CN101816629B - 一种双重靶向脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双重靶向脂质体及其制备方法和应用。本发明提供的靶向脂质体，由脂质体和其表面的修饰物组成，脂质体表面的修饰物为p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside和转铁蛋白。本发明还保护一种载药脂质体，是用所述的靶向脂质体包载柔红霉素得到的。本发明得到的靶向脂质体具有良好的跨血脑屏障的能力，并且靶向脑胶质瘤，可作为药物载体。本发明得到的载药脂质体，能够使药物在跨过血脑屏障后靶向到脑胶质瘤部位，从而肿瘤部位的药物浓度大大增加，提高化疗的效果。本发明为脑胶质瘤化疗提供了一个新的对策，并有助于对脑胶质瘤的非侵入性治疗的研究，具有重要的理论意义与临床意义。

Description

一种双重靶向脂质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种双重靶向脂质体及其制备方法和应用。

背景技术

原发性脑瘤已成为癌症的十大死因之一。100,000人中就有5到10人患恶性脑胶质瘤[Wrensch M，Minn Y，Chew T，Bondy M，Berger MS.Epidemiology of primarybrain tumors：current concepts and review of the literature.Neuro Oncol.2002 Oct；4(4)：278-99.Behin A，Hoang-Xuan K，Carpentier AF，Delattre JY.Primary brain tumours in adults.Lancet.2003 Jan 25；361(9354)：323-31.]。侵入性脑胶质瘤细胞能够快速地浸润和破坏正常脑组织结构，因而不可能通过手术完全切除肿瘤。尽管使用手术切除、放疗和化疗联合治疗，恶性脑胶质瘤病人的平均生存时间不超过一年[Astner ST，Pihusch R，Nieder C，Rachinger W，LohnerH，Tonn JC，Molls M，Grosu AL.Extensive local and systemic therapy inextraneural metastasized glioblastoma multiforme.Anticancer Res.2006Nov-Dec；26(6C)：4917-20.Nieder C，Grosu AL，Astner S，Molls M.Treatmentof unresectable glioblastoma multiforme.Anticancer Res.2005Nov-Dec；25(6C)：4605-10.]。化疗方法失败的主要原因是抗癌药通过静脉给药后不能到达脑实质。血脑屏障由内皮单层细胞、星形胶质细胞和周皮细胞组成，它将脑实质与血液分开，并阻止药物向中枢神经系统渗透。血脑屏障阻止大分子和98％以上的小分子药物的摄取[Pardridge WM.BBB-Genomics：creating new openings forbrain-drug targeting.Drug Discov Today.2001 Apr 1；6(8)：381-383]。化疗的另一个的障碍就是使化疗药在肿瘤部位维持高浓度而不扩散到正常组织[Minchinton AI，Tannock IF.Drug penetration in solid tumours.Nat Rev Cancer.2006 Aug；6(8)：583-92.Ohlfest JR，Demorest ZL，Motooka Y，VengcoI，Oh S，Chen E，Scappaticci FA，Saplis RJ，Ekker SC，Low WC，Freese AB，LargaespadaDA.Combinatorial antiangiogenic gene therapy by nonviral gene transferusing the sleeping beauty transposon causes tumor regression and improvessurvival in mice bearing intracranial human glioblastoma.Mol Ther.2005Nov；12(5)：778-88]。因此，对科研工作者来说，研究一种新的给药系统既能使药物透过血脑屏障又能靶向脑胶质瘤成为一项紧迫的任务。

脑胶质瘤根据细胞的类型分成以下几类：(脑室)室管膜细胞瘤(室管膜细胞)，成胶质细胞瘤(星形胶质细胞)，少突神经胶质(细胞)瘤(少突胶质细胞)，混合性神经胶质瘤(不同类型的神经胶质)。低度的脑胶质瘤分化良好(细胞不能回复较原始状态)并且是良性的，能被很好的诊断。重度胶质瘤不分化(细胞回复较原始状态的)并且是恶性的，很难被很好的诊断。根据WHO对胶质瘤的分级系统，4级胶质瘤的诊断最困难，患者的平均存活时间仅为12个月。从总体看，几乎没有病人存活能超过3年。通过手术和/或放射治疗几乎不能治愈恶性胶质瘤(神经胶质瘤)。主要是以下两大原因限制了化疗所能起到的作用：抗肿瘤药不能透过血脑屏障及其在透过血脑屏障后对肿瘤组织的渗透能力很差。在脑肿瘤部位能维持高的治疗浓度已成为化疗的一大挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一种双重靶向脂质体及其制备方法和应用。

本发明提供的双重靶向脂质体，由脂质体和其表面的修饰物组成，其特征在于：所述脂质体表面的修饰物为p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside(对硝基苯-α-D-吡喃甘露糖苷，MAN)和转铁蛋白(transferrin，TF)。

所述p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside可连接于所述脂质体的氨基上；所述转铁蛋白可连接于所述脂质体的羧基上。所述脂质体的氨基可由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂(DSPE-PEG-NH₂)提供；所述脂质体的羧基可由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH(DSPE-PEG-COOH)提供。

具体来说：所述脂质体制备时，可在原料中加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH结合到脂质体表面，提供用于连接p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside和转铁蛋白的氨基和羧基。

