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CN113891728A - 与cd40和fap结合的双特异性抗体 - Google Patents

与cd40和fap结合的双特异性抗体 Download PDF

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CN113891728A
CN113891728A CN202080035990.6A CN202080035990A CN113891728A CN 113891728 A CN113891728 A CN 113891728A CN 202080035990 A CN202080035990 A CN 202080035990A CN 113891728 A CN113891728 A CN 113891728A
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seq
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手冢雄太
长内绫
宇佐美克明
西谷春江
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Kyowa Kirin Co Ltd
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Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
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Abstract

本发明的目的在于提供一种与CD40和FAP结合且显示强FAP依赖性CD40激动剂活性的双特异性抗体或该双特异性抗体片段等。本发明涉及包括包含第一抗原结合结构域的IgG部分和第二抗原结合结构域，并与人CD40和人FAP结合的双特异性抗体或该双特异性抗体片段等，其中，该IgG部分的重链C末端直接或经由接头与该第二抗原结合结构域结合。

Description

与CD40和FAP结合的双特异性抗体
技术领域
本发明涉及包含与CD40结合的抗原结合结构域和与成纤维细胞活化蛋白α(Fibroblast activation protein alpha)(FAP)结合的抗原结合结构域的双特异性抗体或该双特异性抗体片段、编码该双特异性抗体或该双特异性抗体片段的DNA、包含该DNA的载体、生产该双特异性抗体的杂交瘤和转化株、该双特异性抗体或该双特异性抗体片段的制造方法、包含该双特异性抗体或该双特异性抗体片段的治疗和诊断剂、使用该双特异性抗体或该双特异性抗体片段的治疗和诊断方法、以及包含该双特异性抗体的检测或测定用试剂。
背景技术
CD40是被鉴定为表达于人B细胞表面作为抗原的I型的膜型糖蛋白，已知在B淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、上皮细胞和成纤维细胞等多种细胞类型、或肿瘤性的人B细胞等某些种类的肿瘤细胞中也有表达。在 CD40缺陷小鼠中，确认到胸腺依赖性免疫球蛋白的类别转换和胚中心的形成受损，证实了细胞性和体液免疫反应中CD40的重要作用。CD40的信号参与免疫球蛋白的类别转换和细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte 、CTL)的诱导，因此在肿瘤免疫的活化和作为癌症疫苗的佐剂的医药品中的应用也备受期待(非专利文献1)
FAP为85kDa的跨膜糖蛋白，形成二聚体。FAP属于丝氨酸蛋白酶超家族，具有肽酶活性。FAP在胰腺癌、乳腺癌、胃癌等各种癌当中，在肿瘤内浸润的成纤维细胞Cancer-associated fibroblast(CAF)和黑色素瘤等部分癌细胞中高表达。在健康人的正常组织当中，仅在存在于淋巴组织的成纤维细胞和骨髓中的间充质干细胞等一小部分部位表达。着眼于该局限性表达特性，被期待作为癌症分子靶标医药品的靶标分子或诊断标记物、癌症疫苗靶标(非专利文献2)。
现有的以CD40为靶标的抗体，能够列举出Chi-Lob 7/4、HCD-122、 APX005M、SEA-CD40和CP870，893(21.4.1)等(非专利文献3)。其中， CP870，893具有强力的CD40信号诱导能力，对实体瘤实施了以全身性免疫活化作为药效机理的临床试验。但是，无法显示其有效性，而报道了细胞因子释放综合征、血栓标记物的上升、肝功能参数的上升等来自全身性免疫活化的毒性的表现(非专利文献4)。
作为识别CD40的双特异性蛋白质，已知有识别CD28和CD40的多价抗体(专利文献1)。已知有具有异源二聚化的重链的IgG型抗人GPC3/抗小鼠CD40双特异性抗体(专利文献2)。另外，已知与nectin-4、PSMA、EGFR、 HER2和MSLN等癌抗原和CD40结合，使CD40活化的双特异性蛋白质(专利文献3、4)。这些双特异性抗体均具有源自激动性抗CD40抗体的CD40 结合部位。
此外，已知通过对CD40和癌细胞表面抗原具有特异性的Diabody等的双特异性分子，在癌细胞附近使CD40表达细胞活化的方法(专利文献5)。
另外，报道了一种具有源自激动性抗CD40抗体SGN-40的CD40结合部位和FAP结合部分，使FAP依赖性活化CD40的双特异性蛋白质(专利文献6)。已知具有源自锚蛋白重复蛋白的CD40结合模块和FAP结合模块的双特异性蛋白质，诱导FAP特异性CD40信号，活化树突状细胞、B细胞和巨噬细胞(非专利文献5、6)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2009/131239号
专利文献2：国际公开第2015/156268号
专利文献3：国际公开第2017/205738号
专利文献4：国际公开第2018/140831号
专利文献5：国际公开第99/61057号
专利文献6：国际公开第2018/185045号
非专利文献
非专利文献1：Diehl L et al.,Nat Med.1999Jul；5(7):774-9
非专利文献2：Guan-Min Jiang et al.,Oncotarget.2016 May 31； 7(22):33472-82
非专利文献3：Beatty GL et al.,Expert Rev Anticancer Ther.2017 Feb； 17(2):175-186
非专利文献4：Vonderheide RH et al.,Oncoimmunology.2013 Jan 1； 2(1):e23033
非专利文献5：Fiedler U.et al.,AACR Annual Meeting 2018,poster 4552.(April 14-18,2018)
非专利文献6：Rigamonti N.et al.,SITC 33rd Annual Meeting 2018, poster637.(November 9-11,2018)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供与CD40和FAP结合，仅在FAP存在时显示强CD40激动剂活性的双特异性抗体或该双特异性抗体片段、编码该双特异性抗体或该双特异性抗体片段的DNA、包含该DNA的载体、生产该双特异性抗体或该双特异性抗体片段的杂交瘤和转化株、该双特异性抗体或该双特异性抗体片段的制造方法、包含该双特异性抗体或该双特异性抗体片段的治疗和诊断剂、使用该双特异性抗体或该双特异性抗体片段的治疗和诊断方法、以及包含该双特异性抗体或该双特异性抗体片段的检测或测定用试剂等。
解决问题的方法
作为解决上述问题的方法，本发明提供包括包含第一抗原结合结构域的IgG部分和第二抗原结合结构域，并与人CD40和人FAP结合的双特异性抗体或该双特异性抗体片段等，其中，该IgG部分的重链C末端直接或经由接头与该第二抗原结合结构域结合。
即本发明涉及以下内容。
1.一种包括包含第一抗原结合结构域的IgG部分和第二抗原结合结构域，并与人CD40和人成纤维细胞活化蛋白α(FAP)结合的双特异性抗体，其中，该IgG部分的重链C末端直接或经由接头与该第二抗原结合结构域结合。
2.根据上述1所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的任意一方源自非激动性抗CD40抗体。
3.根据上述1或2所述的双特异性抗体，其与人CD40和人FAP分别以二价结合。
4.根据上述1～3中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述IgG部分的重链C末端与所述第二抗原结合结构域直接结合。
5.根据上述1～4中任一项所述的双特异性抗体，其具有CD40激动剂活性。
6.根据上述1～5中任一项所述的双特异性抗体，其中，在没有FAP表达细胞时不显示CD40激动剂活性，仅在有FAP表达细胞时显示CD40激动剂活性。
7.根据上述1～6中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的任意一方为抗CD40 IgG抗体的 Fab(抗CD40 Fab)。
8.根据上述1～7中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的任意一方为抗FAP抗体的Fab(抗 FAP Fab)。
9.根据上述1～8中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域为抗CD40 Fab，所述第二抗原结合结构域为抗FAP Fab。
10.根据上述1～8中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域为抗FAP Fab，所述第二抗原结合结构域为抗CD40 Fab。
11.根据上述7、9或10所述的双特异性抗体，其中，所述抗CD40 Fab 为包括：含有分别包含序列编号24～26所示的氨基酸序列的互补决定区 (CDR)1～3的重链可变区(VH)和含有分别包含序列编号19～21所示的氨基酸序列的CDR1～3的轻链可变区(VL)的Fab。
12.根据上述7和9～11中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述抗 CD40 Fab为包括：含有序列编号23所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号18所示的氨基酸序列的VL的Fab。
13.根据上述8～12中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述抗FAP Fab为包括：含有选自以下的(i)～(v)中的任意一个重链CDR1～3的VH和含有分别包含序列编号19～21所示的氨基酸序列的CDR1～3的VL的Fab，
(i)分别包含序列编号33～35所示的氨基酸序列的重链CDR1～3、
(ii)分别包含序列编号38～40所示的氨基酸序列的重链CDR1～3、
(iii)分别包含序列编号43～45所示的氨基酸序列的重链CDR1～3、
(iv)分别包含序列编号48～50所示的氨基酸序列的重链CDR1～3和
(v)分别包含序列编号53～55所示的氨基酸序列的重链CDR1～3。
14.根据上述8～13中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述抗FAP Fab 为包括：含有包含选自序列编号32、37、42、47、52、75、77、79、81和 83任意一个所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号18所示的氨基酸序列的VL的Fab。
15.根据上述1～14中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述IgG部分含有包含序列编号61所示的氨基酸序列的重链恒定区。
16.根据上述1～9和11～15中任一项所述的双特异性抗体，其中，由包含选自序列编号65、67、69、71、73、85、87、89、91和93任意一个所示的氨基酸序列的两条重链和含有包含序列编号18所示的氨基酸序列的 VL的四条轻链构成。
17.根据上述1～8和10～15中任一项所述的双特异性抗体，其中，由包含选自序列编号95、97、99、101、103、105、107、109和111中的任意一个所示的氨基酸序列的两条重链和含有包含序列编号18所示的氨基酸序列的VL的四条轻链构成。
18.上述1～17中任一项所述的双特异性抗体的双特异性抗体片段。
19.编码上述1～17中任一项所述的双特异性抗体或上述18所述的双特异性抗体片段的DNA。
20.含有上述19所述的DNA的重组体载体。
21.将上述20所述的重组体载体导入至宿主细胞而得到的转化株。
22.一种上述1～17中任一项所述的双特异性抗体或上述18所述的双特异性抗体片段的制造方法，其特征在于，在培养基中培养上述21所述的转化株，使培养物中生产并累积上述1～17中任一项所述的双特异性抗体或上述18所述的双特异性抗体片段，从该培养物采集双特异性抗体或上述18 所述的双特异性抗体片段。
23.一种与CD40和FAP的至少一者有关的疾病的治疗和/或诊断药物，其含有上述1～17中任一项所述的双特异性抗体或上述18所述的双特异性抗体片段作为有效成分。
24.根据上述23所述的治疗和/或诊断药物，其中，与CD40和FAP的至少一者有关的疾病为癌症。
25.一种与CD40和FAP的至少一者有关的疾病的治疗和/或诊断方法，其使用上述1～17中任一项所述的双特异性抗体或上述18所述的双特异性抗体片段。
26.根据上述25所述的方法，其中，与CD40和FAP的至少一者有关的疾病为癌症。
27.根据上述1～17中任一项所述的双特异性抗体或上述18所述的双特异性抗体片段，其用于治疗和/或诊断与CD40和FAP的至少一者有关的疾病。
28.根据上述27所述的双特异性抗体或该双特异性抗体片段，其中，与CD40和FAP的至少一者有关的疾病为癌症。
29.上述1～17中任一项所述的双特异性抗体或上述18所述的双特异性抗体片段在制造与CD40和FAP的至少一者有关的疾病的治疗和/或诊断剂中的应用。
30.根据上述29所述的应用，其中，与CD40和FAP的至少一者有关的疾病为癌症。
31.一种用于检测或测定CD40和FAP的至少一者的试剂，其包含上述 1～17中任一项所述的双特异性抗体或上述18所述的双特异性抗体片段。
32.一种双特异性抗体或该双特异性抗体片段的衍生物，其是使放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、蛋白质或抗体医药通过化学或基因工程学的方法结合到上述1～17中任一项所述的双特异性抗体或上述18所述的双特异性抗体片段得到的。
发明的效果
根据本发明，能够提供与CD40和FAP结合，仅在FAP存在时显示强 CD40激动剂活性的双特异性抗体或该双特异性抗体片段、编码该双特异性抗体或该双特异性抗体片段的DNA、包含该DNA的载体、生产该双特异性抗体或该双特异性抗体片段的杂交瘤和转化株、该双特异性抗体或该双特异性抗体片段的制造方法、包含该双特异性抗体的治疗和诊断剂、使用该双特异性抗体或该双特异性抗体片段的治疗和诊断方法、以及包含该双特异性抗体或该双特异性抗体片段的检测或测定用试剂。
附图说明
图1作为本发明的双特异性抗体的结构的一例，表示一种IgG部分的重链的C末端直接结合Fab的双特异性抗体。
图2表示利用ELISA法评价各种CD40-FAP双特异性抗体对人 FAP-GST的结合的结果。纵轴表示吸光度，表示将各个CD40-FAP双特异性抗体添加10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032或0.00064μg/mL时的结果。比较对象中，使用抗DNP抗体作为阴性对照抗体。
图3的(A)表示利用流式细胞法评价各种CD40-FAP双特异性抗体对 HEK293细胞的结合活性的结果。图3的(B)表示利用流式细胞法评价各种 CD40-FAP双特异性抗体对表达人FAP的HEK293细胞的结合的结果。各图的纵轴表示以平均荧光强度(MFI)所示的结合活性，表示将各个双特异性抗体添加10、1、0.1或0.01μg/mL时的结果。比较对象中，使用抗DNP抗体作为阴性对照抗体。
图4表示R1090S55A的以对Ramos细胞带来的CD95的表达量增加作为指标的CD40信号诱导活性。纵轴表示平均荧光强度(MFI)，表示CD95 的表达量，表示将各个双特异性抗体添加10、1或0.1μg/mL时的结果。比较对象中，使用抗DNP抗体作为阴性对照抗体，使用激动性抗CD40抗体 21.4.1作为阳性对照抗体。
图5的(A)表示各种CD40-FAP双特异性抗体的以对与HEK293共培养的Ramos细胞带来的CD95的表达量增加作为指标的CD40信号诱导活性。图5的(B)表示各种CD40-FAP双特异性抗体的以对与表达人FAP的 HEK293共培养的Ramos细胞带来的CD95的表达量增加作为指标的CD40 信号诱导活性。各图的纵轴表示平均荧光强度(MFI)，表示CD95的表达量，表示将各个双特异性抗体添加10、1、0.1、0.01或0.001μg/mL时的结果。比较对象中，使用抗DNP抗体作为阴性对照抗体，使用激动性抗CD40抗体21.4.1作为阳性对照抗体。
图6的(A)表示各种CD40-FAP双特异性抗体的以对与HEK293共培养的树突状细胞带来的CD83的表达量增加作为指标的CD40信号诱导活性。图6的(B)表示各种CD40-FAP双特异性抗体的以对与表达人FAP的 HEK293共培养的树突状细胞带来的CD83的表达量增加作为指标的CD40 信号诱导活性。各图的纵轴表示平均荧光强度(MFI)，表示CD83的表达量，表示将各个双特异性抗体添加10、1、0.1或0.01μg/mL时的结果。比较对象中，使用抗DNP抗体作为阴性对照抗体，使用激动性抗CD40抗体21.4.1 作为阳性对照抗体。
图7的(A)表示以对与HEK293共培养的树突状细胞的CD80的表达量增加作为指标的各种CD40-FAP双特异性抗体的CD40信号诱导活性。纵轴表示平均荧光强度(MFI)，表示CD80的表达量。图7的(B)表示以对与表达人FAP的HEK293共培养的树突状细胞的CD80的表达量增加作为指标的各种CD40-FAP双特异性抗体的CD40信号诱导活性。各图的纵轴表示荧光强度(MFI)，表示CD80的表达量，表示将各个双特异性抗体添加10、1、 0.1或0.01μg/mL时的结果。比较对象中，作为阴性对照抗体使用抗DNP 抗体，作为阳性对照抗体使用激动性抗CD40抗体21.4.1。
图8的(A)表示各种CD40-FAP双特异性抗体的以对与HEK293共培养的树突状细胞的CD86的表达量增加作为指标的CD40信号诱导活性。图8 的(B)表示各种CD40-FAP双特异性抗体的以对与表达人FAP的HEK293共培养的树突状细胞的CD86的表达量增加作为指标的CD40信号诱导活性。各图的纵轴表示平均荧光强度(MFI)，表示CD86的表达量，表示将各个双特异性抗体添加10、1、0.1或0.01μg/mL时的结果。比较对象中，作为阴性对照抗体使用抗DNP抗体，作为阳性对照抗体使用激动性抗CD40抗体 21.4.1。
图9的(A)表示各种CD40-FAP双特异性抗体的以对与HEK293共培养的树突状细胞的HLA-ABC的表达量增加作为指标的CD40信号诱导活性。图9的(B)表示各种CD40-FAP双特异性抗体的以对与表达人FAP的 HEK293共培养的树突状细胞的HLA-ABC的表达量增加作为指标的CD40 信号诱导活性。各图的纵轴表示平均荧光强度(MFI)，表示HLA-ABC的表达量，表示将各个双特异性抗体添加10、1、0.1或0.01μg/mL时的结果。比较对象中，作为阴性对照抗体使用抗DNP抗体，作为阳性对照抗体使用激动性抗CD40抗体21.4.1。
图10的(A)表示各种CD40-FAP双特异性抗体的以对与HEK293共培养的树突状细胞的IL-12的浓度升高(表达量增加)作为指标的CD40信号诱导活性。图10的(B)表示各种CD40-FAP双特异性抗体的以对与表达人FAP 的HEK293共培养的树突状细胞的IL-12的浓度升高(表达量增加)作为指标的CD40信号诱导活性。各图的纵轴表示IL-12的浓度(pg/mL)，表示将各个双特异性抗体添加10、1、0.1或0.01μg/mL时的结果。比较对象中，作为阴性对照抗体使用抗DNP抗体，作为阳性对照抗体使用激动性抗CD40抗体21.4.1。
图11的(A)表示利用流式细胞法评价各种CD40-FAP双特异性抗体对 HEK293细胞的结合性的结果。图11的(B)表示利用流式细胞法评价各种 CD40-FAP双特异性抗体对表达人FAP的HEK293细胞的的结合性的结果。各图的纵轴表示平均荧光强度(MFI)，作为结合性指标。表示将各个双特异性抗体添加10、1、0.1或0.01μg/mL时的结果。比较对象中，作为阴性对照抗体使用抗DNP抗体。
图12的(A)表示各种CD40-FAP双特异性抗体的以对与HEK293共培养的Ramos细胞的CD95的表达量增加作为指标的CD40信号诱导活性。图 12的(B)表示各种CD40-FAP双特异性抗体的以对与表达人FAP的HEK293 共培养的Ramos细胞的CD95的表达量增加作为指标的CD40信号诱导活性。各图的纵轴表示平均荧光强度(MFI)，表示CD95的表达量，表示将各个双特异性抗体添加10、1、0.1、0.01或0.001μg/mL时的结果。比较对象中，作为阴性对照抗体使用抗DNP抗体，作为阳性对照抗体使用激动性抗 CD40抗体21.4.1。
图13的(A)和图13的(B)表示各种CD40-FAP双特异性抗体的以对与 FAP阳性细胞株共培养的Ramos细胞的CD95的表达量增加作为指标的 CD40信号诱导活性。作为FAP阳性细胞株，图13的(A)中使用了成纤维细胞株IMR90，图13的(B)中使用了黑色素瘤細胞株RPMI7951。各图的纵轴表示平均荧光强度(MFI)，表示CD95的表达量，表示将各个双特异性抗体添加10、1、0.1、0.01或0.001μg/mL时的结果。比较对象中，作为阴性对照抗体使用抗DNP抗体，作为阳性对照抗体使用激动性抗CD40抗体 21.4.1。
