138170000691
注：客观缓解包括完全缓解(CR；肿瘤体积减少100％)和部分缓解(PR；≤肿瘤改变-30％)。临床收益包括CR、PR和疾病稳定(-30％<肿瘤变化≤+20％)。使用精确logistic回归计算发生概率。
表3：使用线性回归法预测各组的肿瘤大小相对于基线的变化。
Figure BDA0003710138170000692
*：-100％是肿瘤大小变化的最小合理值。注:p值比较每种处理与与三联(PD1d+IL-2V+IL-33)处理的效果。模型调整后的R2：43.8％。
实施例5
CD40L诱饵和IL-2变体及联合GEEP治疗
SIN逆转录病毒载体的构建编码三聚体CD40L诱饵和不与CD25结合的IL-2变体。这些分子在NFAT下表达，因此仅在激活的T细胞中产生，而激活的T细胞只应发生在肿瘤微环境中。临床前模型显示，IL-2变体促进分化程度较低的表型，并支持体内植入(即T细胞的持久性)。在临床前研究中，还显示CD40L促进肿瘤控制。它可以作用于抗原呈递细胞，例如树突状细胞，以激活它们，从而提供更好的T细胞支持。因此，CD40L诱饵是一种肿瘤微环境重新编程。
T细胞首先用PD1诱饵-tEGFR工程化，然后通过共转导或混合不同的工程化T细胞群与CD40L诱饵和IL2V结合。如有必要，tEGFR(或称为细胞消除标签(CET))可用于评估转导效率和用于富集工程化细胞(在抗EGFR包被珠上)。它可以作为一种追踪植入后患者体内的工程化T细胞的方法(通过采集血液样本或肿瘤活检的FAC)。此外，在患者使用西妥昔单抗出现毒性时，可通过ADCC将其用作消除标签。
表4示例转基因的代表性序列
Figure BDA0003710138170000701
Figure BDA0003710138170000711
Figure BDA0003710138170000721
Figure BDA0003710138170000731
Figure BDA0003710138170000741
Figure BDA0003710138170000751
Figure BDA0003710138170000761
Figure BDA0003710138170000771
Figure BDA0003710138170000781
Figure BDA0003710138170000791
Figure BDA0003710138170000801
Figure BDA0003710138170000811
Figure BDA0003710138170000821
Figure BDA0003710138170000831
Figure BDA0003710138170000841
Figure BDA0003710138170000851
Figure BDA0003710138170000861
Figure BDA0003710138170000871
Figure BDA0003710138170000881
Figure BDA0003710138170000891
Figure BDA0003710138170000901
Figure BDA0003710138170000911
Figure BDA0003710138170000921
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Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp Arg Ser Leu Thr
1 5 10 15
Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met Leu Asn Trp Asn
35 40 45
Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Ser Asn
50 55 60
Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Thr Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala
100 105 110
Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu Arg Ile
115 120 125
Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro Lys Pro Glu Gly
130 135 140
Arg Phe Gln
145
<210> 2
<211> 288
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
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Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 3
<211> 147
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115 120 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130 135 140
Gln Phe Gln
145
<210> 4
<211> 371
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 4
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115 120 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130 135 140
Gln Phe Gln Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
145 150 155 160
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
165 170 175
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
180 185 190
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
195 200 205
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
210 215 220
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
225 230 235 240
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
245 250 255
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
260 265 270
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
275 280 285
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
290 295 300
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
305 310 315 320
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
325 330 335
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
340 345 350
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
355 360 365
Pro Gly Lys
370
<210> 5
<211> 1113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 5
cctggctggt ttctggacag ccctgacaga ccctggaatc ctccaacatt cagccccgct 60
ctgctggtgg ttaccgaggg cgataatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 120
gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 180
gcctttcctg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt tacacagctg 240
cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtccgggcca gaagaaacga cagcggcaca 300
tatctgtgcg gcgccatttc tctggcccct aaggctcaga tcaaagagag cctgagagcc 360
gagctgagag tgacagaaag acgggccgaa gtgcccacag ctcacccttc accttctcca 420
agacctgccg gccagtttca gcctccttgt cctagctgtc ctgctcctga gtttctcggc 480
ggaccctccg tgttcctgtt tcctccaaag cctaaggaca ccctgatgat cagcagaacc 540
cctgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccaagagg accctgaggt gcagttcaat 600
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcctagaga ggaacagttc 660
aacagcacct acagagtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 720
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccta gcagcatcga gaaaaccatc 780
agcaaggcca agggccagcc aagagaaccc caggtgtaca cactgcctcc aagccaagag 840
gaaatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtca agggcttcta cccttccgat 900
atcgccgtgg aatgggagag caatggccag cctgagaaca actacaagac cacacctcct 960
gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg tacagcagac tgaccgtgga caagagcaga 1020
tggcaagagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1080
acccagaagt ccctgagcct gtctcctggc aaa 1113
<210> 6
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 6
Met Ala Ser Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser
1 5 10 15
Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys
20 25 30
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Ser Pro Ser Asn Gln Asp Asp Arg Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg
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Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser
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115 120 125
Glu
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<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 7
Met Ala Ser Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser
1 5 10 15
Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys
20 25 30
Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met
35 40 45
Ser Pro Ser Asn Gln Asp Asp Arg Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg
50 55 60
Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ala Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn
65 70 75 80
Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser
85 90 95
Gly Thr Tyr Phe Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Lys Ile
100 105 110
Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Leu
115 120 125
Glu His His His His His His
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<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 8
Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu
1 5 10 15
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65 70 75 80
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 9