所述脂质体具体可用卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂(DSPE-PEG-NH₂)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH(DSPE-PEG-COOH)作为原料制备得到。卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH的质量比可为(104.5-105.5)∶(44.5-45.5)∶(28-28.5)∶(3.4-3.6)∶(3.4-3.6)。卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH的具体摩尔比可为52∶43∶4∶0.5∶0.5。

所述靶向脂质体中，所述转铁蛋白与所述脂质体的质量比为(4-5)∶15，所述p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside与所述脂质体的质量比为(1.5-2)∶15。

所述靶向脂质体中，所述转铁蛋白与卵磷脂的比可为300-400μg转铁蛋白/μmol磷脂。所述靶向脂质体中，所述p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside与所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂的摩尔比可为(3-10)∶1。

所述聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺具体可为DSPE-PEG2000。所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂具体可为DSPE-PEG2000-NH₂。所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH具体可为DSPE-PEG2000-COOH。

本发明还提供了一种靶向脂质体的制备方法，包括如下步骤：

1)以卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH为原料制备表面具有氨基和羧基的脂质体；

2)将p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside与脂质体的氨基连接；将转铁蛋白与脂质体的羧基连接；

得到靶向脂质体。

所述步骤1)中，制备脂质体的方法具体可为硫酸铵梯度法。

所述步骤2)中，可用戊二醛作连接剂，将p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside与脂质体的氨基(由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂提供)的氨基连接。

所述步骤2)中，可用EDCI作连接剂，将转铁蛋白与脂质体的羧基(由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH提供)连接。

所述步骤1)中，卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH的质量比可为(104.5-105.5)∶(44.5-45.5)∶(28-28.5)∶(3.4-3.6)∶(3.4-3.6)。卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH的具体摩尔比可为52∶43∶4∶0.5∶0.5。

所述聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺具体可为DSPE-PEG2000。所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂具体可为DSPE-PEG2000-NH₂。所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH具体可为DSPE-PEG2000-COOH。

所述的靶向脂质体可应用于制备药物载体。

本发明还保护一种药物载体，它的活性成分为所述的靶向脂质体。

本发明还保护一种载药脂质体，是用所述的靶向脂质体包载药物得到的。

所述药物具体可为柔红霉素。

本发明还保护一种治疗脑肿瘤的药物，它的活性成分是包载柔红霉素的载药脂质体。

所述脑肿瘤可为脑胶质瘤，具体可为C6胶质瘤。

所述包载柔红霉素的载药脂质体可应用于制备治疗脑肿瘤的药物。

所述脑肿瘤可为脑胶质瘤，具体可为C6胶质瘤。

脂质体经MAN修饰后，能够被血脑屏障上的GLUT1(葡萄糖转运体1)识别，使脂质体跨膜转运通过血脑屏障；脂质体经TF修饰后，在跨血脑屏障后可通过转铁蛋白受体(TfR)主动识别脑胶质瘤细胞，从而提高肿瘤部位的药物浓度，增加抗癌药物的细胞内传递效率；因此发挥双重靶向作用。机制可能与下面两个方面有关：血脑屏障上有TfR表达，肿瘤细胞表面上有GLUT1表达；大多数的脑肿瘤都是实体瘤，实体瘤的无血管部分成为有效控制肿瘤生长的主要障碍。甘露糖衍生物和转铁蛋白修饰的柔红霉素脂质体制备及其二级靶向作用的梗概图见图1：葡萄糖转运体(GLUT1，一级靶向)介导跨血脑屏障，然后转铁蛋白(二级靶向)介导靶向C6胶质瘤细胞。

脂质体的粒径可以显著性的影响脂质体的体内药物动力学性质、毒性及其抗肿瘤活性。就粒径本身而言，平均粒径在100nm左右的脂质体拥有最长的血浆半衰期。本发明得到的包载柔红霉素的脂质体的平均粒径在120nm附近，多分散系数在0.13-0.25左右，是一个粒径大小合适、分布均匀的分散体系，在血液中的循环时间长，使脂质体囊泡有更多的机会通过肿瘤部位新生毛细血管内皮组织上的“孔隙”而向肿瘤组织富集，从而实现更好的抗肿瘤活性。Zeta电位是衡量脂质体或脂质纳米粒等分散体系的物理稳定性的参数之一。本发明得到的包载柔红霉素的脂质体的zeta电位略显负性，说明脂质体囊泡之间具有适量的静电排斥力，脂质体贮存稳定性更好，不易发生聚沉。本发明得到的柔红霉素脂质体对C6胶质瘤细胞具有明显的抑制作用。

本发明将MAN与脂质体表面DSPE-PEG-NH₂连接得以增加跨血脑屏障能力，将转铁蛋白与脂质体表面的DSPE-PEG-COOH连接以靶向脑胶质瘤，得到了双重靶向脂质体。将抗肿瘤药柔红霉素包封于脂质体中，得到了一种全新的抗恶性脑胶质瘤双重靶向脂质体，能够使药物在跨过血脑屏障后靶向到脑胶质瘤部位，从而肿瘤部位的药物浓度大大增加，提高化疗的效果。本发明为脑胶质瘤化疗提供了一个新的对策，并有助于对脑胶质瘤的非侵入性治疗的研究，具有重要的理论意义与临床意义。