图14的(A)和图14的(B)表示对与固相化FAP的珠粒共培养的Ramos 细胞的各种CD40-FAP双特异性抗体的CD40信号诱导活性。图14的(A) 和图14的(B)分别以CD83和CD95的表达量增加为信号诱导活性的指标。各图的纵轴表示平均荧光强度(MFI)，表示CD83或者CD95的表达量，各图的横轴表示对阴性对照抗体的抗DNP抗体的抗FAP抗体的相对荧光强度(RFI)，表示共培养的各珠粒上的FAP的表达量，表示将各个双特异性抗体添加1μg/mL时的结果。比较对象中，作为阴性对照抗体使用抗DNP抗体，作为阳性对照抗体使用激动性抗CD40抗体21.4.1。
图15表示各种CD40-FAP双特异性抗体的以对与成纤维细胞株 SC00A05共培养的Ramos细胞的CD83的表达量增加作为指标的CD40信号诱导活性。图的纵轴表示平均荧光强度(MFI)，表示CD83的表达量，表示将各个双特异性抗体添加10、1、0.1、或0.01μg/mL时的结果。比较对象中，作为阴性对照抗体使用抗DNP抗体，作为阳性对照抗体使用激动性抗 CD40抗体21.4.1。
图16的(A)～(C)表示对与成纤维细胞株SC00A05共培养的树突状细胞的各种CD40-FAP双特异性抗体的CD40信号诱导活性。图16的(A)～(C)中，分别以CD83、CD86和HLA-ABC的表达量增加为CD40信号诱导活性的指标。各图的纵轴表示平均荧光强度(MFI)，分别表示CD83、CD86和 HLA-ABC的表达量，表示将各个双特异性抗体添加10、1、0.1或0.01μg/mL时的结果。比较对象中，作为阴性对照抗体使用抗DNP抗体，作为阳性对照抗体使用激动性抗CD40抗体21.4.1。
图17的(A)和图17的(B)表示对在添加交联抗体条件下的Ramos细胞的各种CD40-FAP双特异性抗体的FAP表达细胞非依赖性的CD40信号诱导活性。图17的(A)和图17的(B)分别以CD83和CD95的表达量增加为CD40 信号诱导活性的指标。各图的纵轴表示平均荧光强度(MFI)，表示CD83或者CD95的表达量，表示将各个双特异性抗体添加0.1、0.01或0.001μg/mL 时的结果。比较对象中，作为阴性对照抗体使用抗DNP抗体。
发明的具体实施方式
本发明涉及与人CD40和人FAP特异性结合的双特异性抗体(以下，记载为本发明的双特异性抗体)。
本发明中的CD40以与TNF receptor superfamily member 5(TNFRSF5)、Bp50、CDW40、MGC9013和p50相同的含义使用。作为CD40，例如可以列举：包含NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中GenBank Accession No.NP_001241或序列编号6所示的氨基酸序列的人CD40、以及包含 GenBank Accession No.XP_005569274或序列编号8所示的氨基酸序列的猴 CD40等。另外，例如可以列举由序列编号6、GenBank Accession No.NP＿001241、GenBank Accession No.XP＿005569274或序列编号8所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成且具有CD40 的功能的多肽。
包含与序列编号6、GenBank Accession No.NP＿001241、GenBank AccessionNo.XP＿005569274或序列编号8所示的氨基酸序列通常具有70％以上、优选为80％以上、更加优选为90％以上的同源性的氨基酸序列的多肽、由最优选具有95％、96％、97％、98％和99％以上的同源性的氨基酸序列构成且具有CD40的功能的多肽也包括在本发明的CD40中。
具有序列编号6、GenBank Accession No.NP_001241、GenBank Accession No.XP_005569274或序列编号8所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1 个以上的氨基酸残基的氨基酸序列的多肽能够通过使用定点突变导入法 [Molecular Cloning,A LaboratoryManual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley& Sons(1987-1997)、Nucleic AcidsResearch,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad. Sci.USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13, 4431(1985)、Proceeding of the NationalAcademy of Sciences in USA,82,488 (1985)]等，例如在编码序列编号6、GenBankAccession No.NP_001241、 GenBank Accession No.XP_005569274或序列编号8所示的氨基酸序列的 DNA中导入定点突变而得到。缺失、取代或添加的氨基酸的数量没有特别限定，优选为1个～数十个，例如为1～20个，更优选为1个～数个，例如为 1～5个氨基酸。
作为编码CD40的基因，例如可以列举：序列编号5或GenBank Accession No.NM＿001250所示的人CD40的碱基序列和序列编号7或 GenBank Accession No.XM_011766922所示的猴CD40的碱基序列等。另外，例如包含由序列编号5、GenBank Accession No.NM＿001250、序列编号7 或GenBank Accession No.XM_011766922所示的碱基序列中缺失、取代或添加1个以上的碱基的碱基序列构成且编码具有CD40的功能的多肽的DNA 的基因，包含由与序列编号5、GenBank Accession No.NM＿001250、序列编号7或GenBank AccessionNo.XM_011766922所示的碱基序列优选具有 60％以上的同源性的碱基序列、更优选具有80％以上的同源性的碱基序列、更加优选具有95％以上的同源性的碱基序列构成且编码具有CD40的功能的多肽的DNA的基因，以及包含由与由序列编号5、GenBank AccessionNo.NM＿001250、序列编号7或GenBank Accession No.XM_011766922所示的碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交的DNA构成且编码具有CD40 的功能的多肽的DNA的基因等也包括在本发明的编码CD40的基因中。
作为在严格条件下杂交的DNA，例如是指通过将具有序列编号5、 GenBankAccession No.NM＿001250、序列编号7或GenBank Accession No.XM_011766922所示的碱基序列的DNA用于探针的菌落杂交法、噬菌斑杂交法、Southern印迹杂交法、或DNA微阵列法等获得的能够杂交的DNA。具体而言，能够列举可以如下鉴定的DNA：通过使用固定有源自杂交的菌落或噬菌斑的DNA、或具有该碱基序列的PCR产物或寡聚DNA的滤片或载玻片，在0.7～1.0mol/L的氯化钠存在下，在65℃进行杂交[Molecular Cloning,A LaboratoryManual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1:CoreTechniques,A Practical Approach,Second Edition,Oxford University(1995)]后，使用0.1～2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成包含150mmol/L氯化钠、15mmol/L柠檬酸钠)，在65℃条件下清洗滤片或载玻片，由此能够鉴定的DNA。作为能够杂交的DNA，例如能够列举：与序列编号5、GenBank Accession No.NM＿001250、序列编号7或GenBankAccession No.XM_011766922所示的碱基序列优选具有 60％以上的同源性的DNA、更优选具有80％以上的同源性的DNA、更加优选具有95％以上的同源性的DNA。
在编码真核生物的蛋白质的基因的碱基序列中经常见到基因多态性。本发明中使用的基因内因这样的多态性而在碱基序列中产生了小规模的变异的基因也包括在本发明的编码CD40的基因中。
除了特别说明的情况以外，本发明中的同源性的数值可以为本领域技术人员使用公知的同源性检索程序算出的数值，关于碱基序列，可以列举BLAST[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]中使用默认参数算出的数值等，关于氨基酸序列，可以列举BLAST2[Nucleic AcidsResearch,25,3389(1997)、 Genome Research,7,649(1997)、 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]中使用默认参数算出的数值等。
作为默认参数，G(Cost to open gap)在碱基序列的情况下为5，在氨基酸序列的情况下为11，-E(Cost to extend gap)在碱基序列的情况下为2，在氨基酸序列的情况下为1，-q(Penalty for nucleotide mismatch)为-3、-r(reward for nucleotide match)为1，-e(expect value)为10，-W(wordsize)在碱基序列的情况下为11个残基，在氨基酸序列的情况下为3个残基，-y[Dropoff(X)for blast extensions in bits]在blastn的情况下为20，在blastn以外的程序时为7，-X(X dropoff value for gapped alignment in bits)为15，以及-Z(final X dropoff value for gapped alignment in bits)在blastn的情况下为50，在blastn以外的程序时为25(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
由CD40的氨基酸序列的部分序列构成的多肽能够通过本领域技术人员公知的方法来制作，例如，能够通过使编码序列编号6、GenBank Accession No.NP＿001241、GenBankAccession No.XP＿005569274或序列编号8所示的氨基酸序列的DNA的一部分缺失，培养导入了包含其的表达载体的转化体来制作。另外，能够根据利用上述的方法制作的多肽或DNA，通过与上述同样的方法，获得例如具有序列编号6、GenBank Accession No.NP＿001241、GenBank Accession No.XP＿005569274或序列编号8所示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列的多肽。进而，由CD40的氨基酸序列的部分序列构成的多肽、或具有CD40 的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列的多肽也能够通过芴基甲氧基羰基(Fmoc)法、叔丁基氧基羰基(tBoc) 法等化学合成法制造。
作为本发明中的CD40的细胞外区域，例如可以列举：对GenBank AccessionNo.NP＿001241所示的人CD40的氨基酸序列使用公知的跨膜区域预测程序SOSUI(http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html)、 TMHMM ver.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)或ExPASy Proteomics Server(http://Ca.expasy.org/)等所预测的区域等。具体而言，可以列举序列编号6或GenBank AccessionNo.NP＿001241的第21位～第194位所示的氨基酸序列、序列编号2所示的氨基酸序列。
作为CD40的功能，可以列举CD40配体或激动剂结合时诱导CD40信号，引起各种作用。例如，如果对癌细胞诱导CD40信号，则会引起该癌细胞的细胞死亡或增殖抑制等。如果对B淋巴细胞诱导CD40信号，则例如诱发该B淋巴细胞的活化、CD95的表达促进、类别转换重组和体细胞高频突变(somatic hypermutation)等，诱导抗原高亲和性抗体产生等。如果对树突状细胞诱导CD40信号，例如会引起该树突状细胞的成熟化或IL-12产生。如果对巨噬细胞诱导CD40信号，则例如会引起M2巨噬细胞的表面标记物的减少和M1巨噬细胞的表面标记物的表达的诱导或pro-inflammatory细胞因子产生。
CD40信号是指通过CD40传导至细胞内的信号。
本发明中的FAP以与FAPA、SIMP、DPPIV、FAPalpha、Separase相同含义使用。
作为FAP，例如可以列举：包含GenBank Accession No.NP_004451或序列编号14所示的氨基酸序列的人FAP或包含GenBank Accession No.NP ＿032012或序列编号16所示的氨基酸序列的小鼠FAP等。另外，例如可以列举：由序列编号14或16、GenBank AccessionNo.NP_004451或GenBank Accession No.NP＿032012所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成且具有FAP的功能的多肽。
包含与序列编号14或16、GenBank Accession No.NP_004451或GenBankAccession No.NP＿032012所示的氨基酸序列具有优选70％以上、更优选为 80％以上、更加优选为90％以上的同源性的氨基酸序列的多肽、最优选由具有95％、96％、97％、98％和99％以上的同源性的氨基酸序列构成且具有FAP 的功能的多肽也包括在本发明的FAP中。
具有序列编号14或16、GenBank Accession No.NP_004451或GenBank AccessionNo.NP＿032012所示的氨基酸序列中缺失、取代、或添加了1个以上的氨基酸残基的氨基酸序列的多肽能够通过使用上述定点突变导入法等，在编码例如序列编号14或16、GenBankAccession No.NP_004451或GenBank Accession No.NP＿032012所示的氨基酸序列的DNA中导入定点突变而获得。缺失、取代或添加的氨基酸的数量没有特别限定，优选为1 个～数十个，例如为1～20个，更优选为1个～数个，例如为1～5个氨基酸。
作为本发明中的编码FAP的基因，例如可以列举包含Genbank Accession No.NM＿004460或序列编号13所示的碱基序列的人FAP的基因；或者包含Genbank AccessionNo.NM＿007986或序列编号15所示的碱基序列的小鼠FAP的基因。
另外，例如包含由序列编号13或15、Genbank Accession No.NM＿ 004460或Genbank Accession No.NM＿007986所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个以上的碱基的碱基序列构成且编码具有FAP的功能的多肽的DNA的基因，包含由与序列编号13或15、Genbank Accession No.NM＿ 004460或Genbank Accession No.NM＿007986所示的碱基序列具有60％以上的同源性的碱基序列、优选具有80％以上的同源性的碱基序列、更加优选具有95％以上的同源性的碱基序列构成且编码具有FAP的功能的多肽的 DNA的基因，以及包含由与序列编号13或15、Genbank Accession No.NM ＿004460或Genbank AccessionNo.NM＿007986所示的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA构成且编码具有FAP的功能的多肽的DNA的基因等也包括在本发明的编码FAP的基因中。
作为本发明中的FAP的细胞外区域，例如可以列举对GenBank Accession No.NP＿004451所示的人FAP的氨基酸序列使用公知的跨膜区域预测程序SOSUI(http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html)、 TMHMM ver.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)或ExPASy Proteomics Server(http://Ca.expasy.org/)等所预测出的区域等。具体而言，可以列举序列编号14或GenBankAccession No.NP＿004451的第27位～第760 位所示的氨基酸序列、序列编号10所示的氨基酸序列。
作为FAP的功能，例如可以列举：该分子所具有的蛋白酶活性产生的细胞外基质的重建等。
抗体是指源自编码构成免疫球蛋白的重链的可变区和重链的恒定区、以及编码轻链的可变区和轻链的恒定区的全部或一部分的基因(称为“抗体基因”)的蛋白质。本发明的抗体也包括具有任意免疫球蛋白类和亚类的抗体或抗体片段。
重链(H链)是指构成免疫球蛋白分子的2种多肽中分子量较大的多肽。重链决定抗体的类和亚类。IgA、IgD、IgE、IgG和IgM分别具有α链、δ链、ε链、γ链和μ链作为重链，重链的恒定区的特征在于不同的氨基酸序列。轻链(L链)是指构成免疫球蛋白分子的2种多肽中分子量较小的多肽。人的抗体的情况下，轻链存在κ链和λ链这2种。
可变区(V区)通常是指在免疫球蛋白的N末端侧的氨基酸序列内存在的富于多样性的区域。可变区以外的部分采取多样性较少的结构，因此被称为恒定区(C区)。重链和轻链的各可变区缔合而形成抗原结合部位，决定抗体向抗原的结合特性。以下，将重链可变区或轻链可变区简记作VH或 VL。
抗原结合部位是指抗体中识别抗原并与其结合的部位，且是与抗原决定基(表位)形成互补的立体结构的部位。抗原结合部位在与抗原决定基之间产生较强的分子间相互作用。抗原结合部位由包含至少3个互补决定区 (CDR)的VH和VL构成。人的抗体的情况下，VH和VL分别具有3个CDR。这些CDR分别从N末端侧起依次称为CDR1、CDR2和CDR3。
恒定区中，重链恒定区或轻链恒定区分别记作CH或CL。CH根据作为重链的亚类的α链、δ链、ε链、γ链和μ链分类。CH由从N末端侧起依次排列的CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域构成，将CH2 结构域和CH3结构域一并称为Fc区。另一方面，CL被分类为被称为Cλ链和Cκ链的2个亚类。
在人的IgG的情况下，重链中，可变区相当于Kabat等的EU索引 (Kabat et al.,Sequences of proteins of immunological interest,1991Fifth edition) 中的第1位至第117位的氨基酸序列，恒定区相当于第118位以后的氨基酸序列。人的抗体的轻链中，可变区相当于Kabat等编号系统(Kabat numbering)中的第1位至第107位的氨基酸序列，恒定区相当于第108位以后的氨基酸序列。
在人的IgG的情况下，CH1是指具有EU索引所示的第118位至第215 位的氨基酸序列的区域。同样地，CH2是指具有Kabat等的EU索引所示的第231位至第340位的氨基酸序列的区域，CH3是指具有Kabat等的EU索引所示的第341位至第447位的氨基酸序列的区域。在CH1与CH2之间存在被称为铰链(hinge)区(以下有时也记作铰链)的富于柔软性的氨基酸区域。铰链区是指具有Kabat等的EU索引所示的第216位至第230位的氨基酸序列的区域。
在人的抗体的κ链的情况下，CL是指具有Kabat numbering所示的第 108位至第214位的氨基酸序列的区域，在λ链的情况下，CL是指具有第 108位至第215位的氨基酸序列的区域。
单克隆抗体是保持有单一性(monoclonality)的抗体产生细胞所分泌的抗体，识别单一的表位(也称为抗原决定基)。单克隆抗体分子彼此具有同一氨基酸序列(1级结构)，呈单一的结构。多克隆抗体是指不同克隆的抗体产生细胞所分泌的抗体分子的群。寡克隆抗体是指混合多种不同的单克隆抗体的抗体分子的群。
表位是指抗体识别并结合的抗原的结构部位。作为表位，例如可以列举：单克隆抗体识别并结合的单一的氨基酸序列、由氨基酸序列构成的立体结构、糖链结合的氨基酸序列和由糖链结合的氨基酸序列构成的立体结构等。
作为本发明中的单克隆抗体，能够列举：由杂交瘤产生的抗体、以及通过由包含抗体基因的表达载体转化得到的转化体所产生的基因重组抗体。
杂交瘤例如能够通过制备抗原，从用该抗原免疫的动物获取具有抗原特异性的抗体产生细胞，进而使该抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合来制备。能够通过培养该杂交瘤、或者将该杂交瘤向动物投予使该杂交瘤腹水癌化，将该培养液或腹水分离、纯化，由此取得所需的单克隆抗体。作为用抗原免疫的动物，只要能够制作杂交瘤，则可以使用任何动物，优选使用小鼠、大鼠、仓鼠和兔等。另外，也能够从这样的被免疫动物取得具有抗体产生能力的细胞，对该细胞在in vitro(体外)实施免疫后，与骨髓瘤细胞融合，从而制作杂交瘤。
作为本发明中的基因重组抗体，例如可以列举：重组小鼠抗体、重组大鼠抗体、重组仓鼠抗体、重组兔抗体、人型嵌合抗体(也称为嵌合抗体)、人源化抗体(也称为CDR移植抗体)和人抗体等通过基因重组技术制造的抗体。在基因重组抗体中，可以根据作为对象的动物种类或目的，确定适用源自哪种动物的重链和轻链的可变区和恒定区。例如，在作为对象的动物种类为人的情况下，能够使可变区源自人或小鼠等的非人动物，使恒定区和接头源自人。
嵌合抗体是指由人以外的动物(非人动物)的抗体的VH和VL与人抗体的CH和CL构成的抗体。作为非人动物，只要能够制作杂交瘤，则可以使用小鼠、大鼠、仓鼠和兔等任何动物。嵌合抗体能够通过如下方式制造：从生成单克隆抗体的源自非人动物的杂交瘤取得编码VH和VL的cDNA，分别插入至具有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体，构建嵌合抗体表达载体，并导入至动物细胞使其表达。