Met Ala Ser Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser
1 5 10 15
Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys
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Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met
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Ser Pro Ser Asn Gln Val Asp Arg Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg
50 55 60
Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ala Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 10
Met Ala Ser Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser
1 5 10 15
Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys
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Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met
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Ser Pro Ser Asn Gln Val Asp Arg Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg
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Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ala Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn
65 70 75 80
Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser
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115 120 125
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<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 11
Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser
20 25 30
Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser
35 40 45
Asn Gln Val Asp Arg Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr
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Phe Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Trp Lys Ile Lys Glu Ser
100 105 110
Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr
115 120 125
Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Pro
130 135 140
Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
145 150 155 160
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
165 170 175
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
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Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
195 200 205
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
210 215 220
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
225 230 235 240
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
245 250 255
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
260 265 270
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
275 280 285
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
290 295 300
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
305 310 315 320
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
325 330 335
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
340 345 350
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 12
Met Ala Ser Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser
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Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys
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Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 13
Met Ala Ser Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser
1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 14
Met Ala Ser Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser
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Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys
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Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Glu
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Ser Pro Ser Asn Gln Asp Asp Arg Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg
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65 70 75 80
Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser
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Gly Thr Tyr Phe Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Lys Ile
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
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Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
195 200 205
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
305 310 315 320
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
325 330 335
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
340 345 350
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
355 360 365
Gly Lys
370
<210> 15
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 15
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Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Glu
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115 120 125
Glu
<210> 16
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 16
Met Ala Ser Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser
1 5 10 15
Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys
20 25 30
Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Glu
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Glu His His His His His His
130 135
<210> 17
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 17
Met Ala Ser Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser
1 5 10 15
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Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Glu
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Gly Thr Tyr Phe Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Trp Lys Ile
100 105 110
Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu
115 120 125
Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe
130 135 140
Gln Thr Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
180 185 190
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
195 200 205
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
210 215 220
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
225 230 235 240
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
245 250 255
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
260 265 270
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
275 280 285
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
290 295 300
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
305 310 315 320
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
325 330 335
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
340 345 350
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355 360 365
Gly Lys
370
<210> 18
<211> 224
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 19
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 20
<211> 108
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 20
Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Ile Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ile Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Asp