附图说明

图1为双重靶向脂质体制备及双重靶向作用梗概图。

图2为BSA标准曲线。

图3为载药脂质体A1和载药脂质体C1的形态。

图4为HRP标准曲线。

图5为HRP不同时间的通透率。

图6为透过血脑屏障能力测定中柔红霉素的跨体外血脑屏障转运率。

图7为MAN竞争实验中柔红霉素的跨体外血脑屏障转运率。

图8为48小时后，载药脂质体对C6胶质瘤细胞的抗增殖作用。

图9为应用不同的载药脂质体，C6胶质瘤细胞摄取柔红霉素的情况。

图10为TF受体竞争实验中，不同处理中，C6胶质瘤细胞摄取柔红霉素的情况。

图11为激光共聚焦法检测细胞对不同载药脂质体的摄取及其在细胞内的分布。

图12为BMVEC/C6共培养实验中不同载药脂质体在跨体外血脑屏障后对C6胶质瘤的抑制率。

图13为胶质瘤细胞球实验的不同处理中肿瘤球体积率。

图14为不同载药脂质体处理的C6胶质瘤大鼠的脑胶质肿瘤体积抑制率。

图15为不同载药脂质体处理的C6胶质瘤大鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、脂质体的制备

卵磷脂(EPC)和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(polyethyleneglycol-distearoylphosphatidylethanolamine，PEG2000-DSPE)购自日本油脂株式会社(日本NOF公司)；胆固醇(cholesterol)购自北京市海淀区微生物培养基制品厂(北京双旋微生物培养基制品厂)；DSPE-PEG2000-COOH、DSPE-PEG2000-NH₂、p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside(MAN)、转铁蛋白(分子量为80,000道)(holo-transferrin，TF)购自Sigma-Aldrich Corporation，Beijing local agent，China；shephedex G-100、trinitrobenzene sulphonic acid(TNBS)购自Sigma-Aldrich公司，Beijing local agent，China；

1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide hydrochloride(EDCI)购自Shanghai Medpep Co.，Ltd.，China；N-hydroxysuccinimide(NHS)购自BeijingSansheng Tengda Technology Co.，Ltd.，China；BCA试剂盒购自PierceCorporation，Beijing local agent，China；聚碳酯过滤器(孔径400、200nm)购自Millipore(Bedford，MA，USA)；柔红霉素盐酸盐购自南京天尊泽众化学试剂公司。HP1100型高效液相色谱仪(Agilent，美国)。Nano Series Zen 4003 ZetaSizer(Malvern instruments，英国)。SPI3800N series SPA-400型原子力显微镜(日本)。

一、空白脂质体的制备

1、空白脂质体的制备

将卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-COOH、DSPE-PEG2000-NH₂按摩尔比52∶43∶4∶0.5∶0.5溶解在氯仿中；旋转蒸发除去氯仿，在茄形瓶中40℃、40rpm旋蒸形成薄膜；加入10ml 250mM硫酸铵，先在水浴中超声5min，然后转移到血清瓶中在JY92-2D型超声波细胞粉碎机中进一步超声(超声工作时间为10s，间歇时间为10s，全程时间为10min，保护温度为35℃)。得到脂质体A。

2、空白MAN修饰的脂质体的制备

通过戊二醛作连接剂，将MAN化学连接到脂质体A上DSPE-PEG2000-NH₂的氨基上，具体步骤为：将8ml脂质体A(7.5mg/ml)与2mg MAN混合；然后缓慢加入戊二醛，使戊二醛终浓度为15mM；室温下孵育5min；在PBS(pH7.4)中透析去除未连接的MAN和戊二醛。得到脂质体B。

3、空白MAN和TF修饰的脂质体的制备

通过EDCI作连接剂，将转铁蛋白的氨基与脂质体B上DSPE-PEG-COOH的羧基连接，具体步骤为：取2ml脂质体B(7.5mg/ml)，加入1.0mg EDCI和1.44mg NHS(DSPE-PEG-COOH∶EDCI∶NHS＝0.063∶2.5∶6.3；摩尔比)，混匀后加入5mg转铁蛋白，缓慢搅拌并室温孵育3h。过Shephedex G-100柱(用pH7.4的PBS平衡)，去除游离转铁蛋白，得到脂质体C。

4、空白TF修饰的脂质体的制备

通过EDCI作连接剂，将转铁蛋白的氨基与脂质体A上DSPE-PEG-COOH的羧基连接，步骤同步骤3。得到脂质体D。

二、载药脂质体的制备和包封率的测定

药脂比＝柔红霉素盐酸盐的质量∶脂质体中卵磷脂和胆固醇的质量之和。

1、载药脂质体的制备

将柔红霉素盐酸盐以1∶12的药脂比与脂质体A混合，40℃水浴中振摇20min，然后进行透析，除去游离的柔红霉素盐酸盐，得到载药脂质体A1。

将柔红霉素盐酸盐以1∶12的药脂比与脂质体B混合，40℃水浴中振摇20min，然后进行透析，除去游离的柔红霉素盐酸盐，得到载药脂质体B1。

将柔红霉素盐酸盐以1∶12的药脂比与脂质体C混合，40℃水浴中振摇20min，然后进行透析，除去游离的柔红霉素盐酸盐，得到载药脂质体C1。

将柔红霉素盐酸盐以1∶12的药脂比与脂质体D混合，40℃水浴中振摇20min，然后进行透析，除去游离的柔红霉素盐酸盐，得到载药脂质体D1。

2、包封率的测定

将载药脂质体置于10mL容量瓶中，用10倍量的甲醇破坏，并用流动相定容，HPLC法测定柔红霉素含量。

包封率(％)＝载药脂质体中柔红霉素的含量/(载药脂质体中柔红霉素的含量+游离柔红霉素含量)×100％。

表1不同载药脂质体的包封率

在所制备的载药脂质体A1、B1、C1、D1中，柔红霉素的包封率均大于90％。

实施例2、脂质体的性能测定

一、转铁蛋白修饰率测定(BCA法)

