JP2022531911A - Ｂｃｍａを標的とする操作された免疫細胞及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＢＣＭＡを標的とする操作された免疫細胞及びその使用を提供する。特に、本発明は、ＢＣＭＡを特異的に標的とするＣＡＲを提供し、該ＣＡＲは、Ｓ由来のｓｃＦｖである抗原結合ドメイン、配列番号９に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１０に示される抗体軽鎖可変領域を含む。本発明はまた、該ＣＡＲを含むＣＡＲ－Ｔ細胞、Ｓ由来のｓｃＦｖを含む二重ＣＡＲ－及びＣＡＲ－Ｔ細胞、並びにその関連使用を提供する。他のｓｃＦｖを使用して構築されたＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、本発明の構築ＣＡＲ－Ｔ細胞は、より良好な死滅効果及び腫瘍除去能を有する。

Description

[0001]本発明は、免疫療法の分野、より具体的には、ＢＣＭＡを標的とする操作された免疫細胞及びその使用に関する。

[0002]多発性骨髄腫（ＭＭ）は、悪性形質細胞腫瘍である。該腫瘍細胞は、骨髄中の形質細胞に由来し、形質細胞は、Ｂリンパ球の最終的な機能的段階に発達する細胞である。多発性骨髄腫は、高い罹患率及び高い死亡率の特徴を有する基本的に不治の疾患である。２０１７年の統計では、米国において、新たに診断された多発性骨髄腫患者が３０，０００人存在し、その中で、１２，０００人が死に直面し得る。目下、多発性骨髄腫のための一般的な治療法として、細胞傷害性薬物療法、プロテアーゼ阻害剤（ボルテゾミブ等）、レナリドミド、モノクローナル抗体、コルチコステロイド等が挙げられる。しかしながら、現行の治療法は全て、部分的に有効であり、持続的な軽減効果を有さず、高い再発リスクを有する。したがって、多発性骨髄腫の治療法の改善は、特に重要であると思われる。

[0003]したがって、当該技術分野において、多発性骨髄腫のための有効で、再発率が低く、かつ安全な治療法の必要性に迫られている。

[0004]本発明の目的は、ＢＣＭＡを標的とする操作された免疫細胞及びその使用を提供することである。
[0005]本発明の別の目的は、ＣＤ１９及びＢＣＭＡの両方を標的とする操作された免疫細胞並びにその使用を提供することである。

[0006]本発明の第１の態様では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴＣＲが提供され、ＣＡＲ又はＴＣＲの抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）は、配列番号９に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１０に示される抗体軽鎖可変領域を含む。

[0007]別の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域との間に位置するリンカーペプチドを更に含む。
[0008]別の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは、下記式Ａ又は式Ｂ：
Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ、（Ａ）； Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ、（Ｂ）
（式中、Ｖ_Ｈは、抗体重鎖可変領域であり；Ｖ_Ｌは、抗体軽鎖可変領域であり；「－」は、リンカーペプチド又はペプチド結合である）
で示される通りである。

[0009]別の好ましい実施形態では、Ｖ_Ｈと、Ｖ_Ｌとの間のリンカーペプチドは、１個～４個、好ましくは１個～４個、より好ましくは配列番号７（ＧＧＧＧＳ）に示されるように３個～４個の連続配列である。

[0010]別の好ましい実施形態では、ＣＡＲは、下記式Ｉ：
Ｌ－ｓｃＦｖ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （Ｉ）
（式中、
「－」は、それぞれ独立して、リンカーペプチド又はペプチド結合であり；
Ｌは、不在であるか、又はシグナルペプチド配列であり；
Ｈは、不在であるか、又はヒンジ領域であり；
ＴＭは、膜貫通ドメインであり；
Ｃは、共刺激シグナル分子であり、
ＣＤ３ζは、ＣＤ３ζに由来する細胞質シグナル伝達配列である）
で示される構造を有する。

[0011]本発明の第２の態様では、二重特異性ＣＡＲ又はＴＣＲが提供され、該二重特異性ＣＡＲ又はＴＣＲは、ＢＣＭＡ及び第１の標的を標的とし、
該二重特異性ＣＡＲにおける該ＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）は、配列番号９に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１０に示される抗体軽鎖可変領域を含み、
該第１の標的は、
ＣＤ１３８、カッパ軽鎖、ＮＫＧ２Ｄ－リガンド、ＴＡＣＩ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１５１、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、ＣＬＬ１、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦＲ－２、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３、ＰＭＳＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ－４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、Ｆｌｔ１、ＫＤＲ、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、Ｌｅｗｉｓ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＳＣＡ、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＳＬＮ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＬＴＰＲ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ－１、Ｒｏｂｏｌ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、Ｎｏｔｃｈ－１－４、ＡＰＲＩＬ、ＣＳ１、ＭＡＧＥ３、クローディン１８．２、葉酸受容体α、葉酸受容体β、ＧＰＣ２、ＣＤ７０、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＴＲＯＰ－２、又はそれらの組合せ
からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、該二重特異性ＣＡＲ又はＴＣＲは、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインを含む。

[0012]別の好ましい実施形態では、第１の標的はＣＤ１９であり、二重特異性ＣＡＲにおける該ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）は、配列番号１１に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１２に示される抗体軽鎖可変領域を含む。

[0013]別の好ましい実施形態では、第１の標的はＣＤ１９であり、二重特異性ＣＡＲにおける該ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）は、配列番号２１～配列番号３０のいずれか１つに示される抗体重鎖可変領域及び配列番号３１～配列番号３６のいずれか１つに示される抗体軽鎖可変領域を含む。

[0014]特定の配列は、以下に示される通りである：
配列番号２１に示されるＣＤ１９抗体重鎖可変領域（Ｈ９）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＳＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；
配列番号２２に示されるＣＤ１９抗体重鎖可変領域（Ｈ１）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ；
配列番号２３に示されるＣＤ１９抗体重鎖可変領域（Ｈ８）
ＱＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＶＴＩＳＫＤＴＳＫＳＱＶＦＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；
配列番号２４に示されるＣＤ１９抗体重鎖可変領域（Ｈ１０）
ＱＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＳＱＶＦＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；
配列番号２５に示されるＣＤ１９抗体重鎖可変領域（Ｈ２）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＶＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ；
配列番号２６に示されるＣＤ１９抗体重鎖可変領域（Ｈ３）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ；
配列番号２７に示されるＣＤ１９抗体重鎖可変領域（Ｈ４）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ；
配列番号２８に示されるＣＤ１９抗体重鎖可変領域（Ｈ５）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＳＬＫＬＳＳＬＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ；
配列番号２９に示されるＣＤ１９抗体重鎖可変領域（Ｈ６）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＡＡＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＳＬＫＬＳＳＬＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ；
配列番号３０に示されるＣＤ１９抗体重鎖可変領域（Ｈ７）
ＱＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；
配列番号３１に示されるＣＤ１９抗体軽鎖可変領域（Ｌ５）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ；
配列番号３２に示されるＣＤ１９抗体軽鎖可変領域（Ｌ１）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ；
配列番号３３に示されるＣＤ１９抗体軽鎖可変領域（Ｌ６）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＧＡＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ；
配列番号３４に示されるＣＤ１９抗体軽鎖可変領域（Ｌ２）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ；
配列番号３５に示されるＣＤ１９抗体軽鎖可変領域（Ｌ３）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３６に示されるＣＤ１９抗体軽鎖可変領域（Ｌ４）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＡＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
[0015]別の好ましい実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、第１の標的を標的とする抗原結合ドメイン及びＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインの両方を含む。

[0016]別の好ましい実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、下記式ＩＩ：
Ｌ－ｓｃＦｖ１－Ｉ－ｓｃＦｖ２－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （ＩＩ）
（式中、
「－」は、それぞれ独立して、リンカーペプチド又はペプチド結合であり；
Ｌは、不在であるか、又はシグナルペプチド配列であり；
Ｉは、可撓性リンカーであり；
Ｈは、不在であるか、又はヒンジ領域であり；
ＴＭは、膜貫通ドメインであり；
Ｃは、共刺激シグナル分子であり、
ＣＤ３ζは、ＣＤ３ζに由来する細胞質シグナル伝達配列であり；
ｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ２の一方は、第１の標的を標的とする抗原結合ドメインであり、他方は、ＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインである）
で示されるような構造を有する。

[0017]別の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ２は、互いに独立して、タンデムであり得るか、又はリープ構造で存在し得る。
[0018]別の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ１は、第１の標的を標的とする抗原結合ドメインであり、ｓｃＦｖ２は、ＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインである。

[0019]別の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ１は、ＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインであり、ｓｃＦｖ２は、第１の標的を標的とする抗原結合ドメインである。
[0020]別の好ましい実施形態では、可撓性リンカーＩの配列は、１個～６個、好ましくは配列番号７（ＧＧＧＧＳ）に示されるような３個～５個の連続配列である。

[0021]別の好ましい実施形態では、可撓性リンカーＩは、配列番号１７、配列番号１８又は配列番号１９に示される配列を有する。
[0022]別の好ましい実施形態では、第１の標的を標的とする抗原結合ドメインは、下記式Ｃ又は式Ｄで示されるような構造を有する：
[0023]Ｖ_Ｌ１－Ｖ_Ｈ１ （Ｃ）； Ｖ_Ｈ１－Ｖ_Ｌ１ （Ｄ）
[0024]（式中、Ｖ_Ｌ１は、第１の標的に対する抗体軽鎖可変領域であり；Ｖ_Ｈ１は、第１の標的に対する抗体重鎖可変領域であり；「－」は、リンカーペプチド又はペプチド結合である）。

[0025]別の好ましい実施形態では、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインは、下記式Ｃ又は式Ｄで示されるような構造を有する：
[0026]Ｖ_Ｌ１－Ｖ_Ｈ１ （Ｃ）； Ｖ_Ｈ１－Ｖ_Ｌ１ （Ｄ）
[0027]（式中、Ｖ_Ｌ１は、ＣＤ１９に対する抗体軽鎖可変領域であり；Ｖ_Ｈ１は、ＣＤ１９に対する抗体重鎖可変領域であり；「－」は、リンカーペプチド又はペプチド結合である）。

[0028]別の好ましい実施形態では、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体ＦＭＣ６３の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
[0029]別の好ましい実施形態では、抗ＣＤ１９抗体の重鎖可変領域は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する。

[0030]別の好ましい実施形態では、抗ＣＤ１９抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する。
[0031]別の好ましい実施形態では、ＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインは、下記式Ａ又は式Ｂで示されるような構造を有する：
Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ、（Ａ）； Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ、（Ｂ）
（式中、Ｖ_Ｈは、抗体重鎖可変領域であり；Ｖ_Ｌは、抗体軽鎖可変領域であり；「－」は、リンカーペプチド又はペプチド結合である）。

[0032]別の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ１は、配列番号１１に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１２に示される抗体軽鎖可変領域を含み、ｓｃＦｖ２は、配列番号９に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１０に示される抗体軽鎖可変領域を含む。

[0033]別の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ１は、配列番号９に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１０に示される抗体軽鎖可変領域を含み、ｓｃＦｖ２は、配列番号１１に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１２に示される抗体軽鎖可変領域を含む。

[0034]別の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ１及び／又はｓｃＦｖは、マウス由来、ヒト由来、ヒト及びマウス由来のキメラ、又は完全ヒト化単鎖抗体可変領域断片である。
[0035]別の好ましい実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、下記式ＩＩＩ又はＩＩＩ’：
Ｌ－Ｖ_Ｌ３－ｓｃＦｖ３－Ｖ_Ｈ３－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （ＩＩＩ）
Ｌ－Ｖ_Ｈ３－ｓｃＦｖ３－Ｖ_Ｌ３－Ｈ１－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （ＩＩＩ’）
（式中、
「－」は、それぞれ独立して、リンカーペプチド又はペプチド結合であり；
要素Ｌ、Ｈ、ＴＭ、Ｃ及びＣＤ３ζは、上述の通りであり；
ｓｃＦｖ３は、ＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインであり、Ｖ_Ｈ３は、第１の標的に対する抗体重鎖可変領域であり、Ｖ_Ｌ３は、第１の標的に対する抗体軽鎖可変領域であるか；又は
ｓｃＦｖ３は、第１の標的を標的とする抗原結合ドメインであり、Ｖ_Ｈ３は、ＢＣＭＡに対する抗体重鎖可変領域であり、Ｖ_Ｌ３は、ＢＣＭＡに対する抗体軽鎖可変領域である）
で示されるような構造を有する。

[0036]別の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ３は、配列番号９に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１０に示される抗体軽鎖可変領域を含む。
[0037]別の好ましい実施形態では、Ｖ_Ｈ３は、配列番号９に示される抗体重鎖可変領域を有し、Ｖ_Ｌ３は、配列番号１０に示される抗体軽鎖可変領域を有する。

[0038]別の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ３は、配列番号１１に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１２に示される抗体軽鎖可変領域を含み、Ｖ_Ｈ３は、配列番号９に示される抗体重鎖可変領域を有し、Ｖ_Ｌ３は、配列番号１０に示される抗体軽鎖可変領域を有する。

[0039]別の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ３は、配列番号９に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１０に示される抗体軽鎖可変領域を含み、Ｖ_Ｈ３は、配列番号１１に示される抗体重鎖可変領域を有し、Ｖ_Ｌ３は、配列番号１２に示される抗体軽鎖可変領域を有する。

[0040]別の好ましい実施形態では、ＣＡＲは、図１に示される構造を有する。
[0041]別の好ましい実施形態では、Ｌは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４、ＣＤ１３７、又はそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質のシグナルペプチドである。

[0042]別の好ましい実施形態では、Ｌは、ＣＤ８に由来するシグナルペプチドである。
[0043]別の好ましい実施形態では、Ｌは、配列番号１６又は配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。

[0044]別の好ましい実施形態では、Ｈは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、又はそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質のヒンジ領域である。別の好ましい実施形態では、Ｈは、それぞれ独立して、ＣＤ８に由来するヒンジ領域である。

[0045]別の好ましい実施形態では、Ｈは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する。
[0046]別の好ましい実施形態では、ＴＭは、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、又はそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通領域である。別の好ましい実施形態では、ＴＭは、それぞれ独立して、ＣＤ８又はＣＤ２８に由来する膜貫通領域である。別の好ましい実施形態では、ＣＤ８由来の膜貫通領域は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する。

[0047]別の好ましい実施形態では、ＣＤ２８由来の膜貫通領域は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する。
[0048]別の好ましい実施形態では、Ｃは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＰＤ１、Ｄａｐ１０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＴＬＲ２、又はそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の共刺激シグナル分子である。別の好ましい実施形態では、Ｃは、ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子である。