65 70 75 80
Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Ser Tyr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 21
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 22
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 22
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 23
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 23
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Ala Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 24
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 24
gcccctacca gcagcagcac caaaaagaca cagctgcaac tggaacacct cctgctggac 60
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac cgccatgctg 120
acagccaagt tcgccatgcc taagaaggcc accgagctga agcacctcca gtgcctggaa 180
gaggccctga agcctctgga agaagtgctg aatctggccc agagcaagaa cttccacctg 240
aggcctaggg acctgatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa gggcagcgag 300
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagctacca tcgtggaatt tctgaaccgg 360
tggatcacct tcagccagag catcatcagc accctgacct ga 402
<210> 25
<211> 159
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser
1 5 10 15
Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr
20 25 30
Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val
35 40 45
Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp
50 55 60
Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp
65 70 75 80
Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys
85 90 95
Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met
100 105 110
His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe
115 120 125
Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser
130 135 140
Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr
145 150 155
<210> 26
<211> 477
<212> DNA
<213> 智人
<400> 26
agcatcaccg gcatcagccc catcacagag tatctggcca gcctgagcac ctacaacgac 60
cagagcatca cattcgccct ggaagatgag agctacgaga tctacgtgga agatctgaag 120
aaggacgaga agaaagacaa ggtgctgctg agctactacg agtctcagca ccccagcaat 180
gagtctggcg acggcgtgga cggaaagatg ctgatggtta cactgagccc caccaaggat 240
ttctggctgc acgccaacaa caaagagcac agcgtcgagc tgcacaagtg cgagaagcct 300
ctgcctgacc aggccttctt cgtgctgcac aacatgcaca gcaactgcgt gtccttcgag 360
tgcaagaccg atcctggcgt gttcatcggc gtgaaggaca accatctggc cctgatcaag 420
gtggacagca gcgagaatct gtgcaccgag aacatcctgt tcaagctgag cgagaca 477
<210> 27
<211> 158
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 27
Ser Ile Gln Gly Thr Ser Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
1 5 10 15
Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Val Ser Phe Val Leu Glu Asn Gly Cys Tyr
20 25 30
Val Ile Asn Val Asp Asp Ser Gly Lys Asp Gln Glu Gln Asp Gln Val
35 40 45
Leu Leu Arg Tyr Tyr Glu Ser Pro Cys Pro Ala Ser Gln Ser Gly Asp
50 55 60
Gly Val Asp Gly Lys Lys Leu Met Val Asn Met Ser Pro Ile Lys Asp
65 70 75 80
Thr Asp Ile Trp Leu His Ala Asn Asp Lys Asp Tyr Ser Val Glu Leu
85 90 95
Gln Arg Gly Asp Val Ser Pro Pro Glu Gln Ala Phe Phe Val Leu His
100 105 110
Lys Lys Ser Ser Asp Phe Val Ser Phe Glu Cys Lys Asn Leu Pro Gly
115 120 125
Thr Tyr Ile Gly Val Lys Asp Asn Gln Leu Ala Leu Val Glu Glu Lys
130 135 140
Asp Glu Ser Cys Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Ser Lys Ile
145 150 155
<210> 28
<211> 240
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser
20 25 30
Cys Ser Val Ala Arg Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly
35 40 45
Ala Gly Leu Ala Val Gln Gly Trp Phe Leu Leu Gln Leu His Trp Arg
50 55 60
Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp
65 70 75 80
Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala
85 90 95
His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu
100 105 110
Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr
115 120 125
His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr
130 135 140
Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser
145 150 155 160
Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu
165 170 175
Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser
180 185 190
Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His
195 200 205
Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu
210 215 220
Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val
225 230 235 240
<210> 29
<211> 167
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser
1 5 10 15
His Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu
20 25 30
Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala
35 40 45
Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys
50 55 60
Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly
65 70 75 80
Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg
85 90 95
Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser
100 105 110
Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser
115 120 125
Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val
130 135 140
Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser
145 150 155 160
Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val
165
<210> 30
<211> 501
<212> DNA
<213> 智人
<400> 30
gatggacctg ccggatcttg ggagcagctg atccaagagc ggagaagcca cgaagtgaac 60
cctgccgcac atctgacagg cgccaattct agcctgacag gctctggtgg acccctgctg 120
tgggaaactc aactgggact cgccttcctg agaggcctga gctatcatga tggcgccctg 180
gtggttacca aggccggcta ctactacatc tacagcaagg tgcagctcgg cggcgtggga 240
tgtcctcttg gactggcctc tacaatcacc cacggcctgt acaagcggac ccctagatac 300
cccgaggaac tggaactgct ggtgtcccag cagagccctt gtggcagagc cacaagcagc 360
agcagagttt ggtgggacag cagctttctc ggcggagtgg tgcatctgga agccggcgaa 420
aaggtggtcg tcagagtgct ggatgagaga ctcgtgcggc tgagagatgg caccagaagc 480
tacttcggcg ccttcatggt t 501
<210> 31
<211> 168
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 31
Asp Gly Gly Lys Gly Ser Trp Glu Lys Leu Ile Gln Asp Gln Arg Ser
1 5 10 15
His Gln Ala Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ala Ser Leu
20 25 30
Ile Gly Ile Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Arg Leu Gly Leu Ala
35 40 45
Phe Leu Arg Gly Leu Thr Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Thr Met Glu
50 55 60
Pro Gly Tyr Tyr Tyr Val Tyr Ser Lys Val Gln Leu Ser Gly Val Gly
65 70 75 80
Cys Pro Gln Gly Leu Ala Asn Gly Leu Pro Ile Thr His Gly Leu Tyr
85 90 95
Lys Arg Thr Ser Arg Tyr Pro Lys Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Arg
100 105 110
Arg Ser Pro Cys Gly Arg Ala Asn Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser
115 120 125
Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Glu Val Val
130 135 140
Val Arg Val Pro Gly Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Asp Gly Thr Arg
145 150 155 160
Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val
165
<210> 32
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
100 105 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145 150 155 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165 170 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195 200 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
210 215 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245 250 255
Gly Leu Leu Lys Leu
260
<210> 33
<211> 149
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 33
Met Gln Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Val Ser
1 5 10 15
Glu Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly
20 25 30
Tyr Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val Met Leu Glu Asn Gly Lys Gln
35 40 45
Leu Thr Val Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Thr Gln Val Thr
50 55 60
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gln Arg Pro Phe Ile Val Gly
65 70 75 80
Leu Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala
85 90 95
Ala Asn Thr His Ser Ser Ser Gln Leu Cys Glu Gln Gln Ser Val His
100 105 110
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
115 120 125
Val Thr Glu Ala Ser Gln Val Ile His Arg Val Gly Phe Ser Ser Phe
130 135 140
Gly Leu Leu Lys Leu
145
<210> 34
<211> 149
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
1 5 10 15
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
20 25 30
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
35 40 45
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
50 55 60
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
65 70 75 80
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
85 90 95
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
100 105 110
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
115 120 125
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
130 135 140
Gly Leu Leu Lys Leu
145
<210> 35
<211> 447
<212> DNA
<213> 智人
<400> 35
atgcagaagg gcgaccagaa tcctcagatc gccgctcacg tgatcagcga ggccagcagc 60
aagacaacaa gcgtgctgca gtgggccgag aagggctact acaccatgag caacaacctg 120
gtcaccctgg aaaacggcaa gcagctgacc gtgaagagac agggcctgta ctacatctac 180
gcccaagtga ccttctgcag caacagagag gccagctctc aggccccttt tatcgccagc 240
ctgtgcctga agtcccctgg cagattcgag cggattctgc tgagagccgc caacacacac 300
agcagcgcca aaccttgtgg ccagcagtct attcacctcg gcggagtgtt tgagctgcag 360
cctggcgcaa gcgtgttcgt gaatgtgaca gaccctagcc aggtgtccca cggcaccggc 420
tttacatctt tcggcctgct gaagctg 447
<210> 36
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 36
Met Gly Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe
1 5 10 15
Ser Thr Thr Ala Leu Ser Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu
20 25 30
Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile
35 40 45
Lys Lys Leu Ile Gly Glu Val Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His
65 70 75 80
Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala
85 90 95
Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn
100 105 110
Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala
115 120 125
Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe
130 135 140
Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu
145 150 155 160
Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln
165 170 175
Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val
180 185 190
Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe
195 200 205
Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
210 215
<210> 37
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 37
atgggaacaa acaaatgcct gctgcagatc gccctgctgc tgtgctttag cacaacagcc 60
ctgagccgga tgaagcagat cgaggacaag atcgaagaga tcctgagcaa gatctaccac 120
atcgagaacg agatcgcccg gatcaagaaa ctgatcggcg aagtcggcgg aggctctggt 180
ggtggatctg gcggaggatc tatgcagaaa ggcgaccaga atcctcagat cgccgctcac 240
gtgatcagcg aggccagcag caagacaaca agcgtgctgc agtgggccga gaagggctac 300
tacaccatga gcaacaacct ggtcaccctg gaaaacggca agcagctgac cgtgaagaga 360
cagggcctgt actacatcta cgcccaagtg accttctgca gcaacagaga ggccagctct 420
caggcccctt ttatcgccag cctgtgcctg aagtcccctg gcagattcga gcggattctg 480
ctgagagccg ccaacacaca cagcagcgcc aaaccttgtg gccagcagtc tattcacctc 540
ggcggagtgt ttgagctgca gcctggcgca agcgtgttcg tgaatgtgac agaccctagc 600
caggtgtccc acggcaccgg ctttacatct ttcggcctgc tgaagctctg a 651
<210> 38
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
100 105 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145 150 155 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165 170 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195 200 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
210 215 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245 250 255
Gly Leu Leu Lys Leu
260
<210> 39
<211> 182
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 39
Met Asn Asn Arg Trp Ile Leu His Ala Ala Phe Leu Leu Cys Phe Ser
1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Ile Asn Tyr Lys Gln Leu Gln Leu Gln Glu Arg
20 25 30
Thr Asn Ile Arg Lys Cys Gln Glu Leu Leu Glu Gln Leu Asn Gly Lys
35 40 45
Ile Asn Leu Thr Tyr Arg Ala Asp Phe Lys Ile Pro Met Glu Met Thr
50 55 60
Glu Lys Met Gln Lys Ser Tyr Thr Ala Phe Ala Ile Gln Glu Met Leu
65 70 75 80
Gln Asn Val Phe Leu Val Phe Arg Asn Asn Phe Ser Ser Thr Gly Trp
85 90 95
Asn Glu Thr Ile Val Val Arg Leu Leu Asp Glu Leu His Gln Gln Thr
100 105 110
Val Phe Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Gln Glu Glu Arg Leu Thr
115 120 125
Trp Glu Met Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Lys Ser Tyr Tyr Trp Arg
130 135 140
Val Gln Arg Tyr Leu Lys Leu Met Lys Tyr Asn Ser Tyr Ala Trp Met
145 150 155 160
Val Val Arg Ala Glu Ile Phe Arg Asn Phe Leu Ile Ile Arg Arg Leu
165 170 175
Thr Arg Asn Phe Gln Asn
180
<210> 40
<211> 357
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 41
<211> 1074
<212> DNA
<213> 智人
<400> 41
atgcttctgc tggttacatc tctgctgctg tgcgagctgc cccatcctgc ctttctgctg 60
atccccagaa aagtgtgcaa cggcatcggc atcggagagt tcaaggacag cctgagcatc 120
aacgccacca acatcaagca cttcaagaac tgcaccagca tcagcggcga cctgcacatt 180
ctgcctgtgg cctttagagg cgacagcttc acccacacac ctccactcga tccccaagag 240
ctggacatcc tgaaaaccgt gaaagagatc accggatttc tgttgatcca ggcttggccc 300
gagaaccgga cagatctgca cgccttcgag aacctggaaa tcatcagagg ccggaccaag 360
cagcacggcc agttttctct ggctgtggtg tccctgaaca tcaccagcct gggcctgaga 420
agcctgaaag aaatcagcga cggcgacgtg atcatctccg gcaacaagaa cctgtgctac 480
gccaacacca tcaactggaa gaagctgttc ggcaccagcg gccagaaaac aaagatcatc 540
agcaaccggg gcgagaacag ctgcaaggct acaggccaag tgtgccacgc tctgtgtagc 600
cctgaaggct gttggggacc cgagcctaga gattgcgtgt cctgcagaaa cgtgtcccgg 660