1、标准曲线的制备

采用BCA试剂盒(Pierce Corporation，Beijing local agent，China)，以BSA为标准进行测定，用PBS配置0、25、125、250、500、750和1000μg/ml的BSA，加入工作液后37℃下孵育30min，冷却至室温于540nm测定吸光值。标准曲线见图2。

2、修饰率

按BCA试剂盒说明书测定实施例1制备的脂质体C和脂质体D中的转铁蛋白含量，并计算修饰率(μg TF/μmol磷脂)(修饰率＝连接到脂质体上的转铁蛋白质量∶卵磷脂的物质的量)，结果见表2。

表2脂质体中的转铁蛋白含量和转铁蛋白修饰率(n＝3)

二、MAN修饰率测定

脂质体上DSPE-PEG-NH₂的氨基与三硝基苯硫酸反应，分别检测实施例1制备的脂质体A、脂质体B和脂质体C上可与三硝基苯硫酸反应的氨基数量。脂质体B的MAN修饰率为：(1-脂质体B上可与三硝基苯硫酸反应的氨基数量/脂质体A上可与三硝基苯硫酸反应的氨基数量)×100％。脂质体C的MAN修饰率为：(1-脂质体C上可与三硝基苯硫酸反应的氨基数量/脂质体A上可与三硝基苯硫酸反应的氨基数量)×100％。

脂质体上可与三硝基苯硫酸反应的氨基数量的检测方法为：向1ml脂质体溶液中加入1ml 4％NaHCO₃和1ml 10％十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulphate，SDS)。混合后30℃下反应20min，然后再加入1ml 0.1％TNBS溶液，再在40℃下反应2h，最后加入0.5ml 1M HCl终止反应，320nm下测定吸光度(Mitra M，Mandal AK，Chatterjee TK，Das N.Targeting of mannosylated liposome incorporated benzylderivative of Penicillium nigricans derived compound MT81 toreticuloendothelial systems for the treatment of visceral leishmaniasis.J Drug Target.2005 Jun；13(5)：285-93)。

表3脂质体B和脂质体C的MAN修饰率(n＝3)

三、粒径和电位测定

使用Nano Series Zen 4003 Zeta Sizer(Malvern instruments，Ltd，UK)测定实施例1制备的载药脂质体A1、B1、C1、D1的粒径、多分散系数和Zeta电位。

不同载药脂质体的粒径(particle size)、多分散系数(polydispersity index，PDI)和zeta电位(zeta potential)的测定结果见表4。

表4不同载药脂质体的粒径、多分散系数和zeta电位(n＝3)

脂质体粒径分布均匀，粒径在120nm左右。各载药脂质体都略带负电，说明脂质体囊泡之间具有适量的静电排斥力，贮存稳定性更好，不易发生聚沉。

五、原子力显微镜(AFM)

采用原子力显微镜对实施例1制备的载药脂质体A1和载药脂质体C1进行形态学观察，方法如下：使用去离子水稀释至柔红霉素浓度为100μg/mL，用0.2μm微孔滤膜过滤，取10μL脂质体溶液涂于硅片上，室温干燥，用原子力显微镜进行测定。载药脂质体A1和载药脂质体C1的形态见图3，图3中，A：载药脂质体A1；B：载药脂质体C1。结果表明：药脂质体A1表面呈光滑状，载药脂质体C1表面可见小球结构。

实施例3、脂质体体外双重靶向作用评价

鼠C6胶质瘤细胞系购自中国医学科学院药物所；Ham’s F10培养基购自GIBCO/BRL公司(Germany)北京代理北京迈成科技有限公司；胎牛血清(FBS)购自中美合资兰州民海生物工程有限公司；马血清购自北京拜尔迪生物科技有限公司；SRB购自Sigma北京代理拜尔迪生物科技有限公司；辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase，HRP分子量为40000，酶活性＞250U·mg^-1)、鼠脑内皮细胞(brainmicrovascular endothelial cells，BMVEC)及其内皮细胞培养液(cndothclialcell culture medium，ECCM)均购自中日友好医院临床研究所；酶标仪(BIO-RADModel 680，中国上海Bio-Rad实验室设备公司)，细胞插入器(Corning，USA)；电阻测定仪，(EVOMk，Word Precision Instruments，USA)。采用实施例1制备的载药脂质体进行以下试验。

一、跨血脑屏障研究

1、BMVEC细胞的培养

鼠脑内皮细胞在鼠脑内皮细胞培养液(其组成为DMEM，20％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，2mmol/L 1-谷胺酰胺，100μg/ml内皮生长因子(ECGF)，40U/ml肝素)中传代培养，培养条件为37℃、5％二氧化碳。