人源化抗体是指将非人动物抗体的VH和VL的CDR移植到人抗体的 VH和VL的对应CDR而成的抗体。VH和VL的CDR以外的区域被称为框架区(以下记作FR)。人源化抗体能够通过如下方式制造：构建编码由非人动物抗体的VH的CDR的氨基酸序列和任意的人抗体的VH的FR的氨基酸序列构成的VH的氨基酸序列的cDNA、和编码由非人动物抗体的VL 的CDR的氨基酸序列和任意的人抗体的VL的FR的氨基酸序列构成的VL 的氨基酸序列的cDNA，将其分别导入具有编码人抗体的CH和CL的DNA 的动物细胞用表达载体中，构建人源化抗体表达载体，将其导入动物细胞使其表达。
人抗体原本是指在人体内天然存在的抗体，但也包括从人抗体噬菌体文库和人抗体产生转基因动物中得到的抗体等，该人抗体噬菌体文库和人抗体产生转基因动物是由于近来基因工程、细胞工程、发育工程技术的进步而制得的。
在人体内天然存在的抗体例如能够通过如下方式获得：通过使人末梢血淋巴细胞感染EB病毒等而永生化并进行克隆，从而培养产生该抗体的淋巴细胞，由该培养上清纯化该抗体。
人抗体噬菌体文库是通过将由人B细胞制备的抗体基因插入噬菌体基因，而使Fab、scFv等抗体片段在噬菌体表面表达的文库。能够以对固定有抗原的基质的结合性为指标，从该文库中回收表面表达有具有所需的抗原结合性的抗体片段的噬菌体。该抗体片段能够进一步通过基因工程方法转换成由2条完整的H链和2条完整的L链构成的人抗体分子。
人抗体产生转基因动物是指细胞内整合有人抗体基因的动物。具体而言，例如能够通过向小鼠ES细胞导入人抗体基因，将该ES细胞移植到小鼠的早期胚胎后，使个体发育，从而制作产生人抗体的转基因小鼠。源自产生人抗体的转基因动物的人抗体能够通过如下方式制备：通过使用通常的非人动物所进行的杂交瘤制作法取得杂交瘤，进行培养，在培养上清中产生、累积抗体。
在本发明中，抗CD40抗体是指特异性识别并结合CD40的细胞外区域的单克隆抗体。另外，在本发明中，抗FAP抗体是指特异性识别并结合FAP 的细胞外区域的单克隆抗体。
在本发明中，双特异性抗体是指与两种表位分别特异性结合的抗体。本发明的双特异性抗体包括包含第一抗原结合结构域的IgG部分和第二抗原结合结构域，具有该IgG部分的重链C末端直接或经由接头与该第二抗原结合结构域结合的结构。
在本发明中，IgG部分是指由对IgG或Fc部分进行了改变的IgG构成的双特异性抗体的部分结构，具有2个由1条轻链和1条重链构成的异源二聚体缔合而成的异源四聚体结构。
所述IgG的重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的任何亚类。另外，也可以将这些氨基酸序列的一部分缺失、添加、取代和/或插入。另外，也可以将由IgG的重链的CH1、铰链、CH2和CH3构成的氨基酸序列的全部或将一部分片段适当组合使用。另外，也可以将这些氨基酸序列部分缺损、或改变顺序来使用。另外，IgG部分中所使用的IgG的亚类没有特别限定，优选为IgG4、将IgG4的重链恒定区的第228位的Ser残基取代成 Pro、将第235位的Leu残基取代成Asn的IgG4突变体(以下也记作IgG4PE)、或将IgG4的重链恒定区的第228位的Ser残基取代成Pro、将第235位的 Leu残基取代成Asn、且将第409位的Arg残基取代成Lys的IgG4突变体(以下记作IgG4PE R409K)。
例如，重链的恒定区(从N末端侧起依次为CH1-铰链-CH2-CH3)优选为由包含序列编号61所示的氨基酸序列的IgG4PE R409K构成的IgG部分。
在本发明中，抗原结合结构域是指具有特异性识别并结合抗原的功能的部分结构。作为抗原结合结构域，例如可以列举，利用抗体或该抗体片段、配体或受体等具有对抗原结合能力的蛋白质的重组蛋白质或多肽。
在本发明中，例如能够通过使用公知的免疫学检测法、优选荧光细胞染色法等测定想要评价的表达CD40或FAP细胞与重组蛋白质、多肽、抗体或该抗体片段或者双特异性抗体的结合性这一方法来确认重组蛋白质、多肽、抗体或该抗体片段或者双特异性抗体等与CD40或FAP的任意1个结合。另外，也可以组合使用公知的免疫学检测法[MonoclonalAntibodies- Principles and Practice,Third Edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、单克隆抗体实验手册、讲谈社Scientific(1987)]等。
在本发明的双特异性抗体中，第一抗原结合结构域为构成IgG部分的一部分的部分结构。另外，第二抗原结合结构域为直接或经由接头结合于 IgG部分的重链C末端的部分结构。第一和第二抗原结合结构域的任意一方与CD40结合，另一方与FAP结合。本发明的双特异性抗体中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域分别与CD40和FAP结合后称为CD40-FAP双特异性抗体。另外，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域分别与FAP和CD40结合后称为FAP-CD40双特异性抗体。
本发明的双特异性抗体可以为CD40-FAP双特异性抗体、FAP-CD40双特异性抗体的任意其一，但优选为CD40-FAP双特异性抗体。
在本发明中，与FAP结合的抗原结合结构域只要为分别特异性识别 FAP并与之结合的结构域，则可以为任意的结构域。例如，与FAP结合的抗原结合结构域可以为抗FAP抗体、FAP配体和天然存在的相互作用分子等能够通过基因重组技术制作的多肽、蛋白质分子及其片段、以及该蛋白质分子的与低分子或天然物的缀合体等任意形态。
作为与FAP结合的抗原结合结构域的具体例子，可以列举包含抗FAP 抗体的CDR的多肽、抗FAP抗体的抗体片段、包含抗FAP抗体的可变区的多肽或包含与FAP结合的配体的结合结构域的多肽等。作为与FAP结合的抗原结合结构域，优选为包含抗FAP抗体的可变区的多肽，更加优选为抗FAP抗体的Fab。也将抗FAP抗体的Fab称作抗FAP Fab。
在本发明中，与CD40结合的抗原结合结构域只要为分别特异性识别 CD40并与之结合的结构域，则可以为任意的结构域。
作为与CD40结合的抗原结合结构域的具体例子，可以列举包含抗 CD40抗体的CDR的多肽、抗CD40抗体的抗体片段、包含抗CD40抗体的可变区的多肽或包含与CD40结合的配体的结合结构域的多肽等。作为与 CD40结合的抗原结合结构域，优选为包含抗CD40抗体的可变区的多肽，更加优选为抗CD40抗体的Fab。也将抗CD40抗体的Fab称作抗CD40 Fab。
在本发明中，作为与CD40结合的抗原结合结构域的具体例子，可以列举源自非激动性抗CD40抗体、分别特异性识别CD40并与之结合的抗原结合结构域。
非激动性抗CD40抗体是指特异性识别CD40并与之结合但并不具有激动剂活性的抗体。
作为源自非激动性抗CD40抗体，与CD40结合的抗原结合结构域，例如可以列举包含非激动性抗CD40抗体的CDR的多肽、非激动性抗CD40 抗体的抗体片段、包含非激动性抗CD40抗体的可变区的多肽等。
作为对CD40的抗原结合结构域，在使用非激动性抗CD40抗体的情况下，优选为包含非激动性抗CD40抗体的可变区的多肽，更加优选为非激动性抗CD40抗体的Fab。
在本发明的双特异性抗体中，在第二抗原结合结构域为Fab的情况下， IgG部分的重链C末端可以直接或经由接头与该Fab的重链N末端结合，还可以与轻链N末端结合，但优选与该Fab的重链N末端结合。
在本发明的双特异性抗体中，IgG部分的重链的C末端与第二抗原结合结构域可以直接结合，也可以经由接头结合。在本发明中，接头是指使IgG 部分的重链的C末端与第二抗原结合结构域结合的化学结构，优选为多肽。作为接头，例如可以列举单链肽，作为具体的例子，可以列举氨基酸序列由ES、ESKYG、ESKYGPP、GGGGS或GGGGS的重复序列构成的单链肽。
本发明的双特异性抗体，具有例如图1所示结构，即从N末端侧依次结合VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-VH2-CH1而成的2条多肽链(也称为双特异性抗体的重链)和从N末端侧结合VL-CL而成的4条多肽链(也称为双特异性抗体的轻链)。其中，VH1表示重链的N末端侧的VH，VH2表示C末端侧的VH。
双特异性抗体的2条重链经由铰链区的半胱氨酸残基进行二硫键结合而缔合。双特异性抗体的重链和轻链经由CH1和CL的半胱氨酸残基进行二硫键结合而缔合。双特异性抗体的2条重链可以相同也可以不同，优选相同。另外，双特异性抗体的4条轻链，可以互相不同也可以相同，优选4 条都相同。另外，CL可以为Cλ链和Cκ链的任一种。
作为本发明的双特异性抗体，例如可以列举具有CD40激动剂活性的双特异性抗体。作为本发明的双特异性抗体，优选在没有FAP分子或表达FAP 的细胞(也称为FAP表达细胞)时不显示CD40激动剂活性，仅在有FAP分子或表达FAP的细胞时显示CD40激动剂活性的双特异性抗体。这样的双特异性抗体由于仅在表达FAP的细胞存在的癌等的病变部或淋巴结活化 CD40，所以在不产生伴随全身性的CD40的活化的副作用的方面为优选。
在人当中，作为表达FAP的细胞，可以列举肿瘤局部和淋巴结局部的成纤维细胞或肿瘤细胞等。
本发明的双特异性抗体所具有的CD40激动剂活性是指通过双特异性抗体与细胞上的CD40结合，而引发通过该CD40的信号，诱导抗原提呈细胞的活化的活性、诱导肿瘤细胞的细胞死亡的活性等。
在本发明中，抗体或双特异性抗体有无CD40激动剂活性，例如能够通过以Lagresle et al.,J Immunol 1995；154:5746-5756中所述的方法为标准评价B细胞或人伯基特淋巴瘤细胞Ramos细胞(JCRB细胞库，细胞编号： JCRB9119)等的表达CD40的细胞上的CD95、C80、CD83、CD86、和/或 HLA-ABC的表达量增加来确认。
在本发明中，抗体或双特异性抗体结合到表达CD40的细胞上时，对比阴性对照，若CD95、CD80、CD83、CD86和/或HLA-ABC等的表达量增加，则判定该抗体或该双特异性抗体具有激动剂活性。另一方面，抗体或双特异性抗体结合到表达CD40的细胞上时，对比阴性对照，若CD95、 CD80、CD83、CD86和/或HLA-ABC等的表达量没有增加，则判定该抗体或该双特异性抗体不具有激动剂活性。
作为本发明的双特异性抗体，具体可以列举在存在表达FAP的细胞下，并与FAP和CD40结合时，诱导表达CD40的抗原提呈细胞的活化和/或肿瘤细胞的细胞死亡的双特异性抗体等。
在本发明中，CD40拮抗剂活性是指利用CD40配体或CD40激动剂抑制CD40的活化的活性等。例如是指抑制通过CD40配体或CD40激动剂与 CD40结合的信号诱导的活性等。
与CD40结合但不具有CD40拮抗剂活性的抗体称为非拮抗性抗CD40 抗体。
抗体的CD40拮抗剂活性例如能够通过利用CD40配体诱导的Ramos 细胞等表达CD40的细胞上的CD95表达因添加抗体而被抑制来确认。
本发明的双特异性抗体可以与在同一细胞上表达的CD40和FAP结合，也可以与在两个不同细胞上表达的CD40和FAP结合。
在本发明中，将一分子的双特异性抗体所具有的对某个抗原的结合结构域的数量称为结合价数。例如，在本发明中，在一分子的双特异性抗体各具有两个与CD40结合的抗原结合结构域和与FAP结合的抗原结合结构域的情况下，这样的双特异性抗体与CD40和FAP分别以二价结合。
本发明的双特异性抗体能够通过现有的制作技术([Nature Protocols,9,2450-2463(2014)]、国际公开第1998/050431号、国际公开第 2001/7734号、国际公开第2002/002773号和国际公开第2009/131239号)等制作。
本发明的双特异性抗体，可以在IgG部分包含的2条重链各自的C末端分别具有1个第二抗原结合结构域，也可以只在1条重链的C末端具有1 个，但优选在2条重链各自的C末端分别具有1个。在2条重链各自的C 末端分别具有1个第二抗原结合结构域的情况下，它们可以相同也可以不同，但优选为同一第二抗原结合结构域。
在构成本发明的双特异性抗体的氨基酸序列中，缺失、添加、取代或插入有1个以上的氨基酸残基，且具有与上述的双特异性抗体同样活性的双特异性抗体也包括在本发明的双特异性抗体中。
缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸的数量为1个以上，其数量没有特别限定，为通过Molecular Cloning,The Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley& Sons(1987-1997)、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad. Sci.,USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13, 4431(1985)、Proc.Natl.Acad.SciUSA,82,488(1985)等所记载的定点突变导入法等公知的技术而能够缺失、取代、插入或添加的程度的数量。例如通常为1～数十个，优选为1～20个，更优选为1～10个，更加优选为1～5个。
在上述的本发明的双特异性抗体的氨基酸序列中，缺失、取代、插入或添加1个以上的氨基酸残基表示如下。意味着在同一序列中的任意且1 个或多个氨基酸序列中有1个或多个氨基酸残基的缺失、取代、插入或添加。另外，也有同时产生缺失、取代、插入或添加的情况，也有取代、插入或添加的氨基酸残基为天然型和非天然型的任意一种的情况。
作为天然型氨基酸残基，例如可以列举：L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L- 天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L- 亮氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和L-半胱氨酸等。
以下示出能够互换的氨基酸残基的优选例。同一组中包含的氨基酸残基能够互换。
A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2- 氨基丁酸、甲硫氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸
B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2- 氨基辛二酸
C组：天冬酰胺、谷氨酰胺
D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸 E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸
F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸
G组：苯丙氨酸、酪氨酸
本发明的双特异性抗体也包括包含经翻译后修饰的任何氨基酸残基的抗体。作为翻译后修饰，例如可以列举多肽的N末端上的谷氨酰胺残基取代为焦谷氨酰胺(pyroGlu)等[Beck et al,Analytical Chemistry,85, 715-736(2013)]。
作为本发明的双特异性抗体，例如还可以列举：第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的任意一方为源自非激动性抗CD40抗体的抗CD40 Fab的双特异性抗体，第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的任意一方为抗FAP Fab的双特异性抗体。
另外，作为本发明的双特异性抗体，例如可以列举：第一抗原结合结构域为抗CD40Fab，所述第二抗原结合结构域为抗FAP Fab的双特异性抗体，第一抗原结合结构域为抗FAPFab，第二抗原结合结构域为抗CD40 Fab 的双特异性抗体。
作为本发明的双特异性抗体，具体而言，例如可以列举下述(1)～(4)所述的双特异性抗体等。
(1)包含源自抗CD40抗体的抗CD40 Fab的IgG部分的重链的C末端直接与抗FAPFab结合而成的与人CD40和人FAP结合的双特异性抗体。
(2)包含抗FAP Fab的IgG部分的重链的C末端直接与源自抗CD40抗体的抗CD40Fab结合而成的与人CD40和人FAP结合的双特异性抗体。
(3)包含源自非激动性抗CD40抗体的抗CD40 Fab的IgG部分的重链的 C末端直接与抗FAP Fab结合而成的与人CD40和人FAP结合的双特异性抗体；以及
(4)包含抗FAP Fab的IgG部分的重链的C末端直接与源自非激动性 CD40抗体的抗CD40 Fab结合而成的与人CD40和人FAP结合的双特异性抗体。
其中，IgG部分的重链的恒定区(N末端侧开始依次CH1-铰链-CH2-CH3) 优选包含以序列编号61所示的氨基酸序列。另外，作为本发明的双特异性抗体或该双特异性抗体片段，优选上述(1)和(3)。
上述(1)～(4)的双特异性抗体中，优选包括含有分别包含序列编号24～26 所示的氨基酸序列的包含互补决定区(CDR)1～3的VH和分别包含序列编号19～21所示的氨基酸序列的包含CDR1～3的VL的抗CD40 Fab的双特异性抗体；更优选包括含有包含序列编号23所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号18所示的氨基酸序列的VL的抗CD40 Fab的双特异性抗体。
另外，上述(1)～(4)的双特异性抗体中，优选包括含有包含选自以下的 (i)～(v)中的任意一种，优选为选自(iii)～(v)中的任意一种，更优选为(iii)的重链CDR1～3的VH和含有分别包含序列编号19～21所示的氨基酸序列的 CDR1～3的VL的抗FAP Fab的双特异性抗体。
(i)分别包含序列编号33～35所示的氨基酸序列的重链CDR1～3、
(ii)分别包含序列编号38～40所示的氨基酸序列的重链CDR1～3、
(iii)分别包含序列编号43～45所示的氨基酸序列的重链CDR1～3、
(iv)分别包含序列编号48～50所示的氨基酸序列的重链CDR1～3，以及
(v)分别包含序列编号53～55所示的氨基酸序列的重链CDR1～3。
进而，上述(1)～(4)的双特异性抗体中，更优选包括含有包含选自序列编号32、37、42、47、52、75、77、79、81和83中的任意一种，优选选自序列编号42、47和75中的任意一种所示的氨基酸序列，更优选包含序列编号42所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号18所示的氨基酸序列的 VL的抗FAP Fab的双特异性抗体。
上述(1)～(4)的双特异性抗体中，更加优选包括含有分别包含序列编号 24～26所示的氨基酸序列的包含CDR1～3的VH和含有分别包含序列编号 19～21所示的氨基酸序列的包含CDR1～3的VL的抗CD40 Fab以及含有包含选自以下的(i)～(v)中的任意一种，优选为选自(iii)～(v)中的任意一种，更优选为(iii)的重链CDR1～3的VH和含有分别包含序列编号19～21所示的氨基酸序列的CDR1～3的VL的抗FAP Fab的双特异性抗体。
(i)分别包含序列编号33～35所示的氨基酸序列的重链CDR1～3、
(ii)分别包含序列编号38～40所示的氨基酸序列的重链CDR1～3、
(iii)分别包含序列编号43～45所示的氨基酸序列的重链CDR1～3、
(iv)分别包含序列编号48～50所示的氨基酸序列的重链CDR1～3，以及
(v)分别包含序列编号53～55所示的氨基酸序列的重链CDR1～3。
上述(1)～(4)的双特异性抗体中，进一步优选包括含有包含序列编号23 所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号18所示的氨基酸序列的VL的抗 CD40 Fab以及含有包含选自序列编号32、37、42、47、52、75、77、79、 81和83中的任意一种，优选选自序列编号42、47和75中的任意一种所示的氨基酸序列，更优选包含序列编号42所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号18所示的氨基酸序列的VL的抗FAP Fab的双特异性抗体。
另外，作为本发明的双特异性抗体，可以列举：含有包含选自序列编号65、67、69、71、73、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109和 111、优选选自序列编号69、71和85中的任意一种所示的氨基酸序列，更优选序列编号69所示的氨基酸序列的2条重链和含有包含序列编号18所示的氨基酸序列的VL的4条轻链构成的双特异性抗体。
另外，本发明的双特异性抗体也包括：包含与选自序列编号65、67、69 、71、73、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109和111中任意一种所示的氨基酸序列分别至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源的氨基酸序列的重链，和包含与序列编号18所示的氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％或至少99％同源的氨基酸序列的4条轻链构成的双特异性抗体。
作为本发明的双特异性抗体的例子，可以列举：Ct-R1090-Fa018、 Ct-R1090-Fa1007、Ct-R1090-Fa1013、Ct-R1090-Fa1014、Ct-R1090-Fa1046、Ct-R1090-Fa1046-GTS、Ct-R1090-Fa1046-FTS、Ct-R1090-Fa1046-KTS、 Ct-R1090-Fa1046-WTS、Ct-R1090-Fa1046-TTS、Ct-Fa018-R1090、 Ct-Fa1007-R1090、Ct-Fa1013-R1090、Ct-Fa1014-R1090、 Ct-Fa1046-GTS-R1090、Ct-Fa1046-FTS-R1090、Ct-Fa1046-KTS-R1090、 Ct-Fa1046-WTS-R1090和Ct-Fa1046-TTS-R1090。其中，优选 Ct-R1090-Fa1013、Ct-R1090-Fa1014和Ct-R1090-Fa1046-GTS，更优选 Ct-R1090-Fa1013。