ggcagagaat gcgtggacaa gtgcaatctg ctggaaggcg agccccgcga gttcgtggaa 720
aacagcgagt gcatccagtg tcaccccgag tgtctgcccc aggccatgaa cattacctgt 780
accggcagag gccccgacaa ctgtattcag tgcgcccact acatcgacgg ccctcactgc 840
gtgaaaacat gtcctgctgg cgtgatggga gagaacaaca ccctcgtgtg gaagtatgcc 900
gacgccggac atgtgtgcca cctgtgtcac cctaattgca cctacggctg tacaggccct 960
ggcctggaag gctgtccaac aaacggacct aagatcccct ctatcgccac cggcatggtt 1020
ggagccctgc tgctgcttct ggttgtggcc cttggcatcg gcctgtttat gtag 1074
<210> 42
<211> 752
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 42
Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser
20 25 30
Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser
35 40 45
Asn Gln Asp Asp Arg Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro
50 55 60
Gly Gln Asp Ala Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp
65 70 75 80
Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr
85 90 95
Phe Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Lys Ile Lys Glu Ser
100 105 110
Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr
115 120 125
Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Pro
130 135 140
Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
145 150 155 160
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
165 170 175
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
180 185 190
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
195 200 205
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
210 215 220
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
225 230 235 240
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
245 250 255
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
260 265 270
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
275 280 285
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
290 295 300
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
305 310 315 320
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
325 330 335
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
340 345 350
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ala
355 360 365
Ser Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu
370 375 380
Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu Leu Val
385 390 395 400
Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile
405 410 415
Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser
420 425 430
Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser
435 440 445
Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser
450 455 460
Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys
465 470 475 480
Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu
485 490 495
Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly
500 505 510
Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn
515 520 525
Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp
530 535 540
Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn
545 550 555 560
Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser
565 570 575
Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala
580 585 590
Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val
595 600 605
Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn
610 615 620
Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile
625 630 635 640
Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr
645 650 655
Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly
660 665 670
Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn
675 680 685
Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys
690 695 700
His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys
705 710 715 720
Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly
725 730 735
Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
740 745 750
<210> 43
<211> 2259
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 43
gacagccctg acagaccctg gaatcctcca acattcagcc ccgctctgct ggtggttacc 60
gagggcgata atgccacctt cacctgtagc ttcagcaaca ccagcgagag cttcgtgctg 120
aactggtaca gaatgagccc cagcaaccag gacgacagac tggccgcctt tcctgaggat 180
agatctcagc ccggccagga cgcccggttc agagttacac agctgcccaa cggccgggac 240
ttccacatgt ctgtcgtccg ggccagaaga aacgacagcg gcacatattt ttgcggcgcc 300
atttctctgg cccctaaggc taaaatcaaa gagagcctga gagccgagct gagagtgaca 360
gaaagacggg ccgaagtgcc cacagctcac ccttcacctt ctccaagacc tgccggccag 420
tttcagactc ctccttgtcc tagctgtcct gctcctgagt ttctcggcgg accctccgtg 480
ttcctgtttc ctccaaagcc taaggacacc ctgatgatca gcagaacccc tgaagtgacc 540
tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaagaggac cctgaggtgc agttcaattg gtacgtggac 600
ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cctagagagg aacagttcaa cagcacctac 660
agagtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa agagtacaag 720
tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcctagc agcatcgaga aaaccatcag caaggccaag 780
ggccagccaa gagaacccca ggtgtacaca ctgcctccaa gccaagagga aatgaccaag 840
aaccaggtgt ccctgacctg cctggtcaag ggcttctacc cttccgatat cgccgtggaa 900
tgggagagca atggccagcc tgagaacaac tacaagacca cacctcctgt gctggacagc 960
gacggctcat tcttcctgta cagcagactg accgtggaca agagcagatg gcaagagggc 1020
aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1080
ctgagcctgt ctctgggcaa agccagccgg aagagaagat ctggatctgg cgaaggcaga 1140
ggctccctgc tgacttgcgg agatgtggaa gagaaccccg gacctatgct tctgctggtt 1200
acatctctgc tgctgtgcga gctgccccat cctgcctttc tgctgatccc cagaaaagtg 1260
tgcaacggca tcggcatcgg agagttcaag gacagcctga gcatcaacgc caccaacatc 1320
aagcacttca agaactgcac cagcatcagc ggcgacctgc acattctgcc tgtggccttt 1380
agaggcgaca gcttcaccca cacacctcca ctcgatcccc aagagctgga catcctgaaa 1440
accgtgaaag agatcaccgg atttctgttg atccaggctt ggcccgagaa ccggacagat 1500
ctgcacgcct tcgagaacct ggaaatcatc agaggccgga ccaagcagca cggccagttt 1560
tctctggctg tggtgtccct gaacatcacc agcctgggcc tgagaagcct gaaagaaatc 1620
agcgacggcg acgtgatcat ctccggcaac aagaacctgt gctacgccaa caccatcaac 1680
tggaagaagc tgttcggcac cagcggccag aaaacaaaga tcatcagcaa ccggggcgag 1740
aacagctgca aggctacagg ccaagtgtgc cacgctctgt gtagccctga aggctgttgg 1800
ggacccgagc ctagagattg cgtgtcctgc agaaacgtgt cccggggcag agaatgcgtg 1860
gacaagtgca atctgctgga aggcgagccc cgcgagttcg tggaaaacag cgagtgcatc 1920
cagtgtcacc ccgagtgtct gccccaggcc atgaacatta cctgtaccgg cagaggcccc 1980
gacaactgta ttcagtgcgc ccactacatc gacggccctc actgcgtgaa aacatgtcct 2040
gctggcgtga tgggagagaa caacaccctc gtgtggaagt atgccgacgc cggacatgtg 2100
tgccacctgt gtcaccctaa ttgcacctac ggctgtacag gccctggcct ggaaggctgt 2160
ccaacaaacg gacctaagat cccctctatc gccaccggca tggttggagc cctgctgctg 2220
cttctggttg tggcccttgg catcggcctg tttatgtag 2259
<210> 44
