CN114288419B - 一种利福平纳米递药系统的制备及其在防治帕金森病方面的应用 - Google Patents
一种利福平纳米递药系统的制备及其在防治帕金森病方面的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于纳米载药系统技术领域，具体涉及一种利福平纳米递药系统的制备及其在防治帕金森病方面的应用，本发明首次将利福平装载于PEG‑PCL纳米递药系统，将其制备成聚合物胶束；并在聚合物胶束表面修饰有TTBZ分子，可特异性结合VMAT2。相较于传统的利福平药剂类型，本发明的载体(PEG‑PCL)细胞毒性微弱，由PEG‑PCL亲性嵌段形成的胶束，具有疏水内核‑亲水外核的结构特征，增加了利福平的水溶性，提高了其在体内循环的稳定性；具有靶向给药能力，提高利福平在多巴胺神经元的局部聚集浓度，从而提高药物的生物利用度，提高其对帕金森病等神经疾病的保护作用，并减少其外周的毒副作用。
Description
技术领域
本发明属于纳米载药系统技术领域，具体涉及一种利福平纳米递药系统的制备及其在防 治帕金森病方面的应用。
背景技术
利福平(Rifampicin，Rif)为利福霉素类半合成广谱抗菌药，通用名：利福平，英文名： RIFAMPICINTABLETS。作为一种经典、有效、安全的抗结核药物，利福平对多种病原微生物均有抗菌活性。利福平口服吸收良好，服药后1.5～4小时血药浓度达峰值。本品与其他抗结核药联合用于各种结核病的初治与复治，包括结核性脑膜炎的治疗。此外，利福平还具有潜在的神经保护作用。有研究表明，在神经毒性药物诱导的帕金森病(Parkinson’sdisease， PD)体外模型中，利福平预处理能逆转鱼藤酮及MPP+等毒性因子导致的神经元凋亡现象。 进一步研究证实，利福平可以通过上调内质网应激相关因子GRP78的表达、调节凋亡相关通 路PI3K/Akt/GSK-3β/CREB的水平、提高α-突触核蛋白的SUMO化等途径缓解多巴胺能神经 元受到的毒性损害；同时通过调节TLR-4相关通路、抑制NLRP3炎症小体激活来减低神经 炎症水平；并通过影响小胶质细胞内自噬-溶酶体通路水平来提高胶质细胞对病理性蛋白的清 除能力。
也有研究发现，在活体动物模型上，腹腔注射利福平虽然在分子病理层面对PD小鼠有 一定的神经保护作用，但对动物造模后产生的运动症状及行为学改变并没有出现稳定的改善， 且给药时间长，对模型小鼠的毒副作用较大。分析认为，利用利福平治疗神经性疾病尚存在 以下不足：(1)利福平脂溶性强，但其水溶性低，在体内循环中稳定性较差；(2)利福平在 颅内黑质-纹状体的局部聚集浓度远低于其发挥作用的工作浓度；3)利福平的外周毒性，如 肝脏毒性，限制了其较高浓度的使用。
因此，有必要增加利福平的水溶性，提高其在体内循环中的稳定性，增加药物的靶向能 力，提高其在颅内多巴胺神经元的局部聚集浓度，减少外周毒副作用。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种利福平纳米递药系统的制备方法，制 备得到的利福平纳米递药系统有效增加了利福平的水溶性，提高其在体内循环中的稳定性， 增加药物的靶向能力，提高其在颅内多巴胺神经元的局部聚集浓度，从而提高其对帕金森病 等神经疾病的保护作用，并减少外周毒副作用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供一种利福平纳米递药系统的制备方法，该方法包括以下步骤：
S1、通过自组装的方式将利福平装载于PEG-PCL载体中制备得到PEG-PCL@利福平(简 称PEG-PCL@rif)；
S2、将巯基丙酸和TTBZ(C28H39NO6S，其结构式见图3)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】和DMAP(4-二甲氨基吡啶)的催化下反应生成HS-TTBZ；
S3、通过HS-TTBZ的巯基和与步骤S1的PEG-PCL@利福平中PEG-PCL尾端的C＝C基团在APS(过硫酸铵)和Na2SO3的催化下发生点击化学反应，即可制备得到利福平纳米递药系统。
作为本发明的一个优选实施方式，上述的利福平纳米递药系统的制备方法包括以下步骤：
S1、将利福平和APEG-PCL冻干粉溶于DMF中形成有机相，并将有机相加至水中，然后用透析袋透析12h以上，收集透析袋中的溶液，经过滤后制得PEG-PCL@利福平溶液；