本发明的双特异性抗体中也包括具有效应子活性的抗体。
效应子活性是指经由抗体的Fc区而引起的抗体依赖性的细胞毒活性，例如可以列举：抗体依赖性细胞毒活性(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity activity；ADCC活性)、补体依赖性细胞毒活性 (Complement-Dependent Cytotoxicity activity；CDC活性)、巨噬菌体或树突状细胞等吞噬细胞所引起的抗体依赖性吞噬活性(Antibody-dependent cellular phagocytosis activity；ADCP活性)和调理素效应等。
在本发明中，ADCC活性和CDC活性能够使用公知的测定方法[CancerImmunol.Immunother.,36,373(1993)]来测定。
ADCC活性是指已与靶标细胞上的抗原结合的抗体经由抗体的Fc区与免疫细胞的Fc受体结合，从而使免疫细胞(自然杀伤细胞等)激活，以毒杀靶标细胞的活性。
Fc受体(FcR)是与抗体的Fc区结合的受体，通过抗体的结合诱发各种效应子活性。各FcR对应于抗体的亚类，IgG、IgE、IgA、IgM分别与FcγR、 FcεR、FcαR、FcμR特异性结合。此外，FcγR存在FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32) 和FcγRIII(CD16)的亚型，各亚型存在FcγRIA、FcγRIB、FcγRIC、FcγRIIA、 FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA和FcγRIIIB的同种型。这些不同的FcγR存在于不同的细胞上[Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)]。在人类中，FcγRIIIB 在中性粒细胞特异性表达，FcγRIIIA在单核细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和一部分T细胞中表达。经由抗体对FcγRIIIA的结合诱发NK细胞依赖性的ADCC活性。
CDC活性是指已与靶标细胞上的抗原结合的抗体使血液中的由补体相关蛋白质群构成的一系列级联反应(补体激活通路)激活，并毒杀靶标细胞的活性。另外，通过由补体的激活而产生的蛋白片段诱导免疫细胞的迁移和激活。CDC活性的级联反应首先通过C1q首先与Fc区结合，其次与2个丝氨酸蛋白酶C1r和C1s结合而开始形成C1复合体。
本发明的双特异性抗体对抗原表达细胞的CDC活性、或ADCC活性能够通过公知的测定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]评价。
作为控制本发明的双特异性抗体的效应子活性的方法，已知控制与IgG 部分的抗体的Fc区(由CH2和CH3结构域构成的恒定区)的第297位的天冬酰胺(Asn)结合的N-结合复合型糖链的还原末端存在的N-乙酰基葡萄糖胺 (GlcNAc)进行α-1，6结合的岩藻糖(也称为核心岩藻糖)的量的方法(国际公开第2005/035586号、国际公开第2002/31140号和国际公开第00/61739号)、或通过抗体的Fc区的氨基酸残基的改变来控制的方法(国际公开第 00/42072号)等。
通过控制向双特异性抗体加成的岩藻糖的量，能够使抗体的ADCC活性增加或降低。例如，作为使与结合于抗体的Fc的N-结合复合型糖链结合的岩藻糖的含量降低的方法，能够通过使用α1,6-岩藻糖转移酶基因缺损的宿主细胞表达双特异性抗体而取得具有高ADCC的双特异性抗体。另一方面，作为使与结合于双特异性抗体的Fc的N-结合复合型糖链结合的岩藻糖的含量增加的方法，能够通过使用导入有α1,6-岩藻糖转移酶基因的宿主细胞表达抗体而取得具有低ADCC活性的双特异性抗体。
另外，通过改变双特异性抗体的Fc区的氨基酸残基，能够使ADCC活性或CDC活性增加或降低。例如通过使用美国专利申请公开第 2007/0148165号说明书中记载的Fc区的氨基酸序列，能够使双特异性抗体的CDC活性增加。另外，通过进行美国专利第6,737,056号说明书、美国专利第7,297,775号说明书或美国专利第7,317,091号说明书等中记载的氨基酸改变，也能够使ADCC活性或CDC活性增加或降低。
进而，也可以通过组合上述方法而获得控制了效应子活性的双特异性抗体。
本发明的双特异性抗体的稳定性能够通过测定纯化过程或一定条件下保存的样品中形成的凝集体(寡聚物)量来评价。对比对照，在本发明的双特异性抗体中，相同条件下凝集体量降低的情况评价为本发明的双特异性抗体的稳定性高于对照。凝集体量能够通过使用包括凝胶过滤色谱在内的适当的色谱将凝集的抗体和没有凝集的抗体分离来测定。
本发明的双特异性抗体的产生细胞的生产率能够通过测定由该抗体产生细胞在培养液中产生的抗体量来进行评价。更具体而言，能够通过HPLC 法或ELISA法等适当的方法测定从培养液去除产生细胞后的培养上清所含的抗体的量来进行评价。
在本发明中，抗体片段是指免疫球蛋白的片段，其中，包含抗原结合部位且具有对抗原的抗原结合性的蛋白质。例如可以列举Fab、Fab’、F(ab’)2、 scFv、Diabody、dsFv、VHH或包含CDR的肽等。
Fab是对IgG抗体利用蛋白分解酶木瓜蛋白酶进行处理所得到的片段中 (在H链的第224位的氨基酸残基被切断)H链的N末端侧约一半与L链整体由二硫键(S-S键)结合的、分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段。将包含VH和CH1的Fab的H链记作VH-CH1。另外，将包含VL和CL 的Fab的L链记作VL-CL。将源自抗CD40抗体的Fab记作抗CD40 Fab，源自抗FAP抗体的Fab记作抗FAP Fab。
F(ab’)2是对IgG利用蛋白质分解酶胃蛋白酶进行处理所得到的片段中 (在H链的第234位的氨基酸残基被切断)略大于Fab经由铰链区的S-S键而结合的片段的、分子量约10万的具有抗原结合活性的抗体片段。
Fab’是将上述F(ab’)2的铰链区的S-S键切断所得到的分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段。
scFv是将1条VH和1条VL使用12个残基以上的适当的肽接头(P)连结构成的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，且是具有抗原结合活性的抗体片段。
Diabody是抗原结合特异性相同或不同的scFv形成二聚物所得到的抗体片段，且是对相同抗原具有2价抗原结合活性、或对不同的抗原分别具有特异性的抗原结合活性的抗体片段。
dsFv是指使将VH和VL中的各1个氨基酸残基取代为半胱氨酸残基所得到的多肽经由该半胱氨酸残基间的S-S键结合而成的片段。
VHH(也称为纳米抗体)是指variable domain of heavy chain of heavy chainantibody(VHH抗体)中的重链可变区，能够在没有其它多肽的情况下与抗原结合。
VHH抗体是存在于羊驼等骆驼科的动物和鲨鱼等软骨鱼中的抗体，没有轻链和CH1，仅由重链构成。
包含CDR的肽是包含VH或VL的CDR的至少1个区域而构成的。包含多个CDR的肽能够通过使CDR彼此直接或经由适当的肽接头结合而制作。包含CDR的肽能够通过构建编码本发明的双特异性抗体的VH和VL 的CDR的DNA，将该DNA插入至原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，将该表达载体导入至原核生物或真核生物而使其表达来制造。另外，包含CDR的肽也能够通过Fmoc法或tBoc法等化学合成法来制造。
包含以抗体的效应子活性的增强或缺损、抗体的稳定化、和血中半衰期的控制为目的的氨基酸残基改变的Fc区也能够用于本发明的双特异性抗体。
本发明的双特异性抗体，包含对本发明的双特异性抗体化学地或基因工程地结合放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、蛋白质或抗体医药等而成的双特异性抗体的衍生物。
本发明中的双特异性抗体的衍生物能够通过对本发明的双特异性抗体的H链或L链的N末端侧或C末端侧、该双特异性抗体中的糖链等通过化学的方法[抗体工学入门、地人书馆(1994)]结合放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、免疫赋活剂、蛋白质或抗体医药等来制造。
另外，本发明中的双特异性抗体的衍生物能够通过使编码本发明的双特异性抗体的DNA与编码所需的蛋白质或抗体医药的DNA连结并插入至表达载体，将该表达载体导入至适当的宿主细胞并使其表达的基因工程的方法来制造。
作为放射性同位素，例如可以列举111In、131I、125I、90Y、64Cu、99Tc、77Lu或211At等。放射性同位素能够通过氯胺T法等与抗体直接结合。另外，也可以使抗体与螯合放射性同位素的物质结合。作为螯合剂，例如可以列举1-异硫氰酸酯苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。
作为低分子药剂，例如可以列举：烷基化剂、亚硝基脲剂、代谢拮抗剂、抗生素、植物碱、拓扑异构酶抑制剂、激素疗法剂、激素拮抗剂、芳香酶抑制剂、P糖蛋白抑制剂、铂配位化合物衍生物、M期抑制剂或激酶抑制剂等抗癌剂[临床肿瘤学、癌与化学疗法社(1996)]、氢化可的松或强的松等类固醇剂、阿司匹林或吲哚美辛等非类固醇剂、金硫醇盐或青霉胺等免疫调节剂、环磷酰胺或硫唑嘌呤等免疫抑制剂或马来酸氯苯那敏或克马西汀这样的抗组胺剂等抗炎剂[炎症与抗炎疗法、医齿药出版株式会社(1982)] 等。
作为抗癌剂，例如可以列举：阿米福汀(氨磷汀)、顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、放线菌素、双氯乙基甲胺(氮芥)、链脲佐菌素、环磷酰胺、异环磷酰胺、卡莫斯汀(BCNU)、洛莫斯汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、吉西他滨(健择)、柔红霉素、甲基苄肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、道诺霉素、丙霉素、雌莫司汀、紫杉醇(泰素)、多西紫杉醇(多西他赛)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、克拉屈滨、喜树碱、10-羟基-7- 乙基-喜树碱(SN38)、氟脲苷、氟达拉滨、羟基脲、依达比星、美司钠、伊立替康(CPT-11)、拓扑替康、米托蒽醌、托泊替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、羟基脲、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、链脲佐菌素、他莫昔芬、戈舍瑞林、柳菩林、氟他胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替哌、尿嘧啶氮介、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、氢化可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、长春地辛、尼莫斯汀、司莫司、卡培他滨、雷替曲塞、阿扎胞苷、UFT、奥沙利铂、吉非替尼(易瑞沙)、伊马替尼(STI571)、厄洛替尼、FMS样酪氨酸激酶(FMS-like tyrosine kinase 3)(Flt3)抑制剂、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth facotr receptor)(VEGFR)抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor)(FGFR)抑制剂、特罗凯等的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor)(EGFR)抑制剂、根赤壳菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素、雷帕霉素、安吖啶、全反式维甲酸、沙利度胺、来那度胺、阿那曲唑、法倔唑、来曲唑、依西美坦、金硫醇盐、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立滨、环孢菌素、雷帕霉素、氢化可的松、贝沙罗汀(他格雷汀)、他莫昔芬、地塞米松、黄体素类、雌激素类、阿那曲唑(瑞宁)、巯基嘌呤、阿司匹林、吲哚美辛、塞来昔布、硫唑嘌呤、青霉胺、金硫醇盐、马来酸氯苯那敏、氯苯那敏、克马西汀、维生素A酸、贝沙罗汀、砷、硼替佐米、别嘌醇、卡奇霉素、伊布利妥单抗、塔格列汀、奥唑米星、克拉霉素、亚叶酸、酮康唑、氨基谷氨酰胺、苏拉明、甲氨蝶呤或美登木素生物碱或其衍生物等。
作为使低分子药剂与本发明的双特异性抗体结合的方法，例如可以列举经由戊二醛使药剂与该抗体的氨基间结合的方法、或经由水溶性碳二酰亚胺使药剂的氨基与该抗体的羧基结合的方法等。
作为高分子药剂，可以列举：聚乙二醇(PEG)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯马来酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、或羟基丙基甲基丙烯酰胺等。通过使这些高分子化合物与本发明的双特异性抗体结合，可以期待如下效果等：(1)提高化学性、物理性或生物性的各种因子的稳定性；(2)显著延长血中半衰期；或(3)抑制免疫原性的消失或抗体产生[生物缀合医药品、广川书店(1993)]。
例如，作为使PEG与本发明的双特异性抗体结合的方法，可以列举使其与PEG化修饰试剂反应的方法等[生物缀合医药品、广川书店(1993)]。作为PEG化修饰试剂，可以列举：赖氨酸向ε-氨基的修饰剂(日本特开昭 61-178926号公报)、天冬氨酸和谷氨酸向羧基的修饰剂(日本特开昭 56-23587号公报)、或精氨酸向胍基的修饰剂(日本特开平2-117920号公报) 等。
作为免疫赋活剂，可以为作为免疫佐剂所已知的天然物，作为具体例，可以列举使免疫增强的药剂，如β(1→3)葡聚糖(例如，香菇多糖或裂褶菌素)、或α半乳糖神经酰胺(KRN7000)等。
作为蛋白质，例如可以列举使NK细胞、巨噬细胞或中性粒细胞等负责免疫的细胞激活的细胞因子或增殖因子或毒素蛋白等。
作为细胞因子或增殖因子，例如可以列举：干扰素(以下记作IFN)-α、 IFN-β、IFN-γ、白介素(以下记作IL)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等。
作为毒素蛋白，例如可以列举：蓖麻毒素、白喉毒素或ONTAK等，也包括为了调节毒性而在蛋白质中导入了变异的蛋白毒素。
与蛋白质或抗体医药融合的融合抗体能够通过使编码蛋白质的cDNA 与编码本发明的双特异性抗体的cDNA连结，构建编码融合抗体的DNA，将该DNA插入原核生物或真核生物用表达载体，并将该表达载体导入原核生物或真核生物并使其表达来制造。
在将上述双特异性抗体的衍生物作为检测方法、定量方法、检测用试剂、定量用试剂或诊断药物使用的情况下，作为与本发明的双特异性抗体结合的药剂，可以列举通常的免疫学检测或测定法中使用的标记物。作为标记物，例如可以列举：碱性磷酸酶、过氧化物酶或萤光素酶等酶、吖啶酯或咯吩等发光物质、或荧光素异硫氰酸酯(FITC)或四甲基罗丹明异硫氰酸酯(RITC)、Alexa(注册商标)Fluor 488、R-phycoerythrin(R-PE)等荧光物质等。
本发明包含具有CDC活性或ADCC活性等细胞毒活性的双特异性抗体。本发明的双特异性抗体对抗原表达细胞的CDC活性或ADCC活性能够通过公知的测定方法[CancerImmunol.Immunother.,36,373(1993)]来评价。
另外，本发明涉及包含特异性识别并结合CD40和FAP的双特异性抗体的组合物、或含有该双特异性抗体作为有效成分的、与CD40和FAP的至少一者有关的疾病的治疗药物。
作为与CD40和FAP的至少一者相关的疾病，只要为与CD40和FAP 的至少一者相关的疾病，则可以为任何疾病，例如可以列举恶性肿瘤和癌症等。
在本发明中，作为恶性肿瘤和癌症，例如可以列举：大肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、恶性黑色素瘤(黑色素瘤)、甲状腺癌、肾细胞癌、白血病、淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胆管癌、食道癌、肝癌、头颈部癌、皮肤癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、绒毛膜癌、咽癌、喉癌、间皮瘤、胸膜瘤、男性胚胎瘤、子宫内膜增生、子宫内膜异位症、胚组织瘤、纤维肉瘤、卡波济肉瘤、血管瘤、海绵状血管瘤、血管母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星状细胞瘤、神经纤维瘤、寡突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤和威尔姆斯瘤等。
含有本发明的双特异性抗体或它们的衍生物的治疗药物可以为仅包含作为有效成分的该双特异性抗体、或它们的衍生物的药物，通常优选作为与药理学上可接受的一种以上的载体一起混合，通过制剂学的技术领域中公知的任意的方法制造的医药制剂来提供。
给药途径优选使用治疗时最有效的途径，例如可以列举：口服给药、或口腔内、气管内、直肠内、皮下、肌肉内或静脉内等的非口服给药。其中，优选静脉内给药。
作为给药形式，例如可以列举：喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏或贴剂等。
给药量或给药次数根据目标治疗效果、给药方法、治疗时长、年龄和体重等而不同，通常成人每天为10μg/kg～10mg/kg。
此外，本发明涉及含有本发明的双特异性抗体的、CD40和FAP的至少一者的免疫学检测用或测定用试剂、或与CD40和FAP的至少一者有关的疾病的诊断药物。另外，本发明涉及使用本发明的双特异性抗体、CD40和 FAP的至少一者的免疫学检测用或测定用方法、与CD40和FAP的至少一者有关的疾病的治疗方法、或与CD40和FAP的至少一者有关的疾病、优选CD40和FAP的表达细胞参与的疾病的诊断方法。
作为本发明中检测或测定CD40和FAP的至少一者的量的方法，可以列举任意公知的方法。例如可以列举免疫学检测或测定方法等。
免疫学检测或测定方法是指使用施加了标记的抗原或抗体来检测或测定抗体量或抗原量的方法。作为免疫学检测或测定方法，例如可以列举放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法(luminescentimmunoassay)、蛋白质印迹法或理化方法等。
通过使用本发明的双特异性抗体来检测或测定表达CD40和FAP的至少一者的细胞，能够诊断与CD40和FAP的至少一者有关的疾病、优选CD40 和FAP的表达细胞参与的疾病。
在表达CD40和FAP的至少一者的细胞的检测中，能够使用公知的免疫学检测法。作为公知的免疫学检测法，例如可以列举：免疫沉降法、免疫细胞染色法、免疫组织染色法或荧光抗体染色法等。另外，荧光抗体染色法中例如可以使用FMAT8100HTS系统(AppliedBiosystems公司制)等。
作为本发明中作为检测或测定CD40和FAP的至少一者的对象的生物体试样，例如为组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿、粪便、组织液或培养液等，只要具有包含表达CD40和FAP的至少一者的细胞的可能性，则没有特别限定。
含有本发明的双特异性抗体、或者它们的衍生物的诊断药物可以根据目标诊断方法而包含用于进行抗原抗体反应的试剂、该反应的检测用试剂。作为用于进行抗原抗体反应的试剂，例如可以列举缓冲剂、盐等。
作为检测用试剂，例如可以列举与所述双特异性抗体、或者它们的衍生物结合的标记后的二次抗体、或与标记对应的底物等通常的免疫学检测或测定法所使用的试剂。
以下，对本发明的双特异性抗体的制作方法、该双特异性抗体的活性评价方法、以及使用该双特异性抗体的疾病的治疗方法和诊断方法具体地进行记载。
1.单克隆抗体的制作方法
本发明中的单克隆抗体的制造方法包括下述的作业步骤。即，(1)进行作为免疫原使用的抗原的纯化和在细胞表面过度表达抗原的细胞的制作的至少一者；(2)用抗原使动物免疫后，采集血液，检验其抗体效价，确定摘出脾脏等的时间，制备抗体产生细胞的步骤；(3)制备骨髓瘤细胞(myeloma)； (4)使抗体产生细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合；(5)筛选产生目标抗体的杂交瘤群；(6)从杂交瘤群分离(克隆)单克隆(monoclonal)细胞；(7)根据情况，培养用于大量制造单克隆抗体的杂交瘤、或饲养移植了杂交瘤的动物；(8) 对这样制造得到的单克隆抗体的生理活性及其抗原结合特异性进行研究，或鉴定作为标记试剂的特性等。
以下，按照上述的步骤对本发明中的用于制作与CD40和FAP结合的双特异性抗体的、与CD40结合的单克隆抗体和与FAP结合的单克隆抗体的制作方法进行详细叙述。该抗体的制作方法不限于此，例如也可以使用脾脏细胞以外的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞。
(1)抗原的纯化
表达CD40或FAP的细胞能够通过将包含编码CD40或FAP的全长或其部分长度的cDNA的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞等而得到。另外，可以从大量表达CD40和FAP的至少一者的各种人肿瘤培养细胞或人组织等之中纯化CD40和FAP的至少一者并将其用作抗原。另外，也可以将该肿瘤培养细胞或该组织等直接作为抗原使用。此外，也可以通过Fmoc法或tBoc法等化学合成法制备具有CD40或FAP的部分序列的合成肽并将其用于抗原。