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 44
Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser
20 25 30
Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser
35 40 45
Asn Gln Val Asp Arg Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro
50 55 60
Gly Gln Asp Ala Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp
65 70 75 80
Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr
85 90 95
Phe Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Trp Lys Ile Lys Glu Ser
100 105 110
Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Pro Pro Cys Pro Ser
115 120 125
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
130 135 140
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
145 150 155 160
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
165 170 175
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
180 185 190
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
195 200 205
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
210 215 220
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
225 230 235 240
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
245 250 255
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
260 265 270
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
275 280 285
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
290 295 300
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
305 310 315 320
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
325 330 335
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ala Ser Arg Lys Arg
340 345 350
Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
355 360 365
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu
370 375 380
Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val
385 390 395 400
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
405 410 415
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
420 425 430
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
435 440 445
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
450 455 460
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
465 470 475 480
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
485 490 495
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
500 505 510
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
515 520 525
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
530 535 540
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
545 550 555 560
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
565 570 575
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
580 585 590
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
595 600 605
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
610 615 620
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
625 630 635 640
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
645 650 655
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
660 665 670
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
675 680 685
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
690 695 700
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
705 710 715 720
Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
725 730
<210> 45
<211> 675
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe
385 390 395 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405 410 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg
420 425 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu
435 440 445
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465 470 475 480
Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
500 505 510
Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys
515 520 525
Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys
530 535 540
Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545 550 555 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln
610 615 620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645 650 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660 665 670
Ile Leu Ile
675
<210> 46
<211> 2028
<212> DNA
<213> 智人
<400> 46
atgcttctgc tggttacatc tctgctgctg tgcgagctgc cccatcctgc ctttctgctg 60
atccccacac aagtgtgcac cggcaccgac atgaagctga gactgcctgc ctctcctgag 120
acacacctgg acatgctgag acacctgtac cagggctgtc aggtggtgca gggcaatctg 180
gaactgacct acctgcctac caacgccagc ctgagctttc tgcaggacat ccaagaggtg 240
cagggatacg tgctgattgc ccacaatcaa gtgcgccagg tgccactgca gcggctgaga 300
atcgttagag gcacccagct gttcgaggac aactatgccc tggccgtgct ggacaatggc 360
gaccctctga acaacaccac acctgtgaca ggcgcttctc ctggcggact gagagaactg 420
cagctgagaa gcctgaccga gatcctgaaa ggcggcgtgc tgatccagag aaaccctcag 480
ctgtgctacc aggacaccat cctgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggcc 540
ctgacactga tcgacaccaa cagaagcaga gcctgccatc cttgcagccc catgtgcaag 600
ggctctagat gttggggcga gagcagcgag gattgccaga gcctgaccag aacagtgtgt 660
gccggcggat gtgccagatg caaaggacct ctgcctaccg actgctgcca cgagcaatgt 720
gccgctggat gtacaggccc caagcactct gattgcctgg cctgcctgca cttcaaccac 780
tctggaatct gcgaactgca ctgccccgct ctggtcacct acaacaccga taccttcgag 840
agcatgccca atcctgaggg cagatacacc ttcggcgcca gctgtgtgac agcctgtcct 900
tacaactacc tgagcaccga cgtgggcagc tgtacccttg tgtgccctct gcataatcaa 960
gaagtgaccg ccgaggacgg cacccagaga tgcgagaagt gtagcaagcc ttgcgccaga 1020
gtgtgttacg gcctcggcat ggaacacctg agagaagtgc gggccgtgac cagcgccaat 1080
atccaagaat ttgccggctg caagaagatc tttggcagcc tcgccttcct gcctgagagc 1140
ttcgatggcg atcctgccag caatactgcc cctctgcagc ctgaacagct ccaggtgttc 1200
gagacactgg aagagatcac cggctacctg tatatcagcg cctggccaga cagcctgcct 1260
gacctgtccg tgttccagaa cctgcaagtg atccggggca gaatcctgca caacggcgcc 1320
tattctctga ccctgcaagg cctgggaatc agctggctgg gactgagatc cctgagagag 1380
cttggatctg gcctggctct gatccaccac aatacccacc tgtgcttcgt gcacaccgtg 1440
ccttgggacc agctgtttcg gaatcctcat caggccctgc tgcacaccgc caacagacct 1500
gaggatgagt gtgttggcga aggcctggct tgtcaccagc tctgtgctag aggacactgt 1560
tggggccctg gacctacaca gtgcgtgaac tgtagccagt tcctgcgggg ccaagagtgc 1620
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gccgatcagt gcgtggcctg tgctcactac aaggaccctc cattctgcgt ggccagatgt 1800
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ggatgtccag ccgagcagag agcctctcca ctgacctcta tcatctctgc cgtcgtgggc 1980
atcctgctgg tggtggttct gggcgttgtg ttcggcatcc tgatttga 2028
<210> 47
<211> 1070
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 47
Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser
20 25 30
Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr
85 90 95
Phe Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Lys Ile Lys Glu Ser
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Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr
115 120 125
Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Pro
130 135 140
Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
145 150 155 160
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
165 170 175
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
180 185 190
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
195 200 205
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
210 215 220
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
225 230 235 240
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
245 250 255
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
260 265 270
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
275 280 285
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
290 295 300
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
305 310 315 320
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
325 330 335
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
340 345 350
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ala
355 360 365
Ser Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu
370 375 380
Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu Leu Val
385 390 395 400
Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile
405 410 415
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420 425 430
Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys
435 440 445
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450 455 460
Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu
465 470 475 480
Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile
485 490 495
Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp
545 550 555 560
Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu
565 570 575
Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro
580 585 590
Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln
595 600 605
Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly
610 615 620
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625 630 635 640
Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser
645 650 655
Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp
660 665 670
Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala
675 680 685
Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly
690 695 700
Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu
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Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val
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Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile
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Leu Ile
1070
<210> 48
<211> 1050
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 48
Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser
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35 40 45
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65 70 75 80
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Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
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Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His
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<212> PRT
<213> 智人
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<210> 51
<211> 692
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
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245 250 255
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275 280 285
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物质
<400> 52
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210 215 220
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
225 230 235 240
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
245 250 255
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
260 265 270
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
275 280 285
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
290 295 300
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
305 310 315 320
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
325 330 335
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
340 345 350
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ala
355 360 365
Ser Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu
370 375 380
Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Thr Thr Pro Arg
385 390 395 400
Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro Met Lys Gly Pro Ile
405 410 415
Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg Arg Met Ser Ser Leu
420 425 430
Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu Ser Lys Thr Leu Gly
435 440 445
Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile Ala Leu Gly Gly Leu
450 455 460
Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile Cys Val Thr Val Trp
465 470 475 480
Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile Ser Gly Ser Leu Leu
485 490 495
Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu Val Lys Gly Lys Met
500 505 510
Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile Ser Gly Met Ile Leu
515 520 525
Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met
530 535 540
Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr
545 550 555 560
Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln
565 570 575
Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser Val Met
580 585 590
Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile Ala Gly Ile Val Glu
595 600 605
Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys Ser Asn Ile Val Leu
610 615 620
Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile Glu Ile Lys Glu Glu
625 630 635 640
Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro Lys Asn Glu Glu Asp
645 650 655
Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu Glu Glu Thr Glu Thr
660 665 670
Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser Ser Pro Ile Glu Asn
675 680 685
Asp Ser Ser Pro
690

Claims (55)

1.一种组合物，包含基因修饰的淋巴细胞，所述多个淋巴细胞表达用于调节受试者免疫系统的至少两个转基因。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述转基因选自抗体、抗体片段、受体、诱饵、检查点阻断调节剂、细胞因子、趋化因子、激素、细胞消除标签及其组合。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述诱饵选自PD1、CTLA4、LAG3、VEGFR1、TIM3、TIGIT和SIRPα诱饵。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述诱饵是PD1诱饵。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述PD-1诱饵是PD-1.IgG4诱饵。
6.如权利要求2所述的组合物，其中所述细胞因子选自：LIGHT或其变体、IL-33或其变体、IL-2或其变体、IL-15或其变体、IL-12或其变体和CD40L或其变体。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述细胞因子是突变细胞因子。
8.如权利要求2所述的组合物，其中所述细胞消除标签选自截断的EGFR(tEGFR)、HER2、CD20和CD19。