S2、将巯基丙酸、EDCI和DMAP低温搅拌混匀，再加入TTBZ继续搅拌12h以上，得 到TTBZ-SH溶液；
S3、将步骤S2的TTBZ-SH溶液和步骤S1的PEG-PCL@利福平溶液混合，并加入APS 和Na2SO3低温搅拌36h以上，然后用透析袋透析过夜，收集透析袋中的溶液即可得利福平纳 米递药系统。
本发明以PEG-PCL聚合物胶束作为递药系统的载体，将疏水性的利福平装载于内核，以 提高其水溶性和体内循环的稳定性，并将可以特异性结合多巴胺神经元内VMTA2的TTBZ 作为给递药系统的配体，以提高其靶向能力，进而增加药物的局部工作浓度，从而提高其对 帕金森病等神经疾病的保护作用，并减少外周毒副作用。
优选地，利福平和APEG-PCL冻干粉的质量比为1：8-12；利福平与DMF的料液比为1mg：1-3mL。具体地，利福平和APEG-PCL冻干粉的质量比为1：10；利福平与DMF的料 液比为1mg：1mL。
优选地，巯基丙酸、EDCI与DMAP的质量比为3：11：7。
优选地，TTBZ-SH溶液与PEG-PCL@利福平溶液的体积比为1：4-6；TTBZ-SH溶液与APS、Na2SO3的料液比为1mL：1mg：1mg。具体地，TTBZ-SH溶液与PEG-PCL@利福平溶 液的体积比为1：5。
优选地，步骤S1的过滤为采用0.45um的微孔滤膜进行过滤。
优选地，步骤S1中，将有机相加至水中为在超声作用下将有机相逐滴加至水中。
优选地，步骤S1和S3中的透析袋的截留分子量为14，000。
本发明还提供了采用上述的一种利福平纳米递药系统的制备方法制备得到的利福平纳米 递药系统。
本发明还提供了上述的利福平纳米递药系统在制备神经保护药物中的应用，所述神经保 护药物包括防治帕金森病的药物。
PD是由于中脑黑质多巴胺能神经元退行变性、坏死，多巴胺能神经递质分泌不足而导致 运动迟缓、肌张力障碍等锥体外系运动障碍的神经退行性疾病，目前临床上对PD的治疗主 要以多巴胺能替代治疗及DBS手术治疗为主。迄今为止，仍缺乏针对PD发病过程分子机制 的疾病修饰治疗方法。本发明将常见的、已在体外实验中证实具有修饰PD疾病进展的利福 平，装载于PEG-PCL胶束中，并在胶束表面修饰TTBZ分子，使其靶向多巴胺神经元，从而 提高其神经保护作用。
当然，除帕金森病外，其他能使本发明的利福平纳米递药系统发挥保护作用的神经性疾 病同样在本发明的保护范围内。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明首次将利福平装载于PEG-PCL纳米递药系统，将其制备成聚合物胶束；并在聚合 物胶束表面修饰有TTBZ分子，可特异性结合多巴胺神经元内囊泡单胺转运体2(Vesicular Monoamine Transporter 2，VMAT2)。相较于传统的利福平药剂类型，本发明的利福平纳米递 药系统具有以下优点：(1)载体(PEG-PCL)细胞毒性微弱，其中PEG的安全性已得到美国 食品药品监督管理局(FDA)认证；(2)PEG-PCL亲性嵌段形成的胶束，具有疏水内核-亲水 外核的结构特征，增加了利福平的水溶性，提高了其在体内循环的稳定性；(3)具有靶向给 药能力，提高利福平在多巴胺神经元的局部聚集浓度，从而提高药物的生物利用度，提高其 对帕金森病等神经疾病的保护作用，并减少其外周的毒副作用。
附图说明
图1为PEG-PCL@rif的制备流程图；
图2为TTBZ修饰PEG-PCL@rif的示意图；
图3为TTBZ巯基修饰的化学合成路线图；
图4为TTBZ修饰PEG-PCL@rif的合成图；
图5为TTBZ-PEG-PCL@rif的透射电镜图；
图6为TTBZ-PEG-PCL@rif的1H NMR测定结果；
图7为TTBZ-PEG-PCL@rif的稳定性测定结果；
图8为TTBZ-PEG-PCL@rif的安全性测定结果；
图9为载体TTBZ-PEG-PCL的靶向能力测试结果；
图10为TTBZ-PEG-PCL@rif的经修饰作用。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的 说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实 施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材 料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1利福平纳米递药系统(TTBZ-PEG-PCL@rif聚合物胶束)的制备