本发明中使用的CD40或FAP能够通过使用Molecular Cloning,A LaboratoryManual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)或CurrentProtocols In Molecular Biology,John Wiley& Sons(1987-1997)等中记载的方法等，例如通过以下的方法，使编码该CD40 或FAP的DNA在宿主细胞中表达而制造。
通过将包含编码CD40或FAP的部分的全长cDNA插入至适当的表达载体的启动子的下游来制作重组载体。也可以代替上述全长cDNA，而使用基于全长cDNA所制备的包含编码多肽的部分的适当长度的DNA片段。然后，将所得到的该重组载体导入至适合该表达载体的宿主细胞，由此能够获得生产CD40或FAP的转化体。
作为表达载体，只要能够在使用的宿主细胞中自主复制或整合到染色体中且在能够转录编码CD40或FAP的DNA的位置含有适当的启动子，则能够使用任何载体。
作为宿主细胞，例如大肠杆菌等属于埃希氏菌属等的微生物、酵母、昆虫细胞或动物细胞等，只要能够表达目标基因，则能够使用任意宿主细胞。
在使用大肠杆菌等原核生物作为宿主细胞的情况下，重组载体优选为能够在原核生物中进行自主复制，并且含有启动子、核糖体结合序列、包含编码CD40或FAP的部分的DNA、以及转录终止序列的载体。另外，该重组载体并不一定需要转录终止序列，但优选在结构基因的正下方配置转录终止序列。此外，该重组载体也可以包含控制启动子的基因。
作为该重组载体，优选使用将作为核糖体结合序列的SD序列 (Shine-Dargarno序列)与起始密码子之间调节为适当的距离(例如，6～18个碱基)的质粒。
另外，作为编码该CD40或FAP的DNA的碱基序列，能够以成为最适于宿主内的表达的密码子的方式取代碱基，由此，能够提高目标CD40或FAP的生产率。
作为表达载体，只要能够在使用的宿主细胞中发挥功能，则能够使用任何表达载体，例如可以列举：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上由Roche Diagnostics公司制)、pKK233-2(Pharmacia公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promega公司制)、pQE-8(Qiagen公司制)、pKYP10(日本特开昭58-110600号公报)、pKYP200[AgriculturalBiological Chemistry,48, 669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl. Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制)、 pTrs30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[由大肠杆菌IGHA2(FERM BP-400)制备、日本特开昭60-221091号公报]、pGKA2[由大肠杆菌 IGKA2(FERM BP-6798)制备、日本特开昭60-221091号公报]、pTerm2(美国专利第4,686,191号说明书、美国专利第4,939,094号说明书、美国专利第5,160,735号说明书)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia公司制)、pET系统(Novagen公司制)或 pME18SFL3(东洋纺株式会社制)等。
作为启动子，只要是能够在使用的宿主细胞中发挥功能，则可以为任何启动子。例如可以列举:trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子或T7启动子等源自大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，例如也可以列举：2个Ptrp串联的串联启动子、tac启动子、lacT7启动子、或let I启动子等人为设计改变的启动子等。
作为宿主细胞，例如可以列举：大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49或大肠杆菌DH5α等。
作为向宿主细胞导入重组载体的导入方法，只要是能够在使用的宿主细胞中导入DNA的方法，则都可以使用，例如可以列举使用钙离子的方法 [Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)、Gene,17,107(1982)、Molecular& General Genetics,168,111(1979)]。
在使用动物细胞作为宿主的情况下，作为表达载体，只要在动物细胞中发挥功能，则可以使用任意表达载体，例如可以列举：pcDNAI(Invitrogen 公司制)、pcDM8(Funakoshi公司制)、pAGE107[日本特开平3-22979号公报； Cytotechnology,3,133(1990)]、pAS3-3(日本特开平2-227075号公报)、 pCDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制)、 pcDNA3.1(Invitrogen公司制)、pREP4(Invitrogen公司制)、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3或pKANTEX93(国际公开第97/10354号)等。
作为启动子，只要能够在动物细胞中发挥功能，则可以使用任意启动子，例如可以列举：巨细胞病毒(CMV)的immediate early(IE)基因的启动子、 SV40的初期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子或莫洛尼小鼠白血病病毒的启动子或增强子。另外，也可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一起使用。
作为宿主细胞，例如可以列举：人伯基特淋巴瘤细胞Namalwa、源自非洲绿猴肾脏的细胞COS、源自中国仓鼠卵巢的细胞CHO、或人白血病细胞HBT5637(日本特开昭63-000299号公报)等。
作为向宿主细胞导入重组载体的导入方法，只要为在动物细胞中导入 DNA的方法，则都可以使用，例如可以列举：电穿孔法[Cytotechnology,3,133 (1990)]、磷酸钙法(日本特开平2-227075号公报)、或脂质体转染法[Proc.Natl. Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
将如上得到的源自保有整合了编码CD40或FAP的DNA的重组载体的微生物、或动物细胞等的转化体在培养基中培养，在培养物中生成并累积该CD40和FAP的至少一者，从该培养物中获取，由此能够制造CD40或 FAP。在培养基中培养该转化体的方法能够根据宿主的培养中使用的通常的方法进行。
在源自真核生物的细胞中表达的情况下，能够得到添加有糖或糖链的 CD40或FAP。
在培养由使用诱导性启动子的重组载体转化后的微生物时，可以根据需要在培养基中添加诱导剂。例如在培养由使用lac启动子的重组载体转化后的微生物的情况下，可以在培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷等，在培养由使用trp启动子的重组载体转化后的微生物的情况下，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。
作为培养以动物细胞作为宿主而得到的转化体的培养基，例如可以列举：通常所使用的RPMI1640培养基[The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)]、Eagle的MEM培养基[Science,122,501(1952)]、 Dulbecco改良MEM培养基[Virology,8,396(1959)]、199培养基[Proc.Soc. Exp.Biol.Med.,73,1(1950)]、Iscove’sModified Dulbecco’s Medium(IMDM) 培养基、或在这些培养基中添加了胎牛血清(FBS)等的培养基等。培养通常在有pH6～8、30～40℃、5％CO2等条件下进行1～7天。另外，培养期间，可以根据需要在培养基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
作为编码CD40或FAP的基因的表达方法，除了直接表达以外，还能够使用分泌生产或融合蛋白表达等方法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]。作为 CD40或FAP的生产方法，可以列举例如：在宿主细胞内生产的方法、分泌到宿主细胞外的方法、或在宿主细胞外膜上生产的方法，能够通过改变使用的宿主细胞、或生产的CD40或FAP的结构来选择适当的方法。
例如，能够通过制作在编码细胞外区域的氨基酸序列的DNA上连结编码抗体的Fc区的DNA、编码谷胱甘肽S-转移酶(GST)的DNA、或编码FLAG 标签的DNA或编码Histidine标签的DNA等而成的DNA，并使其表达并纯化，从而制作抗原融合蛋白。具体而言，例如可以列举：使CD40或FAP 的细胞外区域结合于人IgG的Fc区而成的Fc融合蛋白、CD40或FAP的细胞外区域与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。
在CD40或FAP在宿主细胞内或宿主细胞外膜上生产的情况下，能够通过使用Paulson等人的方法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、Law等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4, 1288(1990)]、日本特开平05-336963号公报、或国际公开第94/23021号等中记载的方法，使CD40或FAP积极地分泌至宿主细胞外。另外，也能够利用使用二氢叶酸还原酶基因等的基因扩增体系(日本特开平2-227075号公报)使CD40或FAP的生产量升高。
所生产的CD40或FAP例如能够如下分离、纯化。
在CD40或FAP在细胞内以溶解状态表达的情况下，在培养结束后将细胞通过离心分离回收，悬浮于水系缓冲液后，使用超声波破碎机、法式压滤壶、Menton-Gaulin匀浆机、或Dyno-Mill等破碎细胞，获得无细胞提取液。通过将通常的蛋白质的分离纯化法、即溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙基氨基乙基(DEAE)- 琼脂糖、DIAION HPA-75(三菱化学株式会社制)等树脂的阴离子交换色谱法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制)等树脂的阳离子交换色谱法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性色谱法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和色谱法、色谱聚焦法、或等电点电泳等电泳法等方法单独或组合使用，能够从将该无细胞提取液离心分离得到的上清中获得纯化蛋白质。
在CD40或FAP在细胞内形成不溶体而表达的情况下，通过与上述同样将细胞回收后进行破碎、离心分离，作为沉淀组分回收该CD40或FAP 的不溶体。将回收后的该CD40或FAP的不溶体利用蛋白质变性剂可溶化。通过将该可溶化液稀释或透析，使该CD40或FAP恢复正常的立体结构后，能够通过与上述同样的分离纯化法得到多肽的纯化蛋白质。
在CD40或FAP或其糖修饰体等衍生物被分泌到细胞外的情况下，能够在培养上清中回收该CD40或FAP、或其糖修饰体等衍生物。通过与上述同样地使用离心分离等方法对该培养上清进行处理，获得可溶性组分，能够使用与上述同样的分离纯化法从该可溶性组分得到纯化蛋白质。
另外，本发明中使用的CD40或FAP也可以通过Fmoc法或tBoc法等化学合成法来制造。具体而言，例如可以利用Advanced Kemtec公司、Perkin Elmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Instrument公司、 Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、或株式会社岛津制作所等制造的肽合成机等进行化学合成。
(2)抗体产生细胞的制备步骤
用(1)中获得的抗原来免疫小鼠、大鼠、仓鼠、兔、牛、或羊驼等动物，采集该动物的脾脏、淋巴结或末梢血中的抗体产生细胞。另外，作为动物，例如作为被免疫动物可以列举富塚等人的文献[Tomizuka.et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,97、722,(2000)]中记载的产生源自人的抗体的转基因小鼠、为了提高免疫原性而进行了CD40或FAP的条件性基因敲除的小鼠等。
免疫通过与弗氏完全佐剂、或氢氧化铝凝胶和百日咳菌疫苗等适当的佐剂一起投予抗原来进行。小鼠免疫时的免疫原给药法可以为皮下注射、腹腔内注射、静脉内注射、皮内注射、肌肉内注射或足跖注射等之中的任意一种，优选腹腔内注射、足跖注射或静脉内注射。在抗原为部分肽的情况下，制作与BSA(牛血清白蛋白)、或KLH(Keyhole Limpethemocyanin)等的载体蛋白质的缀合物，将其用作免疫原。
抗原的投予在第1次投予后，每隔1～2周进行5～10次。在各给药后的第3～7天从眼底静脉丛采血，对其血清的抗体效价使用酶免疫测定法 [Antibodies-A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)(1988)]等来测定。如果将上述的血清对免疫中使用的抗原显示充分的抗体效价的动物用作融合用抗体的产生细胞的供给源，则能够提高后续操作的效果。
在抗原的最终投予后的第3～7天，从免疫后的动物中摘出脾脏等包含抗体产生细胞的组织，采集抗体产生细胞。抗体产生细胞是浆细胞和作为其前体细胞的淋巴细胞，其可以从个体的任意部位获得，一般可以从脾脏、淋巴结、骨髓、扁桃体、末梢血、或它们的适当组合等中获得，但脾脏细胞最常使用。在使用脾脏细胞的情况下，将脾脏切碎分散后，离心分离，再除去红细胞，由此取得融合用抗体产生细胞。
(3)骨髓瘤细胞的制备步骤
作为骨髓瘤细胞，可以使用源自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔或人等哺乳动物的没有自我抗体产生能力的细胞，一般使用从小鼠得到的细胞系、例如，8-氮鸟嘌呤耐性小鼠(源自BALB/c)骨髓瘤细胞细胞系 P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiologyand Immunology,18, 1(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J.Immunology,6,511(1976)]、 SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、 P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]、或 P3-X63-Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]等。该细胞系可以利用适当的培养基、例如8-氮鸟嘌呤培养基[添加了谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素、FCS 和8-氮鸟嘌呤的RPMI-1640培养基]、Iscove改良Dulbecco培养基(Iscove’sModified Dulbecco’s Medium；以下称为“IMDM”)、或Dulbecco改良Eagle 培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；以下称为“DMEM”)等的培养基来传代培养。在细胞融合的3～4天前将上述的细胞系用正常培养基(例如包含10％FCS的DMEM培养基)传代培养，在进行融合的当天确保2×107个以上的细胞数。
(4)细胞融合
将(2)中得到的融合用抗体产生细胞和(3)中得到的骨髓瘤细胞细胞用最低限度基础培养基Minimum Essential Medium(MEM)培养基或PBS(磷酸二钠1.83g、磷酸一钾0.21g、食盐7.65g、蒸留水1升、pH7.2)充分清洗，以使融合用抗体产生细胞：骨髓瘤细胞细胞＝5：1～10：1的方式混合，离心分离后，除去上清。将沉淀的细胞团充分分散后，在37℃下一边搅拌一边加入聚乙二醇-1000(PEG-1000)、MEM培养基和二甲基亚砜的混合液。再每 1～2分钟添加MEM培养基1～2mL数次后，加入MEM培养基使得总量达到 50mL。离心分离后，除去上清，将沉淀的细胞团缓慢分散后，将细胞缓慢地分散在HAT培养基[添加有次黄嘌呤、胸苷和氨基蝶呤的正常培养基]中。将该悬浊液在5％CO2培养箱中于37℃培养7～14天。
另外，也能够用以下的方法进行细胞融合。将脾脏细胞和骨髓瘤细胞细胞用无血清培养基(例如DMEM)、或磷酸缓冲生理盐水(以下称为“磷酸缓冲液”)充分清洗，以使脾脏细胞与骨髓瘤细胞细胞的细胞数之比达到5： 1～10：1左右的方式进行混合，并离心分离。除去上清，将沉淀的细胞团充分分散后，一边搅拌一边滴加1mL的包含50％(w/v)聚乙二醇(分子量 1000～4000)的无血清培养基。然后，缓慢加入10mL的无血清培养基后，离心分离。再次去除上清，将沉淀的细胞悬浮于适量的包含次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)液和人白介素-2(IL-2)的正常培养基(以下称为HAT培养基) 中，分注至培养用板(以下称为板)的各孔中，在存在5％二氧化碳气体的条件下，以37℃培养2周左右。途中适当补充HAT培养基。
(5)杂交瘤群的选择
在融合所使用的骨髓瘤细胞细胞为8-氮鸟嘌呤耐性株的情况下，即为次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶(HGPRT)缺损株的情况下，没有融合的骨髓瘤细胞细胞和骨髓瘤细胞细胞彼此的融合细胞无法在HAT培养基中存活。另一方面，抗体产生细胞彼此的融合细胞和抗体产生细胞与骨髓瘤细胞细胞的杂交瘤能够在HAT培养基中存活，但抗体产生细胞彼此的融合细胞最终会达到寿命。因此，通过在HAT培养基中继续培养，仅抗体产生细胞与骨髓瘤细胞细胞的杂交瘤存活，最终能够获得杂交瘤。
关于以集落状生长的杂交瘤，进行从HAT培养基向去除了氨基蝶呤的培养基(以下称为HT培养基)的培养基更换。然后，采集培养上清的一部分，使用后述的抗体效价测定法，能够选择产生抗体的杂交瘤。作为抗体效价的测定方法，例如可以列举：放射性同位素免疫定量法(RIA法)、固相酶免疫定量法(ELISA法)、荧光抗体法和被动红细胞凝集反应法等各种公知技术，从检测灵敏度、迅速性、准确性和操作的自动化的可能性等的观点考虑，优选RIA法或ELISA法。
将通过测定抗体效价而判明了会产生所需抗体的杂交瘤移至其它板进行克隆。作为该克隆法，例如可以列举在板的1个孔中包含1个细胞的方式进行稀释并培养的极限稀释法、在软琼脂培养基中进行培养并回收集落的软琼脂法、通过显微操作将1个细胞分离的方法、通过细胞分选仪将1 个细胞分离的方法等。
对确认到抗体效价的孔，反复进行2～4次例如利用极限稀释法的克隆，选择稳定确认到抗体效价的克隆作为产生针对CD40或FAP的单克隆抗体的杂交瘤株。
(6)单克隆抗体的制备
对经过姥鲛烷处理[腹腔内给药2,6,10,14-四甲基十五烷(Pristane)0.5mL 并饲养2周]的8～10周龄的小鼠或裸小鼠腹腔内注射(5)中得到的单克隆抗体产生杂交瘤。在10～21天杂交瘤发生腹水癌化。从该小鼠采集腹水，进行离心分离将固体成分除去后，用40～50％硫酸铵进行盐析，利用辛酸沉淀法、DEAE-琼脂糖柱、蛋白A柱或凝胶过滤柱进行纯化，收集IgG或IgM 组分，作为纯化单克隆抗体。另外，通过在上述品系的小鼠(例如，BALB/c)或Nu/Nu小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或兔等的腹腔内使该杂交瘤增殖，能够得到大量包含与CD40或FAP结合的单克隆抗体的腹水。
将(5)中得到的单克隆抗体产生杂交瘤在添加有10％FBS的RPMI1640 培养基等中培养后，通过离心分离去除上清，悬浮于GIT培养基、或添加有5％Daigo GF21的Hybridomas-SFM培养基等，通过烧瓶培养、旋转瓶培养或反向培养(バック培養)等培养3～7天。将所得到的细胞悬浊液离心分离，从所得到的上清进行利用蛋白A柱或蛋白G柱的纯化，收集IgG组分，也能够得到纯化单克隆抗体。作为纯化的简便方法，也能够利用市售的单克隆抗体纯化试剂盒(例如，MAbTrap GII试剂盒；Amersham Pharmacia Biotech公司制)等。
抗体的亚类的确定通过亚类分类试剂盒利用酶免疫测定法来进行。蛋白量的定量通过Lowry法和根据280nm处的吸光度[1.4(OD280)＝免疫球蛋白1mg/mL]进行计算的方法来进行。
(7)单克隆抗体对CD40或FAP的结合试验
单克隆抗体对CD40或FAP的结合性能够通过免疫双扩散(Ouchterlony) 法、ELISA法、RIA法、流式细胞法(FCM)或表面等离子共振法(SPR)等的结合试验体系进行测定。
免疫双扩散法虽然简便，但在抗体的浓度较低的情况下需要浓缩操作。另一方面，在使用ELISA法或RIA法的情况下，通过使培养上清直接与抗原吸附固相反应，进而使用与各种免疫球蛋白同型、亚类对应的抗体作为二抗，能够鉴定抗体的同型、亚类，并且测定抗体的结合活性。