9.如前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述至少两个转基因包含PD-1诱饵或其变体、IL-2变体、LIGHT或其变体、IL-33或其变体和CD40L或其变体中的两个或多个。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述至少两个转基因还包含tEGFR或其变体、截断的HER2(tHER2)或其变体、CD20或其变体、或CD19或其变体。
11.如权利要求9或10所述的组合物，其中所述至少两个转基因包含：
(a)所述PD-1诱饵或其变体和所述tEGFR或其变体；
(b)所述PD-1诱饵或其变体和所述IL-2变体；
(c)所述PD-1诱饵或其变体和所述LIGHT或其变体；
(d)所述PD-1诱饵或其变体和所述IL-33或其变体；
(e)所述PD-1诱饵或其变体和所述CD40L或其变体；
(f)所述PD-1诱饵或其变体、所述IL-2变体和所述IL-33或其变体；
(g)所述PD-1诱饵或其变体、所述tEGFR或其变体和所述IL-2变体；
(h)所述PD-1诱饵或其变体，所述tEGFR或其变体和所述LIGHT或其变体；
(i)所述PD-1诱饵或其变体、所述tEGFR或其变体和所述IL-33或其变体；
(j)所述PD-1诱饵或其变体、所述tEGFR或其变体和所述CD40L或其变体；
(k)所述PD-1诱饵或其变体、所述tEGFR或其变体、所述IL-2变体和所述IL-33或其变体；
(l)所述PD-1诱饵或其变体、所述tEGFR或其变体、所述IL-2变体和所述CD40L或其变体；或
(m)所述PD-1诱饵或其变体、所述tEGFR或其变体、所述IL-33变体和所述CD40L或其变体。
12.如权利要求10所述的组合物，其中所述PD-1诱饵或其变体与所述tEGFR或其变体、所述tHER2或其变体、所述CD20或其变体、所述CD19或其变体包含在同一载体上。
13.如权利要求4-5和9-11中任一项所述的组合物，其中所述PD-1诱饵包含SEQ ID NO:1-4、6-17、42、44、47-48和51-52中任一条的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1-4、6-17、42、44、47-48和51-52中任一条具有至少80％一致性的氨基酸序列。
14.如权利要求6-13中任一项所述的组合物，其中所述IL-2变体包含SEQ ID NO:21-23中任一条的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21-23中任一条具有至少80％一致性的氨基酸序列。
15.如权利要求6-14中任一项所述的组合物，其中所述IL-33包含SEQ ID NO:25和27中任一条的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25和27中任一条具有至少80％一致性的氨基酸序列。
16.如权利要求6-15中任一项所述的组合物，其中所述LIGHT包含SEQ ID NO:28-29和31中任一条的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28-29和31中任一条具有至少80％一致性的氨基酸序列。
17.如权利要求6-16中任一项所述的组合物，其中所述CD40L包含SEQ ID NO:32-34、36和38中任一条的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:32-34、36和38中任一条具有至少80％一致性的氨基酸序列。
18.如权利要求2和10-17中任一项所述的组合物，其中：所述tEGFR包含与SEQ ID NO:40具有至少80％一致性的氨基酸序列或SEQ ID NO:40的氨基酸序列；所述HER2包含与SEQID NO:45具有至少80％一致性的氨基酸序列或SEQ ID NO:45的氨基酸序列；所述CD20包含与SEQ ID NO:49具有至少80％一致性的氨基酸序列或SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
19.如权利要求2所述的组合物，其中所述抗体或抗体片段选自VEGF、TGF-B、4-1BB、CD28、CD27、NKG2D、PD1、PDL1和CTLA4抗体。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述抗体是PD1抗体。
21.如前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述多个淋巴细胞包含至少两个淋巴细胞亚群。
22.如前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述多个淋巴细胞由两个淋巴细胞亚群组成。
23.如权利要求21或22所述的组合物，其中所述多个淋巴细胞的每个亚群至少表达一个转基因。
24.如权利要求21-23中任一项所述的组合物，其中所述至少两个转基因彼此不同。
25.如权利要求21-24中任一项所述的组合物，其中所述多个淋巴细胞包括：(i)至少表达两个转基因的第一亚群；和(ii)至少表达两个转基因的第二亚群，其中所述第一亚群的至少一个转基因不同于所述第二亚群的转基因，或者其中所述第一亚群的至少一个转基因与所述第二亚群的转基因相同。
26.如权利要求25所述的组合物，其中：
(i)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和IL-2变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和LIGHT或其变体；
(ii)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和IL-2变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和IL-33或其变体；
(iii)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和IL-2变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和CD40L或其变体；
(iv)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和LIGHT或其变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和IL-33或其变体；或
(v)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和LIGHT或其变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和CD40L或其变体；或
(vi)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和IL-33或其变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体和CD40L或其变体。
27.如权利要求26所述的组合物，其中所述第一亚群或所述第二亚群还表达tEGFR或其变体、tHER2或其变体、CD20或其变体、或CD19或其变体。
28.如权利要求27所述的组合物，其中：
(i)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和IL-2变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和LIGHT或其变体；
(ii)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和IL-2变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和IL-33或其变体；
(iii)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和IL-2变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和CD40L或其变体；
(iv)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体，tEGFR或其变体和LIGHT或其变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体，tEGFR或其变体和IL-33或其变体；
(v)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和LIGHT或其变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和CD40L或其变体；或
(vi)所述第一亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和IL-33或其变体，所述第二亚群至少表达PD-1诱饵或其变体、tEGFR或其变体和CD40L或其变体。
29.如权利要求21至28中任一项所述的组合物，其中所述两个亚群以约1:1至约1:100之比例组合。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述两个亚群以约1:1的比例组合。
31.如前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述淋巴细胞为自体淋巴细胞。
32.如前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述淋巴细胞为肿瘤浸润淋巴细胞。
33.如前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述淋巴细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。
34.如前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述淋巴细胞表达重组T细胞受体(TCR)。
35.如权利要求34所述的淋巴细胞组合物，其中所述重组T细胞受体(TCR)显示出针对NY-ESO1、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGEA-10、MAGE-C2、SSX2、MAGE-A12或其组合的反应性。
36.一种药物组合物，其中包含有效量的前述权利要求任一项所述的组合物和医药上可接受的载体。
37.如权利要求32所述的药物组合物，其中还包含第二治疗剂。
38.一种试剂盒，其中包含有效量的权利要求1-35中任一项所述的组合物或权利要求36-37中任一项所述的药物组合物。
39.一种制备权利要求1-35中任一项所述组合物的方法，包括：
提供多个淋巴细胞；
向所述多个淋巴细胞引入编码至少两个转基因的核酸分子，以获得基因修饰的多个淋巴细胞；和
在细胞培养基中扩增所述基因修饰的多个淋巴细胞。
40.一种制备权利要求1-35中任一项所述组合物的方法，包括：
提供多个淋巴细胞；
向所述多个淋巴细胞引入两个或多个核酸分子，所述两个或多个核酸分子中的每一个编码至少一个转基因，从而获得基因修饰的多个淋巴细胞；和
在细胞培养基中扩增所述基因修饰的多个淋巴细胞。
41.如权利要求39或40所述的方法，其中所述至少两个转基因包含PD-1诱饵、IL-2变体、LIGHT或其变体、IL-33或其变体和CD40L或其变体中的两个或多个。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述至少两个转基因还包含tEGFR或其变体、tHER2或其变体、CD20或其变体、或CD19或其变体。
43.如权利要求41或42所述的方法，其中所述至少两个转基因包含：
(a)所述PD-1诱饵或其变体和所述tEGFR或其变体；
(b)所述PD-1诱饵或其变体和所述IL-2变体；
(c)所述PD-1诱饵或其变体和所述LIGHT或其变体；
(d)所述PD-1诱饵或其变体和所述IL-33或其变体；
(e)所述PD-1诱饵或其变体和所述CD40L或其变体；
(f)所述PD-1诱饵或其变体、所述IL-2变体和所述IL-33或其变体；
(g)所述PD-1诱饵或其变体、所述tEGFR或其变体和所述IL-2变体；
(h)所述PD-1诱饵或其变体，所述tEGFR或其变体，和所述LIGHT或其变体；
(i)所述PD-1诱饵或其变体、所述tEGFR或其变体、所述IL-33或其变体；
(j)所述PD-1诱饵或其变体、所述tEGFR或其变体、所述CD40L或其变体；
(k)所述PD-1诱饵或其变体、所述tEGFR或其变体、所述IL-2变体和所述IL-33或其变体；
(l)所述PD-1诱饵或其变体、所述tEGFR或其变体、所述IL-2变体和所述CD40L或其变体；或
(m)所述PD-1诱饵或其变体、所述tEGFR或其变体、所述IL-33变体和所述CD40L或其变体。
44.如权利要求42所述的方法，其中所述PD-1诱饵与所述tEGFR或其变体、所述tHER2或其变体、所述CD20或其变体、所述CD19或其变体被包含在同一载体上。
45.一种制备权利要求21-35中任一项所述组合物的方法，其中包括：
向第一多个淋巴细胞引入编码至少两个转基因的第一核酸分子，以获得基因修饰的第一多个淋巴细胞；和
向第二多个淋巴细胞引入编码至少两个转基因的第二核酸分子，以获得基因修饰的第二多个淋巴细胞。
46.如权利要求45所述的方法，其中包括在引入所述第一核酸的步骤后在细胞培养基中扩增所述第一多个淋巴细胞，或在引入所述第二核酸的步骤后在细胞培养基中扩增所述第二多个淋巴细胞。
47.如权利要求45或46之方法，其中还包含以约1:1至约1:100之间的预定比例将所述基因修饰的第一多个淋巴细胞与所述基因修饰的第一多个淋巴细胞组合。
48.如权利要求39-40和46中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基是限定的细胞培养基。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述细胞培养基包含新抗原肽。
50.一种治疗受试者的癌症/肿瘤或慢性感染的方法，其中包括向有需要的受试者施用有效治疗量的如权利要求1-35中任一项的组合物或如权利要求36-37中任一项的药物组合物。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、微卫星高度不稳定型肿瘤、头颈部肿瘤、肾癌和乳腺癌。
52.如权利要求50或51所述的方法，其中所述组合物通过静脉输液施用。
53.如权利要求50-52中任一项所述的方法，其中还包括向受试者施用第二治疗剂。
54.如权利要求53所述的方法和如权利要求37所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂是抗癌剂或抗肿瘤剂。
55.如权利要求53或54所述的方法，其中所述组合物或药物组合物在所述第二治疗剂之前、之后或伴随施用于所述受试者。
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