[0049]別の好ましい実施形態では、４－１ＢＢ由来の共刺激シグナル分子は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する。
[0050]別の好ましい実施形態では、ＣＤ２８由来の共刺激シグナル分子は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。

[0051]別の好ましい実施形態では、ＣＤ３ζは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。
[0052]別の好ましい実施形態では、ＣＡＲ（好ましくは、Ｃ末端又はＮ末端）は、細胞自殺（ｓｕｉｃｉｄｅ）要素を更に含む。

[0053]別の好ましい実施形態では、細胞自殺要素は、ＣＡＲ若しくは二重特異性ＣＡＲのＬ又はＣＤ３ζに、Ｔ２Ａを介して結合される。
[0054]本発明の第３の態様では、核酸分子が提供され、該核酸分子は、本発明の第１の態様によるＣＡＲ若しくはＴＣＲ又は本発明の第２の態様による二重特異性ＣＡＲ若しくはＴＣＲをコードする。

[0055]本発明の第４の態様では、ベクターが提供され、該ベクターは、本発明の第３の態様による核酸分子を含む。
[0056]別の好ましい実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、トランスポゾン、又はそれらの組合せからなる群から選択される。

[0057]別の好ましい実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
[0058]本発明の第５の態様では、宿主細胞が提供され、該宿主細胞は、染色体に外因的に組み込まれる本発明の第４の態様によるベクター、若しくは本発明の第３の態様による核酸分子を含むか、或いは本発明の第１の態様によるＣＡＲ若しくはＴＣＲ又は本発明の第２の態様による二重特異性ＣＡＲ若しくはＴＣＲを発現する。

[0059]本発明の第６の態様では、操作された免疫細胞が提供され、該免疫細胞は、染色体に外因的に組み込まれる本発明の第４の態様によるベクター、若しくは本発明の第３の態様による核酸分子を含むか、或いは本発明の第１の態様によるＣＡＲ若しくはＴＣＲ又は本発明の第２の態様による二重特異性ＣＡＲ若しくはＴＣＲを発現する。

[0060]別の好ましい実施形態では、免疫細胞は、
（ａ）免疫細胞のＰＤ－１遺伝子発現が、サイレンシングされていること；
（ｂ）免疫細胞がＴ細胞であり、Ｔ細胞のＴＣＲ遺伝子発現が、サイレンシングされていること；
（ｃ）免疫細胞が、外因性細胞自殺要素を発現すること；
（ｄ）免疫細胞が、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＣＤ４７抗体、Ｔｉｍ３抗体、Ｌａｇ３抗体、Ｔｉｇｉｔ抗体、ＯＸ４０抗体、ＩＣＯＳ抗体、ＩＬ７、ＣＸＣＬ１９、ＩＬ２１、ＩＬ１５、ＩＬ２、ＩＬ１８、若しくはそれらの組合せを発現又は分泌すること；及び
（ｅ）免疫細胞のサイトカイン関連シグナル伝達経路が増強され、サイトカインが、ＩＬ７、ＣＸＣＬ１９、ＩＬ２１、ＩＬ１５、ＩＬ２、ＩＬ１８、又はそれらの組合せからなる群から選択されること
からなる群から選択される１つ又は複数の特徴を有する。

[0061]別の好ましい実施形態では、操作された免疫細胞は、
（ｉ）キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）；又は
（ｉｉ）キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）
からなる群から選択される。

[0062]別の好ましい実施形態では、免疫細胞は、外因性細胞自殺要素を発現する。
[0063]別の好ましい実施形態では、ＣＡＲ及び細胞自殺要素は、免疫細胞において同時発現される。

[0064]別の好ましい実施形態では、ＣＡＲ及び細胞自殺要素は、自己切断要素によって結合される。
[0065]別の好ましい実施形態では、細胞自殺要素は、ＣＡＲのＮ末端又はＣ末端に位置する。

[0066]別の好ましい実施形態では、自己切断要素は、２Ａ配列又はＩＲＥＳ配列、好ましくは、Ｐ２Ａ及びＴ２Ａを含む。
[0067]別の好ましい実施形態では、細胞自殺要素は、ＨＳＶ－ＴＫ、ｉＣａｓｐ９、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、ΔＣＤ１９、ＲＱＲ８、ＥＧＦＲｔ、又はそれらの組合せからなる群から選択される。

[0068]別の好ましい実施形態では、細胞自殺要素は、下記式ＩＶ：
Ｌ２－Ｄ－Ｆ （ＩＶ）
（式中、
「－」は、それぞれ独立して、リンカーペプチド又はペプチド結合であり；
Ｌ２は、任意選択のシグナルペプチド配列であり；
Ｄは、自殺スイッチ要素であり；
Ｆは、膜貫通要素である）
で示されるような構造を有する。

[0069]別の好ましい実施形態では、シグナルペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦＲに由来するシグナルペプチドである。
[0070]別の好ましい実施形態では、細胞自殺要素は、切断型上皮増殖因子（ＥＧＦＲｔ）、切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）遺伝子、誘導性カスパーゼ９遺伝子（ｉＣａｓｐ９）、ＨＳＶ－ＴＫ、ΔＣＤ２０、ｍＴＭＰＫ、又はそれらの組合せからなる群から選択される。

[0071]別の好ましい実施形態では、細胞自殺要素は、ＥＧＦＲｔである。
[0072]別の好ましい実施形態では、操作された免疫細胞は、自己免疫療法及び／又は同種異系免疫療法に使用される。

[0073]別の好ましい実施形態では、操作された免疫細胞は、クローン増殖が可能な腫瘍細胞を死滅させ得る。
[0074]別の好ましい実施形態では、本発明の第１の態様によるＣＡＲを発現する免疫細胞と比較して、第２の態様による二重特異性ＣＡＲを発現する免疫細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでより長く生存する。

[0075]別の好ましい実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏは、自己的なｉｎ ｖｉｖｏ、又は同種異系的なｉｎ ｖｉｖｏを包含する。
[0076]本発明の第７の態様では、操作された免疫細胞が提供され、
該免疫細胞は、外因性である第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含み、ここで、第１の発現カセットは、第１の標的を標的とする第１のＣＡＲ若しくは第１の外因性ＴＣＲを発現するのに使用され、第２の発現カセットは、ＢＣＭＡを標的とする第２のＣＡＲ若しくは第２の外因性ＴＣＲを発現するのに使用されるか、又は
該免疫細胞は、第１の標的を標的とする第１のＣＡＲ若しくは第１の外因性ＴＣＲ及びＢＣＭＡを標的とする第２のＣＡＲ若しくは第２の外因性ＴＣＲを発現し、
第２のＣＡＲ若しくは第２の外因性ＴＣＲにおけるＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）は、配列番号９に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１０に示される抗体軽鎖可変領域を含み；
該第１の標的は、
ＣＤ１３８、カッパ軽鎖、ＮＫＧ２Ｄ－リガンド、ＴＡＣＩ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１５１、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、ＣＬＬ１、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦＲ－２、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３、ＰＭＳＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ－４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、Ｆｌｔ１、ＫＤＲ、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、Ｌｅｗｉｓ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＳＣＡ、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＳＬＮ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＬＴＰＲ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ－１、Ｒｏｂｏｌ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、Ｎｏｔｃｈ－１－４、ＡＰＲＩＬ、ＣＳ１、ＭＡＧＥ３、クローディン１８．２、葉酸受容体α、葉酸受容体β、ＧＰＣ２、ＣＤ７０、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＴＲＯＰ－２、又はそれらの組合せ
からなる群から選択される。

[0077]別の好ましい実施形態では、第１の標的はＣＤ１９であり、第１のＣＡＲにおけるＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）は、配列番号１１に示される抗体重鎖可変領域、及び配列番号１２に示される抗体軽鎖可変領域を含む。

[0078]別の好ましい実施形態では、第２のＣＡＲは、本発明の第１の態様によるＣＡＲである。
[0079]別の好ましい実施形態では、第１のＣＡＲ及び第２のＣＡＲは、免疫細胞の細胞膜上に位置する。

[0080]別の好ましい実施形態では、ＣＤ１９を標的とする第１のＣＡＲ及びＢＣＭＡを標的とする第２のＣＡＲは、免疫細胞の細胞膜上で発現される。
[0081]別の好ましい実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、同じベクター又は異なるベクター上に位置する。

[0082]別の好ましい実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、同じベクター上に位置する。
[0083]別の好ましい実施形態では、第１のＣＡＲは、下記式Ｖ：
Ｌ－ｓｃＦｖ１’－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （Ｖ）
（式中、
「－」は、それぞれ独立して、リンカーペプチド又はペプチド結合であり；
要素Ｌ、Ｈ、ＴＭ、Ｃ及びＣＤ３ζは、上述の通りであり；
ｓｃＦｖ１’は、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインである）
で示される構造を有する。

[0084]別の好ましい実施形態では、第１のＣＡＲ及び第２のＣＡＲは、２Ａペプチドを介して結合される。
[0085]別の好ましい実施形態では、２Ａペプチドは、配列番号２に示される配列を有する。

[0086]別の好ましい実施形態では、免疫細胞は、細胞自殺要素を更に含む。
[0087]別の好ましい実施形態では、細胞自殺要素及び二重特異性ＣＡＲは、Ｔ２Ａを介して結合される（か、又はタンデムで存在する）。

[0088]別の好ましい実施形態では、細胞自殺要素は、第１のＣＡＲ及び／又は第２のＣＡＲに、Ｔ２Ａを介して結合される。
[0089]別の好ましい実施形態では、免疫細胞のＰＤ１遺伝子発現は、サイレンシングされている。

[0090]別の好ましい実施形態では、「ＰＤ－１遺伝子発現が、サイレンシングされていること」は、ＰＤ－１遺伝子が、発現されないか、又は低発現である（ｕｎｄｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）ことを意味する。

[0091]別の好ましい実施形態では、「低発現」は、免疫細胞のＰＤ－１遺伝子の発現レベルＧ１の、正常な免疫細胞のＰＤ－１遺伝子の発現レベルＧ０に対する比（即ち、Ｇ１／Ｇ０）が０．５以下、好ましくはＧ１／Ｇ０が０．３以下、より好ましくは０．２以下、より好ましくは０．１以下、最も好ましくは０であることを指す。

[0092]別の好ましい実施形態では、「低発現」は、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＰＤ－１遺伝子の発現レベルＧ１の、正常なＴ細胞のＰＤ－１遺伝子の発現レベルＧ０に対する比（即ち、Ｇ１／Ｇ０）が０．５以下、好ましくはＧ１／Ｇ０が０．３以下、より好ましくは０．２、より好ましくは０．１、最も好ましくは０であることを指す。

[0093]本発明の第８の態様では、製剤が提供され、該製剤は、本発明の第１若しくは第２の態様によるＣＡＲ又はＴＣＲ、或いは本発明の第６若しくは第７の態様による操作された免疫細胞、及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む。

[0094]別の好ましい実施形態では、製剤は、液体製剤である。
[0095]別の好ましい実施形態では、製剤の投薬形態は、注射である。
[0096]別の好ましい実施形態では、製剤中の操作された免疫細胞は、１×１０^３個～１×１０^８個の細胞／ｍｌ、好ましくは１×１０^４個～１×１０^７個の細胞／ｍｌの濃度を有する。

[0097]別の好ましい実施形態では、ＣＡＲは、二重特異性ＣＡＲを含む。
[0098]本発明の第９の態様では、癌若しくは腫瘍を予防及び／又は処置するための薬物又は製剤の調製における、本発明の第１若しくは第２の態様によるＣＡＲ又はＴＣＲ、或いは本発明の第６若しくは第７の態様による操作された免疫細胞の使用が提供される。

[0099]別の好ましい実施形態では、腫瘍は、血液腫瘍である。
[00100]別の好ましい実施形態では、血液腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、又はそれらの組合せからなる群から選択される。

[00101]別の好ましい実施形態では、癌又は腫瘍は、多発性骨髄腫である。
[00102]別の好ましい実施形態では、癌又は腫瘍は、リンパ腫である。
[00103]別の好ましい実施形態では、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、慢性リンパ球性白血球（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、マントル細胞リンパ腫、（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）及び複合性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。

[00104]別の好ましい実施形態では、癌又は腫瘍は、再発性癌又は腫瘍である。
[00105]別の好ましい実施形態では、薬物又は製剤は、クローン増殖が可能な腫瘍細胞を死滅させることによって、癌又は腫瘍を処置する。

[00106]別の好ましい実施形態では、クローン増殖が可能な腫瘍細胞は、クローン形成細胞、腫瘍細胞前駆体細胞、及び腫瘍前駆細胞を含む。
[00107]本発明の第１０の態様では、下記工程：本発明の第３の態様による核酸分子又は本発明の第４の態様によるベクターを、免疫細胞へ形質導入して、それにより操作された免疫細胞を得る工程を含む、操作された免疫細胞を調製する方法が提供され、該操作された免疫細胞は、本発明の第１又は第２の態様によるＣＡＲ又はＴＣＲを発現する。

[00108]別の好ましい実施形態では、免疫細胞が、Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。
[00109]本発明の第１１の態様では、下記工程：
（１）操作されるべき免疫細胞を提供する工程と、
（２）第１の標的を標的とする第１のＣＡＲを発現するための第１の発現カセットを、該免疫細胞へ導入する工程と、
（３）ＢＣＭＡを標的とする第２のＣＡＲを発現するための第２の発現カセットを、該免疫細胞へ導入して、それにより、操作された免疫細胞を得る工程
とを含む、操作された免疫細胞を調製する方法が提供され、
ここで、第２のＣＡＲにおけるＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）は、配列番号９に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１０に示される抗体軽鎖可変領域を含み、
該第１の標的は、ＣＤ１３８、カッパ軽鎖、ＮＫＧ２Ｄ－リガンド、ＴＡＣＩ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１５１、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、ＣＬＬ１、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦＲ－２、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３、ＰＭＳＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ－４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、Ｆｌｔ１、ＫＤＲ、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、Ｌｅｗｉｓ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＳＣＡ、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＳＬＮ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＬＴＰＲ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ－１、Ｒｏｂｏｌ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、Ｎｏｔｃｈ－１－４、ＡＰＲＩＬ、ＣＳ１、ＭＡＧＥ３、クローディン１８．２、葉酸受容体α、葉酸受容体β、ＧＰＣ２、ＣＤ７０、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＴＲＯＰ－２、又はそれらの組合せ
からなる群から選択される。

[00110]別の好ましい実施形態では、工程（２）は、工程（３）の前、工程（３）の後、工程（３）と同時に、又は工程（３）と交互に実施され得る。
[00111]別の好ましい実施形態では、工程（１）で操作される免疫細胞が、第１のＣＡＲ又は第２のＣＡＲを発現する場合、工程（２）又は工程（３）は省略され得る。