作为程序的具体例，使纯化或部分纯化的重组CD40或FAP吸附于 ELISA用96孔板等的固相表面，再对没有吸附抗原的固相表面通过与抗原无关的蛋白质、例如牛血清白蛋白(BSA)进行封闭。将ELISA板利用 phosphate buffer saline(PBS)和包含0.05％Tween20的PBS(Tween-PBS)等清洗后，与阶段稀释后的第1抗体(例如小鼠血清、培养上清等)反应，使抗体与固定于板的抗原结合。然后，分注作为第2抗体的生物素、酶(horse radishperoxidase；HRP、alkaline phosphatase；ALP等)、化学发光物质或放射线化合物等标记后的抗免疫球蛋白抗体，使第2抗体与在板上结合的第1抗体反应。用Tween-PBS充分清洗后，进行与第2抗体的标记物质相应的反应，选择对靶标抗原特异性反应的单克隆抗体。
用FCM法能够测定抗体对抗原表达细胞的结合活性[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]。抗体结合于在细胞膜上表达的膜蛋白质抗原表示该抗体识别并结合天然存在的抗原的立体结构。
作为SPR法，可以列举通过Biacore的动力学(kinetics)分析。例如，使用BiacoreT100，测定抗原与被测物质之间的结合的动力学，将其结果用机器附带的分析软件分析。作为程序的具体例，将抗小鼠IgG抗体用胺偶联法固定于传感器芯片CM5后，通入杂交瘤培养上清或纯化单克隆抗体等被测物质以结合适当量，再通入浓度已知的多种浓度的抗原，测定结合和解离。然后，使用机器附带的软件对所得到的数据进行通过1：1结合模型的动力学分析，获得各种参数。或者，将CD40或FAP例如利用胺偶联法固定于传感器芯片上后，通入浓度已知的多种浓度的纯化单克隆抗体，测定结合和解离。使用机器附带的软件对所得到的数据进行利用二价结合模型的动力学分析，获得各种参数。
另外，在本发明中，与针对CD40或FAP的抗体竞争性地与CD40或 FAP结合的抗体能够通过使被测抗体在上述的结合试验体系中共存并反应来选择。即通过筛选在加入被测抗体时抑制与抗原的结合的抗体，能够获得与上述获得的抗体竞争性地与CD40或FAP结合的抗体。
(8)单克隆抗体对CD40或FAP的表位的鉴定
在本发明中，抗体识别并结合的表位的鉴定能够如下进行。
例如，制作抗原的部分缺损体、改变了物种间不同的氨基酸残基的突变体、或改变了特定的结构域的突变体，如果抗体对该缺损体或突变体的反应性降低，则表明缺损部位或氨基酸改变部位为该抗体的表位。这样的抗原的部分缺损体和突变体可以使用适当的宿主细胞例如大肠杆菌、酵母、植物细胞或哺乳动物细胞等作为分泌蛋白而取得，也可以在宿主细胞的细胞膜上表达而作为抗原表达细胞制备。在膜型抗原的情况下，为了在保持抗原的立体结构不变的情况下表达，优选在宿主细胞的膜上表达。另外，也可以制作模拟抗原的1级结构或立体结构的合成肽，以确认抗体的反应性。合成肽可以列举使用公知的肽合成技术来制作其分子的各种部分肽的方法等。
例如，对于人和小鼠的CD40或FAP的细胞外区域，制作将构成各区域的结构域适当组合而成的嵌合蛋白，确认抗体对该蛋白的反应性，由此能够鉴定抗体的表位。然后，更加细致地，使用本领域技术人员公知的寡肽合成技术合成各种其对应部分的寡肽、或该肽的突变体等，确认抗体对该肽的反应性，由此能够确定表位。作为用于得到多种寡肽的简便的方法，也能够利用市售的试剂盒[例如，SPOTs试剂盒(Genosys Biotechnology公司制)、使用多中心合成法的一系列的多中心-肽合成试剂盒(Chiron公司制) 等]。
作为结合于与和CD40或FAP结合的抗体所结合的表位相同表位的抗体，其能够通过鉴定在上述的结合试验体系中得到的抗体的表位，制作该表位的部分合成肽、模拟该表位的立体结构的合成肽、或该表位的重组体等并进行免疫而取得。
例如，如果表位为膜蛋白，则通过制作将全细胞外区域或一部分细胞外结构域连结于适当的标签例如FLAG标签、Histidine标签、GST蛋白质或抗体Fc区等得到的重组融合蛋白，用该重组蛋白质进行免疫，从而能够更有效地制作该表位特异性的抗体。
2.基因重组抗体的制作
作为基因重组抗体的制作例，在P.J.Delves.,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIALTECHNIQUES.,1997WILEY、P.Shepherd and C. Dean.Monoclonal Antibodies.,2000OXFORD UNIVERSITY PRESS和J.W. Goding.,Monoclonal Antibodies:principlesand practice.,1993ACADEMIC PRESS等中进行了简要说明，以下示出嵌合抗体、人源化抗体和人抗体的制作方法。另外，关于基因重组小鼠、大鼠、仓鼠和兔抗体，也能够用同样的方法制作。
(1)从杂交瘤取得编码单克隆抗体的V区的cDNA
编码单克隆抗体的VH和VL的cDNA例如能够如下进行取得。
首先，从产生单克隆抗体的杂交瘤提取mRNA，并合成cDNA。然后，将合成的cDNA克隆到噬菌体或质粒等载体，制作cDNA文库。从该文库中，将编码抗体的C区部分或V区部分的DNA用作探针，分别分离具有编码VH或VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。确定分离得到的重组噬菌体或重组质粒内的VH或VL的全碱基序列，从该碱基序列推测VH或 VL的全氨基酸序列。
作为用于制作杂交瘤的非人动物，使用小鼠、大鼠、仓鼠或兔等，但只要能够制作杂交瘤，则能够使用任何动物。
从杂交瘤制作总RNA时，使用硫氰酸胍-三氟乙酸铯法[Methods in Enzymol.,154,3(1987)]、或RNA easy kit(Qiagen公司制)等的试剂盒等。
从总RNA制备mRNA时，使用寡(dT)固定化纤维素柱法[Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]、或Oligo-dT30＜Super＞mRNA Purification Kit(Takara Bio公司制)等的试剂盒等。另外，也可以使用Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen公司制)或QuickPrep mRNAPurification Kit(Pharmacia公司制) 等的试剂盒来制备mRNA。
cDNA的合成和cDNA文库的制作使用公知的方法[Molecular Cloning, ALaboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1,John Wiley &Sons(1987-1997)]或SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Invitrogen公司制)或ZAP-cDNA Synthesis Kit(Stratagene公司制)等的试剂盒等。
在制作cDNA文库时，作为供整合入以从杂交瘤提取的mRNA为模板合成的cDNA的载体，只要为能够整合入该cDNA的载体即可，可以使用任何载体。
例如使用ZAP Express[Strategies,5,58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λZAPII(Stratagene公司制)、λgt10、λgt11[DNA Cloning:A Practical Approach,I,49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech公司制)、λExCell、pT7T3-18U(Pharmacia公司制)、 pcD2[Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)]或pUC18[Gene,33,103(1985)]等。
供导入由噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌只要能够导入、表达和维持该cDNA文库，则可以使用任何大肠杆菌。例如使用 XL1-Blue MRF’[Strategies,5,81(1992)]、C600[Genetics,39,440(1954)]、Y1088、Y1090[Science,222,778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.,166,1(1983)]、 K802[J.Mol.Biol.,16,118(1966)]、或JM105[Gene,38,275(1985)]等。
从cDNA文库中选择编码非人抗体的VH或VL的cDNA克隆，使用利用经同位素或荧光标记的探针的集落杂交法、或噬菌斑杂交法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]等。
另外，也可以通过制备引物，以从mRNA合成的cDNA或cDNA文库为模板，进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)法[以下记作PCR 法、Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1,John Wiley&Sons(1987-1997)]，由此来制备编码VH或VL的 cDNA。
将所选择的cDNA利用适当的限制性内切酶等切断后，克隆到 pBluescript SK(-)(Stratagene公司制)等质粒，通过通常使用的碱基序列分析方法等来确定该cDNA的碱基序列。例如，进行双脱氧法[Proc.Natl.Acad. Sci.USA,74,5463(1977)]等反应后，使用A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia公司制)等碱基序列自动分析装置等来分析。
从确定的全碱基序列分别推测VH和VL的全氨基酸序列，通过与已知的抗体的VH和VL的全氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDept.Health and Human Services(1991)]比较，确定所取得的 cDNA是否编码包含分泌信号序列的抗体的VH和VL各自的完整的氨基酸序列。
关于包含分泌信号序列的抗体的VH和VL各自的完整的氨基酸序列，通过与已知的抗体的VH和VL的全氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDept.Health and Human Services(1991)]比较，能够推测分泌信号序列的长度和N末端氨基酸序列，进而能够鉴定它们所属的亚群。
另外，VH和VL的各CDR的氨基酸序列能够通过与已知的抗体的VH 和VL的氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and HumanServices(1991)]比较来推测。
另外，关于所得到的VH和VL的完整的氨基酸序列，例如可以通过使用SWISS-PROT或PIR-Protein等任意的数据库，进行利用BLAST法[J.Mol. Biol.,215,403(1990)]等的同源性检索，确认该VH和VL的完整的氨基酸序列是否为新的序列。
(2)基因重组抗体表达用载体的构建
基因重组抗体表达用载体能够通过向动物细胞用表达载体克隆编码人抗体的CH和CL的至少一者的DNA来构建。
作为人抗体的C区，能够使用任意的人抗体的CH和CL，例如能够使用人抗体的γ1亚类的CH和κ类的CL等。作为编码人抗体的CH和CL的 DNA，使用cDNA，但也可以使用由外显子和内含子构成的染色体DNA。
作为动物细胞用表达载体，只要能够整合入编码人抗体的C区的基因并表达的载体即可，可以使用任何载体，例如可以使用 pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.,101, 1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci. USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]、或 pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.,13,79(1993)]、INPEP4(Biogen-IDEC公司制)、N5KG1val(美国专利第6,001,358号说明书)、N5KG4PE R409K(国际公开第 2006/033386号中记载)、N5KG2载体(国际公开第2003/033538号中记载)、转座子载体(国际公开第2010/143698号)等。
作为动物细胞用表达载体的启动子和增强子，可以使用SV40的初始启动子[J.Biochem.,101,1307(1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987)]、CMV启动子(美国专利第5,168,062 号说明书)或免疫球蛋白H链的启动子[Cell,41,479(1985)]和增强子[Cell, 33,717(1983)]等。
从载体的构建的容易性、向动物细胞导入的容易性、细胞内的抗体H 链和L链的表达量的均衡性等的观点出发，基因重组抗体的表达使用搭载有抗体H链和L链的两基因的载体(串联型载体)[J.Immunol.Methods,167, 271(1994)]，但也可以将分别搭载有抗体H链和L链的各基因的多个载体(分离型载体)组合使用。
作为串联型的基因重组抗体表达用载体，使用pKANTEX93(国际公开第97/10354号)、pEE18[Hybridoma,17,559(1998)]、N5KG1val(美国专利第 6,001,358号说明书)、N5KG4PE R409K(国际公开第2006/033386号中记载)、N5KG2载体(国际公开第2003/033538号中记载)、Tol2转座子载体(国际公开第2010/143698号)等。
(3)嵌合抗体表达载体的构建
通过在(2)所获得的基因重组抗体表达用载体内的编码人抗体的CH或 CL的基因的各自的上游分别克隆(1)中得到的编码非人抗体的VH或VL的 cDNA，能够构建嵌合抗体表达载体。
首先，为了将编码非人抗体的VH或VL的cDNA的3’末端侧与人抗体的CH或CL的5’末端侧连结，制作以连结部分的碱基序列编码适当的氨基酸且成为适当的限制性内切酶识别序列的方式设计的VH和VL的cDNA。然后，将制作得到的VH和VL的cDNA分别以适当的形式表达的方式克隆到(2)中得到的基因重组抗体表达用载体内的编码人抗体的CH或CL的基因的各自的上游，从而构建嵌合抗体表达载体。
另外，也可以通过将编码非人抗体的VH或VL的cDNA使用两端具有适当的限制性内切酶的识别序列的合成DNA通过PCR法分别扩增，并克隆到(2)中得到的基因重组抗体表达用载体，从而构建嵌合抗体表达载体。
(4)编码人源化抗体的V区的cDNA的制作
编码人源化抗体的VH或VL的cDNA能够如下制作。首先，分别选择移植(1)中得到的非人抗体的VH或VL的CDR的氨基酸序列的人抗体的VH 或VL的框架区(以下记作FR)的氨基酸序列。
选择的FR的氨基酸序列只要为源自人抗体，则能够使用任何序列。例如，使用Protein Data Bank等数据库中注册的人抗体的FR的氨基酸序列、或人抗体的FR的各亚群的共通氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDept.Health and Human Services(1991)]等。为了抑制抗体的结合活性的降低，选择与原本的非人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列具有尽可能高的同源性(60％以上)的人FR的氨基酸序列。
然后，在所选择的人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列中分别移植原本的非人抗体的CDR的氨基酸序列，分别设计人源化抗体的VH或VL 的氨基酸序列。考虑到抗体基因的碱基序列中所见的密码子的使用频度，将所设计的氨基酸序列[Sequences of Proteins ofImmunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]转换成DNA序列，由此分别设计人源化抗体的VH或VL的cDNA序列。
基于所设计得到的cDNA序列，合成由100～150个碱基左右的长度构成的数条合成DNA，使用它们进行PCR反应。该情况下，从PCR的反应效率和能够合成的DNA长度的观点出发，优选针对H链和L链各设计4～6 条合成DNA。另外，也可以合成可变区全长的合成DNA来使用。
此外，通过在位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的限制性内切酶的识别序列，能够在(2)中得到的基因重组抗体表达用载体中容易地克隆入编码人源化抗体的VH或VL的cDNA。PCR反应后，将扩增产物分别克隆到pBluescript SK(-)(Stratagene公司制)等质粒，通过与(1)中记载的方法同样的方法确定碱基序列，取得具有所需的编码人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列的质粒。
(5)人源化抗体的V区的氨基酸序列的改变
人源化抗体如果仅将非人抗体的VH和VL的CDR移植到人抗体的VH 和VL的FR，则其抗原结合活性与原本的非人抗体相比会降低[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。因此，鉴定出人抗体的VH和VL的 FR的氨基酸序列中直接参与向抗原的结合的氨基酸残基、与CDR的氨基酸残基相互作用的氨基酸残基、和维持抗体的立体结构并间接参与向抗原的结合的氨基酸残基，将这些氨基酸残基取代为原本的非人抗体的氨基酸残基，由此能够使降低的人源化抗体的抗原结合活性升高。
为了鉴定与抗原结合活性相关的FR的氨基酸残基，可以通过使用X射线结晶分析[J.Mol.Biol.,112,535(1977)]或电脑建模[Protein Engineering,7, 1501(1994)]等来进行抗体的立体结构的构建和分析。另外，通过对各个抗体制作数种改变体，反复研究各自与抗原结合活性的相关性，并进行试错，能够取得具有所需的抗原结合活性的改变人源化抗体。
人抗体的VH和VL的FR的氨基酸残基能够通过使用改变用合成DNA 进行(4)中记载的PCR反应来改变。关于PCR反应后的扩增产物，通过(1) 中记载的方法，确定碱基序列，确认实施了目标改变。
(6)人源化抗体表达载体的构建
向(2)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游分别克隆入所构建的编码人源化抗体的VH或VL的cDNA，从而能够构建人源化抗体表达载体。
例如，通过向(4)和(5)中得到的构建人源化抗体的VH或VL时所使用的合成DNA中位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的限制性内切酶的识别序列，从而将它们以适当的形式表达的方式分别克隆到(2)中得到的基因重组抗体表达用载体内的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游。
(7)人抗体表达载体的构建
在使用产生人抗体的动物作为被免疫动物建立了产生单克隆抗体的杂交瘤的情况下，在(1)中，能够获得人抗体的VH和VL的氨基酸序列和cDNA 序列。因此，通过在(2)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的 CH或CL的各基因的上游分别克隆入(1)中得到的编码人抗体的VH或VL 的基因，能够构建人抗体表达载体。
(8)基因重组抗体的瞬时表达
使用(3)、(6)和(7)中得到的基因重组抗体表达用载体、或将它们改变得到的表达载体使基因重组抗体瞬时表达，能够有效地评价所得到的多种基因重组抗体的抗原结合活性。
供导入表达载体的宿主细胞只要为能够表达基因重组抗体的宿主细胞，则可以使用任何细胞，例如使用COS-7细胞[American Type Culture Collection(ATCC)编号：CRL1651]。向COS-7细胞导入表达载体时使用 DEAE-葡聚糖法[Methods in Nucleic AcidsRes.,CRC press(1991)]、或脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
导入表达载体后，使用酶免疫抗体法[Monoclonal Antibodies-Principles andpractice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、单克隆抗体实验手册、 Kodansha Scientific(1987)]等来测定培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性。
(9)基因重组抗体的稳定表达株的取得和基因重组抗体的制备
通过将(3)、(6)和(7)中得到的基因重组抗体表达用载体导入适当的宿主细胞，能够得到稳定表达基因重组抗体的转化株。
作为表达载体向宿主细胞的导入，例如可以列举：电穿孔法[日本特开平2-257891号公报、Cytotechnology,3,133(1990)]、钙离子方法、电穿孔法、原生质球法、乙酸锂法、磷酸钙法、脂质体转染法等。另外，作为向后述的动物导入基因的方法，例如可以列举：显微注射法、使用电穿孔或脂质体转染法向ES细胞导入基因的方法、和核移植法等。
作为供导入基因重组抗体表达用载体的宿主细胞，只要是能够使基因重组抗体表达的宿主细胞，则可以使用任何细胞。例如，使用小鼠 SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、中国仓鼠CHO-K1细胞(ATCC CCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5细胞(ATCC CCL-1781)、CHO-S细胞(Life Technologies、 CatNo.11619)、二氢叶酸还原酶基因(dhfr)缺损的CHO细胞(CHO/DG44细胞)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]、获得了凝集素耐性的Lec13 细胞[SomaticCell and Molecular genetics,12,55(1986)]、α1,6-岩藻糖转移酶基因缺损的CHO细胞(国际公开第2005/035586号、国际公开第02/31140 号)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC编号：CRL1662)等。