2、体外血脑屏障建立

细胞插入器(Corning，NY，USA；0.4μm孔径，12mm直径，1.12cm²表面积)以2％的明胶包被后，每个细胞插入器中种37,500个鼠脑内皮细胞，培养5天，每两天更换一次培养液。

3、体外血脑屏障模型评价

(1)血脑屏障体外模型跨膜电阻的测定

通过测定单层血脑屏障(BBB)的电阻来判断BBB形成的紧密程度。电阻高于250Ωcm²可用于实验。血脑屏障体外模型的跨膜电阻为276～282Ωcm。

(2)HRP含量测定标准曲线的建立

配制浓度为100μg·ml^-1的HRP溶液，倍比稀释得到浓度为12.5、6.25、3.125、1.56和0.78ng·ml^-1的HRP的标准系列溶液，各取50μl加入96孔板，依次加入50μl显色液A和B(购于中日友好医院临床研究所)，显色10min后加入2M H₂SO₄终止反应，于450nm测定样品的吸光度，建立HRP含量测定的标准曲线(见图4)。

(3)BBB通透性测定

血脑屏障形成后，细胞插入器的上池中加入含500ngHRP的培养基500μl，下池中加入1000μl的培养基，维持细胞插入器内外池液面相平，于0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和24.0h时取50μl的下池液体，测定透过血脑屏障HRP的量，取样后补充等体积的空白培养基，以维持内外液面平衡，根据下式计算HRP的通透率。

通透率＝C_t，下池/C_0，上池

C_t，下池：t时刻下池中HRP的浓度；

C_0，上池：实验开始时上池中HRP的浓度。

HRP不同时间的通透率见图5。

4、各制剂透过血脑屏障能力的测定

在18个细胞插入器上分别接种鼠脑内皮细胞，当电阻测定显示均形成完整的紧密连接时，分成六组(每组3个细胞插入器)，每组的上池中均加入500μl的无血清DMEM培养基，下池中加入1000μl的无血清DMEM培养基。第一组的上池培养基做空白对照，第二组的上池中含有5μg游离柔红霉素，第三组的上池中含有载药脂质体B1(含5μg柔红霉素)，第四组的上池中含有载药脂质体D1(含5μg柔红霉素)，第五组的上池中含有载药脂质体C1(含5μg柔红霉素)，第六组的上池中含有载药脂质体A1(含5μg柔红霉素)。细胞插入器置于12孔板上，在培养箱中培养，于0、2、4、8和24h取出孔内的溶液0.5ml，再补入0.5ml新鲜培养液，HPLC测定样品中柔红霉素含量，根据下式计算柔红霉素跨体外血脑屏障转运率。

C_t，下池：t时刻下池中柔红霉素的浓度；

C_0，上池：实验开始时上池中柔红霉素的浓度。

图6为柔红霉素跨体外血脑屏障转运率。载药脂质体C1跨BBB能力是游离柔红霉素的37.18倍，载药脂质体B1的1.50倍，载药脂质体D1的2.76倍，载药脂质体A1的2.94倍。结果表明，柔红霉素脂质体在经过MAN和TF修饰后，大大提高了柔红霉素的跨血脑屏障转运能力。

5、MAN竞争实验

在12个细胞插入器上分别接种鼠脑内皮细胞，当电阻测定显示均形成完整的紧密连接时，分成四组(每组3个细胞插入器)，每组的上池中均加入500μl的无血清DMEM培养基，下池中加入1000μl的无血清DMEM培养基。第三组和第四组的上池中加入200μg MAN，以饱和GLUT1受体。MAN加入30分钟后，在第一组和第三组分别加入载药脂质体B1(含5μg柔红霉素)，在第二组和第四组分别加入载药脂质体C1(含5μg柔红霉素)。细胞插入器置于12孔板上，在培养箱中培养，在0、2、4、8和24h时从下池中取500μl样品，取样后立即补入新鲜培养液500μl，HPLC法测定样品中柔红霉素的含量，计算柔红霉素跨体外血脑屏障转运率(公式同步骤4)。

结果如图7所示，加入MAN后，由于游离的MAN与GLUT1竞争性结合，使得载药脂质体B1、载药脂质体C1的跨血脑屏障能力大大降低。该结果证明MAN和TF修饰的柔红霉素脂质体通过MAN介导与GLUT1识别结合，从而跨血脑屏障转运能力显著提高。

二、靶向C6胶质瘤研究

1、C6胶质瘤细胞培养

鼠C6胶质瘤细胞生长在F10培养液(含5％胎牛血清、15％马血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中，培养条件：37℃、5％二氧化碳。

2、C6胶质瘤细胞细胞毒实验

①将鼠C6胶质瘤细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔2500个(培养液体积为每孔180μL)，置二氧化碳培养箱中于37℃，相对湿度95％的条件下孵育24h。

