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CN117126891A - 一种逆转录病毒表达载体及包括其的car-t细胞 - Google Patents

一种逆转录病毒表达载体及包括其的car-t细胞 Download PDF

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CN117126891A
CN117126891A CN202311101740.XA CN202311101740A CN117126891A CN 117126891 A CN117126891 A CN 117126891A CN 202311101740 A CN202311101740 A CN 202311101740A CN 117126891 A CN117126891 A CN 117126891A
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CN
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cells
car
cell
expression vector
jhsc008
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Application number
CN202311101740.XA
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王建勋
史渊源
冯娅茹
孙睿
王炳彰
卢泯村
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Shenzhen Cell Valley Biopharmaceutical Co ltd
Guangdong Junhou Biopharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Cell Valley Biopharmaceutical Co ltd
Guangdong Junhou Biopharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明提供一种逆转录病毒表达载体及包括其的CAR‑T细胞，其表达的氨基酸残基序列为SEQ ID NO:2。通过其制备的CAR‑T细胞给CAR‑T装上“安全开关”，在人为可控下进行治疗，且在不良反应发生前及时踩刹车。本发明制备的CAR‑T细胞给CAR‑T装上“安全开关”后，比普通的CAR‑T细胞和没有安全开关的CAR‑T细胞具有更好的疗效以及更少的副作用，提高了CAR‑T疗法的安全性。

Description

一种逆转录病毒表达载体及包括其的CAR-T细胞
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗技术领域，特别涉及带自杀性开关iCASP9治疗多发性骨髓瘤的CAR-T细胞。
背景技术
多发性骨髓瘤是浆细胞恶性增殖性疾病，疾病特征是骨髓中的浆细胞像肿瘤细胞一样无限制地增生，并且大部分病例伴有单克隆免疫球蛋白分泌，最终导致器官或组织损伤。
目前治疗的方案主要是化疗、局部放疗、造血干细胞移植。然而，放疗、化疗治疗在病程中可反复出现感染、发热，如皮肤感染、肺部感染等并发症，化疗药物和肾上腺皮质激素的应用，也增加了发生感染的机会。医学临床上针对靶向骨髓瘤相关抗原的CAR-T治疗方案给这类疑难疾病带来了新的机遇。
CAR-T治疗技术在多发性骨髓瘤疾病治疗中已经取得显著地临床疗效，但CAR-T疗法也带来了相关毒性和局限性，包括肿瘤外毒性、抗原逃逸、非最佳激活等等，除了发挥抗肿瘤作用，还可能会导致细胞因子释放综合征(CRS)，安全性问题日益凸显。
在管理不良反应时，及时的药物干预是有效的，最近证实的一个分子开关，能够诱导半胱天冬酶9(iCASP9)，具有这样的潜能来消除T细胞治疗带来的威胁，如果有需要，它能够消减移植的T细胞。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种逆转录病毒表达载体，其表达的氨基酸残基序列为SEQ ID NO:2:
MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSTSFGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSATNFSLLKQAGDVEENPGPMEWSWVFLFFLSVTTGVHSDIEQKLISEEDLDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLV QSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSQVQLVQSGGGLVQPGRSLRLPCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGSGSYYNPFYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGGNTVAWYQQLPGTAPKLLIYNYSQRPSGVPDRFSGSKSGTSSSLAIGGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVLGAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFAPRKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