[00112]本発明の第１２の態様では、キットが提供され、該キットは、本発明の第６又は第７の態様による操作された免疫細胞を調製するのに使用され、該キットは、容器、及び該容器中に位置する本発明の第３の態様による核酸分子又は本発明の第４の態様によるベクターを含む。

[00113]本発明の第１３の態様では、キットが提供され、該キットは、本発明の第６又は第７の態様による操作された免疫細胞を調製するのに使用され、該キットは、容器、及び該容器中に位置する下記のもの：
（１）第１の核酸配列（該第１の核酸配列は、第１の発現カセットを含み、第１の発現カセットは、第１の標的を標的とする第１のＣＡＲを発現するのに使用される）と、
（２）第２の核酸配列（該第２の核酸配列は、第２の発現カセットを含み、第２の発現カセットは、ＢＣＭＡを標的とする第２のＣＡＲを発現するのに使用される）
とを含み、
ここで、第２のＣＡＲにおけるＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）は、配列番号９に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１０に示される抗体軽鎖可変領域を含み、
該第１の標的は、ＣＤ１３８、カッパ軽鎖、ＮＫＧ２Ｄ－リガンド、ＴＡＣＩ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１５１、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、ＣＬＬ１、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦＲ－２、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３、ＰＭＳＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ－４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、Ｆｌｔ１、ＫＤＲ、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、Ｌｅｗｉｓ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＳＣＡ、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＳＬＮ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＬＴＰＲ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ－１、Ｒｏｂｏｌ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、Ｎｏｔｃｈ－１－４、ＡＰＲＩＬ、ＣＳ１、ＭＡＧＥ３、クローディン１８．２、葉酸受容体α、葉酸受容体β、ＧＰＣ２、ＣＤ７０、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＴＲＯＰ－２、又はそれらの組合せ
からなる群から選択される。

[00114]別の好ましい実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、同じ容器又は異なる容器中に位置する。
[00115]別の好ましい実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、同じ発現ベクター中に位置する。

[00116]本発明の第１４の態様では、癌若しくは腫瘍の予防及び／又は処置のための本発明の第６又は第７の態様による操作された免疫細胞の使用が提供される。
[00117]別の好ましい実施形態では、癌又は腫瘍は、多発性骨髄腫である。

[00118]本発明の第１５の態様では、疾患を処置する方法が提供され、該方法は、適切な量の、本発明の第６若しくは第７の態様による細胞、又は本発明の第５の態様による製剤を、処置を必要とする対象に投与する工程を含む。

[00119]別の好ましい実施形態では、疾患は、癌又は腫瘍である。
[00120]本発明の第１６の態様では、（ａ）免疫細胞において外因性である第１の発現カセット及び第２の発現カセットの両方を発現させる工程（ここで、該第１の発現カセットは、ＣＤ１９を標的とする第１のＣＡＲを発現するのに使用され、該第２の発現カセットは、ＢＣＭＡを標的とする第２のＣＡＲを発現するのに使用される）、又は（ｂ）該免疫細胞において、第２の態様による二重特異性ＣＡＲを発現させる工程を含む、免疫細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの生存能を高めるか、又はクローン増殖が可能な腫瘍細胞に対する免疫細胞の死滅能を高める方法が提供される。

[00121]別の好ましい実施形態では、上記方法によって構築される免疫細胞は、本発明の第６及び第７の態様に記載される通りである。
[00122]別の好ましい実施形態では、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、本発明の第７の態様における第１の発現カセット及び第２の発現カセットと同じ意味を有する。

[00123]別の好ましい実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏは、自己的なｉｎ ｖｉｖｏ、又は同種異系的なｉｎ ｖｉｖｏを包含する。
[00124]本発明の第１７の態様では、操作された免疫細胞において外因性の第１の発現カセットを発現させる工程（ここで、該第１の発現カセットは、ＣＤ１９を標的とする第１のＣＡＲを発現するのに使用される）を含む、ＢＣＭＡを標的とする操作された免疫細胞の、ｉｎ ｖｉｖｏでの生存能又はクローン増殖が可能な腫瘍細胞に対する死滅能を高める方法が提供される。

[00125]別の好ましい実施形態では、第１の発現カセットは、本発明の第７の態様における第１の発現カセット及び第２の発現カセットと同じ意味を有する。
[00126]別の好ましい実施形態では、ＢＣＭＡを標的とする操作された免疫細胞は、本発明の第１の態様によるＣＡＲを発現する免疫細胞である。

[00127]別の好ましい実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏは、自己的なｉｎ ｖｉｖｏ、又は同種異系的なｉｎ ｖｉｖｏを包含する。
[00128]本発明の第１８の態様では、第１の発現カセットの使用が提供され、該第１の発現カセットは、ＣＤ１９を標的とする第１のＣＡＲを発現するのに使用されるか、ＢＣＭＡを標的とする操作された免疫細胞の、ｉｎ ｖｉｖｏでの生存能若しくはクローン増殖が可能な腫瘍細胞に対する死滅能を高めるのに使用されるか、又はキットを調製するのに使用され、ここで、キットは、ＢＣＭＡを標的とする操作された免疫細胞の、ｉｎ ｖｉｖｏでの生存能又はクローン増殖が可能な腫瘍細胞に対する死滅能を高めるのに使用される。

[00129]別の好ましい実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏは、自己的なｉｎ ｖｉｖｏ、又は同種異系的なｉｎ ｖｉｖｏを包含する。
[00130]本発明の範囲内で、本発明の上述の技術的特徴のそれぞれ及び下記（例えば、実施形態）において具体的に記載される各種技術的特徴のそれぞれが、新たな技術的解決法又は好ましい技術的解決法を形成するために互いに組み合わせられてもよいことが理解されるべきである。限られたスペースを考慮して、それらは、本明細書中で繰り返されない。

[00131]図１は、本発明によるＣＡＲ及び細胞自殺要素を含有する構造の模式図を示す図であり、ここで、二重特異性ＣＡＲ及び自殺スイッチ要素が、２Ａを介して結合されている。 [00132]図２は、それぞれ本発明によるジャーカット細胞及び初代Ｔ細胞の表面におけるＣＡＲ－ＢＢ及びＣＡＲ－Ｓ１の発現をフローサイトメトリーにより分析した結果を示す図である。 [00133]図３は、それぞれ本発明による、Ｈｅｌａ細胞及びＢＣＭＡ過剰発現細胞（Ｈｅｌａ－ＢＣＭＡ）のそれぞれに対するＣＡＲ－ＢＢ及びＣＡＲ－Ｓ１の死滅効果（ＲＴＣＡ法）並びにＨｅｌａ細胞及びＢＣＭＡ過剰発現細胞（Ｈｅｌａ－ＢＣＭＡ）それぞれに対するＣＡＲ－Ａｐｒｉｌ及びＣＡＲ－Ｓ１の死滅効果（ＲＴＣＡ法）を示す図である。 [00134]図４は、本発明において使用される標的細胞のＢＣＭＡ発現を示す図である。 [00135]図５は、それぞれ本発明による、ＭＭ．１ｓ細胞及びＲＰＭＩ－８２２６細胞に対するＣＡＲ－ＢＢ及びＣＡＲ－Ｓ１の種々のバッチのｉｎ ｖｉｔｒｏでの死滅実験（ルシフェラーゼ法）の結果を示す図である。 [00136]図６は、それぞれ本発明による、Ｈｅｌａ細胞及びＢＣＭＡ過剰発現細胞（Ｈｅｌａ－ＢＣＭＡ）に対するＣＡＲ－ＢＢ及びＣＡＲ－Ｓ１の死滅プロセス中のサイトカインＩＦＮｒの放出を示す図である。 [00137]図７は、本発明によるＲＰＭＩ－８２２６で皮下にモデル化したモデルである免疫不全マウスにおける静脈内再注入後のＣＡＲ－ＢＢ及びＣＡＲ－Ｓ１の腫瘍除去能を示す図である。 [00138]図８は、本発明による二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＤ１９－ＣＡＲ及びＢＣＭＡ－ＣＡＲの発現を示す図である。 [00139]図９は、本発明による安全性スイッチが付加された二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＤ１９－ＣＡＲ及びＢＣＭＡ－ＣＡＲの発現並びにＥＧＦＲｔの発現の分析を示す図である。 [00140]図１０は、本発明によるＣＡＲ－１９、ＣＡＲ－ＢＣＭＡ及び二重特異性ＣＡＲ－Ｔの種々のバッチによる、Ｈｅｌａ細胞並びに抗原過剰発現Ｈｅｌａ細胞系統であるＨｅｌａ－ＢＣＭＡ、Ｈｅｌａ－ＣＤ１９及びＨｅｌａ－ＢＣＭＡ－ＣＤ１９の死滅の比較の図である。 [00141]図１１は、本発明による、ＭＭ．１ｓ細胞、ＲＰＭＩ－８２２６細胞及びＮａｌｍ６細胞に対するＣＡＲ－１９、ＣＡＲ－ＢＣＭＡ及び二重特異性ＣＡＲ－Ｔの種々のバッチのｉｎ ｖｉｔｒｏでの死滅実験（ルシフェラーゼ法）の結果を示す図である。 [00142]図１２は、本発明による、ＢＣＭＡ過剰発現Ｈｅｌａ細胞（Ｈｅｌａ－ＢＣＭＡ）に対するＣＡＲ－ＢＣＭＡ及び二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞の死滅プロセス中のサイトカイン放出を示す図である。 [00143]図１３は、ＭＭ．１ｓ又はＲａｊｉ腫瘍標的細胞で共培養した後の二重ＣＡＲ－Ｔ細胞の表面上でのＣＤ１０７ａ分子の発現の分析を示す図である。 [00144]図１４は、本発明による、ＲＰＭＩ－８２２６で皮下にモデル化したモデルである免疫不全マウスにおける静脈内再注入後のＣＡＲ－Ｓ１、二重特異性ＣＡＲ－Ｓ２及びＣＡＲ－Ｓ４の腫瘍除去能を示す図である。 [00145]図１５は、本発明による、ＭＭ．１ｓ－ｌｕｃで静脈内にモデル化したモデルである免疫不全マウスにおける静脈内再注入後の種々の用量の二重特異性ＣＡＲ－Ｓ２及びＣＡＲ－Ｓ４細胞の腫瘍除去能を示す図である。 [00146]図１６は、ＭＭ患者の骨髄におけるＣＤ３４陰性単球のクローン形成に関する種々のＣＡＲ－Ｔ細胞の阻害能を示す図である。 [00147]図１７は、Ｎａｌｍ６－Ｌｕｃ細胞でモデル化したＮＯＧマウスに対する種々のＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍除去能を示す図である。 [00148]図１８は、Ｔ細胞の表面上でのＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ及び安全スイッチの発現を示す図である。 [00149]図１９は、Ｎａｌｍ６又はＲＭＰＩ８２２６細胞に対する種々のＣＡＲ－Ｔ細胞の死滅効果（ルシフェラーゼ法）を示す図である。単一ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、二重ＣＡＲ対は、標的細胞を死滅させる、より強力な能力を有する。 図２０は、種々のＣＡＲ－Ｔ細胞が、陰性標的細胞（Ｋ５６２、Ｒａｊｉ－ＫＯ１９、Ｎａｌｍ６－ＫＯ１９、及びＣＣＲＦ）に対して死滅能を有さないことを示す図である。 [00150]図２１は、Ｒａｊｉ－ｌｕｃでモデル化したＮＯＧ細胞に対する種々のＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍除去能を示す図である。単一ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、二重ＣＡＲ対は、標的細胞を死滅させる、より強力な能力を有する。 [00151]図２２は、Ｒａｊｉリンパ腫細胞に対するＣＡＲ－Ｓ１のｉｎ ｖｉｔｒｏでの死滅実験（ルシフェラーゼ法）の結果を示す図であり、ここで、図２２Ａは、Ｒａｊｉリンパ腫標的細胞の表面上でのＢＣＭＡ抗原の発現を示し、図２２Ｂは、種々のＥ：Ｔ比におけるＣＡＲ－Ｓ１細胞によるＲａｊｉリンパ腫標的細胞の死滅を示す。

[00152]広範囲かつ綿密な研究後に、本発明者らは、ＢＣＭＡを標的とする新規の操作された免疫細胞を初めて構築したが、その中に含有されるＣＡＲにおける抗原結合ドメインは、Ｓ由来のｓｃＦｖである。実験により、ＢＢ ｓｃＦｖ及びＡｐｒｉｌ由来のＢＣＭＡ結合ドメインの使用を用いて構築されたＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、本発明において構築されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、より高い死滅効果及び腫瘍除去能を有することが示された。本発明はまた、ＢＣＭＡ陽性ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＤ１９陽性ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方を死滅させることができる二重ＣＡＲ－Ｔ細胞を構築するためにＳ ｓｃＦｖ及びＣＤ１９ ｓｃＦｖを使用する。

[00153]具体的には、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、種々のＢＣＭＡ抗体のｓｃＦｖを用いて構築される。それらを比較することによって、予想外にも、Ｓ由来のｓｃＦｖによって構築されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＢＢ ｓｃＦｖ及びＡｐｒｉｌ由来のＢＣＭＡ結合ドメインによって構築されたものよりも、ＢＣＭＡ過剰発現細胞及びＢＣＭＡ陽性腫瘍標的細胞を死滅させる、より高い能力を有することが見出した。ｉｎ ｖｉｖｏでのマウス動物モデルもまた、Ｓ由来のｓｃＦｖによって構築されたＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＢＢ由来ＣＡＲ－Ｔよりも高い腫瘍除去能を有することを示している。当該技術分野で一般に使用されるＢＣＭＡを標的とする幾つか他のｓｃＦｖを用いて構築されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、理想的なｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの機能を示さない。

用語
[00154]本開示をより良好に理解するためには、或る特定の用語が、まず初めに定義される。本出願で使用される場合、本明細書中で明らかに別記されない限り、下記用語はそれぞれ、以下で付与される意味を有する。他の定義は、明細書全体にわたって記載される。

[00155]「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値又は組成の許容可能な誤差範囲内の値又は組成を指す場合があり、それは、値又は組成が、どのように測定又は決定されるかにある程度依存する。

[00156]「投与」という用語は、注射又は注入を介する等、静脈内、筋内、皮下、腹腔内、脊髄内又は他の非経口経路の投与を含め、本発明の生成物を対象に物理的に導入するための、当業者に既知の各種方法及び送達系のいずれかの使用を指す。

