CN105726520B - 含笑内酯二甲胺脂质体雾化吸入剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明创造提供了一种含笑内酯二甲胺脂质体，所述脂质体以类表面活性物质作为载体，包含药物有效成分为含笑内酯二甲胺及其衍生物。所述的含笑内酯二甲胺脂质体是在在治疗肺纤维化中药物中的应用。相对于现有技术，本发明提供的以PSMC为载体的的含笑内酯二甲胺雾化吸入剂以及其在治疗肺纤维化药物中的应用，是通过PSMC与细胞膜相同的磷脂双分子层结构以及磷脂的滋润保护作用，提高药物与肺泡细胞的结合率，改变药代动力学特点，延长药物体内作用时间，显著提高含笑内酯二甲胺对肺纤维化的治疗效果。

Description

含笑内酯二甲胺脂质体雾化吸入剂及其应用

技术领域

本发明涉及药物制剂学领域，具体而言，涉及类肺表面活性物质(plumonarysurfactant mimic carrier,PSMC)为载体的含笑内酯二甲胺(ACT001)雾化吸入剂在治疗肺纤维化中的应用。

背景技术

雾化吸入是呼吸道疾病,例如哮喘、肺气肿、支气管扩张和慢性支气管炎等的常用治疗方式。主要是因为：①肺部吸收面积巨大(约140m²)，而且肺泡与全身循环系统紧密相连；②上皮屏障薄，膜通透性高；③吸入法给药与动脉注射具有生物等效性，生物相容性好；④避免了肝脏的首过效应以及对肾脏功能的影响。雾化吸入剂作为一种吸入剂应用于肺部疾病，通过鼻子呼吸进入，可以针对任何人随时随地使用，尤其可以面向儿童或饮食困难的老人和病人使用，方便快捷，应用范围广。

肺纤维化是目前临床上高发的肺部疾病，其临床表现为呼吸困难，肺间隔内成纤维细胞的增生，细胞外基质的沉积过大。由于肺纤维化是由持续性的肺损伤导致的，因此一旦发生肺纤维化，则难以治愈。肺纤维化的治疗目前并没有特效药物。肺纤维化疾病致死率高、临床治疗措施匮乏，因此在深入了解其发病机制的基础上开发新型的治疗肺纤维化的药物迫在眉睫。

含笑内酯二甲基胺是含笑内酯的衍生物，是由天然提取物小白菊内酯为原料制取而来，在本文中将其简称为ACT001。研究表明ACT001可以通过抑制肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1等的表达而具有抗炎作用。ACT001还可以通过调节糖代谢途径中丙酮酸激酶(PKM2)的构象抑制肺泡上皮细胞发生上皮间充质转变(EMT)向肌成纤维细胞的分化、抑制肺组织中的进行性炎症反应、细胞损伤以及细胞外基质在肺间质中的过度沉积，从而发挥治疗肺纤维化的作用。

为了最大程度的发挥ACT001对肺纤维化的治疗效果，本研究提供了一种新型的ACT001-PSMC雾化吸入剂，其可以显著提高ACT001对肺纤维化的治疗效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种以PSMC为载体的的含笑内酯二甲胺脂质体雾化吸入剂(ACT001)以及其在肺纤维化治疗药物中的应用。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

一种含笑内酯二甲胺脂质体，所述脂质体以类表面活性物质作为载体，包含药物有效成分为含笑内酯二甲胺及其衍生物。

进一步的，所述药物有效成分包含含笑内酯二甲胺及其药学上可接受的盐水合物或他们的组合。

进一步的，所述类表面活性物质为类肺表面活性物质，所述类肺表面活性物质由磷脂及胆固醇组成。

进一步的，所述磷脂包括卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱或他们的组合。

进一步的，所述脂质体中载体与药物有效成分的重量比为：载体：药物有效成分＝5:1。

进一步的，所述脂质体中还包含适宜量的可药用辅料。

本发明还提供一种所述的含笑内酯二甲胺脂质体的制备方法，其步骤包括：首先将磷脂和胆固醇按照一定比例溶于乙醇中，于旋转蒸发仪上减压蒸发，溶剂蒸干呈均一薄膜；然后将称取的含笑内酯二甲胺溶于PBS缓冲液中预热；将预热后的溶液加入旋好的薄膜里，水化洗膜，探头超声，微孔滤膜过滤得含笑内酯二甲胺脂质体混悬液。

本发明的另一目的是保护所述的含笑内酯二甲胺脂质体在治疗肺纤维化中药物中的应用。

进一步的，所述含笑内酯二甲胺脂质体的药效是通过类肺表面活性物质与细胞膜相同的磷脂双分子层结构以及磷脂的滋润保护作用，提高药物与肺泡细胞的结合率，延长药物体内作用时间来实现的。