在一种实施方式中，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如1所述的氨基酸。
在一种实施方式中，本发明提供一种CAR-T细胞，其由如上所述的逆转录病毒表达载体转导后所获得。
在一种实施方式中，本发明提供一种用于治疗肿瘤的药物组合物，所述药物组合物含有如上所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述肿瘤优选为人多发性骨髓瘤。
在一种实施方式中，本发明提供一种如上所述的CAR-T细胞或如上所述的药物组合物的用途，用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物或制剂，所述肿瘤优选为人多发性骨髓瘤。
在一种实施方式中，本发明提供一种体外抑制肿瘤细胞的方法，包括：将肿瘤细胞与如上所述的CAR-T细胞或如上所述的药物组合物接触，从而抑制所述肿瘤细胞，所述肿瘤优选为人多发性骨髓瘤。
本发明构建了一种带有开关的CAR序列，这种结构将包含用于管理潜在毒性的安全开关机制；这种组合可以克服CAR-T细胞疗法当前的局限性，并有助于改善患者的治疗结果。本发明制备的带有开关的CAR-T细胞对RPMI肿瘤细胞有明显的杀伤作用。
本发明制备的CAR-T细胞给CAR-T装上“安全开关”，在人为可控下进行治疗，且在不良反应发生前及时踩刹车。本发明制备的CAR-T细胞给CAR-T装上“安全开关”后，比普通的CAR-T细胞和没有安全开关的CAR-T细胞具有更好的疗效以及更少的副作用，提高了CAR-T疗法的安全性。
本发明研究发现，通过常规CAR T生产工艺获得加入ICASP9 CAR T开关修饰T细胞的制备可行性，以及ICASP9 CAR T杀伤RPMI的可行性。结果显示，ICASP9 CAR T对RPMI肿瘤细胞具有有效的体外杀伤能力。ICASP9 CAR T通过小分子化学诱导药物AP1903能在体外有效中止CASP9 CAR T细胞的扩增和持久性，有助于控制CRS等副作用的产生，缓解毒性问题，增加安全性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是使用MYC抗体染色通过流式细胞仪检测转导48h后pMFG-MYC-CD38-BCMA-CAR-T(以下简称JHSC005)和pMFG-MYC-CD38-BCMA-ICASP9-CAR-T(以下简称JHSC008)细胞的阳性率结果图，其中图1A是JHSC005，图1B是JHSC008，横坐标为PE信号强度；纵坐标为细胞数。
图2是使用流式细胞术检测在不同效靶比情况下，JHSC005细胞、JHSC008细胞和普通T细胞杀伤RPMI肿瘤细胞时的杀伤效率结果图。
图3是使用流式细胞术检测添加不同浓度的AP1903作用JHSC005细胞的凋亡结果图，其中图3A是未添加AP1903，图3B是添加AP1903 1ng/mL，和图3C是添加AP190310ng/mL。
图4是使用流式细胞术检测添加不同浓度的AP1903作用JHSC008细胞的凋亡结果图，其中图4A是未添加AP1903，图4B是添加AP1903 1ng/mL，和图4C是添加AP190310ng/mL。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
若未特别指明，以下实施例均按照常规实验条件，或按照制造厂商说明书建议的条件进行。
实施例一
材料：RPMI 1640无血清培养基、AIM-Ⅴ无血清培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液及青霉素-链霉素均购自美国Gibco公司。淋巴细胞分离液购自加拿大Stemcell公司。细胞凋亡试剂盒(Annexin-V FITC、binding buffer)购自北京金普来公司。白细胞介素2(IL-2)、OKT-3购自北京义翘神州科技股份有限公司。RetroNectin购自日本TAKARA Bio公司。MYC抗体购自美国R&D Systems。RPMI细胞购自ATCC。AP1903购自MedChemExpress公司。
本实施例验证ICASP9-CAR-T对人多发性骨髓瘤(RPMI)肿瘤细胞的杀伤效果观察，具体流程如下。
一.PBMC培养
无菌收集健康人的外周静脉血，用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，分离得到外周血单个核细胞(PBMC)，加入T细胞培养基进行培养，同时加入终浓度为100ng/mL OKT-3和100U/mL IL-2刺激T细胞增殖，置于37℃、5％ CO2细胞培养箱中无菌培养48h。
T细胞培养基包含：AIM-Ⅴ无血清培养基(Gibco，USA)+10％胎牛血清FBS(Gibco，USA)+1％青霉素-链霉素(Gibco，USA)。
收集培养后的细胞即为人原代T细胞。
二.JHSC005、JHSC008细胞的制备
1.逆转录病毒表达载体构建
设计构建2种含CD38-BCMA串联双靶点的CAR，其中一种不含ICASP9自杀基因，命名为pMFG-MYC-CD38-BCMA-CAR-T(以下简称JHSC005)，表达的氨基酸残基序列如SEQ ID NO:1所示；另一种含ICASP9自杀基因，命名为pMFG-MYC-CD38-BCMA-ICASP9-CAR-T(以下简称JHSC008)，表达的氨基酸残基序列如SEQ ID NO:2所示。逆转录病毒表达质粒的构建方法为分子生物学常规实验技术，具体实施按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考M.R.格林、J.萨姆布鲁克等著，贺福初等译的《分子克隆实验指南》，第四版，科学出版社)和相应的产品说明书进行。
SEQ ID NO:1：