[00157]「抗体」（Ａｂ）という用語は、抗原に特異的に結合し、ジスルフィド結合によって相互結合される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン、又はそれらの抗原結合部分を包含するが、これらに限定されない。Ｈ鎖はそれぞれ、重鎖可変領域（本明細書中ではＶＨと略記される）及び重鎖定常領域を含有する。重鎖定常領域は、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含有する。軽鎖はそれぞれ、軽鎖可変領域（本明細書中ではＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域を含有する。軽鎖定常領域は、定常ドメインＣＬを含有する。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分させることができ、それらには、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が散在されている。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、下記の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含有する：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。

[00158]本明細書中のアミノ酸名称は、国際的に認められている英語一文字によって同定され、アミノ酸名称の相当する三文字略号が、それぞれ、Ａｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｖａｌ（Ｖ）であることは理解されるべきである。

Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）
[00159]ＢＣＭＡは、成熟Ｂリンパ球の表面、即ち形質芽球及び形質細胞の表面上で発現される膜貫通タンパク質である。多発性骨髄腫は、形質細胞の異常増殖及び骨髄への浸潤によって引き起こされる。研究により、ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫細胞上で発現することが示されている。ＢＣＭＡを標的とするＣａｒ－Ｔ細胞は、骨髄腫細胞を特異的に死滅させることが示されている。しかしながら、一部の患者において、ＢＣＭＡを標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けた後、再発の経過が見られる。これらの再発した患者に関して、処置を継続するためには、ＢＣＭＡとは異なる別の標的を見つけ出す必要がある。

ＣＤ１９
[00160]ＣＤ１９分子は、Ｂ細胞の表面上の膜貫通タンパク質であり、ＣＤ１９分子は、Ｂ細胞活性化、シグナル伝達及び成長制御に密接に関連している。図１に示されるように、ＣＤ１９は、全てのＢ細胞表面上でほぼ発現され、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞は現在、白血病及びリンパ腫の処置において著しい有効性を有する。一般的に、形質細胞の９９．９５％が、表面上でＣＤ１９を発現せず、したがって、多発性骨髄腫の処置のためにＣＤ１９を使用する可能性が顧みられることはないと考えられる。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
[00161]本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、標的特異的な結合要素（抗原結合ドメインとも称される）を含む。細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達領域及びζ鎖部分を含む。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子を含む細胞内ドメインの一部を指す。共刺激分子は、リンパ球の、抗原に対する有効な応答に必要とされる細胞表面分子であり、抗原受容体又はそれらのリガンドではない。

[00162]ＣＡＲの細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとの間に、又はＣＡＲの細胞質ドメインと、膜貫通ドメインとの間に、リンカーが取り込まれ得る。本明細書中で使用される場合、「リンカー」という用語は概して、ポリペプチド鎖の膜貫通ドメインを細胞外ドメイン又は細胞質ドメインに結合させる機能を果たす任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを指す。リンカーは、０個～３００個のアミノ酸、好ましくは２個～１００個のアミノ酸、最も好ましくは３個～５０個のアミノ酸を含み得る。

[00163]本発明の好ましい実施形態では、本発明によって提供されるＣＡＲの細胞外ドメインは、ＢＣＭＡ（又はＢＣＭＡ及びＣＤ１９）を標的とする抗原結合ドメインを含む。本発明のＣＡＲが、Ｔ細胞で発現されると、本発明のＣＡＲは、抗原結合特異性に基づいて抗原認識を実施し得る。本発明のＣＡＲが、その結合された抗原に結合すると、本発明のＣＡＲは、腫瘍細胞に影響を及ぼし、腫瘍細胞が成長するのを停止させるか、死滅するのを促進させるか、又は他の場合では、影響を受けさせるかして、患者における腫瘍負荷を低減又は排除させる。抗原結合ドメインは、好ましくは、共刺激分子及びζ鎖の１つ又は複数由来の細胞内ドメインに融合される。好ましくは、抗原結合ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと組み合わせた細胞内ドメインに融合される。

[00164]本明細書中で使用される場合、「抗原結合ドメイン」及び「単鎖抗体断片」はともに、抗原結合活性を有する、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、又は単一Ｆｖ断片を指す。Ｆｖ抗体は、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含有するが、定常領域を有さず、抗原結合部位全てを有する最小の抗体断片である。概して、Ｆｖ抗体はまた、ＶＨドメインと、ＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含有し、抗原結合に必要とされる構造を形成し得る。抗原結合ドメインは、通常、ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）である。ｓｃＦｖのサイズは概して、完全抗体のサイズの１／６である。単鎖抗体は好ましくは、ヌクレオチド鎖によってコードされるアミノ酸鎖配列である。本発明の好ましい実施形態として、抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡを特異的に認識する抗体を含み、任意選択で、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９を特異的に認識する抗体（好ましくは、単鎖抗体）を更に含む。

[00165]ヒンジ領域及び膜貫通領域（膜貫通ドメイン）に関して、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含むように設計され得る。一実施形態では、ＣＡＲにおけるドメインの１つと天然で結合される膜貫通ドメインが使用される。数例では、膜貫通ドメインは、選択されるか、又はアミノ酸置換によって修飾させて、かかるドメインを、同じか、又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合させるのを回避することができ、それにより、受容体複合体の他の成員との相互作用を最低限に抑える。

[00166]本発明のＣＡＲにおける細胞内ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含む。
[00167]好ましくは、本発明のＣＡＲはまた、細胞自殺要素を含む。

[00168]好ましくは、本発明のＢＣＭＡを標的とするｓｃＦｖは、Ｓ ｓｃＦｖであり、実施例におけるＢＢ ｓｃＦｖ及びＡｐｒｉｌ鎖は、対照として使用される。ＢＢ ｓｃＦｖ及びＡｐｒｉｌ鎖はともに、ＢＣＭＡを標的とするための、当該技術分野において一般に使用される結合配列であり、ＢＢ ｓｃＦｖは、ＰＣＴ出願公開第２０１０１０４９４９ Ａ３号に記載されており、Ａｐｒｉｌ鎖は、中国特許第１０５６５８６７１Ａ号に記載されている。

ＣＤ１９及びＢＣＭＡを標的とする二重特異性ＣＡＲ
[00169]多発性骨髄腫（ＭＭ）は、悪性の形質細胞腫瘍である。腫瘍細胞は、骨髄中の形質細胞から生じ、形質細胞は、最終的な機能的段階においてＢリンパ球によって発生する細胞である。多発性骨髄腫は、高い罹患率及び高い死亡率の特徴を有する基本的に不治の疾患である。２０１７年の統計では、米国において、新たに診断された多発性骨髄腫患者が３０，０００人存在し、その中で、１２，０００人が死に直面し得る。目下、多発性骨髄腫のための一般的な治療法として、細胞毒性薬療法、プロテアーゼ阻害剤（ボルテゾミブ等）、レナリドミド、モノクローナル抗体、コルチコステロイド等が挙げられる。しかしながら、現行の治療法は全て、部分的に有効であり、持続的な軽減効果を有さず、高い再発リスクを有する。したがって、多発性骨髄腫の治療法の改善は、特に重要であると思われる。

[00170]ＣＤ１９は、プレＢ細胞及び成熟Ｂ細胞の膜表面上に発現される分子量９５ｋＤａを有する糖タンパク質であり、Ｂ細胞Ｃａ＋＋の膜貫通シグナル伝達経路と密接に関連されており、Ｂ細胞の増殖及び分化に対して制御効果を有する。ＣＤ１９は、主に、高い組織発現特異性を伴って正常なＢ細胞及び癌性Ｂ細胞において発現され、抗体又はＣＡＲ－Ｔ免疫療法に関する良好な標的である。しかしながら、免疫療法の過程では、Ｂ細胞のＣＤ１９エピトープは、多くの場合失われており、患者における免疫療法への不応答又は再発を引き起こす。

[00171]二重特異性は、同じＣＡＲが、２つの異なる抗原に特異的に結合して、２つの異なる抗原を免疫学的に認識することができ、ＣＡＲが、抗原のいずれか１つと組み合わせられた場合に免疫応答を生じることができることを意味する。

[00172]別の好ましい実施形態では、ＣＤ１９及びＢＣＭＡを標的とする二重特異性ＣＡＲは、本発明の第２の態様において記載されている。
[00173]本発明の好ましい実施形態では、本発明によって提供されるＣＡＲの細胞外ドメインは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ及び抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む、ＣＤ１９及びＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインを含む。

[00174]別の好ましい実施形態では、本発明は、ＣＤ１９抗原及びＢＣＭＡ抗原に対する二重特異性キメラ抗原受容体を提供する。ＣＤ１９及びＢＣＭＡの両方を標的とするＣＡＲ構造構成成分は、シグナルペプチド、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、ヒンジ領域、膜貫通領域、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達領域を含むことができ、ここで、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ及びＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、短ペプチドセグメント（Ｇ４Ｓ）×Ｎを通じて結合される。ＣＤ１９及びＢＣＭＡの両方を標的とするＣＡＲ構造は、本発明の第２の態様に記載されている。

[00175]別の好ましい実施形態では、本発明のＣＤ１９及びＢＣＭＡ二重特異性ＣＡＲは、単一構造を有し、ＣＤ１９及びＢＣＭＡに対するｓｃＦｖを含有し、ここで、ＣＡＲは、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ及びＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含有し、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ及びＢＣＭＡ ｓｃＦｖ及びヒンジの順序付けは、その機能の主な影響要因である。

[00176]別の好ましい実施形態では、本発明は、ＢＣＭＡ ｓｃＦｖの配列を最適化する。ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ（Ｓ ｓｃＦｖ）は、ＢＣＭＡと高い親和性及び良好な特異性を有し、ＢＣＭＡの完全長抗原及び細胞外領域を特異的に標的とし得る。

[00177]本発明の好ましい実施形態では、（Ｇ４Ｓ）×３が、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ及びＢＣＭＡ ＳｃＦｖを結合するのに使用される。このＣＡＲは、最良の活性及び死滅能を有する。

[00178]ＣＤ１９及びＢＣＭＡを標的とする二重特異性ＣＡＲは、本発明で使用される。単一抗原を標的とするＣＡＲと比較して、その親和性は、著しく高められ、免疫細胞の活性は、著しく増加し、相乗効果が得られる。更に、腫瘍細胞におけるＣＤ１９及びＢＣＭＡの不均等な発現レベルに起因して、二重標的とするＣＡＲ－Ｔは、より広い治療範囲を有する。ＣＤ１９及びＢＣＭＡの両方を標的とするＣＡＲ免疫細胞は、単一表面抗原のダウンレギュレート又は欠乏によって引き起こされる抗原エスケープの可能性を低減することができる。更に、ＣＤ１９及びＢＣＭＡの二重特異性ＣＡＲ－Ｔは、単一ＣＡＲ－Ｔの能力よりも著しく良好な、骨髄腫を有する患者の骨髄におけるＣＤ３４陰性単球のｉｎ ｖｉｔｒｏでのクローン形成を阻害する能力を有し、これは、ＣＤ１９及びＢＣＭＡの二重特異性ＣＡＲ－Ｔが、単一ＣＡＲ－Ｔの能力よりも著しく良好な腫瘍前駆細胞を阻害する能力を有することを示している。最終的に、ＣＤ１９抗原の付加は、ＣＤ１９及びＢＣＭＡの二重特異性ＣＡＲ－Ｔの連続的な生存能を増加し得る。

キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）
[00179]本明細書中で使用される場合、「ＣＡＲ－Ｔ細胞」、「ＣＡＲ－Ｔ」及び「本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞」は、本発明の第３の態様に包含されるＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。

[00180]ＣＡＲ－Ｔ細胞は、他のＴ細胞ベースの治療法を上回る下記の利点を有する：（１）ＣＡＲ－Ｔ細胞の作用プロセスは、ＭＨＣによって拘束されないこと；（２）多くの腫瘍細胞が同じ腫瘍抗原を発現するという事実を考慮して、或る特定の抗原に向けたＣＡＲ遺伝子の構築が完了すると、それが広く使用され得ること；（３）ＣＡＲは、腫瘍タンパク質抗原及び糖脂質非タンパク質抗原の両方を使用することができ、腫瘍抗原標的の範囲を拡張すること；（４）患者の自己細胞を使用することによって、拒絶のリスクが低減され得ること、及び（５）ＣＡＲ－Ｔ細胞は、免疫学的な記憶機能を有し、長期間にわたって体内で生存することができること。

キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）
[00181]本明細書中で使用される場合、「ＣＡＲ－ＮＫ細胞」、「ＣＡＲ－ＮＫ」及び「本発明のＣＡＲ－ＮＫ細胞」は全て、本発明の第３の態様に包含されるＣＡＲ－ＮＫ細胞を指す。本発明のＣＡＲ－ＮＫ細胞は、多発性骨髄腫等の高いＢＣＭＡ発現を有する腫瘍を処置するのに使用され得る。

[00182]ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、非抗原特異的な経路を通じて、ウイルス感染及び腫瘍細胞浸潤から身体を防御する免疫エフェクター細胞の主要なタイプである。操作された（遺伝子修飾された）ＮＫ細胞は、腫瘍抗原を特異的に認識する能力及び高められた抗腫瘍細胞傷害性を含む、新たな機能を獲得し得る。

[00183]自己ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、例えば、下記の利点を更に有する：（１）体内の正常細胞に対して死滅効果を有さずに、パーフォリン及びグランザイムを放出することによって、腫瘍細胞を直接死滅させること；（２）少量のサイトカインを放出させる、それによって、サイトカインストームのリスクを低減させること；及び（３）ｉｎ ｖｉｔｒｏで「既製の（ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ）」製品へと非常に容易に拡張及び発達すること。更に、ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に類似している。

自殺遺伝子スイッチ
[00184]非腫瘍標的化及びサイトカイン放出症候群等のＣＡＲ－Ｔ細胞の有害反応を更に制御するために、本発明におけるＣＡＲ－Ｔ細胞は全て、外因性薬物の作用下で、身体におけるＣＡＲ－Ｔ細胞を効果的に排除することができる自殺遺伝子スイッチを有し、それにより、未知の、又は制御できない長期にわたる傷害性を阻止して、患者の安全性を保証する。

[00185]本発明で使用される自殺スイッチは、単純ヘルペスウイルスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、ＣＤ２０、突然変異ヒトチミジル酸キナーゼ（ｍＴＭＰＫ）等であり得る。比較すると、ＨＳＶ－ＴＫ、ｉＣａｓｐ９及びＣＤ２０は、ＣＡＲ細胞に対して同じ除去能を有するが、ｉＣａｓｐ９及びＣＤ２０は、より速い除去速度を有し、ＨＳＶ－ＴＫは、より遅い除去速度を有する。