(1)PEG-PCL@利福平的制备
如图1所示，通过自组装(Self-assembly)的方式将利福平装载于PEG-PCL载体中，制 备得到PEG-PCL@rif(PEG-PCL@利福平)溶液，具体制备方法如下：
分别称取1mg利福平(rifampicin，rif)和10mgAllyl-PEG-PCL(PEG-PCL)冻干粉(购 于舜纳纳米公司)溶于1mL DMF液中形成有机相，并在超声作用(130W)下将所得有机相逐滴加至10mL去离子水中。将上述所得混合液置于截留分子量为14，000的透析袋中，用 水透析12h以上，收集透析袋中的溶液，用0.45um的微孔滤膜除去疏水性药物聚集体，即可 得PEG-PCL@rif溶液。
2)TTBZ-PEG-PCL@rif的制备
如图2的制备示意图所示，靶向配体TTBZ在APS和Na2SO3催化下被修饰于 PEG-PCL@rif表面，从而使纳米胶束具有靶向能力。制备过程分两步，首先在EDCI【1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】和DMAP(4-二甲氨基吡啶)的催化下，巯基丙酸 (C3H6O2S)和TTBZ【C28H39NO6S， 3-(2-hydroxy-3-isobutyl-10-methoxy-2,3,4,6,7,11b-hexahydro-1H-pyrido[2,1-a]isoquinolin- 9-yloxy)propyl 4-methylbenzenesulfonate)】反应生成HS-TTBZ(如图3所示)；然后HS-TTBZ 的巯基和PEG-PCL@rif中PEG-PCL尾端的C＝C基团在过硫酸铵(APS)和Na2SO3的催化 下发生点击化学反应，生成TTBZ-PEG-PCL@rif(如图4所示)。具体制备方法如下：
分别称取0.6mg巯基丙酸、2.2mg EDCI和1.4mgDMAP，于4℃环境下低温搅拌混匀6h， 随后加入1mg TTBZ，继续搅拌12h，得到TTBZ-SH溶液；
将所得的TTBZ-SH溶液1mL和5mL上述的PEG-PCL@rif溶液混合，并加入1mg APS 和1mgNa2SO3，于4℃低温搅拌36h，将所得混合溶液置于截留分子量为14，000的透析袋 中，用水透析过夜，收集透析袋中的溶液即可得TTBZ-PEG-PCL@rif聚合物胶束，即利福平 纳米递药系统。
实施例2TTBZ-PEG-PCL@rif(简称载药胶束)表征和理化性质
(1)TTBZ-PEG-PCL@rif形貌表征的测定
移取10μL载药胶束，并将其缓慢滴加于200目铜网中，自然干燥，再用0.3％磷钨酸对 样品染色1分钟，染色完成后，使用透射电镜(TEM)观察其外观、粒径大小。
通过图5的透射电镜(TEM)可以看出，TTBZ-PEG-PCL@rif纳米粒子的粒径在100nm左右，且聚合物胶束呈圆形稳定分布。稳定的粒径分布为胶束通过被动靶向效应靶向多巴胺 神经元囊泡单胺转运体2(VMAT2)、以增加利福平的局部浓度提供了前提条件。
(2)1HNMR测定
取400μL载药胶束溶于200μL氘代氯仿中，室温放置10min，10000rpm离心10min，然后取500μL上清置于内径为5mm的核磁管中，利用Inova 600MHz共振波谱仪调用 Noesy-presat-1D脉冲序列测定氢谱，通过对氢谱图中的各个峰进行归属，以证实载药系统的 形成。
图6的1HNMR图谱显示，TTBZ-PEG-PCL@rif分别具有TTBZ和PEG-PCL的特征峰， 证明TTBZ和PEG-PCL已成功的连接上。
(3)TTBZ-PEG-PCL@rif的稳定性测定
分别移取1mL载药胶束，置于10mL PBS液和10mL人工脑脊液(简称aCSF，含124.0mMNaCl、26.0mMNaHCO3、2.5mM KCl、2.0mM CaCl2、1.0mM MgCl2、1.25mMNaH2PO4和10.0mM d-葡萄糖)中，于37℃恒温摇床上以100rpm的速度摇动，分别于不同时间点(0、 2h、4h、6h、8h、10h)利用Malvern ZetasizerNano-ZS测量胶束的粒径大小。