ATNFSLLKQAGDVEENPGPMEWSWVFLFFLSVTTGVHSDIEQKLISEEDLDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSQVQLVQSGGGLVQPGRSLRLPCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGSGSYYNPFYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGGNTVAWYQQLPGTAPKLLIYNYSQRPSGVPDRFSGSKSGTSSSLAIGGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVLGAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFAPRKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
SEQ ID NO:2
MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSTSFGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSP EDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSATNFSLLKQAGDVEENPGPMEWSWVFLFFLSVTTGVHSDIEQKLISEEDLDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSQVQLVQSGGGLVQPGRSLRLPCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGSGSYYNPFYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGGNTVAWYQQLPGTAPKLLIYNYSQRPSGVPDRFSGSKSGTSSSLAIGGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVLGAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFAPRKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
2.转染phoenix-Eco细胞
将携带有目的基因的逆转录病毒表达质粒(步骤2.1中构建的JHSC005、JHSC008质粒)转染到phoenix-Eco细胞中，转染试剂为Fugene。转染48h后收集培养液上清，将所述上清用0.45μm滤器过滤，保留滤液待用，命名为亲嗜性病毒A。
3.转导PG13细胞
使用亲嗜性病毒A转导PG13细胞。在培养皿中接种入PG13细胞，加入亲嗜性病毒A，30℃、2500rpm离心1h，随后放入37℃、5％CO2培养箱孵育2h。移除培养上清，加入新鲜的PG13细胞培养基(含有90％的DMEM完全培养基，10％的FBS)，37℃、5％CO2培养箱培养。为提高转导效率，可使用RetroNectin或Polybrene等促转导试剂，促转导试剂的用法用量参照产品说明书。转导24h后收获培养上清，将所述上清用0.45μm滤器过滤，保留滤液待用，该滤液即为对应的JHSC005逆转录病毒载体和JHSC008逆转录病毒载体。
4.转导T细胞
逆转录病毒载体转导人原代T细胞。使用AIM-Ⅴ培养基重悬人原代T细胞至5-10x105/mL，加入步骤2.3中收获的逆转录病毒载体离心转导，随后放入37℃、5％CO2培养箱孵育，加入IL-2至终浓度100U/mL，37℃、5％CO2培养箱培养。逆转录病毒载体转导后所获得的细胞即为对应JHSC005细胞和JHSC008细胞。
三.CAR-T细胞转导效率的检测
取转导48h后的JHSC005细胞和JHSC008细胞，转导48h后用MYC-PE抗体通过流式细胞术检测MYC(R&D，USA)抗原表达，计算转导效率(即MYC表达率)转导效率＝MYC-PE阳性细胞数/总活细胞数×100％，转导效率如图1所示，结果显示为JHSC005的转导效率为80.4％，JHSC008的转导效率为29.5％。
四.CAR-T细胞的体外培养
将转导后的JHSC005细胞、JHSC008细胞和普通T细胞用T细胞培养基，添加100U/mLIL-2培养，每隔48h计数传代1次，观察细胞状态，当三组细胞存活率达到80％以上时表示细胞状态良好，可进行杀伤实验。
五.RPMI肿瘤细胞的体外培养
复苏RPMI细胞，以5×105cells/mL接种于RPMI 1640完全培养基，37℃、5％ CO2细胞培养箱中无菌培养。每隔48h计数传代1次，观察细胞状态，当RPMI细胞存活率达到80％以上时表示细胞状态良好，可进行杀伤实验。
RPMI 1640完全培养基包含：RPMI 1640无血清培养基(Gibco，USA)+10％ FBS(Gibco，USA)+1％青-链霉素溶液(Gibco，USA)。
六.JHSC008细胞的体外杀伤能力验证
实验组为JHSC005细胞组、JHSC008细胞组；对照组不做转导处理，即为普通T细胞组。进行杀伤实验时，用普通T细胞将JHSC005细胞进行稀释，使其转导效率调整为29.5％，与JHSC008细胞标齐。
将效应细胞和靶细胞分组共孵育进行肿瘤细胞杀伤实验，实验效靶比设置分别为1:1组、1:2组、1:4组、1:8组、1:16组，8h后采用流式细胞术检测杀伤效率。
具体实验步骤如下:
靶细胞铺板:将RPMI肿瘤细胞混合均匀，进行取样，使用台盼蓝染色并通过细胞计数仪计数。96孔板每孔加入靶细胞:8×104/100μL孔，根据所需细胞用量，用T细胞培养基(AIM-V无血清培养基+10％FBS+1％P/S)重悬靶细胞，将靶细胞铺于96孔细胞培养板中。
制备效应细胞悬液:将JHSC005细胞、JHSC008细胞和普通T细胞混合均匀，进行取样，使用台盼蓝染色并通过细胞计数仪计数。根据杀伤所需效应细胞用量，取效应细胞，用T细胞培养基(AIM-V无血清培养基+10％FBS+1％P/S)，并添加100U/mL IL-2重悬靶细胞。
96孔板每孔已经加入靶细胞:8×104/100μL。将效应细胞稀释至8×104，取100μL加在铺有RPMI细胞的孔中，即E:T(效应细胞:靶细胞)＝1:1组(杀伤孔)；将效应细胞稀释至4×104，取100μL加在铺有RPMI细胞的孔中，即E:T(效应细胞:靶细胞)＝1:2组(杀伤孔)；将效应细胞稀释至2×104，取100μL加在铺有RPMI细胞的孔中，即E:T(效应细胞:靶细胞)＝1:4组(杀伤孔)；将效应细胞稀释至1×104，取100μL加在铺有RPMI细胞的孔中，即E:T(效应细胞:靶细胞)＝1:8组(杀伤孔)；将效应细胞稀释至5×103，取100μL加在铺有RPMI细胞的孔中，即E:T(效应细胞:靶细胞)＝1:16组(杀伤孔)；每组三个平行；并以仅有RPMI细胞的孔作为未杀伤孔；做好标记。
铺板结束后，将96孔板放入37℃、5％ CO2细胞培养箱中共培养8h。
杀伤效率检测:8h后3000rpm离心5min，收集每孔细胞。染色缓冲液(含10％ FBS的PBS缓冲液)冲洗1遍，每组加入Annexin-V FITC抗体进行染色，未经任何处理的RPMI细胞进行抗体染色作为阴性对照，避光孵育30min后用binding buffer混悬进行检测。用流式细胞仪检测靶细胞凋亡率，其中FITC阳性区域细胞为凋亡细胞。杀伤效率＝杀伤孔靶细胞凋亡率-未杀伤孔靶细胞凋亡率。
由图2可知，三组细胞在不同效靶比时对RPMI肿瘤细胞的杀伤效率结果分析如下:效靶比为1:1时，和对照组(普通T细胞)相比，实验组(JHSC008细胞和JHSC005细胞)均对RPMI肿瘤细胞有明显的杀伤作用，且JHSC008细胞对RPMI细胞的杀伤效率最高；杀伤效率按1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16效靶比逐渐降低，且JHSC008细胞杀伤效果明显高于JHSC005细胞和普通T细胞。经逆转录病毒载体转导后的CAR-T细胞，即JHSC008细胞和JHSC005细胞，两组细胞相比于普通T细胞，均能够有效杀伤RPMI肿瘤细胞，且JHSC008细胞杀伤RPMI肿瘤细胞效果显著。
实施例二
本实施例验证小分子药物AP1903抑制JHSC008细胞的表达情况，Rimiducid(AP1903)是二聚化剂，其通过交联FKBP结构域起作用，启动Fas信号传导，引起凋亡。Rimiducid(AP1903)使Caspase 9自杀开关二聚化，并迅速诱导细胞凋亡(apoptosis)，具体流程如下:将实施例一中正在培养的JHSC005细胞和JHSC008细胞分别进行取样，使用台盼蓝染色并通过细胞计数仪计数。用T细胞培养基(AIM-V无血清培养基+10％FBS+1％P/S)，并添加100U/mL IL-2重悬细胞，分别将JHSC005细胞和JHSC008细胞浓度稀释至8×105/mL。
取AP1903(原液浓度:1mg/mL)，用PBS缓冲液(Gibco，USA)逐级10倍稀释至:100μg/mL，10μg/mL，1μg/mL，100ng/mL，10ng/mL。
取96孔培养板，每孔加入180μL细胞悬液及不同浓度的AP1903，具体设置如下:
对照组，即不添加AP1903，180μL JHSC005细胞悬液+20μLT细胞培养基，180μLJHSC008细胞悬液+20μLT细胞培养基；实验组，AP1903浓度为1ng/mL时，180μL JHSC005细胞悬液+20μLAP1903(10ng/mL)，180μL JHSC008细胞悬液+20μLAP1903(10ng/mL)；实验组，AP1903浓度为10ng/mL时，180μL JHSC005细胞悬液+20μLAP1903(100ng/mL)，180μLJHSC008细胞悬液+20μLAP1903(100ng/mL)；做好标记。铺板结束后，将96孔板放入37℃、5％CO2细胞培养箱中共培养6h。
6h后3000rpm离心5min，收集每孔细胞。染色缓冲液(含10％ FBS的PBS缓冲液)冲洗1遍，每组加入Annexin-V FITC抗体进行染色，未添加AP1903的JHSC005细胞和JHSC008细胞进行抗体染色作为阴性对照，避光孵育30min后用binding buffer混悬进行检测。用流式细胞术检测JHSC005细胞和JHSC008细胞的凋亡率。由图3A和图4A可知，未添加AP1903的JHSC005和JHSC008只有1％～2％的细胞发生凋亡，由图3B和图3C发现，添加1ng/mL和10ng/mL浓度的AP1903作用JHSC005细胞，并没有明显的凋亡现象，但通过与图4B和图4C对比，添加1ng/mL和10ng/mL浓度的AP1903作用JHSC008细胞，均为发生明显的凋亡现象，证明小分子药物AP1903作用JHSC008细胞上，表达带有“安全开关”ICASP9的活化细胞被优先杀死，这样可以消除CAR-T细胞治疗带来的威胁，提高治疗的安全性。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (6)