[00186]ｉＣａｓｐ９自殺スイッチは、ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖドメインを含み、ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖドメインは、可撓性リンカーを介して、補充ドメインを含有しないカスパーゼ９に結合され得る。ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖは、３６位のアミノ酸残基の位置でバリンに代わって置換されたフェニルアラニンを有するＦＫＢＰドメインを含む。ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖは、高い選択性及びｎＭ以下の親和性を有し、他の不活性小分子ＡＰ１９０３等の二量体化リガンドを結合し得る。小分子は、付加されると、その二量体化を促進することができ、それにより、細胞アポトーシスを誘導するが、小分子は、自殺スイッチを保有しない正常な細胞にとっては有効でない。

[00187]誘導性安全性スイッチカスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に融合されたヒトカスパーゼ９を使用し、これは、化学誘導物質（ＡＰ１９０３／Ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ、Ｂｅｌｌｉｃｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社）で二量体を形成するように誘導されることができ、融合タンパク質を発現する細胞のアポトーシスを引き起こす。

[00188]ＣＤ１９及びＢＣＭＡは、腫瘍細胞において高度に発現されるが、ＣＤ１９及びＢＣＭＡは、正常なＢ細胞でも発現される。したがって、本発明の操作された免疫細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで正常なＢ細胞を攻撃し得る。

[00189]どのようにして、ＣＡＲ細胞の安全性を制御するかは、常に解決されるべき緊急課題となっている。安全性スイッチをＣＡＲ細胞に付加することは、ＣＡＲ細胞の活性を終結させる最も安全な方法である。ＣＡＲ細胞が、重度の毒性（ＣＲＳ／神経毒性）をもたらした後、又は患者が長期にわたる持続的寛解に達した後、誘導性ｉＣａｓｐ９安全性スイッチは、ＣＡＲ細胞の排除を制御する。

ベクター
[00190]所望の分子をコードする核酸配列は、例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすることによる、遺伝子を含むことが知られているベクターから遺伝子を得ることによる、又は遺伝子を含む細胞及び組織から直接分離するための標準的な技術を使用することによる等の、当該技術分野で既知の組換え方法を使用して得ることができる。任意選択で、目的の遺伝子は、合成的に産生することができる。

[00191]本発明はまた、本発明の発現カセットが挿入されるベクターを提供する。レンチウイルス等のレトロウイルスに由来されるベクターは、それが、導入遺伝子の長期にわたる安定な組込み及び娘細胞における導入遺伝子の伝播を可能にするので、長期にわたる遺伝子導入を達成するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、それらが肝細胞等の非増殖性細胞を形質導入することができるため、マウス白血病ウイルス等の発癌性レトロウイルスに由来されるベクターを上回る利点を有する。レンチウイルスベクターはまた、低い免疫原性の利点も有する。

[00192]概して、本発明の発現カセット又は核酸配列は通常、プロモーターに作動可能に結合されて、発現ベクターに組み込まれる。このベクターは、真核生物における複製及び組込みに適している。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現を調節するのに使用され得る転写及び翻訳終結因子、開始配列及びプロモーターを含有する。

[00193]本発明の発現構築物はまた、核酸免疫化及び遺伝子療法に関する標準的な遺伝子送達プロトコールを利用することができる。遺伝子送達の方法は、当該技術分野で既知である。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号及び同第５，５８９，４６６号を参照のこと。別の実施形態では、本発明は、遺伝子療法ベクターを提供する。

[00194]核酸は、多くのタイプのベクターにクローニングされ得る。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを包含するが、これらに限定されないかかるベクターにクローニングさせることができる。目的の特定のベクターとして、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及びシーケンシングベクターが挙げられる。

[00195]更に、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、ニューヨーク）並びにウイルス学及び分子生物学の他のハンドブックに記載されている。ベクターとして使用され得るウイルスとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。概して、適切なベクターは、少なくとも１種の生物において機能する複製起点、プロモーター配列、利便性の高い制限部位及び１つ又は複数の選択可能マーカーを含有する（例えば、国際公開第０１／９６５８４号、同第０１／２９０５８号、及び米国特許第６，３２６，１９３号を参照）。

[00196]哺乳動物細胞への遺伝子導入のために多くのウイルスベースの系が開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための利便性の高いプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当該技術分野で既知の技法を使用して、ベクターに挿入されて、レトロウイルス粒子へとパッケージングされ得る。続いて、組換えウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで、単離されて、標的細胞に送達され得る。多くのレトロウイルス系が当該技術分野で既知である。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが当該技術分野で既知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。

[00197]エンハンサー等の更なるプロモーター要素は、転写が始まる頻度を調節することができる。概して、これらの要素は、開始部位の上流３０ｂｐ～１１０ｂｐの領域に位置するが、多くのプロモーターはまた、開始部位の下流に機能的要素を含むことが最近示されている。要素が、反転されるか、又は互いに対して移動される場合に、プロモーターの機能を維持するために、プロモーター要素間のスペーシングは、多くの場合柔軟に対応し得る。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーター要素間のスペーシングは、活性が減少し始める前に、５０ｂｐ増加し得る。プロモーターに応じて、個々の要素は、協同的に、又は独立して作用して転写を開始させることができる。

[00198]適切なプロモーターの例は、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベル発現を駆動することが可能な強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長増殖因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかしながら、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬｖプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びに例えばアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘムプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーターであるが、これらに限定されないヒト遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列も使用することができる。更に、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも、本発明の一部として意図される。誘導性プロモーターの使用は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を、かかる発現が望ましい場合にオンにし得るか、又は発現が望ましくない場合に、発現をオフにし得る分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例として、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

[00199]ＣＡＲポリペプチド又はその一部の発現を評価するために、細胞に導入された発現ベクターはまた、発現中の細胞の、ウイルスベクターによってトランスフェクト又は感染されることを求められている細胞集団からの同定及び選択を容易にするように、選択可能マーカー遺伝子及びレポーター遺伝子の一方又は両方を含み得る。他の態様では、選択可能マーカーは、ＤＮＡの単一断片上に保有されて、同時トランスフェクション手順において使用され得る。選択可能マーカー及びレポーター遺伝子はともに、適切な制御配列に隣接させることができ、その結果、選択可能マーカー及びレポーター遺伝子は、宿主細胞において発現され得る。有用な選択可能マーカーとして、例えば、ｎｅｏ等の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。

[00200]レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するのに、また制御配列の機能性を評価するのに使用される。概して、レポーター遺伝子は、レシピエント生物若しくは組織中に存在しないか、又はレシピエント生物若しくは組織によって発現されない遺伝子であり、レポーター遺伝子は、その発現が、酵素活性等の幾つかの容易に検出可能な特性によって明らかに示され得るポリペプチドをコードし得る。ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後、レポーター遺伝子の発現は、適切な時間で測定される。適切なレポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌されたアルカリホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられ得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉら、２０００年 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９～８２頁）。適切な発現系は周知であり、既知の技法を使用して調製され得るか、又は市販されている。概して、最も高いレベルのレポーター遺伝子発現を示す最低５つのフランキング領域を有する構築物が、プロモーターとして同定される。かかるプロモーター領域は、レポーター遺伝子に結合されて、試薬の、プロモーター駆動型転写を調節する能力を評価するのに使用され得る。

[00201]遺伝子を細胞に導入して、遺伝子を細胞に発現させる方法は、当該技術分野で既知である。発現ベクターの状況では、ベクターは、当該技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞又は昆虫細胞に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的又は生物学的手段によって、宿主細胞に移入され得る。

[00202]ポリヌクレオチドを、宿主細胞に導入する物理的方法として、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、パーティクルガン（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等が挙げられる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を産生する方法は、当該技術分野で周知されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、ニューヨーク）を参照のこと。ポリヌクレオチドを、宿主細胞に導入する好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。

[00203]目的のポリヌクレオチドを、宿主細胞に導入する生物学的方法は、ＤＮＡベクター及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を、ヒト細胞等の哺乳動物細胞に挿入する最も広く使用されている方法になっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス等に由来され得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照のこと。

[00204]ポリヌクレオチドを、宿主細胞に導入するための化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ等のコロイド分散系；並びに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベースの系を含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで送達ビヒクルとして使用される例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。

[00205]非ウイルス送達系を使用する場合、例示的な送達ツールはリポソームである。脂質製剤の使用は、核酸を宿主細胞に導入する（ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ｅｘ ｖｉｖｏで、又はｉｎ ｖｉｖｏで）と考えられる。他方で、この核酸は、脂質と結合させることができる。脂質に結合された核酸は、リポソームの水性内部中に封入され得るか、リポソームの脂質二重層に分散され得るか、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方に結合される連結分子を介してリポソームに結合され得るか、リポソームに捕捉され得るか、リポソームと複合体形成され得るか、脂質を含有する溶液中に分散され得るか、脂質と混合され得るか、脂質と組み合わせられ得るか、懸濁液として脂質中に含有され得るか、ミセル中に含有され得るか、若しくはミセルと複合体形成され得るか、又は他の場合で脂質と結合され得る。組成物に関連する脂質、脂質／ＤＮＡ又は脂質／発現ベクターは、溶液中で任意の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造で存在し得るか、ミセルとして存在し得るか、又は「崩壊された」構造を有し得る。それらはまた、単に溶液中に分散されてもよく、場合によっては、不均等なサイズ又は形状の凝集体を形成する。脂質は、天然に存在する脂質又は合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質中に、並びに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール及びアルデヒド等の長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体を含有するかかる化合物中に天然に存在する脂肪滴を含む。

[00206]本発明の好ましい実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
製剤
[00207]本発明は、本発明の第１の態様によるＣＡＲ－Ｔ細胞、及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む組成物を提供する。一実施形態では、製剤は、脂質製剤である。好ましくは、製剤は、注射である。好ましくは、製剤中のＣＡＲ－Ｔ細胞の濃度は、１×１０^３～１×１０^８個の細胞／ｍｌ、より好ましくは１×１０^４個～１×１０^７個の細胞／ｍｌである。

[00208]一実施形態では、製剤は、中性緩衝液生理食塩水、硫酸緩衝液生理食塩水等の緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトール等の炭水化物；タンパク質；ポリペプチド又はグリシン等のアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオ等のキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及び防腐剤を含み得る。本発明の製剤は、好ましくは静脈内投与用に配合される。

治療用途
[00209]本発明は、本発明の発現カセットをコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）で形質導入された細胞（例えば、Ｔ細胞）を用いた治療用途を含む。形質導入されたＴ細胞は、腫瘍細胞のマーカーＢＣＭＡ及び／又はＣＤ１９を標的として、Ｔ細胞を相乗的に活性化させることができ、Ｔ細胞免疫応答を引き起こして、それにより腫瘍細胞に対するそれらの死滅効率を著しく改善する。

[00210]したがって、本発明はまた、哺乳動物における標的細胞集団又は組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激する方法を提供し、該方法は、下記工程：本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞を哺乳動物に投与する工程を含む。

[00211]一実施形態では、本発明は、患者の自己Ｔ細胞（又は同種異系ドナー由来）が単離されて、活性化されて、ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するように遺伝子修飾された後、同じ患者に注射される細胞療法のタイプを含む。この方法においては、移植片対宿主病を患う蓋然性は極めて低く、抗原は、非ＭＨＣ拘束様式で、Ｔ細胞によって認識されてる。更に、１つのＣＡＲ－Ｔが、抗原を発現する癌全てを処置することができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで複製することができ、持続的な腫瘍制御につながり得る長期持続性を生み出す。

[00212]一実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、安定なｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞拡張を受けて、長期間にわたって存続し得る。更に、ＣＡＲ媒介性免疫応答は、養子免疫療法手順の一部である可能性があり、そこでは、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞は、ＣＡＲにおける抗原結合ドメインに特異的な免疫応答を誘導する。例えば、ＢＣＭＡ及び／又はＣＤ１９に対するＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ及び／又はＣＤ１９を発現する細胞に対して特異的な免疫応答を誘発する。

[00213]本明細書中に開示されるデータは、具体的に、抗ＢＣＭＡ及び／又はＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ヒンジ及び膜貫通領域、並びに４－１ＢＢ／ＣＤ２８及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むレンチウイルスベクターを開示するが、本発明は、構築物構成成分それぞれの数における任意の変化を含むと解釈されるべきである。

[00214]処置可能な癌として、血管形成されていないか、又は実質的に血管形成されていない腫瘍、並びに血管形成された腫瘍が挙げられる。癌は、非固形腫瘍（血液腫瘍等、例えば、白血病及びリンパ腫）を含み得るか、又は固形腫瘍を含み得る。本発明のＣＡＲで処置される癌のタイプとして、細胞腫、芽細胞腫及び肉腫、或る特定の白血病又はリンパ系悪性疾患、良性及び悪性腫瘍、並びに肉腫、細胞腫及び黒色腫等の悪性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。成体腫瘍／癌及び小児腫瘍／癌もまた含まれる。

[00215]血液癌は、血液又は骨髄の癌である。血液（又は造血性）癌の例として、急性白血病（球性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病及び骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、顆粒単球性（ｇｒａｎｕｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ）白血病、単球性白血病及び赤白血病等）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病及び慢性リンパ性白血病等）を含む白血病、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性及び進行型）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病及び脊椎異形成が挙げられる。

[00216]固形腫瘍は、通常は嚢胞又は液体領域を含まない組織の異常塊である。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。固形腫瘍の種々の型は、それらの細胞型が形成された後に指定され得る（例えば、肉腫、細胞腫、及びリンパ腫）。肉腫及び細胞腫等の固形腫瘍の例として、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、中皮肉腫、リンパ系悪性疾患、膵癌、及び卵巣癌が挙げられる。

[00217]本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞はまた、哺乳動物のｅｘ ｖｉｖｏでの免疫化及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの治療法のためのワクチンのタイプとして使用することができる。好ましくは、該哺乳動物はヒトである。

[00218]ｅｘ ｖｉｖｏでの免疫化に関して、下記の少なくとも１つが、細胞を哺乳動物に投与する前にｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる：１）細胞を拡張させること；ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸を細胞に導入すること；及び／又はｉｉｉ）細胞を凍結保存すること。

[00219]ｅｘ ｖｉｖｏでの手順は、当該技術分野で周知されており、以下でより十分に論述される。簡潔に述べると、細胞は、哺乳動物（好ましくは、ヒト）から単離されて、本明細書中で開示されるＣＡＲを発現するベクターで、遺伝子修飾される（即ち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入又はトランスフェクトされる）。ＣＡＲ修飾細胞は、治療効果を提供するように哺乳動物レシピエントに投与され得る。哺乳動物レシピエントは、ヒトであってもよく、ＣＡＲ修飾細胞は、レシピエントに対して自己であり得る。或いは、細胞は、レシピエントに対して、同種異系、同系又は異種であり得る。