更进一步的，所述脂质体的给药方式为雾化吸入给药。

相对于现有技术，本发明创造所述的含笑内酯二甲胺脂质体及其应用具有以下优势：

本发明提供的以PSMC为载体的的含笑内酯二甲胺雾化吸入剂以及其在治疗肺纤维化药物中的应用，是通过PSMC与细胞膜相同的磷脂双分子层结构以及磷脂的滋润保护作用，提高药物与肺泡细胞的结合率，改变药代动力学特点，延长药物体内作用时间，显著提高含笑内酯二甲胺对肺纤维化的治疗效果。

附图说明

构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：

图1、示出了给药后各组小鼠体重的变化情况；

图2、示出了雾化剂对肺纤维化模型肺系数的影响；

图3、示出了给药后第三周小鼠组织切片效果图。

具体实施方式

除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本文中使用的一些术语进行了下述定义。

在说明书和权利要求书中使用的，单数型“一个”和“这个”包括复数参考，除非上下文另有清楚的表述。例如，术语“(一个)细胞”包括复数的细胞，包括其混合物。

所有的数字标识，例如pH、温度、时间、浓度，包括范围，都是近似值。要了解，虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。同时也要了解，虽然不总是明确的叙述，本文中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本领域已知的。

下面结合实施例及附图来详细说明本发明创造。

本发明使用的试验材料及其来源包括：

(1)主要实验试剂

蛋黄卵磷脂：白色或淡黄色粉末状物或块状物，上海太伟药业有限公司，批号20110026.

胆固醇：白色粉末，上海艾韦特医药科技有限公司，生产批号B40333。

乙醇：无色有刺激性气味液体，购自天津市化学试剂供销公司。

ACT001富马酸盐：白色粉末，购自天津尚德药缘科技股份有限公司，批号20131112.

硫酸博来霉素：白色粉末，大连美仑生物技术有限公司，CAS号：9041-93-4，货号MB1039，批号：M0401A，纯度：91％。

(2)仪器耗材

生物安全柜：西班牙泰事达(Telstar)，型号：Bio II A。

CO₂培养箱：施都凯仪器设备(上海)有限公司，型号：STIK IL-161HI。

倒置相差显微镜：厂家：奥林巴斯，型号：CKX41。

旋转蒸发仪：型号SHZ-111，购自上海知信实验仪器技术有限公司。

全自动脱水机：购自德国徕卡公司，型号：ASP200S

石蜡包埋机：购自德国徕卡公司，型号：1150C

切片机：购自德国徕卡公司，型号：RM2245

全自动组织染色机：购自德国徕卡公司，型号：AUT0S TINER XL

全自动组织封片机：购自德国徕卡公司，型号：CV5030

正置荧光显微镜：购自奥林巴斯，型号：BX53

(3)小鼠

昆明小鼠(雄性)：由中国人民解放军军事医学科学院试验动物中心和北京维通利华实验动物技术有限公司提供。动物到达后，由专人接收动物于双走廊屏障环境小鼠饲养室内，填写《试验动物接收记录表》(BG-017-V00)，接收时对动物大体情况进行观察，并随机抽取动物进行称重，确保试验动物与引进标准基本吻合。实验动物使用许可证号：SYXK(津)2012-0003。

(4)细胞系：NIH-3T3细胞，正常小鼠成纤维细胞，购自南京凯基生物科技发展有限公司。

(5)所用药物及试剂的配制方法

a)PBS缓冲液(磷酸缓冲液)的配制：称取NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄1.54g、KH₂PO₄0.2g溶于ddH₂0中，调PH至7.4，定容至1L。需121℃高温灭菌后使用。

b)ACT001溶液的配制：称取ACT001粉末1g，溶于100mL的PBS缓冲液中，配制成10mg/mL溶液，待其充分溶解后，用0.22μm滤器过滤除菌后使用，每次使用时现用现配。溶液的配制及使用均应在无菌生物安全柜中操作。

c)博来霉素溶液的配制：称取0.0100g硫酸博来霉素，溶于10mL生理盐水中，配制成1mg/mL的溶液，用0.22μm的滤膜过滤，溶液的配制及过滤均应在无菌生物安全柜中操作，现用现配。

d)福尔马林固定液的配置:将100mL的甲醛与900mL的PBS缓冲液混匀。

实施例1PSMC的制备

实验方法及步骤：将蛋黄卵磷脂和胆固醇以5:1的比例溶于乙醇中，于旋转蒸发仪上50℃减压蒸发，溶剂蒸干呈均一薄膜。将称取的ACT001溶于PBS中预热至60℃，加入旋好的薄膜里，水化洗膜，探头超声，微孔滤膜过滤得PSMC的ACT001混悬液。

实施例2小鼠肺纤维化模型的建立和ACT001药效学检测

实验方法及步骤：

1、小鼠肺纤维化模型的建立：将25只小鼠随机分为五组，空白组、模型组(肺纤维化模型组)、空白PSMC组(建模后给空白PSMC)、ACT001-PBS组(建模后给含药PBS溶液)、ACT001-PSMC组(建模后给含药PSMC)，每组5只。空白组每只一次性灌胃0.15mL的生理盐水溶液；其它组每只一次性灌肺0.15mL的博来霉素溶液。