另外，也可以使用参与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成的酶等蛋白质、参与使岩藻糖的1位以α键结合于N-糖苷键复合型糖链的还原末端的 N-乙酰基葡萄糖胺的6位的糖链修饰的酶等蛋白质、或参与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体输送的蛋白质等的活性降低或缺失的宿主细胞、例如α1,6-岩藻糖转移酶基因缺损的CHO细胞(国际公开第2005/035586号、国际公开第02/31140号)等。
导入表达载体后，通过在包含G418硫酸盐(以下记作G418)等药剂的动物细胞培养用培养基中培养来选择稳定表达基因重组抗体的转化株(日本特开平2-257891号公报)。
动物细胞培养用培养基使用RPMI1640培养基(Invitrogen公司制)、GIT 培养基(日本制药株式会社制)、EX-CELL301培养基(JRH公司制)、 EX-CELL302培养基(JRH公司制)、EX-CELL325培养基(JRH公司制)、IMDM 培养基(Invitrogen公司制)或Hybridoma-SFM培养基(Invitrogen公司制)、或在这些培养基中添加有FBS等各种添加物的培养基等。通过将所得到的转化株在培养基中培养，使基因重组抗体在培养上清中表达、累积。培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性能够通过ELISA法等测定。另外，可以利用DHFR扩增体系(日本特开平2-257891号公报)等，使转化株所产生的基因重组抗体的表达量增加。
基因重组抗体能够由转化株的培养上清使用蛋白A柱进行纯化 [MonoclonalAntibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]。另外，也可以将凝胶过滤、离子交换色谱和超滤等蛋白质的纯化中使用的方法组合进行纯化。
纯化后的基因重组抗体的H链、L链或抗体分子整体的分子量能够使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法[Nature,227,680(1970)]、或蛋白质印迹法 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third Edition,Academic Press(1996)、Antibodies-ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等测定。
3.双特异性抗体的设计
本发明的双特异性抗体能够通过分别设计第二抗原结合结构域和IgG 部分，并设计将它们连结构成的双特异性抗体来制作。
3-1.IgG部分的设计
IgG部分可以通过使用上述1.中记载的方法取得单克隆抗体，使用上述2.中记载的方法确定各抗体的CDR和可变区的cDNA序列，设计包含抗体的CDR或可变区的IgG部分来获得。
3-2.第二抗原结合结构域的设计
在第二抗原结合结构域包含抗体的CDR或可变区的情况下，能够利用上述1.和2.中记载的方法确定抗体的CDR或可变区的DNA序列，设计包含它们的第二抗原结合结构域来制作。作为这样的第二抗原结合结构域，也可以使用：如scFv等那样使VH与VL直接或经由适当的接头结合而成的单链的抗原结合结构域、设计成如Fab和dsFv等那样以双链表达并在表达后进行二硫键结合的抗原结合结构域、或VHH等。另外，作为第二抗原结合结构域，可以使用包含与抗原蛋白质的配体或该配体的抗原蛋白质结合的部分的肽片段。可以利用上述方法评价第二抗原结合结构域的抗原结合活性，并选择保持有抗原结合活性的抗原结合结构域。
4.双特异性抗体的制作
抗原结合结构域除了上述1.中记载的使用杂交瘤的方法以外，还能够通过噬菌体展示法(Phage Display)法、酵母展示法(Yeast display)法等技术进行分离并取得[Emmanuelle Laffy et al.,Human Antibodies 14,33-55,(2005)]。
另外，在制作由多个VH和单一的VL构成的双特异性抗体的情况下，以双特异性抗体所含的各抗原结合结构域与各特异性抗原反应的方式，进行使用噬菌体展示法等的筛选，选择最适于单一VL的各个VH。
具体而言，首先，使用上述1.中记载的方法，用第1抗原免疫动物并由其脾脏制作杂交瘤，克隆编码第1抗原结合结构域的DNA序列。然后，用第2抗原免疫动物，由其脾脏制备cDNA文库，通过PCR从该文库中取得编码VH的氨基酸序列的DNA。
接下来，制作表达将第2抗原的免疫所得到的VH与第一抗原结合结构域的VL连结构成的scFv的噬菌体文库，使用该噬菌体文库进行淘选，选择提呈与第2抗原特异性结合的scFv的噬菌体。从所选择的噬菌体中克隆编码第二抗原结合结构域的VH的氨基酸序列的DNA序列。
此外，在第二抗原结合结构域为Fab的情况下，设计编码将第一抗原结合结构域的VH与第二抗原结合结构域的VH由重链恒定区连结而成的多肽的氨基酸序列的DNA序列，将该DNA序列与编码单一VL的氨基酸序列的DNA序列插入至例如上述2.(2)中记载的基因重组抗体表达用载体，由此能够构建本发明的双特异性抗体的表达载体。
5.本发明的双特异性抗体的活性评价
纯化后的双特异性抗体的活性评价能够如下进行。
本发明的双特异性抗体对表达CD40和FAP的至少一者的细胞系的结合活性能够使用上述的1.(7)记载的结合试验体系进行测定。
对表达CD40和FAP的至少一者的细胞的CDC活性、或ADCC活性能够通过公知的测定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]测定。
本发明的双特异性抗体的细胞死亡诱导活性(也称为抗细胞活性)能够用如下的方法测定。例如将细胞接种于96孔板，添加抗体培养一定时间后，使其与WST-8试剂(Dojindo公司制)反应，利用酶标仪测定450nm的吸光度，由此测定细胞的存活率。
从CD40或FAP向细胞内的信号转导能够通过利用蛋白质印迹法等检测细胞内的蛋白质的磷酸化来评价。
6.使用本发明的双特异性抗体的疾病的治疗方法
本发明的双特异性抗体能够用于治疗与CD40和FAP的至少一者相关的疾病、优选CD40和FAP的表达细胞参与的疾病。作为与CD40和FAP 的至少一者相关的疾病，例如可以列举恶性肿瘤和癌症等。
作为恶性肿瘤和癌症，例如可以列举：大肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、恶性黑色素瘤(黑色素瘤)、甲状腺癌、肾细胞癌、白血病、淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胆管癌、食道癌、肝癌、头颈部癌、扁平上皮癌、皮肤癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、绒毛膜癌、咽癌、喉癌、胸膜瘤、男性胚胎瘤、子宫内膜增生、子宫内膜异位症、胚组织瘤、纤维肉瘤、卡波济肉瘤、血管瘤、海绵状血管瘤、血管母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星状细胞瘤、神经纤维瘤、寡突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤和威尔姆斯瘤等。
含有本发明的双特异性抗体、或这些的衍生物的治疗药可以仅包含作为有效成分的该双特异性抗体、或其衍生物，但通常作为与药理学上可接受的一种以上的载体一起混合，通过制剂学的技术领域中公知的方法制造的医药制剂来提供。
作为给药途径，例如可以列举：口服给药、或口腔内、气管内、直肠内、皮下、肌肉内或静脉内等非口服给药。作为给药形态，例如可以列举：喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏或贴剂等。各种制剂可以使用通常所用的赋形剂、填充剂、结合剂、浸润剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂、保存剂、助溶剂、防腐剂、着色料、香味剂和稳定剂等通过常规方法来制造。
作为赋形剂，例如可以列举：乳糖、果糖、葡萄糖、玉米淀粉、山梨糖醇、结晶纤维素、灭菌水、乙醇、甘油、生理盐水和缓冲液等。作为崩解剂，例如可以列举：淀粉、海藻酸钠、明胶、碳酸钙、柠檬酸钙、糊精、碳酸镁和合成硅酸镁等。
作为结合剂，例如可以列举：甲基纤维素或其盐、乙基纤维素、阿拉伯胶、明胶、羟基丙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等。作为润滑剂，例如可以列举：滑石、硬脂酸镁、聚乙二醇和氢化植物油等。
作为稳定剂，例如可以列举：精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸等氨基酸、人血清白蛋白、明胶、葡聚糖40、甲基纤维素、亚硫酸钠、偏亚硫酸钠等。
作为其它的添加剂，例如可以列举：糖浆、凡士林、甘油、乙醇、丙二醇、柠檬酸、氯化钠、亚硝酸钠和磷酸钠等。
作为适于口服给药的制剂，例如可以列举：乳剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等。
乳剂或糖浆剂这样的液体制备物使用水、蔗糖、山梨糖醇或果糖等糖类、聚乙二醇或丙二醇等二醇类、芝麻油、橄榄油或大豆油等油类、对羟基苯甲酸酯类等防腐剂、或草莓香料或薄荷等香料类等作为添加剂制造。
胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等使用乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇等赋形剂、淀粉或海藻酸钠等崩解剂、硬脂酸镁或滑石等润滑剂、聚乙烯醇、羟基丙基纤维素或明胶等结合剂、脂肪酸酯等表面活性剂、或甘油等增塑剂等作为添加剂制造。
作为适于非口服给药的制剂，例如可以列举：注射剂、栓剂或喷雾剂等。注射剂使用由盐溶液、葡萄糖溶液、或这两者的混合物构成的载体等制造。
栓剂使用可可脂、氢化脂肪或羧酸等载体制造。喷雾剂使用不刺激接受者的口腔和气管粘膜且使本发明的单克隆抗体分散为微细颗粒而使其易于吸收的载体等制造。作为载体，例如可以列举：乳糖或甘油等。另外，也可以作为气溶胶或干粉进行制造。此外，在上述非口服剂中，也可以添加在适于口服给药的制剂中作为添加剂例示的成分。
作为本发明的双特异性抗体的有效量与适当的稀释剂和药理学上能够使用的载体的组合给药的有效量为每次单位体重1kg为0.0001mg～100mg，从第2天起以8周间隔给药。
7.使用本发明的双特异性抗体的疾病的诊断方法
通过使用本发明的双特异性抗体检测或测定表达CD40和FAP的至少一者的细胞，能够诊断与CD40和FAP的至少一者相关的疾病、优选CD40 和FAP的表达细胞参与的疾病。
作为与CD40和FAP的至少一者相关的疾病的恶性肿瘤或癌症的诊断，例如能够如下检测或测定CD40和FAP的至少一者来进行。
首先，对从多个健康者的生物体采集的生物体试样，使用本发明的双特异性抗体、或它们的衍生物，利用下述的免疫学方法，进行CD40和FAP 的至少一者的检测或测定，调查健康者的生物体试样中的CD40和FAP的至少一者的存在量。
接着，对被测者的生物体试样中也同样调查CD40和FAP的至少一者的存在量，将其存在量与健康者的存在量比较。在被测者的CD40和FAP 的至少一者的存在量与健康者相比增加的情况下，该被测者则被诊断为患癌。关于其它的与CD40和FAP的至少一者相关的疾病的诊断也能够用同样的方法诊断。
免疫学方法是指使用施加了标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。例如可以列举：放射性物质标记免疫抗体法、酶免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法、蛋白质印迹法或理化方法等。
作为放射性物质标记免疫抗体法，例如可以列举如下方法：使抗原或表达抗原的细胞等与本发明的双特异性抗体反应，进而与施加了辐射标记的抗免疫球蛋白抗体或结合片段反应后，利用闪烁计数器等进行测定。
作为酶免疫测定法，例如可以列举如下方法：使抗原或表达抗原的细胞等与本发明的双特异性抗体反应，进而与施加了标记的抗免疫球蛋白抗体或结合片段反应后，用吸光光度计测定显色色素。例如可以列举夹心 ELISA法等。
作为酶免疫测定法中使用的标记物，能够使用公知的酶标记[酶免疫测定法、医学书院(1987)]。例如使用碱性磷酸酶标记、过氧化物酶标记、荧光素酶标记、或生物素标记等。
夹心ELISA法是使抗体与固相结合后，截留作为检测或测定对象的抗原，使截留的抗原与第2抗体反应的方法。在该ELISA法中，准备与要检测或测定的抗原结合且抗原结合部位不同的2种抗体或抗体片段，其中，使第1抗体或抗体片段预先吸附于板(例如，96孔板)，然后将第2抗体或抗体片段预先用FITC等荧光物质、过氧化物酶等酶、或生物素等标记。使上述吸附了抗体的板与从生物体内分离的细胞或其破碎液、组织或其破碎液、细胞培养上清、血清、胸水、腹水、或眼液等反应后，与标记后的抗体或抗体片段反应，进行根据标记物质的检测反应。根据将浓度已知的抗原阶段性稀释制作的标准曲线，计算被测样品中的抗原浓度。
作为夹心ELISA法中使用的抗体，可以使用多克隆抗体或单克隆抗体的任意一者，也可以使用Fab、Fab’或F(ab)2等抗体片段。作为夹心ELISA 法中使用的2种抗体的组合，可以为结合于不同的表位的单克隆抗体或该抗体片段的组合，也可以为多克隆抗体与单克隆抗体或其抗体片段的组合。
作为荧光免疫测定法，例如利用文献[Monoclonal Antibodies-Principles andpractice,Third Edition,Academic Press(1996)、单克隆抗体实验手册、 KodanshaScientific(1987)]等中记载的方法测定。作为荧光免疫测定法中使用的标记物，可以使用公知的荧光标记[荧光抗体法、Soft Science公司 (1983)]。例如使用FITC或RITC等。
作为发光免疫测定法，例如利用文献[生物发光和化学发光临床检查 42、广川书店(1998)]等中记载的方法测定。作为发光免疫测定法中使用的标记物，可以列举公知的发光体标记，例如使用吖啶酯或咯吩等。
作为蛋白质印迹法，可以通过如下方法测定：利用SDS(十二烷基硫酸钠)-PAGE[Antibodies-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]将抗原或表达抗原的细胞等分级后，使该凝胶印迹于聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或硝基纤维素膜，使该膜与和抗原结合的抗体或抗体片段反应，进而与施加了FITC等荧光物质、过氧化物酶等酶标记、或生物素标记等的抗IgG抗体或其抗体片段反应后，使该标记可视化。以下，示出一例。
首先，将表达具有所需的氨基酸序列的多肽的细胞或组织溶解，在还原条件下以每个泳道的蛋白量计使0.1～30μg通过SDS-PAGE法泳动。然后，将泳动后的蛋白质转印至PVDF膜，用包含1～10％BSA的PBS(以下记作 BSA-PBS)在室温反应30分钟进行封闭操作。这里，使本发明的双特异性抗体反应，用包含0.05～0.1％的Tween-20的PBS(Tween-PBS)清洗，与过氧化物酶标记后的山羊抗小鼠IgG在室温下反应2小时。用Tween-PBS清洗，用ECLWestern Blotting Detection Reagents(Amersham公司制)等检测该抗体所结合的条带，由此检测抗原。作为利用蛋白质印迹法的检测中使用的抗体，可以使用能够与没有保持天然型的立体结构的多肽结合的抗体。
作为理化方法，例如可以通过使作为抗原的CD40和FAP的至少一者与本发明的双特异性抗体结合形成凝集体，并检测该凝集体。作为其它理化方法，也可以使用毛细管法、一维免疫扩散法、免疫比浊法或乳胶免疫比浊法[临床检查法提要、金原出版(1998)]等。
在乳胶免疫比浊法中，如果使用使抗体或抗原敏化的粒径0.1～1μm左右的聚苯乙烯乳胶等载体，利用对应的抗原或抗体产生抗原抗体反应，则反应液中的散射光增加，透射光减少。将该变化作为吸光度或积分球浊度进行检测，由此测定被测样品中的抗原浓度等。
另一方面，表达CD40和FAP的至少一者的细胞的检测或测定中能够使用公知的免疫学检测法，优选使用免疫沉降法、免疫细胞染色法、免疫组织染色法或荧光抗体染色法等。
作为免疫沉降法，使表达CD40和FAP的至少一者的细胞等与本发明的双特异性抗体反应后，加入蛋白G琼脂糖等具有与免疫球蛋白特异性结合能力的载体，使抗原抗体复合体沉降。
或者，也能够通过如下方法进行表达CD40和FAP的至少一者的细胞的检测或测定。首先，使本发明的双特异性抗体固相化于ELISA用96孔板，然后用BSA-PBS封闭。接着，去除BSA-PBS，用PBS充分清洗后，与表达CD40和FAP的至少一者的细胞或组织的溶解液反应。从充分清洗后的板上利用SDS-PAGE用样品缓冲液提取免疫沉降物，通过上述的蛋白质印迹法来检测。
免疫细胞染色法或免疫组织染色法是指如下方法：使表达抗原的细胞或组织等，为了使抗体的透过性良好而根据情况用表面活性剂或甲醇等处理后，与本发明的双特异性抗体反应，进而与施加了FITC等荧光标记、过氧化物酶等酶标记或生物素标记等的抗免疫球蛋白抗体或其结合片段反应后，将该标记可视化，利用显微镜进行观察。另外，可以通过使荧光标记的抗体与细胞反应，通过利用流式细胞仪进行分析的荧光抗体染色法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、单克隆抗体实验手册、Kodansha Scientific(1987)]进行检测。特别是本发明的双特异性抗体可以通过荧光抗体染色法检测在细胞膜上表达的 CD40和FAP的至少一者。
另外，荧光抗体染色法中，在使用FMAT8100HTS系统(Applied Biosystems公司制)等的情况下，可以不分离所形成的抗体-抗原复合体与没有参与抗体-抗原复合体的形成的游离的抗体或抗原而测定抗原量或抗体量。
实施例
以下，利用实施例具体说明本发明，但本发明不限于下述实施例。
[实施例1]可溶性人和猴CD40抗原以及可溶性人FAP抗原的制备
1.人CD40和猴CD40的可溶性抗原的制备
分别利用以下记载的方法制作在C末端添加有FLAG-Fc的人和猴 CD40的细胞外结构域蛋白。将编码人CD40细胞外结构域的碱基序列示于序列编号1，将由该碱基序列推测的氨基酸序列示于序列编号2，将编码猴CD40细胞外结构域的碱基序列示于序列编号3，将由该碱基序列推测的氨基酸序列示于序列编号4。
(1)FLAG-Fc-人CD40和FLAG-Fc-猴CD40载体的制作
基于人CD40基因序列(Genbank登录编号：NM＿001250、序列编号5；将该基因所编码的氨基酸序列示于序列编号6)制作包含序列编号1所示的碱基序列的人CD40的细胞外结构域的基因片段。
利用限制性内切酶KpnI和XbaI消化包含FLAG-tag和人IgG的Fc区的INPEP4载体(Biogen-IDEC公司制)，将添加序列编号1所示的碱基序列的第1～60位的碱基序列构成的人CD40信号序列编号区的该细胞外结构域的基因片段插入至适当部位，制作人CD40-FLAG-Fc表达载体。
通过同样的方法，基于从猴外周血单核细胞(PBMC)克隆的猴CD40基因的碱基序列(序列编号7；将该基因所编码的氨基酸序列示于序列编号8) 制作含有由序列编号3所示的碱基序列构成的猴CD40的细胞外结构域的基因片段的猴CD40-FLAG-Fc表达载体。
(2)人和猴CD40-FLAG-Fc蛋白质的制作
使用FreeStyle(商标)293表达系统(Thermo Fisher公司制)，将1-(1)中制作的人CD40-FLAG-Fc表达载体导入HEK293细胞进行培养，利用瞬时表达体系表达蛋白质。在载体导入5天后回收培养上清，用孔径0.22μm的膜过滤器(Millipore公司制)过滤。
将该培养上清用Protein A树脂(MabSelect、GE health care公司制)进行亲和纯化。将吸附于蛋白A树脂的抗体用Dulbecco磷酸缓冲生理盐水 [D-PBS(-)无Ca和Mg，液体；以下记作D-PBS(-)。Nacalai Tesque公司制] 清洗，用20mM柠檬酸钠、50mM氯化钠缓冲液(pH3.4)洗脱，回收到包含 1M磷酸钠(pH7.0)的试管中。
然后，通过利用VIVASPIN(Sartrius stealin公司制)的超滤将缓冲液置换为D-PBS(-)后，用孔径0.22μm的膜过滤器Millex-Gv(Millipore公司制)过滤灭菌，制作人CD40-FLAG-Fc蛋白。用同样的方法，使用1-(1)中制作的猴 CD40-FLAG-Fc表达载体制作猴CD40-FLAG-Fc蛋白。取得的蛋白质的浓度通过测定波长280nm的吸光度，并使用根据各蛋白质的氨基酸序列推测的吸光系数来计算。
(3)人和猴CD40-GST载体的制作
用限制性内切酶BglII和KpnI消化包含GST区域的N5载体(Biogen-IDEC公司制)，将由1-(1)记载的序列编号1所示的碱基序列构成的人CD40的细胞外结构域的基因片段插入适当的部位，制作人CD40-GST 表达载体。用同样的方法，制作包含由序列编号3所示的碱基序列构成的细胞外结构域的基因片段的猴CD40-GST表达载体。
(4)人和猴CD40-GST蛋白质的制作
将1-(3)中制作的人CD40-GST载体用与1-(2)同样的方法导入HEK293 细胞，培养该细胞后，将培养上清用膜过滤器过滤。使该培养上清与 Glutathione Sepharose 4B(GEHealthcare公司制)反应，用D-PBS(-)清洗，作为洗脱缓冲液使用含10mM谷胱甘肽50mMTris-HCI(pH8.0)进行亲和纯化。