如图7所示，通过动态光散射技术，显示在不同时间点下，TTBZ-PEG-PCL@rif胶束在 PBS、人工脑脊液(aCSF)中的粒径都均一稳定，证明该载药系统在PBS和人工脑脊液中性质稳定，表征均一。
(4)TTBZ-PEG-PCL@rif的安全性测定
将SH-SY5Y细胞(武汉普诺赛公司)培养于完全培养基(90％DMEM+10％FBS+1％双抗)， 并接种于96孔板中，细胞密度控制在5000个/孔，置于37℃、5％含量的CO2培养箱中培养。 12h后将100μL含TTBZ-PEG-PCL@rif纳米胶束的培养基加入培养板中并使纳米胶束终浓度 分别为100、200、300、400、500μM。分别共培养6、12、18、24小时后，使用CCK-8(CellCountingKit-8)法测定细胞活性，以验证载药胶束的生物安全性。
图8的CCK-8法测定结果证明，不同浓度的TTBZ-PEG-PCL@rif作用于SH-SY5Y细胞后，在不同时长下对细胞凋亡的影响较小，证明该材料安全可靠。
(5)TTBZ-PEG-PCL载体的靶向能力验证
按照实施例1的方法制备TTBZ-PEG-PCL@尼罗红(Nile red)纳米胶束。
使用共聚焦皿接种SH-SY5Y细胞，接种细胞的密度控制在105个/皿，置于37℃、5％含 量的CO2培养箱中培养，待细胞成对数生长时，弃去培养基，用移液枪向皿中轻轻加入1mL 左右的PBS缓冲液，经过数次轻轻地摇晃后弃去废液；再向皿中加入2mL含100μM TTBZ-PEG-PCL@尼罗红聚合物胶束的培养基，孵育24h后弃去培养基，再用PBS液冲洗3次，多 聚甲醛固定5min，PBS液冲洗3次，然后用0.3％Triton-100破膜10分钟，PBS液冲洗3次， 随后用QuickBlockTM免疫染色封闭液(P0260，碧云天)封闭1小时，弃去封闭液，加入抗 VMAT2一抗(1：500，ab70808，Abcam)于4℃放置过夜；第二日弃去一抗，PBS液冲洗 3次，再加入AlexaFlour 488二抗(1：200，ab150077，Abcam)孵育1小时，PBS液冲洗3 次后，加入DAPI染色5min，最后通过共聚焦显微镜(Zeiss LSM 710)对细胞进行观察并拍 照，分析聚合物胶束对细胞的靶向能力和胞内分布情况。
(6)TTBZ-PEG-PCL@rif的神经保护作用
首先，通过α-突触核蛋白(α-syn)左侧纹状体立体定向注射构建PD小鼠模型。具体操 作为：首先腹腔注射1％戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉小鼠，局部消毒后，纵向切开小鼠颅顶 皮肤，并固定于小鼠立体定向仪(深圳瑞沃德公司)上。确定小鼠前囟点(bregrna)，参照小鼠解剖图谱，确定左侧纹状体坐标(前+0.2mm，左+2mm，垂直深度+2.6mm)，随后用4号 针头钻孔。然后通过微针将8μgα-syn缓慢推注入颅内，保持进针速度为0.27μL/min，为了防止注入的α-syn渗出，待注射完毕后停留5min再撤针。上述步骤完成后，缝合切口，使用碘伏消毒后置于保温毯上并密切观察生命体征，直至小鼠复苏。
为了减少反复给药带来的损伤，通过皮下微泵(2002W，即200μL持续泵入2周，购自深圳瑞沃德公司)植入侧脑室持续泵入TTBZ-PEG-PCL@rif(以单纯的利福平为对照)。具 体操作为：
首先腹腔注射1％戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉上述构建的PD模型小鼠，局部消毒后， 纵向切开小鼠颅顶皮肤，并固定于小鼠立体定向仪上。确定小鼠前囟点(bregrna)，通过参 照小鼠解剖图谱，确定左侧侧脑室位置(后+0.2mm，左+1mm，垂直深度+3.0mm)，随后用4号针头钻孔。然后将装有药液的微泵埋入小鼠肩部皮下，通过导管连于输液套管上，将套管沿着颅骨的钻孔植入侧脑室，上述步骤完成后，缝合切口，使用碘伏消毒后置于保温毯上并密切观察生命体征，直至小鼠复苏。
待药液注入完成后，采集鼠脑标本并制作石蜡切片。具体操作为：腹腔注射1％戊巴比妥 钠(50mg/kg)麻醉小鼠，将麻醉的小鼠固定于解剖台上，开胸暴露心脏，剪开右心耳，经左 心室用冰生理盐水快速冲洗，直至小鼠肝脏发白。然后冰4％多聚甲醛-PBS(0.01M，pH 7.4) 持续灌注2小时，快速开颅取出鼠脑，置于4％多聚甲醛固定24小时以上。从黑质前端处冠 状切断，取后半部分行石蜡包埋，5μm连续切片，最后观察染色的结果。