[00220]ｅｘ ｖｉｖｏでの免疫化用の細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本発明はまた、患者において抗原に対する免疫応答を誘発するためのｉｎ ｖｉｖｏでの免疫化のための組成物及び方法を提供する。

[00221]本発明は、腫瘍を処置する方法を提供し、該方法は、治療上有効な量の本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞を、処置を必要とする患者に投与する工程を含む。
[00222]本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞は、単独で、或いは希釈剤及び／又はＩＬ－２、ＩＬ－１７若しくは他のサイトカイン若しくは細胞集団等の他の構成成分と組み合わせて医薬組成物として投与され得る。簡潔に述べると、本発明の医薬組成物は、本明細書中に記載されるような標的細胞集団を含み、１つ若しくは複数の薬学的に又は生理学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせられ得る。かかる組成物は、中性緩衝生理食塩水、硫酸緩衝生理食塩水等の緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトール等の炭水化物；タンパク質；ポリペプチド又はグリシン等のアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオ等のキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及び防腐剤を含み得る。本発明の製剤は、好ましくは静脈内投与用に配合される。

[00223]本発明の医薬組成物は、処置されるべき（又は予防されるべき）疾患に適した方法で投与され得る。投与の量及び頻度は、患者の障害、並びに患者の疾患のタイプ及び重篤性等の要因によって決定され得るが、適切な投与量は、臨床試験によって決定され得る。

[00224]「免疫学的に有効な量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」又は「治療量」について言及する場合、投与されるべき本発明の組成物の正確な量は、医師によって決定されてよく、医師は、患者の（対象の）年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の度合い、及び障害における個々の差を考慮する。概して、本明細書中に記載されるＴ細胞を含む医薬組成物は、１０^４個～１０^９個の細胞／ｋｇ（体重）の用量で、好ましくは１０^５個～１０^６個の細胞／ｋｇ（体重）の用量で（それらの範囲内の整数値全てを含む）投与され得ると指摘され得る。Ｔ細胞組成物はまた、これらの用量で、複数回投与され得る。細胞は、免疫療法における周知の注射技法を使用することによって投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６、１９８８年を参照）。特定の患者に関する最適な投与量及び治療レジメンは、医療分野の当業者によって、患者の疾患の兆候をモニタリングすること、及びそれに応じて治療法を調節することにより、容易に決定され得る。

[00225]組成物の、対象への投与は、噴霧、注射、嚥下、注入、インプラント術又は移植によることを含む、任意の利便性の高い方法で実行され得る。本明細書中に記載される組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、節内、脊髄内、筋内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、又は腹腔内的に、患者に投与され得る。一実施形態では、本発明のＴ細胞組成物は、皮内又は皮下注射によって、患者に投与される。別の実施形態では、本発明のＴ細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節又は感染部位へ直接注射することができる。

[00226]本発明の或る特定の実施形態では、Ｔ細胞を治療レベルに拡張させるために本明細書中に記載される方法又は当該技術分野で既知の他の方法を使用して活性化及び拡張させた細胞は、任意の数の関連治療形態と組み合わせて（例えば、それらに先立って、それらと同時に、又はそれらの後で）患者に投与され、治療形態としては、下記の試薬を用いた治療法が挙げられるが、これらに限定されない：抗ウイルス療法であるシドフォビル及びインターロイキン－２、シタラビン（ＡＲＡ－Ｃとしても既知）、又はＭＳ患者用のナタリズマブ療法、又は乾癬患者用のエファリズマブ療法、又はＰＭＬ患者用の他の療法等の試薬。更なる実施形態では、本発明のＴ細胞は、下記を組み合わせて使用され得る：化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル及びＦＫ５０６等の免疫抑制剤、抗体又は他の免疫療法剤。更なる実施形態では、本発明の細胞組成物は、フルダラビン等の化学療法剤、外照射療法（ＸＲＴ）、及びシクロホスファミドを使用して、骨髄移植と組み合わせて（例えば、それに先立って、それと同時に、又はその後で）患者に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法、続く末梢血幹細胞移植の標準的な処置を受けることができる。幾つかの実施形態では、移植後、対象は、本発明の拡張された免疫細胞の注入を受容する。更なる実施形態では、拡張された細胞は、手術の後又は前に投与される。

[00227]患者に投与される上記処置の投与量は、処置される障害の正確な性質及び処置されるレシピエントによって変化する。ヒトに投与される投与量比は、当該技術分野で受け入れられている実践に従って遂行され得る。概して、処置１回又は一連の処置につき１×１０^６個～１×１０^１０個の本発明による修飾されたＴ細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ２０細胞）が、例えば、静脈内再注入によって患者に投与され得る。

[00228]本発明の主な利点として、下記が挙げられる：
[00229]（ａ）本発明に従って構築されたＳ ｓｃＦｖを含むＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＢＢ及びＡｐｒｉｌ ＣＡＲ－Ｔよりも高い、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍死滅及び機能活性を有すること。

[00230]（ｂ）本発明に従って構築された二重特異性ＣＡＲ－Ｔは、ＢＣＭＡを含む、２つ又はそれよりも多い標的を認識し得ること。
[00231]本発明は、以下の特定の実施例と併せて更に記載される。これらの実施例は、単に本発明について記載するのに使用されるものであり、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。下記の実施例において特定の条件を示していない実験方法は、通常、従来の条件に従うか、又は製造業者によって推奨される条件に従う。別記されない限り、パーセント及び部は、重量に基づいて算出される。

実施例１ ドナー血液からのＰＢＭＣの単離及びＴ細胞の拡張
[00232]単核細胞を、ドナー血液から単離した後、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて、密度勾配遠心分離を実施して、Ｔ細胞（ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を富化した。Ｔ細胞を、カップリングされた抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズを使用して、活性化して、培養して、拡張して、Ｘ－ｖｉｖｏ１５（３００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２）を培地として使用して、続いて、細胞は全て、定温インキュベーター中で、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

実施例２ 細胞培養及び構築
[00233]ＢＣＭＡ発現細胞系統ＭＭ．１ｓ及びＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ．１ｓ－ｆｆｌｕｃ細胞、ＲＰＭＩ８２２６－ｆｆｌｕｃ細胞、及びＢＣＭＡ、ＣＤ１９又はＢＣＭＡ及びＣＤ１９の両方を発現するＨｅｌａ細胞は全て、ＲＰＭＩ １６４０培地中で培養し、２９３Ｔ（ヒト腎上皮細胞系統細胞、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３２１６）は、ＤＭＥＭ培地を用いて培養した。培地には全て、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及び１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを補充した。

[00234]それらの中でも、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９又はＢＣＭＡ及びＣＤ１９の両方を発現するＨｅｌａ細胞は、レンチウイルスベクターを通じて、ＢＣＭＡ及び／又はＣＤ１９抗原を移入することによって得られた、安定にトランスフェクトされた細胞系統であり、ＢＣＭＡ及び／又はＣＤ１９タンパク質分子を特異的に発現することができる。ＭＭ．１ｓ－ｆｆｌｕｃ細胞及びＲＰＭＩ８２２６－ｆｆｌｕｃ細胞は、ホタルルシフェラーゼレンチウイルスによる感染後にスクリーニングすることによって得られた、安定にトランスフェクトされた細胞系統であった。

実施例３ ＣＡＲの構造設計及び形質導入
[00235]ＢＣＭＡを標的とする単一ＣＡＲ並びにＢＣＭＡ及びＣＤ１９の両方を標的とする二重ＣＡＲを設計及び構築して、構造的模式図を図１に示した。それらの中でも、ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ及び自殺スイッチ－ＥＧＦＲｔ要素は、２Ａペプチドを介して結合された。具体的には、本発明に関与するＣＡＲ構造を図１に示し、命名及び組成を表１に示した。

[00236]

[00237]図１及び表１に記載されるＣＡＲに関与する各要素の特定の配列は、下記の通りである：
Ｓ ｓｃＦｖ（Ｓ ｓｃＦｖ）重鎖
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＮＳＧＹＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＡＴＭＴＡＤＫＳＩＮＴＡＹＶＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＦＣＴＲＹＭＷＥＲＶＴＧＦＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号９）
Ｓ ｓｃＦｖ（Ｓ ｓｃＦｖ）軽鎖
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＬＡＳＥＤＩＳＤＤＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＶＹＴＴＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＴＹＫＦＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号１０）
ＢＢ ｓｃＦｖ重鎖
ＤＩＶＬＴＱＳＰＰＳＬＡＭＳＬＧＫＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＴＩＬＧＳＨＬＩＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＴＬＬＩＱＬＡＳＮＶＱＴＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＤＰＶＥＥＤＤＶＡＶＹＹＣＬＱＳＲＴＩＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１３）
ＢＢ ｓｃＦｖ軽鎖
ＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＳＩＮＷＶＫＲＡＰＧＫＧＬＫＷＭＧＷＩＮＴＥＴＲＥＰＡＹＡＹＤＦＲＧＲＦＡＦＳＬＥＴＳＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＹＥＤＴＡＴＹＦＣＡＬＤＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＡＡ（配列番号１４）
Ａｐｒｉｌ鎖
ＳＶＬＨＬＶＰＩＮＡＴＳＫＤＤＳＤＶＴＥＶＭＷＱＰＡＬＲＲＧＲＧＬＱＡＱＧＹＧＶＲＩＱＤＡＧＶＹＬＬＹＳＱＶＬＦＱＤＶＴＦＴＭＧＱＶＶＳＲＥＧＱＧＲＱＥＴＬＦＲＣＩＲＳＭＰＳＨＰＤＲＡＹＮＳＣＹＳＡＧＶＦＨＬＨＱＧＤＩＬＳＶＩＩＰＲＡＲＡＫＬＮＬＳＰＨＧＴＦＬＧＦＶＫＬＳＧＧＧＳＤＰ（配列番号１５）
ＣＤ８シグナルペプチド
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号１６）
（Ｇ４Ｓ）３リンカーペプチド
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７）
（Ｇ４Ｓ）５リンカーペプチド
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１８）
２１８リンカーペプチド
ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１９）
ＣＤ８ヒンジ領域
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号８）
又はＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＳＤＫＰ（配列番号３７）
又はＳＧＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号３８）
ＣＤ８膜貫通領域
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号７）
ＣＤ２８膜貫通領域
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号６）
４１ＢＢシグナル伝達領域
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号５）
ＣＤ２８シグナル伝達領域
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号４）
ＣＤ３ｚシグナル伝達領域
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号３）
又は
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号３９）
２Ａペプチド
ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰ（配列番号２）
ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ（ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）重鎖
ＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号１１）
ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ（ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）軽鎖
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴ（配列番号１２）
ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチド
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１）
ＥＧＦＲｔ配列
ＲＫＶＣＮＧＩＧＩＧＥＦＫＤＳＬＳＩＮＡＴＮＩＫＨＦＫＮＣＴＳＩＳＧＤＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬＤＰＱＥＬＤＩＬＫＴＶＫＥＩＴＧＦＬＬＩＱＡＷＰＥＮＲＴＤＬＨＡＦＥＮＬＥＩＩＲＧＲＴＫＱＨＧＱＦＳＬＡＶＶＳＬＮＩＴＳＬＧＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＱＫＴＫＩＩＳＮＲＧＥＮＳＣＫＡＴＧＱＶＣＨＡＬＣＳＰＥＧＣＷＧＰＥＰＲＤＣＶＳＣＲＮＶＳＲＧＲＥＣＶＤＫＣＮＬＬＥＧＥＰＲＥＦＶＥＮＳＥＣＩＱＣＨＰＥＣＬＰＱＡＭＮＩＴＣＴＧＲＧＰＤＮＣＩＱＣＡＨＹＩＤＧＰＨＣＶＫＴＣＰＡＧＶＭＧＥＮＮＴＬＶＷＫＹＡＤＡＧＨＶＣＨＬＣＨＰＮＣＴＹＧＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰＴＮＧＰＫＩＰＳＩＡＴＧＭＶＧＡＬＬＬＬＬＶＶＡＬＧＩＧＬＦＭ（配列番号２０）
[00238]表１のＣＡＲ遺伝子を、ＦＵＷレンチウイルスベクター骨格へクローニングして、Ｔ細胞を感染させるのに使用することができる完全レンチウイルス発現ベクターを構築した。具体的に、詳細な説明のための例としてＢＣＭＡ ＣＡＲ遺伝子を取り上げて、ＢＣＭＡ ＣＡＲ遺伝子を、ＥＦ１α（ＥＦ－１α）プロモーターの作用下に配置させて、Ｆｕｗ－ＥＦ１α－ＢＣＭＡ ＣＡＲを形成し、３つのプラスミド、即ち、Ｆｕｗ－ＥＦ１α－ＢＣＭＡ ＣＡＲ、レンチウイルス外被プラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ社、プラスミド＃１２２５９）及びレンチウイルスパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ社、プラスミド＃１２２６０）を、リポフェクタミン３０００を使用して、２９３Ｔへ移入して、完全レンチウイルス発現ベクターを調製して、ウイルス上清を、４８時間及び７２時間で収集して、超遠心分離により濃縮して、濃縮されたウイルスを、Ｔ細胞を感染させるのに使用することができる。

[00239]フローサイトメトリー分析の結果により、ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターは、構築されたＣＡＲ遺伝子から調製することができることが示された。

実施例４ ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
[00240]実験方法は以下の通りである：
[00241]４．１ レンチウイルス感染
[00242]単離及び精製した初代Ｔ細胞を活性化した２日後、それらを、実施例３で構築されたレンチウイルスを使用してレンチウイルスベクターで感染させ、続いて、細胞培養フラスコに移して、定温インキュベーター中で、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

[00243]４．２ 細胞の増殖及びＣＡＲ陽性率の検出
[00244]感染の３日後、凍結保存前に、ＢＣＭＡ抗原を使用して、ＢＣＭＡ陽性細胞の細胞数及びパーセントを検出するために、即ち、Ｔ細胞のＣＡＲ陽性率を検出するために、試料を採取した。培地の半分を、２日～３日毎に交換した。

[00245]結果により、実施例３で構築されたレンチウイルスベクターを使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞がそれぞれ、首尾よく構築されることが示され、それらの命名を表１に示す。
[00246]具体的に、ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の構築結果を図２に示す。ＢＣＭＡ ＣＡＲの発現は、ウイルストランスフェクションの後、ＣＡＲ－ＢＢ及びＣＡＲ－Ｓ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方で検出することができ、ＣＡＲ発現は、５０％超に到達し得る。

実施例５ 細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの死滅
[00247]ｉｎ ｖｉｔｒｏでの死滅実験を、実施例４で得られたＣＡＲ－Ｓ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＢＢ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＡＲ－Ａｐｒｉｌ ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて実施した。ＲＴＣＡ法を使用して、標的細胞であるＢＣＭＡを過剰発現するＨｅｌａ細胞系統に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の死滅を検査した。