1.一种逆转录病毒表达载体，其特征在于，其表达的氨基酸残基序列为SEQ ID NO:2:MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGK QEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSTSFGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSATNFSLLKQAGDVEENPGPMEWSWVFLFFLSVTTGVHSDIEQKLISEEDLDIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSQVQLVQSGGGLVQPGRSLRLPCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGSGSYYNPFYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGGNTVAWYQQLPGTAPKLLIYNYSQRPSGVPDRFSGSKSGTSSSLAIGGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVLGAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFAPRKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的氨基酸。
3.一种CAR-T细胞，其特征在于，其由权利要求1所述的逆转录病毒表达载体转导后所获得。
4.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求3所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述肿瘤优选为人多发性骨髓瘤。
5.一种如权利要求3所述的CAR-T细胞或如权利要求4所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物或制剂，所述肿瘤优选为人多发性骨髓瘤。
6.一种体外抑制肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括：将肿瘤细胞与如权利要求3所述的CAR-T细胞或如权利要求4所述的药物组合物接触，从而抑制所述肿瘤细胞，所述肿瘤优选为人多发性骨髓瘤。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107365798A (zh) * 2017-07-13 2017-11-21 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 一种携带iCasp9自杀基因的CD19‑CAR‑T细胞及其应用
WO2018223600A1 (zh) * 2017-06-06 2018-12-13 上海优卡迪生物医药科技有限公司 Octs-car双靶向嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建和应用
CN113549156A (zh) * 2021-07-05 2021-10-26 北京中医药大学 靶向cd38嵌合抗原受体及其应用
CN113549157A (zh) * 2021-07-05 2021-10-26 北京中医药大学 双靶向嵌合抗原受体及其应用
CN113784732A (zh) * 2019-05-07 2021-12-10 亘喜生物科技（上海）有限公司 靶向bcma的工程化免疫细胞及其用途

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018223600A1 (zh) * 2017-06-06 2018-12-13 上海优卡迪生物医药科技有限公司 Octs-car双靶向嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建和应用
CN107365798A (zh) * 2017-07-13 2017-11-21 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 一种携带iCasp9自杀基因的CD19‑CAR‑T细胞及其应用
CN113784732A (zh) * 2019-05-07 2021-12-10 亘喜生物科技（上海）有限公司 靶向bcma的工程化免疫细胞及其用途
CN113549156A (zh) * 2021-07-05 2021-10-26 北京中医药大学 靶向cd38嵌合抗原受体及其应用
CN113549157A (zh) * 2021-07-05 2021-10-26 北京中医药大学 双靶向嵌合抗原受体及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ESTHER DRENT ET AL.,: "Pre-clinical evaluation of CD38 chimeric antigen receptor engineered T cells for the treatment of multiple myeloma", HAEMATOLOGICA, vol. 101, no. 5, 8 February 2016 (2016-02-08), pages 616 - 625 *
段圆圆等: "Ciltacabtagene autoleucel—治疗复发难治性多发性 骨髓瘤的靶向BCMA CAR-T细胞新型疗法", 中国临床药理学与治疗学, vol. 27, no. 10, 31 October 2022 (2022-10-31), pages 1148 - 1154 *

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