②将培养板上的细胞分成5组，每组设置5个浓度，每个浓度设四个复孔。

第1组：细胞贴壁生长后，在细胞培养孔中分别加入20μL无血清培养液配制的游离柔红霉素，柔红霉素的终浓度分别为：0.25、0.5、1、2.5、5μg/L。

第2组：细胞贴壁生长后，在细胞培养孔中分别加入20μL无血清培养液配制的载药脂质体B1，柔红霉素的终浓度分别为：0.25、0.5、1、2.5、5μg/L。

第3组：细胞贴壁生长后，在细胞培养孔中分别加入20μL无血清培养液配制的载药脂质体D1，柔红霉素的终浓度分别为：0.25、0.5、1、2.5、5μg/L。

第4组：细胞贴壁生长后，在细胞培养孔中分别加入20μL无血清培养液配制的载药脂质体C1，柔红霉素的终浓度分别为：0.25、0.5、1、2.5、5μg/L。

第5组：细胞贴壁生长后，在细胞培养孔中分别加入20μL无血清培养液配制的载药脂质体A1，柔红霉素的终浓度分别为：0.25、0.5、1、2.5、5μg/L。

另设溶剂对照孔(4个复孔)。

③将细胞培养板置二氧化碳培养箱中孵育48小时。孵育完毕后，吸弃培养液，每孔加入10％三氯乙酸100μL，然后在4℃冰箱中放置1h固定细胞。培养板各孔用去离子水洗涤5遍，去除三氯乙酸。在空气中干燥后，每孔加0.4％SRB(以1％醋酸配制)100μL，室温下放置15min，弃去各孔内液体后用1％乙酸洗涤5遍，去除未结合染料。空气中干燥后，用100μL pH10.5、10mmol/L的Tris碱溶解，在平板振荡器上振荡10min，置酶标仪中测定每孔吸收度OD值(540nm)。

不同处理后，细胞的存活率见图8。存活率测定结果显示，在柔红霉素的不同制剂中，载药脂质体C1在各个浓度下均表现出最强的抗C6胶质瘤细胞增殖的作用。

计算抑制率(抑制率＝给药组细胞吸光度_540nm/对照组细胞吸光度_540nm)，并使用SPSS软件计算50％抑制浓度(IC50)。IC50计算结果见表5。

表5不同载药脂质体的IC50值

a，与游离柔红霉素处理组相比，P＜0.05；b，载药脂质体A1处理组与载药脂质体D1处理组相比，P＜0.05；c，载药脂质体C1处理组与载药脂质体A1处理组相比P＜0.01。

载药脂质体C1的IC50值比游离柔红霉素的IC50值低1.39倍。各载药脂质体之间，载药脂质体C1的IC50值分别比载药脂质体A1低3.47倍，比载药脂质体B1低3.22倍，比载药脂质体D1低3.08倍。MAN和TF修饰的柔红霉素脂质体表现出最强的抗C6胶质瘤细胞增殖的作用。

3、C6胶质瘤细胞摄取

鼠C6胶质瘤细胞接种于6孔板中(5×10⁵个细胞/孔)(分成五组，每组设4个复孔)；培养24h后，第一组加入游离柔红霉素(柔红霉素终浓度为10μg/mL)，第二组加入载药脂质体B1(柔红霉素终浓度为10μg/mL)，第三组加入载药脂质体D1(柔红霉素终浓度为10μg/mL)，第四组加入载药脂质体C1(柔红霉素终浓度为10μg/mL)，第五组加入载药脂质体A1(柔红霉素终浓度为10μg/mL)；在37℃孵育2h。孵育完毕后用冷的PBS洗三次，经0.25％胰酶消化后用PBS吹打成细胞悬液，用流式细胞仪测定与细胞结合的柔红霉素荧光强度(测定的激发波长为488nm，测定波长为550nm)。每次分析所用的细胞数不少于10⁵个，收集的细胞数为10000个。数据使用FCS Express V3软件进行分析。

结果见图9。图9中，A1：载药脂质体A1；A2：载药脂质体B1；A3：载药脂质体D1；A4：载药脂质体C1；control：C6胶质瘤细胞。峰的右移表明应用不同的载药脂质体，C6胶质瘤细胞摄取柔红霉素的情况。与载药脂质体D1，载药脂质体B1，载药脂质体A1相比，载药脂质体C1显示出最强的C6胶质瘤细胞内摄取能力。

4、C6细胞表面TF受体竞争实验

鼠C6胶质瘤细胞接种于6孔板中(5×10⁵个/孔)(分成四组，每组设4个复孔)，培养24h后，在第三组和第四组分别加入游离的TF(500μg)以饱和细胞表面TF受体；TF加入30分钟后，在第一组和第三组分别加入载药脂质体D1(柔红霉素终浓度为10μg/mL)，在第二组和第四组分别加入载药脂质体C1(柔红霉素终浓度为10μg/mL)；在37℃孵育2h。孵育完毕后用冷的PBS洗三次，经0.25％胰酶消化后用PBS吹打成细胞悬液，用流式细胞仪测定细胞内柔红霉素荧光强度(测定的激发波长为488nm，测定波长为550nm)。每次分析所用的细胞数不少于10⁵，收集的细胞数为10000个。数据使用FCS Express V3软件进行分析。

结果见图10。图10中，B1：TF预饱和30min后应用载药脂质体D1；B2：直接应用载药脂质体D1；B3：TF预饱和30min后应用载药脂质体C1；B4：直接应用载药脂质体C1；control：C6胶质瘤细胞。峰的左移表明胶质瘤细胞表面有大量的TF受体。预先用游离的TF与胶质瘤细胞C6孵育，C6胶质瘤细胞对载药脂质体C1，载药脂质体D1的摄取量显著性减少。该结果说明脂质体经转铁蛋白修饰后能够增加C6胶质瘤细胞内吞作用。MAN和TF修饰的柔红霉素脂质体组能够观察到最强的内吞作用。