2、肺纤维化小鼠的给药治疗：在建模后第二周，给予小鼠药物治疗，空白组和模型组每次用0.1mL的PBS灌肺(模拟临床雾化吸入给药形式)，空白PSMC组每次用0.1mL的空白PSMC溶液灌肺，ACT001-PBS组每次用0.1mL的溶有ACT001的PBS溶液灌肺，ACT001-PSMC组每次用0.1mL的含药PSMC灌肺。给药21天。

3、小鼠肺纤维化的病理检测：在给药后第三周，脱臼处死，取其肺组织，称量小鼠肺重，然后置于福尔马林固定两天，固定后用流水冲洗肺组织表面的固定液，用病理组织脱水机对肺组织进行脱水处理，经石蜡包埋，对包埋组织切片，HE染色，封片后，在显微镜下观察肺组织的变化并进行组织病理学评分，按Szapiel方法评价肺组织纤维化程度。

评分标准如下：0级，无肺间质纤维化；1级，轻度肺间质纤维化，病变范围局限在全肺20％以下；2级，中度肺间质纤维化，病变范围占全肺的20％～50％，肺泡结构紊乱；3级，重度肺间质纤维化，病变范围大于50％，肺泡融合，肺实质结构紊乱。

4.统计学处理

所有数据均经SPSS17.0统计软件进行ANOVA方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

实验结果及评价

1.动物体重变化情况

给药期间小鼠的体重变化情况由图1可知：模型组小鼠体重增长缓慢表明肺纤维化模型造模成功；给药ACT001-PSMC组比给药ACT001-PBS组体重增长明显，表明ACT001PSMC雾化剂剂型的药效比单独使用药物的药效好，提高了药物的利用度；与模型组相比给空PSMC组的小鼠体重也有所增加，说明PSMC中的卵磷脂起到了滋润保护肺泡细胞膜的作用，对肺纤维化有一定的改善作用。

2.肺系数情况

由表1肺系数的数据及图2肺系数变化图可见，模型组的肺系数显著高于空白组，给药PSMC组的肺系数与空白组的肺系数无显著差异。与模型组相比，ACT001-PSMC雾化吸入组的肺系数显著降低，且效果好于单独ACT001雾化吸入组。以上数据表明PSMC雾化剂剂型可以提高药物的利用度，增强药物的药效。

表1药物对小鼠肺系数的影响

注：与空白组相比，#表示P<0.05,##表示P<0.01；与模型组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01。

3.小鼠组织切片效果

给药三周后小鼠的肺组织切片结果如图3所示，由图可知，给药组与模型组相比，给药组的肺纤维化程度明显改善，小鼠的肺部纤维化水平明显降低，肺间质增生增厚的现象好转。病理组织评分结果如表2所示：ACT001PSMC雾化剂剂型的药效比单独使用ACT001雾化的药效好。

表2ACT001对肺纤维化模型组织病理学评分的影响

注：与空白组相比，#表示P<0.05,##表示P<0.01；与模型组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01

以上实施例表明：ACT001-PSMC雾化剂靶向作用于肺部与单独使用ACT001水溶液相比增加药物与肺泡细胞的结合率，改变了药代动力学特点，延长了药物体内作用时间，从而提高了其生物利用度。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于雾化吸入给药的含笑内酯二甲胺脂质体，其特征在于：所述脂质体以类肺表面活性物质作为载体，包含药物有效成分为含笑内酯二甲胺或其药学上可接受的盐水合物或他们的组合；所述脂质体中载体与药物有效成分的重量比为：载体：药物有效成分＝5：1。

2.根据权利要求1所述的一种用于雾化吸入给药的含笑内酯二甲胺脂质体，其特征在于：所述类肺表面活性物质由磷脂及胆固醇组成。

3.根据权利要求2所述的一种用于雾化吸入给药的含笑内酯二甲胺脂质体，其特征在于：所述磷脂包括卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱或他们的组合。

4.权利要求1所述的一种用于雾化吸入给药的含笑内酯二甲胺脂质体，其特征在于：所述脂质体中还包含适宜量的可药用辅料。

5.根据权利要求2所述的一种用于雾化吸入给药的含笑内酯二甲胺脂质体的制备方法，其特征在于：首先将磷脂和胆固醇按照一定比例溶于乙醇中，于旋转蒸发仪上减压蒸发，溶剂蒸干呈均一薄膜；然后将称取的含笑内酯二甲胺溶于PBS缓冲液中预热；将预热后的溶液加入旋好的薄膜里，水化洗膜，探头超声，微孔滤膜过滤得含笑内酯二甲胺脂质体混悬液。

6.权利要求1或3所述的一种用于雾化吸入给药的含笑内酯二甲胺脂质体的用途，其特征在于：所述脂质体是在制备治疗肺纤维化中药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的一种用于雾化吸入给药的含笑内酯二甲胺脂质体的用途，其特征在于：所述含笑内酯二甲胺脂质体的药效是通过类肺表面活性物质与细胞膜相同的磷脂双分子层结构以及磷脂的滋润保护作用，提高药物与肺泡细胞的结合率，延长药物体内作用时间来实现的。