酪氨酸羟化酶(TH)可反映多巴胺神经元的数量，通过TH免疫组织化学染色可发现(图 10)，TTBZ-PEG-PCL@rif治疗组相较于单纯的利福平治疗组，中脑黑质TH显著增多，证明TTBZ-PEG-PCL@rif的神经修饰作用更为显著。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领 域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、 修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种利福平纳米递药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、通过自组装的方式将利福平装载于PEG-PCL载体中制备得到PEG-PCL@利福平；
S2、将巯基丙酸和TTBZ在EDCI和DMAP的催化下反应生成HS-TTBZ；
S3、通过HS-TTBZ的巯基和与步骤S1的PEG-PCL@利福平中PEG-PCL尾端的C＝C基团在APS和Na2SO3的催化下发生点击化学反应，即可制备得到利福平纳米递药系统；
所述TTBZ和PEG-PCL具有如下所示的结构：
2.根据权利要求1所述的一种利福平纳米递药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将利福平和PEG-PCL冻干粉溶于DMF中形成有机相，并将有机相加至水中，然后用透析袋透析12h以上，收集透析袋中的溶液，经过滤后制得PEG-PCL@利福平溶液；
S2、将巯基丙酸、EDCI和DMAP低温搅拌混匀，再加入TTBZ继续搅拌12h以上，得到TTBZ-SH溶液；
S3、将步骤S2的TTBZ-SH溶液和步骤S1的PEG-PCL@利福平溶液混合，并加入APS和Na2SO3低温搅拌36h以上，然后用透析袋透析过夜，收集透析袋中的溶液即可得利福平纳米递药系统。
3.根据权利要求2所述的一种利福平纳米递药系统的制备方法，其特征在于，利福平和APEG-PCL冻干粉的质量比为1：8-12；利福平与DMF的料液比为1mg：1-3mL。
4.根据权利要求2所述的一种利福平纳米递药系统的制备方法，其特征在于，巯基丙酸、EDCI与DMAP的质量比为3：11：7。
5.根据权利要求2所述的一种利福平纳米递药系统的制备方法，其特征在于，TTBZ-SH溶液与PEG-PCL@利福平溶液的体积比为1：4-6；TTBZ-SH溶液与APS、Na2SO3的料液比为1mL：1mg：1mg。
6.根据权利要求2所述的一种利福平纳米递药系统的制备方法，其特征在于，步骤S1的过滤为采用0.45um的微孔滤膜进行过滤。
7.根据权利要求2所述的一种利福平纳米递药系统的制备方法，其特征在于，步骤S1中，在超声作用下将有机相逐滴加至水中。
8.根据权利要求2所述的一种利福平纳米递药系统的制备方法，其特征在于，步骤S1和S3中的透析袋的截留分子量为14，000。
9.采用权利要求1-8任一项所述的一种利福平纳米递药系统的制备方法制备得到的利福平纳米递药系统。
10.权利要求9所述的利福平纳米递药系统在制备神经保护药物中的应用，其特征在于，所述神经保护药物为防治帕金森病的药物。
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2021
- 2021-12-30 CN CN202111656866.4A patent/CN114288419B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Rifampicin Nanoformulation Enhances Treatment of Tuberculosis in Zebrafish;Jiří Trousil et al;Biomacromolecules;第20卷;1798-1815 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114288419A (zh) | 2022-04-08 |
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