5、共聚焦显微镜研究

激光共聚焦法检测细胞对游离柔红霉素，载药脂质体B1，载药脂质体D1，载药脂质体C1以及载药脂质体A1的摄取及其在细胞内的分布行为。鼠C6胶质瘤细胞接种于玻底培养皿中，贴壁生长至60％汇集；设置五组，分别加入游离柔红霉素(柔红霉素终浓度为5μg/mL)、载药脂质体B1(柔红霉素终浓度为5μg/mL)、载药脂质体D1(柔红霉素终浓度为5μg/mL)、载药脂质体C1(柔红霉素终浓度为5μg/mL)、载药脂质体A1(柔红霉素终浓度为5μg/mL)；置二氧化碳培养箱中，37℃培养3小时，依次用冷PBS缓冲液漂洗三次，4％多聚甲醛固定10min，然后用Hoechst33258(激发波长352nm，检测波长461nm)进行细胞核染色7分钟。用激光共聚焦显微镜(LEICATCS SP2)以488nm波长的激光束激发柔红霉素(激发波长488nm，检测波长560nm)进行图像分析。

结果见图11。图11中，C：载药脂质体A1，D：载药脂质体B1，E：载药脂质体D1，F：载药脂质体C1；C1-F1：蓝色表示经Hochest33258染色的C6胶质瘤细胞的核；C2-F2：红色表示应用柔红霉素脂质体后药物在C6胶质瘤细胞内的分布；C3-F3：叠加图像显示应用柔红霉素脂质体后药物分布在C6胶质瘤细胞核。结果表明，药物经C6胶质瘤细胞内吞后主要分布在细胞核中，载药脂质体C1组细胞内柔红霉素分布量最多。

三、体外双重靶向研究---BMVEC/C6共培养实验

设置六组试验(每组3个细胞插入器)。鼠脑内皮细胞种入细胞插入器上层第四天后，在底池种入鼠C6胶质瘤细胞(10000个/孔)，培养液是两种细胞培养液各一半，共培养24h；第一组的上池培养基做空白对照，第二组的上池中含有5μg游离柔红霉素，第三组的上池中含有载药脂质体B1(含5μg柔红霉素)，第四组的上池中含有载药脂质体D1(含5μg柔红霉素)，第五组的上池中含有载药脂质体C1(含5μg柔红霉素)，第六组的上池中含有载药脂质体A1(含5μg柔红霉素)；继续培养48h。孵育完毕后，吸弃培养液，每孔加入10％三氯乙酸2mL，然后在4℃冰箱中放置1h固定细胞。培养板各孔用去离子水洗涤5遍，去除三氯乙酸。在空气中干燥后，每孔加0.4％SRB(以1％醋酸配制)1mL，室温下放置20min，弃去各孔内液体后用1％乙酸洗涤5遍，去除未结合染料。空气中干燥后用2ml、pH 10.5、10mmol/L Tris碱溶解，在平板振荡器上振荡10min，置酶标仪中测定每孔吸收度OD值(540nm)，计算抑制率(抑制率＝给药组细胞吸光度_540nm/对照组细胞吸光度_540nm)，做统计学分析。

结果见图12。制剂在跨过血脑屏障后对C6胶质瘤细胞的抑制率分别为：载药脂质体C1(64.0±0.7％)＞载药脂质体B1(58.6±0.7％)＞载药脂质体A1(46.0±1.0％)≥游离柔红霉素(45.5±0.7％)＞载药脂质体D1(41.3±0.7％)。结果表明，MAN和TF修饰的柔红霉素脂质体显示出“二级靶向作用”(P＜0.01)，即跨过血脑屏障，然后靶向C6胶质瘤细胞。

四、胶质瘤细胞球实验

设置六组试验，每组3个复孔。

①用2％琼脂糖(用无血清培养液配置，80℃下加热30min)40μl包被96孔板，再将鼠C6胶质瘤细胞接种在96孔板中(2000个细胞/孔)，37℃孵育24小时。

②分别用无血清培养液配置游离柔红霉素、载药脂质体B1、载药脂质体D1、载药脂质体C1、载药脂质体A1。

③给药：分别将20μl步骤②得到的载药脂质体(或游离柔红霉素)加入步骤①的96孔板中，柔红霉素的终浓度均为10μg/孔，以无血清培养液为空白对照。

④于给药后第0、1、2、3、5天于倒置显微镜下观察细胞球的形态、球核是否有坏死，并用目镜测微尺测定直径。计算肿瘤体积( $v=\frac{\mathrm{\π}\×d_{\max }\×d_{\min }}{6}$ )，肿瘤球体积率＝(体积_天 ⁱ/体积_天 ⁰)×100％，体积_天 ⁱ是指给药后第i天C6胶质瘤细胞球体积，体积_天 ⁰是指给药前C6胶质瘤细胞球体积，结果见图13。游离柔红霉素只在开始的几天里能微弱的抑制C6胶质瘤细胞球在体积上的增加。载药脂质体C1处理组C6胶质瘤细胞球在大小和体积上产生显著性的减小。第5天时的C6胶质瘤细胞球体积变化率分别是：游离柔红霉素为74.6±5.1％，载药脂质体A1为71.7±5.2％，载药脂质体B1为73.5±3.9％，载药脂质体D1为67.7±3.1％，载药脂质体C1为54.7±2.4％。