[00248]結果を図３に示し（ＲＴＣＡ法を使用して検査した）、ＮＴ対照（トランスフェクトされていないＴ細胞対照）及び培地対照（ブランク対照）は、Ｈｅｌａ－ＢＣＭＡ細胞に対して死滅を有さなかったのに対して、ＣＡＲ－Ｓ１細胞は、ＢＣＭＡに特異的な死滅機能を遂行することができ、ＣＡＲ－Ｓ１細胞は、ＢＣＭＡ陽性Ｈｅｌａ－ＢＣＭＡ細胞を死滅させるのに、ＣＡＲ－ＢＢ細胞よりも良好な結果を示した。

[00249]ルシフェラーゼで標識した腫瘍標的細胞を、死滅能の検出に使用した。ルシフェラーゼ遺伝子を、標的細胞に移入することによって、クローンスクリーニング後に、安定にトランスフェクトされた細胞株ＭＭ．１ｓ－Ｌｕｃ及びＲＰＭＩ８２２６－Ｌｕｃを得た。実験中、ルシフェリン基質を添加することによって、ルシフェラーゼは、ルシフェリンと反応して、蛍光を生じ、蛍光の強度を検出することによって、ルシフェラーゼの活性を測定することができ、続いて、細胞の生存比を検出することができ、ＣＡＲ－Ｔ細胞の死滅効果を得ることができる。

[00250]図４は、標的細胞の表面上での抗原発現を示す。図５は、同じＥ：Ｔ比下で、ＮＴ細胞が、死滅機能を有さず、ＣＡＲ－Ｓ１細胞は、ＭＭ．１ｓ－Ｌｕｃ細胞（ルシフェラーゼ遺伝子を移入したＭＭ．１Ｓ細胞）及びＲＰＭＩ８２２６－Ｌｕｃ細胞（ルシフェラーゼ遺伝子を移入したＲＰＭＩ８２２６細胞）に対して用量依存的死滅効果を有すること、またＣＡＲ－Ｓ１細胞が、ＣＡＲ－ＢＢ及びＣＡＲ－Ａｐｒｉｌよりも良好な死滅能を示したことを示す。

[00251]更に、本出願人はまた、当該技術分野で一般に見られる様々な標的ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を構築して、試験した場合、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞はいずれも、理想的な死滅機能を示さなかった。

[00252]要約すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的細胞（ＢＣＭＡ過剰発現細胞、及びＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞、ＭＭ．１ｓ－Ｌｕｃ及びＲＰＭＩ８２２６細胞）と共培養した後、標的細胞を、ＢＣＭＡを標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞によって溶解させることができ、ＣＡＲ－Ｓ１は、ＣＡＲ－ＢＢよりも高い死滅能を示した。当該技術分野で一般に見られるＢＣＭＡを標的とするｓｃＦｖによって構築された幾つか他のＣＡＲ－Ｔ細胞は、理想的な死滅機能を示さなかった。

実施例６ サイトカイン放出の検出
[00253]実施例４で得られたＢＣＭＡを標的とするＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｓ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＡＲ－ＢＢ ＣＡＲ－Ｔ細胞）を、腫瘍細胞（Ｈｅｌａ、Ｈｅｌａ－ＢＣＭＡ、Ｈｅｌａ－ＣＤ１９、又はＨｅｌａ－ＢＣＭＡ－ＣＤ１９）と混合して、ＲＰＭＩ培地中に置いた。各細胞密度の密度を、１×１０^４個の細胞／ｍｌに調製した。ＣＡＲ－Ｔ細胞及び腫瘍細胞それぞれ１００μｌを、９６ウェルプレートに入れ、一晩共培養した。上清を収集して、遠心分離後、上清を採取して、サイトカインＩＦＮ－γ等の放出レベルを検出した。Ｅｌｉｓａキットを、検出に使用した。

[00254]結果を図６に示す。Ｈｅｌａ－ＢＣＭＡ標的細胞によって同時刺激した後、ＣＡＲ－Ｓ１のサイトカインＩＮＦ－γの分泌は、ＣＡＲ－ＢＢのサイトカインＩＮＦ－γの分泌よりも著しく高かったのに対して、ＮＴ及び培地群では、著しい分泌は見られなかった。

実施例７ ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物有効性に関する研究
[00255]６週齢～１２週齢のＮＯＧマウスを選択して、１×１０^７個のＲＰＭＩ８２２６細胞を皮下注射した。２日後、腫瘍移植片負荷を測定した。１０日後、群分けを実施して、ＣＡＲ－Ｓ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＡＲ－ＢＢ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、群分けの１日後に注射した。ＣＡＲ－Ｔ処置後、マウスの腫瘍体積負荷を、週に２回評価した。

[00256]結果を図７に示す。対照と比較して、ＣＡＲ－Ｓ１細胞を注射したマウスの腫瘍負荷は、著しく抑制された。ＣＡＲ－Ｓ１細胞は、ＣＡＲ－ＢＢよりもわずかに高い抗腫瘍効果を有した。

実施例８ 二重ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
[00257]実験法は、下記の通りである：
[00258]この実施例は、ＢＣＭＡ及びＣＤ１９の両方を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞に関与し、ＣＡＲの構造を図１に示した（ＣＡＲ Ｓ２、ＣＡＲ Ｓ３、ＣＡＲ Ｓ４、ＣＡＲ Ｓ５、ＣＡＲ Ｓ６及びＣＡＲ Ｓ７）。それらの中でも、ＢＣＭＡ ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ及び自殺スイッチ－ＥＧＦＲｔ要素は、２Ａペプチドを介して結合された。それらの中でも、ＢＣＭＡ ＣＡＲ構造におけるｓｃＦｖは、Ｓ及びＢＢのｓｃＦｖ重鎖並びに軽鎖で構成されていた。ここで、Ｓ ｓｃＦｖは、配列番号９及び配列番号１０で構成され、ＢＢ ｓｃＦｖは、配列番号１３及び配列番号１４で構成され、ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号１１及び配列番号１２で構成され、更に、ｓｃＦｖを、Ａｐｒｉｌ配列（配列番号１５）の一部で構成されるＢＣＭＡ結合領域で置き換えて、新たなＣＡＲ構造を形成することができる。

[00259]ＢＣＭＡ－ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子を、ベクター骨格へクローニングして、ＥＦ１α（ＥＦ－１α）プロモーターの作用下に配置させて、ＥＦ１α－ＢＣＭＡ－ＣＤ１９－ＥＧＦＲｔ ＣＡＲを形成し、ＥＦ１α－ＢＣＭＡ－ＣＤ１９－ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ及びレンチウイルス外被プラスミドを、リポフェクタミン３０００を使用して、２９３Ｔへ移入して、完全レンチウイルスベクターを調製して、ウイルス上清を、４８時間及び７２時間で収集して、超遠心分離を介して濃縮して、濃縮されたウイルスを、Ｔ細胞を感染させるのに使用することができる。

[00260]レンチウイルス感染：単離及び精製した初代Ｔ細胞を活性化した２日後、それらを、ＭＯＩ（１～１０）で上記のように構築されたレンチウイルスを使用してレンチウイルスベクターで感染させ、続いて、細胞培養フラスコに移して、定温インキュベーター中で、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

[00261]細胞の増殖及びＣＡＲ陽性率の検出：感染の３日後、凍結保存前に、細胞数及びＢＣＭＡ／ＣＤ１９二重陽性細胞を検出するために、即ち、Ｔ細胞のＣＡＲ陽性率を検出するために、試料を採取した。培地の半分を、２日～３日毎に交換した。

[00262]結果により、図１及び表１に具体的に示されるように、ＢＣＭＡ－ＣＤ１９ ＣＡＲレンチウイルスベクターを使用して、ＢＣＭＡ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、首尾よく構築されることが示された。

[00263]結果を図８に示す。ＢＣＭＡ ＣＡＲ及びＣＤ１９ ＣＡＲの発現は、ＢＣＭＡ抗原及びＣＤ１９抗原の両方を使用して、ウイルス感染されたＴ細胞の表面上で検出することができる。

[00264]図９は、ＢＣＭＡ ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ及びＥＧＦＲｔの発現は全て、ＣＡＲ－Ｓ６及びＣＡＲ－Ｓ７細胞の表面上で検出することができることを示す。
実施例９ 細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの死滅
[00265]ｉｎ ｖｉｔｒｏでの死滅実験を、実施例８で得られたＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて実施した。ＢＣＭＡ及びＣＤ１９を過剰発現する過剰発現Ｈｅｌａ細胞系統を、ＲＴＣＡに使用したか、又はルシフェラーゼで標識した腫瘍標的細胞を、検出に使用した。ルシフェラーゼ遺伝子を、標的細胞に移入することによって、クローンスクリーニング後に、安定にトランスフェクトされた細胞株（ＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ．１ｓ及びＮａｌｍ６）を得た。実験中、ルシフェリン基質を添加することによって、ルシフェラーゼは、ルシフェリンと反応して、蛍光を生じ、蛍光の強度を検出することによって、ルシフェラーゼの活性を測定することができ、続いて、細胞の生存比を検出することができ、ＣＡＲ－Ｔ細胞の死滅効果を得ることができる。

[00266]結果により、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的細胞（ＣＤ１９／ＢＣＭＡ二重陽性、ＣＤ１９単一陽性、及びＢＣＭＡ単一陽性細胞）と共培養した後、標的細胞は全て、溶解することが示され、ＢＣＭＡ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔは、ＣＤ１９／ＢＣＭＡ二重陽性、ＣＤ１９単一陽性、及びＢＣＭＡ単一陽性細胞の全てに対して死滅効果を有することを示した。

[00267]特定の結果を図１０に示す。二重特異性ＣＡＲ－Ｔは、単一陽性ＣＤ１９陽性標的細胞（Ｈｅｌａ－ＣＤ１９）又は単一陽性ＢＣＭＡ陽性標的細胞（Ｈｅｌａ－ＢＣＭＡ）を著しく死滅させることができ、二重特異性ＣＡＲ－Ｔはまた、ＣＤ１９／ＢＣＭＡ二重陽性標的細胞Ｈｅｌａ－ＢＣＭＡ－ＣＤ１９を著しく死滅させることができる。ＢＣＭＡ及びＣＤ１９の組合せを有する二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞は、単一標的及び二重標的細胞の両方に対して死滅効果を有することが示された。単一ＣＡＲ－Ｔ（ＣＡＲ－１９又はＣＡＲ－Ｓ１）は、１つの標的抗原に対してのみ、死滅効果を有するに過ぎなかった。

[00268]図１１は、二重ＣＡＲ－Ｔが、ＢＣＭＡ単一陽性腫瘍標的細胞ＭＭ．１ｓ及びＲＰＭＩ８２２６を著しく死滅させることができることを示す。二重ＣＡＲ－Ｔはまた、ＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞Ｒａｊｉ及びＮａｌｍ６を著しく死滅させた。ＢＣＭＡ及びＣＤ１９の組合せを有する二重ＣＡＲは、ＢＣＭＡ陽性腫瘍標的細胞及びＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞の両方に対して死滅効果を有することが示された。

実施例１０ サイトカイン放出の検出
[00269]ＢＣＭＡ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞（実施例８で得られた）を、腫瘍細胞（Ｈｅｌａ－ＢＣＭＡ）と混合して、ＲＰＭＩ培地中に置いた。各細胞の密度を、１×１０^４個の細胞／ｍｌに調製した。ＣＡＲ－Ｔ細胞及び腫瘍細胞それぞれ１００μｌを、９６ウェルプレートに入れて、一晩共培養した。上清を収集して、遠心分離後、上清を採取して、サイトカインの放出レベルを検出した。ＣＢＡ法を検出に使用した。

[00270]結果を図１２に示す。ＢＣＭ陽性標的細胞によって刺激した後、ＢＣＭＡ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔは、大量のサイトカインを分泌することができ、ＮＴは、ごく少量のサイトカインを分泌した。ＢＣＭＡ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔは、ＢＣＭＡによって活性され得ることが示された。

実施例１１ 刺激された後のＣＤ１０７のアップレギュレーション
[00271]実施例８で得られたＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化して、続いて、Ｃ１０７ａ発現の変化に関して、フローサイトメトリー分析に付し、ＣＤ１９又はＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞系統を、共インキュベーション活性化実験に使用した。共インキュベーション後、細胞を、ＣＤ３、ＣＤ８及びＣＤ１０７ａに関する抗体で標識して、続いて、フローサイトメトリー分析に付した。

[00272]結果を表１３に示す。二重ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＢＣＭＡ陽性腫瘍標的細胞ＭＭ．１ｓ及びＣＤ１９陽性Ｒａｊｉと共培養した後、ＣＡＲ－Ｔ細胞の表面上のＣＤ１０７ａ分子は、著しくアップレギュレートされた。

実施例１２ ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物有効性に関する研究
[00273]６週齢～１２週齢のＮＯＧマウスを選択して、１×１０^７個のＲＰＭＩ８２２６細胞を皮下注射した。２日後、腫瘍移植片量を測定した。１０日後、それらを、類似した腫瘍負荷を有する群に分けて、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、それぞれ、群分けの１日後にそれらに注射した。ＣＡＲ－Ｔ処置後、マウスの腫瘍体積負荷を、週に２回評価した。

[00274]図１４の結果により、ＣＡＲ－Ｓ２及びＣＡＲ－Ｓ４は、ＲＰＭＩ８２２６細胞で皮下的にモデル化したマウスにおいて、腫瘍を排除することができることが示され、それらの著しい抗腫瘍有効性を示す。

[00275]同時に、６週齢～１２週齢のＮＯＧマウスを選択して、１×１０^７個のＭＭ．１ｓ細胞を静脈内注射した。腫瘍移植片負荷を検出して、腫瘍負荷に従って、マウスを群に均等に分けた。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、群分けの１日後に注射した。ＣＡＲ－Ｔ処置後、マウスの腫瘍体積負荷を評価した。各マウスに、ｄ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）３ｍｇを腹腔内注射して、続いて、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ画像システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、４分後に露光時間３０秒で撮影した。放出された光子の量に従って、生物発光シグナルを算出し、光子の量は、露光時間及び表面積を用いて正規化して、最終的に、光子／ｓ／ｃｍ^２／ステラジアン（ｐ／ｓ／ｃｍ^２／ｓｒ）の量を得た。

[00276]図１５の結果により、対照と比較して、二重ＣＡＲ－Ｔ細胞を注射したマウスの腫瘍負荷は、消失するまで著しく低減されたことが示され、ＢＣＭＡ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞が著しい抗腫瘍効果を有していたことを示す。