实施例4、脂质体体内靶向作用评价

使用200-250g的雄性SD大鼠进行试验。采用实施例1制备的载药脂质体进行以下试验。

一、脑胶质瘤大鼠模型的建立

1、准备C6细胞

取处于对数生长期的鼠C6胶质瘤细胞，稀释为5×10⁵细胞/10μl的细胞悬液。将细胞悬液放入37℃水浴保存。

2、接种处理

1)称重

2)麻醉、固定与消毒：大鼠用20％乌拉坦(0.6ml/100g)腹腔注射麻醉后，去头顶毛发约1.0cm×1.5cm，固定于定向仪上，酒精消毒。

3)切口与钻孔位置：沿内眦连线中点向后纵向切开大鼠头皮1cm，暴露颅骨。根据大鼠脑立体定向图谱：前囟后0.4mm，矢状缝旁侧3.5mm的颅骨上以牙科钻钻孔，牙科钻外带塑料套管，仅允许钻头钻透颅骨深1.0-1.5mm(以防止刺破硬脑膜)。

4)C6细胞右脑尾状核接种：使用20uL微量注射器吸入10μL C6细胞悬液，垂直进针深5mm(距硬脑膜)，以1μl/min速率将细胞悬液注入尾状核内。注射完毕后留针5min，缓慢拔针，骨孔立即用无菌骨蜡封闭，术野用生理盐水冲洗，切口用4号线逢合，2针打结，可明显减少头皮下肿瘤生长。

5)术后腹腔注射青霉素，40000U/只。

二、脂质体体内靶向作用评价

将模型大鼠随机分成6组，每组9只。术后第8天开始尾静脉给药，每组的给药情况如下，给药量指的是柔红霉素的给药量：

第1组(柔红霉素)：每周给药三次，给药量为5mg/kg，连续给药一周；

第2组(载药脂质体D1)：每周给药三次，给药量为5mg/kg，连续给药一周；

第3组(载药脂质体B1)：每周给药三次，给药量为5mg/kg，连续给药一周；

第4组(载药脂质体C1)：每周给药三次，给药量为5mg/kg，连续给药一周；

第5组(载药脂质体A1)：每周给药三次，给药量为5mg/kg，连续给药一周；

第6组(生理盐水)：用生理盐水代替给药，作为对照。

采用4％PBS多聚甲醛液固定解剖出肿瘤，用游标卡尺测量病理解剖肿瘤最大层面直径，以最大长宽高直径计算肿瘤体积(mm³)( $v=\frac{\mathrm{\π}\×d_{\max }\×d_{\min }}{6}$ )，肿瘤体积抑制率＝试验组的肿瘤体积/生理盐水对照组的肿瘤体积×100％。

给药一周后肿瘤体积抑制率见图14。游离柔红霉素为13.0±2.4％，载药脂质体A1为14.2±6.2％，载药脂质体B1为25.3±3.3％，载药脂质体D1为22.8±4.1％，载药脂质体C1为37.4±1.0％。与其它组相比，MAN和TF修饰的柔红霉素脂质体组动物显示出肿瘤体积显著性的减小，并且生理盐水组对肿瘤体积的抑制没有效果。

记录动物死亡时间，绘制卡普兰-迈耶存活曲线，结果见图15。载药脂质体C1组大鼠的平均存活时间为22天，显著性的长于生理盐水组(13天，P＝0.001)、游离柔红霉素组(17天，P＝0.001)、载药脂质体A1组(18天，P＝0.005)，载药脂质体B1组(19天，P＝0.038)和载药脂质体D1组(18天，P＝0.034)。

Claims (7)

1.一种靶向脂质体，由脂质体和其表面的修饰物组成，其特征在于：所述脂质体表面的修饰物为p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside和转铁蛋白；所述脂质体的表面具有氨基和羧基；所述p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside连接于所述脂质体的氨基上；所述转铁蛋白连接于所述脂质体的羧基上；所述脂质体的氨基由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂提供；所述脂质体的羧基由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH提供；所述脂质体是用卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH作为原料制备得到的；卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH的质量比为(104.5-105.5)∶(44.5-45.5)∶(28-28.5)∶(3.4-3.6)∶(3.4-3.6)；

所述靶向脂质体中，所述转铁蛋白与所述脂质体的质量比为(4-5)∶15，所述p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside与所述脂质体的质量比为(1.5-2)∶15。

2.一种靶向脂质体的制备方法，包括如下步骤：

1)以卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH₂和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH为原料制备表面具有氨基和羧基的脂质体；

2)将p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside与步骤1)制备的脂质体的氨基连接；将转铁蛋白与步骤1)制备的脂质体的羧基连接；

得到靶向脂质体脂质体。

3.权利要求1所述的靶向脂质体在制备药物载体中的应用。

4.一种药物载体，它的活性成分为权利要求1所述的靶向脂质体。

5.一种载药脂质体，是用权利要求1所述的靶向脂质体包载药物得到的。

6.一种治疗脑肿瘤的药物，它的活性成分是权利要求5所述的载药脂质体；所述载药脂质体包载的药物为柔红霉素。

7.权利要求5所述的载药脂质体在制备治疗脑肿瘤的药物中的应用；所述载药脂质体包载的药物为柔红霉素。

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