実施例１３ 腫瘍形成細胞の死滅に関する研究
[00277]骨髄腫（ＭＭ）を有する患者の再発は、一般的な臨床現象であり、臨床所見は概して、腫瘍細胞の大部分を排除することができるが、腫瘍の再発を招くクローン増殖が可能な腫瘍細胞は、比較的高い薬物耐性を有する傾向にあるということである。クローン増殖が可能な腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の死滅能を研究するために、また二重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞及び単一ＣＡＲ－Ｔ細胞の利点を比較するために、この研究は、骨髄腫クローン形成実験の方法を確立し、ＣＡＲ－Ｔの、クローン形成に対する阻害能を研究した。

[00278]増殖が可能なＭＭ腫瘍細胞は、クローン増殖培地中で成長し得るが、実験中、実験を妨害し得る増殖が可能なＣＤ３４＋造血幹細胞は、除去される必要がある。収集された細胞が、腫瘍増殖細胞によって占められるべきであることは、この実験に関して制御される必要がある重要課題である。

[00279]特定の実験方法は、下記の通りである：
[00280]第１の工程では、骨髄単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌを使用して単離及び抽出し、フローサイトメトリーによって表現型に関して分析した。第２の工程では、ＣＤ３４＋細胞選別キットを使用して、ＣＤ３４＋細胞を除去した。第３の工程では、種々の群のＣＡＲ－Ｔ細胞（二重ＣＡＲ－Ｔ、及び単一ＣＡＲ－Ｔ）を使用して、得られた細胞に関して、死滅実験を実施した。死滅の完了後、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞除去選別キットを使用して除去された。第４の工程では、半固形クローニング増殖培地が、クローン成長に使用され、統計、計数、及び結果のまとめを、１週～２週後に行った。

[00281]結果を図１６に示す。ＣＡＲ－Ｓ２及びＣＡＲ－Ｓ４は、ＣＡＲ－１９及びＣＡＲ－Ｓ１よりも著しく、クローン形成細胞又は腫瘍細胞前駆体細胞を死滅させるのに利点を有し、ＣＡＲ－Ｓ２及びＣＡＲ－Ｓ４が、単一ＣＡＲよりも骨髄腫細胞のクローン形成を阻害する、より高い能力を有することを示した。

実施例１４ Ｎａｌｍ６のｉｎ ｖｉｖｏでの静脈モデル化実験
[00282]６週齢～１２週齢のＮＯＧマウスを選択して、１×１０^７個のＮａｌｍ６細胞を静脈内注射した。６日後、腫瘍移植片負荷を検出して、腫瘍負荷に従って、マウスを群に均等に分けた。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、群分けの１日後に注射した。ＣＡＲ－Ｔ処置後、マウスの腫瘍負荷を評価した。各マウスに、ｄ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）３ｍｇを腹腔内注射して、続いて、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ画像システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、４分後に露光時間３０秒で撮影した。放出された光子の量に従って、生物発光シグナルを算出し、光子の量は、露光時間及び表面積を用いて正規化して、最終的に、光子／ｓ／ｃｍ^２／ステラジアン（ｐ／ｓ／ｃｍ^２／ｓｒ）の量を得た。

[00283]結果を図１７に示す。ＣＡＲ－Ｓ２及びＣＡＲ－Ｓ４を注射したマウスの腫瘍量は、消失するまで著しく低減されたことが示され、ＢＣＭＡ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ－１９よりも著しい抗ＣＤ１９陽性腫瘍効果を有していた。

実施例１５ ＣＡＲ－Ｔ細胞の安全性スイッチ実験
[00284]ＥＧＦＲｔ要素を含有するＣＡＲ－Ｔを、ＥＧＦＲ抗体で染色して、フローサイトメトリーによって分析し、ＣＡＲ発現を同時に分析した。

[00285]結果を図１８に示す。安全性スイッチの発現は、ＣＡＲ－Ｔ細胞で検出された。
実施例１６ ヒト化ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製及び死滅効果の検出
[00286]実施例３及び実施例４の方法を使用して、ヒト化ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ－ｈ１９）及びヒト化二重ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ－ｈＳ２、及びＣＡＲ－ｈＳ４）を構築した。ヒト化ＣＡＲ－Ｔ細胞の構造は、ＣＡＲ－１９の構造に類似していた。ヒト化二重ＣＡＲ－Ｔ細胞ＣＡＲ－ｈＳ２の構造は、ＣＡＲ－Ｓ２の構造に類似し、ＣＡＲ－ｈＳ４の構造は、ＣＡＲ－Ｓ４の構造に類似しており、唯一の違いは、ヒト化ＣＤ１９ ｓｃＦｖを使用して、元の構造におけるマウス由来のｓｃＦｖを置き換えることができることにある。ヒト化ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号２１～配列番号３０のいずれか１つに示される抗体重鎖可変領域及び配列番号３１～配列番号３６のいずれか１つに示される抗体軽鎖可変領域を含む。

[00287]実施例９の方法を使用して、ヒト化二重ＣＲＡ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの死滅効果を検出した。
[00288]ｉｎ ｖｉｔｒｏでの死滅効果を図１９及び図２０に示す。ヒト化ＣＡＲ－Ｔ細胞及びヒト化二重ＣＡＲ－Ｔ細胞は、非標的細胞を死滅させずに、標的細胞に対して著しい死滅効果を示した。

実施例１７ ヒト化ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの薬物有効性に関する研究
[00289]６週齢～１２週齢のＮＯＧマウスを選択して、３×１０^５個のＲａｊｉ細胞を皮下注射した。６日後、腫瘍移植片負荷を測定して、それらを、類似した腫瘍負荷を有する群に分けて、上記のように調製した二重ＣＡＲ－Ｔ細胞を、それぞれ、群分けの１日後にそれらに注射した。ＣＡＲ－Ｔ処置後、マウスの腫瘍体積負荷を評価した。各マウスに、ｄ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）３ｍｇを腹腔内注射して、続いて、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ画像システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、４分後に露光時間３０秒で撮影した。放出された光子の量に従って、生物発光シグナルを算出し、光子の量は、露光時間及び表面積を用いて正規化して、最終的に、光子／ｓ／ｃｍ^２／ステラジアン（ｐ／ｓ／ｃｍ^２／ｓｒ）の量を得た。

[00290]結果を図２１に示す。ヒト化ＣＡＲ－ｈＳ２細胞は、ＣＡＲ－Ｓ２よりも、Ｒａｊｉ細胞でモデル化したマウスにおいて、腫瘍を除去する、より強力な能力を有しており、それらの著しい抗腫瘍有効性を示した。

実施例１８ ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＲａｊｉリンパ腫細胞の死滅
[00291]ルシフェラーゼで標識したＲａｊｉリンパ腫標的細胞を、死滅能の検出に使用した。ルシフェラーゼ遺伝子を、Ｒａｊｉ標的細胞に移入することによって、クローンスクリーニング後に、安定にトランスフェクトされた細胞株Ｒａｊｉ－Ｌｕｃを得た。実験中、ルシフェリン基質を添加することによって、ルシフェラーゼは、ルシフェリンと反応して、蛍光を生じ、蛍光の強度を検出することによって、ルシフェラーゼの活性を測定することができ、続いて、細胞の生存比を検出することができ、ＣＡＲ－Ｔ細胞の死滅効果を得ることができる。

[00292]結果を図２２に示す。ＮＴ細胞は、死滅機能を有さず、ＣＡＲ－Ｓ１細胞は、Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞（ルシフェラーゼ遺伝子を移入したＲａｊｉ細胞）に対して用量依存的死滅効果を有し、リンパ腫等の適応症に関するそれらの潜在用途の価値を示した。

[00293]本発明で言及した文書は全て、文書それぞれがまさに、個々に参考文献として組み込まれているかのように、本出願における参考文献として引用される。更に、本発明の上記教示内容を読み取った後、当業者は、本発明に対して様々な変更又は修正を行うことができ、これらの等価形態はまた、本出願の併記の特許請求の範囲によって規定される範囲内に収まることが理解されるべきである。

Claims (14)

1. 抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）が、配列番号９に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１０に示される抗体軽鎖可変領域を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
2. 前記ｓｃＦｖが、下記式Ａ又は式Ｂ：
   Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ、（Ａ）； Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ、（Ｂ）
   （式中、Ｖ_Ｈは、抗体重鎖可変領域であり；Ｖ_Ｌは、抗体軽鎖可変領域であり；「－」は、リンカーペプチド又はペプチド結合である）
   で示される通りである、請求項１に記載のＣＡＲ。
3. ＢＣＭＡ及び第１の標的を標的とする二重特異性ＣＡＲであって、該二重特異性ＣＡＲにおける該ＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）が、配列番号９に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１０に示される抗体軽鎖可変領域を含み、
   該第１の標的が、
   ＣＤ１３８、カッパ軽鎖、ＮＫＧ２Ｄ－リガンド、ＴＡＣＩ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１５１、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、ＣＬＬ１、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦＲ－２、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３、ＰＭＳＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ－４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、Ｆｌｔ１、ＫＤＲ、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、Ｌｅｗｉｓ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＳＣＡ、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＳＬＮ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＬＴＰＲ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ－１、Ｒｏｂｏｌ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、Ｎｏｔｃｈ－１－４、ＡＰＲＩＬ、ＣＳ１、ＭＡＧＥ３、クローディン１８．２、葉酸受容体α、葉酸受容体β、ＧＰＣ２、ＣＤ７０、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＴＲＯＰ－２、又はそれらの組合せ
   からなる群から選択される、二重特異性ＣＡＲ。
4. 前記第１の標的がＣＤ１９であり、前記二重特異性ＣＡＲにおける該ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）が、配列番号１１、及び配列番号２１～配列番号３０のいずれか１つに示される抗体重鎖可変領域並びに配列番号１２、及び配列番号３１～配列番号３６のいずれか１つに示される抗体軽鎖可変領域を含む、請求項３に記載の二重特異性ＣＡＲ。
5. 下記式ＩＩ：
   Ｌ－ｓｃＦｖ１－Ｉ－ｓｃＦｖ２－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （ＩＩ）
   （式中、
   「－」は、それぞれ独立して、リンカーペプチド又はペプチド結合であり；
   Ｌは、不在であるか、又はシグナルペプチド配列であり；
   Ｉは、可撓性リンカーであり；
   Ｈは、不在であるか、又はヒンジ領域であり；
   ＴＭは、膜貫通ドメインであり；
   Ｃは、共刺激シグナル分子であり、
   ＣＤ３ζは、ＣＤ３ζに由来する細胞質シグナル伝達配列であり；
   ｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ２の一方は、前記第１の標的を標的とする抗原結合ドメインであり、他方は、前記ＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインである）
   で示されるような構造を有する、請求項３に記載の二重特異性ＣＡＲ。
6. 下記式ＩＩＩ又はＩＩＩ’：
   Ｌ－Ｖ_Ｌ３－ｓｃＦｖ３－Ｖ_Ｈ３－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （ＩＩＩ）
   Ｌ－Ｖ_Ｈ３－ｓｃＦｖ３－Ｖ_Ｌ３－Ｈ１－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （ＩＩＩ’）
   （式中、
   「－」は、それぞれ独立して、リンカーペプチド又はペプチド結合であり；
   要素Ｌ、Ｈ、ＴＭ、Ｃ及びＣＤ３ζは、上述の通りであり；
   ｓｃＦｖ３は、前記ＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインであり、Ｖ_Ｈ３は、前記第１の標的に対する抗体重鎖可変領域であり、Ｖ_Ｌ３は、前記第１の標的に対する抗体軽鎖可変領域であるか；又は
   ｓｃＦｖ３は、前記第１の標的を標的とする抗原結合ドメインであり、Ｖ_Ｈ３は、前記ＢＣＭＡに対する抗体重鎖可変領域であり、Ｖ_Ｌ３は、前記ＢＣＭＡに対する抗体軽鎖可変領域である）
   で示されるような構造を有する、請求項３に記載の二重特異性ＣＡＲ。
7. 請求項１に記載のＣＡＲ又は請求項３に記載の二重特異性ＣＡＲをコードする核酸分子。
8. 請求項７に記載の核酸分子を含むベクター。
9. 染色体に外因的に組み込まれる請求項８に記載のベクター、若しくは請求項７に記載の核酸分子を含む、又は請求項１に記載のＣＡＲ若しくは請求項３に記載の二重特異性ＣＡＲを発現する、操作された免疫細胞。
10. 免疫細胞が、外因性である第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含み、
    該第１の発現カセットが、第１の標的を標的とする第１のＣＡＲを発現するのに使用され、第２の発現カセットが、ＢＣＭＡを標的とする第２のＣＡＲを発現するのに使用されるか；又は
    免疫細胞が、該第１の標的を標的とする該第１のＣＡＲ及び該ＢＣＭＡを標的とする該第２のＣＡＲを発現し、
    該第２のＣＡＲにおける該ＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）が、配列番号９に示される抗体重鎖可変領域及び配列番号１０に示される抗体軽鎖可変領域を含み；
    該第１の標的が、
    ＣＤ１３８、カッパ軽鎖、ＮＫＧ２Ｄ－リガンド、ＴＡＣＩ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１５１、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、ＣＬＬ１、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦＲ－２、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３、ＰＭＳＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ－４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ２、Ｏ－アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、Ｆｌｔ１、ＫＤＲ、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、Ｌｅｗｉｓ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＳＣＡ、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＳＬＮ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＬＴＰＲ、ＬＩＦＲＰ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ－１、Ｒｏｂｏｌ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、Ｎｏｔｃｈ－１－４、ＡＰＲＩＬ、ＣＳ１、ＭＡＧＥ３、クローディン１８．２、葉酸受容体α、葉酸受容体β、ＧＰＣ２、ＣＤ７０、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＴＲＯＰ－２、又はそれらの組合せ
    からなる群から選択される、
    操作された免疫細胞。
11. 請求項１に記載のＣＡＲ、請求項３に記載の二重特異性ＣＡＲ、又は請求項９若しくは請求項１０に記載の操作された免疫細胞、及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む製剤。
12. 癌若しくは腫瘍を予防及び／又は処置するための薬物又は製剤の調製における、請求項１に記載のＣＡＲ、請求項３に記載の二重特異性ＣＡＲ、又は請求項９若しくは請求項１０に記載の操作された免疫細胞の使用。
13. 前記薬物又は前記製剤が、クローン増殖が可能な腫瘍細胞を死滅させることによって、前記癌又は前記腫瘍を処置する、請求項１２に記載の使用。
14. 前記クローン増殖が可能な腫瘍細胞が、クローン形成細胞、腫瘍細胞前駆体細胞、及び腫瘍前駆細胞を含む、請求項１３に記載の使用。
    

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