对洗脱后的融合蛋白溶液，用与1-(2)同样的方法利用超滤和膜过滤器进行过滤灭菌，得到人CD40-GST蛋白质。另外，使用猴CD40-GST载体，用同样的方法得到猴CD40-GST蛋白质。取得的蛋白质的浓度通过测定波长280nm的吸光度，使用由各蛋白质的氨基酸序列推测的吸光系数算出。
2.人和小鼠FAP的可溶性抗原的制备
通过以下记载的方法制作添加了FLAG-Fc或GST的人和小鼠FAP的细胞外结构域蛋白质。将编码人FAP细胞外结构域的碱基序列表示为序列编号9，将由该碱基序列推测的氨基酸序列表示为序列编号10，将编码小鼠FAP细胞外结构域的碱基序列表示为序列编号11，将由该碱基序列推测的氨基酸序列表示为序列编号12。
根据序列编号13所示的人FAP基因(Genbank Accession Number：NM ＿004460、将该基因所编码的氨基酸序列表示为序列编号14)和序列编号15 所示的小鼠FAP基因(Genbank Accession Number：NM＿007986、将该基因所编码的氨基酸序列表示为序列编号16)，与1-(1)和(2)中记载的方法同样操作，分别得到人和小鼠FAP-FLAG-Fc蛋白质。
另外，与1-(3)和(4)中记载的方法同样操作，分别得到人和小鼠FAP-GST 蛋白质。取得的蛋白质的浓度通过测定波长280nm的吸光度，使用由各蛋白质的氨基酸序列推测的吸光系数算出。
[实施例2]人FAP表达HEK293细胞的制作
使用In-Fusion HD Cloning Kit(Takara-bio公司制)，将序列编号9表示的人FAP的基因插入pUC载体(Takara-bio公司制)，得到目标FAP表达载体Tn-pMug-Hygro-人FAP。
使用FuGENE HD Transfection Reagent(Promega公司制)将取得的人 FAP表达载体Tn-pMug-Hygro-人FAP导入HEK293细胞。为了筛选表达载体导入细胞，置换为含有1mg/mLHygromycin的培养基，取得耐药细胞。
从取得的药剂筛选细胞中，使用细胞分选仪SH800(SONY公司制)将与抗FAP抗体西罗珠单抗(Sibrotuzumab)结合的FAP高表达组分进行单细胞分离。通过FACS Canto(商标)II(BD Bioscience)确认取得的克隆的FAP表达。以下将获得的人FAP表达细胞记为人FAP-HEK293。
[实施例3]抗CD40单克隆抗体和表达载体的取得
1.CD40免疫人抗体M13噬菌体文库的制作
在人抗体产生小鼠[Ishida&Lonberg,IBC’s 11th Antibody Engineering,Abstract 2000；Ishida,I.et al.,Cloning&Stem Cells 4,85-96(2002) 和石田功(2002)实验医学20，6，846-851]中，作为免疫原，将实施例1中制作的人CD40-FLAG-Fc在进行腹腔内投予合计4次。仅在初次免疫时，作为佐剂添加Alum凝胶(2mg/只)和百日咳疫苗(1×109个/只)。
在初次免疫2周后进行第2次免疫，在其1周后进行第3次免疫，在第3次免疫10天后进行最终免疫，最终免疫4天后解剖小鼠，以外科方式摘取脾脏。将摘出的脾脏放置于细胞滤网(Falcon公司制)上，一边用硅棒轻轻捣碎，一边将细胞移到试管中，进行离心分离，使细胞沉淀后，与红细胞除去试剂(Sigma Aldrich公司制)在冰中反应3分钟，进一步进行离心分离。
使用RNeasy Mini kit(QIAGEN公司制)从所得到的脾脏细胞中提取 RNA，用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech公司制)扩增cDNA，进而用PCR扩增VH基因片段。将该VH基因片段和含有作为人的抗体germ-line序列的、编码L6序列的氨基酸序列(VL)的由序列编号17所示的碱基序列的VL基因片段插入噬菌粒pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia公司制)，将大肠杆菌TG1(Lucigen公司制)进行转化得到质粒。
此外，L6序列由序列编号18所示的氨基酸序列构成，编码人抗体的轻链可变区(VL)，该VL的CDR1、2和3(分别也表示为LCDR1、2和3)的氨基酸序列分别由序列编号19、20和21表示。
使所得到的质粒感染VCSM13抗干扰辅助噬菌体(Interference ResistantHelper Phage)(Agilent Technologies公司制)，由此得到具有由L6序列构成的VL基因、VH基因被文库化的CD40免疫人抗体M13噬菌体文库。
2.抗CD40单克隆抗体的取得
使用该CD40免疫人抗体M13噬菌体文库，通过下述的噬菌体展示法，取得具有包含L6氨基酸序列的VL和包含所需的氨基酸序列的VH的抗 CD40单克隆抗体。将实施例1中取得的人CD40-GST固相化，使用SuperBlock封闭缓冲液(Thermo Fisher公司制)，使将没有结合人CD40-GST 的部位封闭了的MAXISORP STARTUBE(NUNC公司制)与人抗体M13噬菌体文库在室温下反应1～2小时，用D-PBS(-)和含有0.1％Tween20的PBS(以下记作PBS-T。和光纯药工业株式会社制)分别清洗3次后，用0.1M的 Gly-HCl(pH2.2)洗脱噬菌体。
使所洗脱的噬菌体感染TG1感受态细胞并扩增，再次与固相化于 MAXISORPSTARTUBE的人CD40-GST反应，用D-PBS(-)和PBS-T分别清洗5次后，利用0.1M的Gly-HCl(pH2.2)进行噬菌体的洗脱。
重复该操作2次或3次，将提呈与人CD40特异性结合的scFv的噬菌体浓缩。使浓缩了的噬菌体感染TG1，接种于SOBAG培养板(2.0％胰蛋白胨、0.5％酵母浸膏(Yeastextract)、0.05％NaCl、2.0％葡萄糖、10mM MgCl2、 100μg/mL氨苄青霉素、1.5％琼脂)形成菌落。
将菌落接种培养后，使其感染VCSM13抗干扰辅助噬菌体(InterferenceResistant Helper Phage)，再次培养，由此得到单克隆的噬菌体。使用所得到的单克隆的噬菌体，用ELISA选择与人和猴CD40-GST都结合的克隆。
在ELISA时，使用SuperBlock封闭缓冲液(Thermo Fisher公司制)将实施例1的人或猴CD40-GST在各孔中固相化，利用将没有结合人或猴 CD40-GST的部位封闭了的MAXISORP(NUNC公司制)。在各孔中加入各噬菌体克隆，在室温下反应30分钟后，将各孔用PBS-T清洗3次。
然后，用含有10％Block Ace(大日本制药株式会社制)的PBS-T将由辣根过氧化物酶标记后的抗M13抗体(GE Healthcare公司制)稀释至5000倍，在各孔中各加入50μL，在室温下孵育30分钟。将微孔板用PBS-T清洗4 次后，将TMB显色底物液(DAKO公司制)在各孔中各加入50μL，在室温下，孵育10分钟。在各孔中加入2N HCl溶液(50μL/孔)停止显色反应，用酶标仪(Emax；Molecular Devices公司)测定波长450nm(参照波长570nm)时的吸光度。
对与人和猴CD40都结合的克隆，进行序列解析，取得具有包含L6氨基酸序列的VL的抗CD40抗体R1090S55A。取得的CD40抗体R1090S55A 的编码VH的全碱基序列表示为序列编号22，由该碱基序列推测的氨基酸序列表示为序列编号23，VH的CDR1～3(以下有时也记作HCDR1～3)的氨基酸序列表示为序列编号24、25、26。
3.抗CD40单克隆抗体表达载体的取得
制作重组了所取得的抗CD40抗体R1090S55A的基因的可溶性IgG的表达载体。首先，将编码R1090S55A的VL的L6基因亚克隆到N5KG4PE R409K载体(记载于国际公开第2006/033386号)的BglII-BsiWI位点。
然后，将R1090S55A的VH基因亚克隆到N5KG4PE R409K载体的 SalI-NheI位点，得到具有人IgG4PE R409K的恒定区的抗CD40单克隆抗体 R1090S55A的表达载体的N5KG4PER409K_R1090S55A。
4.阳性对照抗体表达载体的取得
为了制作国际公开第2003/040170号中记载的抗CD40单克隆抗体 21.4.1(CP870,893)作为抗CD40抗体的阳性对照抗体，制作表达载体。分别将21.4.1的VH的碱基序列表示为序列编号27，将由该序列推测的VH 的氨基酸序列表示为序列编号28。另外，分别将21.4.1的VL的碱基序列表示为序列编号29，将由该序列推测的VL的氨基酸序列表示为序列编号 30。
合成编码21.4.1的VH和VL的基因，分别亚克隆到N5KG2载体(记载于国际公开第2003/033538号)的SalI-NheI和BglII-BsiWI位点，得到具有人IgG2的恒定区的抗CD40单克隆抗体21.4.1的表达载体 N5KG2_21.4.1。
[实施例4]抗FAP单克隆抗体和表达载体的取得
1.人原初抗体M13噬菌体文库的制作
从源自人PBMC的cDNA，用PCR扩增VH基因片段。该VH基因片段和含有序列编号17表示的L6的氨基酸序列的VL基因片段一起插入将噬菌粒pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia公司制)的标签序列变更为 FLAG-His标签和胰蛋白识别序列[Nature Biotechnoloy 2001,19,75-78]的载体，将大肠杆菌TG1(Lucigen公司制)进行转化得到质粒。
使所得到的质粒感染VCSM13抗干扰辅助噬菌体(Interference ResistantHelper Phage)(Agilent Technologies公司制)，由此得到具有由包含L6碱基序列的VL基因且VH基因被文库化的人原初抗体M13噬菌体文库。
2.FAP免疫人抗体M13噬菌体文库的制作
在人抗体产生小鼠[Ishida&Lonberg,IBC’s 11th Antibody Engineering,Abstract 2000；Ishida,I.et al.,Cloning&Stem Cells 4,85-96(2002) 和石田功(2002)实验医学20，6，846-851]中，作为免疫原，将实施例1中制作的GST-人FAP、GST-小鼠FAP，或Fc-人FAP进行20μg/只或50μg/ 只投予合计4次。仅在初次免疫时，作为佐剂添加Alum凝胶(0.25mg/只或 2mg/只)和灭活百日咳菌悬浊液(Nacalai公司制)(1×109个/只)。
在初次免疫2周后进行第2次免疫，在其1周后进行第3次免疫，在第3次免疫2周后进行最终免疫，最终免疫4天后解剖小鼠，外科摘取淋巴结或脾脏。将摘出的淋巴结或脾脏匀浆后，通过细胞滤网(Falcon公司制) 将细胞移到试管中，进行离心分离，使细胞沉淀。所得的细胞与红细胞除去试剂(Sigma Aldrich公司制)混合，在37℃热水浴中反应1分钟后，用 MDEM培养基(Sigma Aldrich公司制)进行稀释，进一步进行离心分离。
使用RNeasy Mini Plus kit(QIAGEN公司制)从得到的淋巴结细胞或脾脏细胞提取RNA，用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech公司制)扩增cDNA，再用PCR扩增VH基因片段。将该VH基因片段和含有序列编号17表示的L6的氨基酸序列的VL基因片段插入将噬菌粒pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia公司制)的标签序列变更为FLAG-His标签和胰蛋白识别序列的载体，将大肠杆菌TG1(Lucigen公司制)进行转化得到质粒。
使所得到的质粒感染VCSM13抗干扰辅助噬菌体(Interference ResistantHelper Phage)(Agilent Technologies公司制)，由此得到具有由L6序列构成的VL基因且VH基因被文库化的FAP免疫人抗体M13噬菌体文库。
3.抗FAP单克隆抗体的取得
使用人原初抗体M13噬菌体文库和FAP免疫人抗体M13噬菌体文库通过下述的噬菌体展示法，取得具有包含L6氨基酸序列的VL的抗FAP单克隆抗体。将人FAP-His(BioLegend公司制)、小鼠FAP(R&D Systems公司)、或实施例1制作的Fc-人FAP或Fc-小鼠FAP固相化，使用SuperBlock封闭缓冲液，使封闭的MAXISORP STARTUBE与人原初抗体M13噬菌体文库或FAP免疫人抗体M13噬菌体文库在室温下反应1～2小时，用D-PBS(-) 和PBS-T清洗后，用0.25％胰蛋白(Nacalai公司制)洗脱噬菌体。使所洗脱的噬菌体感染TG1感受态细胞并扩增，然后，再次与固相化于MAXISORP STARTUBE的Fc-人FAP、Fc-小鼠FAP、人FAP-His、或小鼠FAP反应，并进行清洗和洗脱。重复该操作，将提呈与人FAP和小鼠FAP特异性结合的抗体分子的噬菌体浓缩。使浓缩了的噬菌体感染TG1，接种于SOBAG培养板(2.0％胰蛋白胨、0.5％酵母浸膏(Yeast extract)、0.05％NaCl、2.0％葡萄糖、10mM MgCl2、100μg/mL氨苄青霉素、1.5％琼脂)形成菌落。
将菌落接种培养后，使其感染VCSM13抗干扰辅助噬菌体(InterferenceResistant Helper Phage)，再次培养，由此得到单克隆的噬菌体液。使用所得到的单克隆的噬菌体液，用ELISA选择与人和小鼠FAP结合的克隆。
在ELISA时，使用SuperBlock封闭缓冲液(Thermo Fisher公司制)将抗 GST抗体(Rockland公司制)在各孔中固相化后，利用使人 FAP-His(BioLegend公司制)、小鼠FAP(R&D Systems公司制)或实施例1制作的GST-人FAP或GST-小鼠FAP结合的MAXISORP(NUNC公司制)。在各孔中加入各噬菌体液，在室温下反应60分钟后，将各孔用PBS-T清洗3 次。
然后，用含有10％Block Ace(大日本制药株式会社制)的PBS-T将由辣根过氧化物酶标记后的抗M13抗体(GE Healthcare公司制)稀释至1000倍，在各孔中各加入50μL，在室温下孵育30分钟。将微孔板用PBS-T清洗3 次后，将TMB显色底物液(DAKO公司制)在各孔中各加入50μL，在室温下，孵育10分钟。在各孔中加入2N HCl溶液(50μL/孔)停止显色反应，用酶标仪(EnSpire：Perkinelmer公司制)测定波长450nm(参照波长570nm)时的吸光度。
对与人和小鼠FAP结合的克隆，进行序列解析，取得具有包含L6氨基酸序列的VL的抗FAP抗体。表1示出编码取得的各抗FAP抗体的VH的全碱基序列和由该碱基序列推测的氨基酸序列、以及HCDR1～3的氨基酸序列。
[表1]
抗FAP抗体VH的序列信息
Figure BDA0003354064220000661
Figure BDA0003354064220000671
4.阳性对照抗体表达载体的取得
制作国际公开第2001/68708号中记载的具有抗FAP单克隆抗体西罗珠单抗的可变区的抗体作为抗FAP抗体的阳性对照抗体。分别将西罗珠单抗的VH的碱基序列表示为序列编号56，将由该序列推测的VH的氨基酸序列表示为序列编号57。另外，分别将西罗珠单抗的VL的碱基序列表示为序列编号58，将由该序列推测的VL的氨基酸序列表示为序列编号59。
合成西罗珠单抗的序列编号56表示的VH的碱基序列和序列编号58 表示的VL的碱基序列的基因片段，插入至pCI载体(Promega公司)的适当的限制性内切酶位点，得到西罗珠单抗表达载体。
[实施例5]与CD40和FAP结合的双特异性抗体的制作
用以下所述的方法制作具有图1所示的结构、与人和猴CD40以及人 FAP结合的双特异性抗体。双特异性抗体的形状采用记载于国际公开第 2009/131239号的形状。
以下步骤中制作的双特异性抗体，作为IgG部分的重链恒定区，具有 IgG4PER409KdCH(碱基序列由序列编号60表示、氨基酸序列由序列编号 61表示)，作为与IgG部分的重链C末端结合的Fab的CH1的IgG4的CH1(碱基序列由序列编号62表示，氨基酸序列由序列编号63表示)。另外，具有含有编码于L6的VL的轻链。
表2示出该双特异性抗体的名称、用于该双特异性抗体制作的抗CD40 抗体的克隆和抗FAP抗体的克隆。
[表2]
CD40-FAP双特异性抗体中包含的抗体克隆
双特异性抗体的名称 VH1的克隆 VH2的克隆
Ct-R1090-Fa018 R1090S55A Fa018
Ct-R1090-Fa1007 R1090S55A Fa1007
Ct-R1090-Fa1013 R1090S55A Fa1013
Ct-R1090-Fa1014 R1090S55A Fa1014
Ct-R1090-Fa1046 R1090S55A Fa1046
1.双特异性抗体的表达载体的制作
用以下所述的方法制作表2记载的双特异性抗体的表达载体。
基于实施例3取得的抗CD40抗体R1090S55A和表2记载的抗FAP抗体克隆的共同VL(L6)的氨基酸序列(序列编号18)，进行最适合哺乳类细胞的表达的密码子转换，获得编码L6氨基酸序列的碱基序列(序列编号17)。人工合成序列编号17表示的碱基序列，克隆至包含信号序列的pCI载体 (Promega公司)的适当限制性内切酶位点，得到轻链表达载体。
然后，将用含有编码序列编号22记载的抗CD40抗体R1090S55A的 VH的碱基序列、编码序列编号60记载的IgG4PE R409K的CH的碱基序列、编码序列编号62记载的IgG4的CH1的碱基序列的人工合成基因和PCR扩增的编码表1记载的抗FAP抗体克隆的VH的碱基序列插入pCI载体 (Promega公司)，获得重链表达载体。表3示出编码取得的CD40-FAP双特异性抗体的重链的碱基序列和由该碱基序列推测的氨基酸序列。
[表3]
CD40-FAP双特异性抗体中包含的重链碱基序列和氨基酸序列
双特异性抗体的名称 重链碱基序列 重链氨基酸序列
Ct-R1090-Fa018 序列编号64 序列编号65
Ct-R1090-Fa1007 序列编号66 序列编号67
Ct-R1090-Fa1013 序列编号68 序列编号69
Ct-R1090-Fa1014 序列编号70 序列编号71
Ct-R1090-Fa1046 序列编号72 序列编号73
2.双特异性抗体的制备
使用实施例5的1.制作的双特异性抗体的表达载体，通过以下的方法分别表达、纯化双特异性抗体。
将CD40-FAP双特异性抗体的重链表达载体和包含编码L6的碱基序列的轻链表达载体通过Expi293(商标)表达系统(Expression System)(Thermo Fisher公司)在Expi293细胞中进行共基因导入，在16小时后添加转染增强剂(Transfection Enhancer)，利用瞬时表达体系表达双特异性抗体。
在载体导入4天后回收培养上清，用孔径0.22μm的膜过滤器(Millipore 制)过滤后，用蛋白A树脂(MabSelect SuRe、GE health care公司)将抗体进行亲和性纯化。使用D-PBS(-)作为清洗液。将吸附于蛋白A的抗体用20mM 柠檬酸钠-50mM NaCl缓冲液(pH3.0)洗脱，回收到包含200mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)的试管中。
然后，使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司制)，通过超滤将缓冲液置换成D-PBS(-)后，用孔径0.22μm的膜过滤器Millex-Gv(Millipore公司制)过滤灭菌，取得CD40-FAP双特异性抗体。测定这样得到的抗体溶液的波长 280nm的吸光度，使用由各抗体的氨基酸序列推测的吸光系数算出纯化抗体的浓度。
[实施例6]对照抗体的制作
分别使用实施例3-3制作的N5KG4PE R409K_R1090S55A、实施例3-4 制作的N5KG2_21.4.1和实施例4-4制作的西罗珠单抗的各表达载体，利用和实施例5-2同样的方法制作具有IgG4PE R409K的CH的抗CD40单克隆抗体R1090S55A和21.4.1、以及抗FAP单克隆抗体西罗珠单抗。
[实施例7]利用ELISA评价双特异性抗体的FAP结合性
按照以下的程序利用ELISA评价实施例5取得的CD40-FAP双特异性抗体的对人FAP的结合性。
将实施例1制作的人FAP-GST在10μg/mL的浓度下稀释至D-PBS(-)，以50μL/孔分注至96孔NUNC―IMMUNO PLATE(Thermo Fisher Scientific 公司制)，4℃静置一晚。用200μL/孔的D-PBS(-)清洗孔3次后，50μL/孔添加用来封闭的1％(w/v)BSA-PBS(-)pH7.0(Nacalai公司制)，室温静置1小时。
除去孔中的溶液，分别以50μL/孔添加稀释至0.00064、0.0032、0.016、 0.08、0.4、2、10或50μg/mL的CD40-FAP双特异性抗体至孔中。室温静置 2小时后，用200μL/孔的不含KCl的0.05w/v％-tPBS(1x)(pH7.2)(Nacalai 公司制)清洗3次，添加50μL/孔作为二次抗体的Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG,FcγFragment specific(JacksonImmunoReseach公司制)用 1％(w/v)BSA-PBS(-)pH7.0(Nacalai公司制)稀释至1/1000倍的溶液，室温静置1小时。
用200μL/孔的不含KCl的0.05w/v％-tPBS(1x)(pH7.2)(Nacalai公司制) 清洗3次孔之后，添加100μL/孔的等量混合substrate reagent pack(R&D systems公司制)的A液和B液得到的混合液，静置5分钟。添加50μL/孔的 Stop solution(R&D systems公司制)使反应停止，使用EPOCH2酶标仪 (Biotek公司制)测定450nm和570nm的吸光度，计算从450nm的吸光度减去570nm的吸光度得到的值。
另外，阴性对照使用编码同型对照抗体[Clin Cancer Res 2005,11(8), 3126-3135记载的2,4-dinitrophenol(DNP)IgG4抗体]的载体，使用根据实施例5记载的方法制作的IgG4抗体R409K突变体(人IgG4抗体中，将第409 位的R取代为K的抗体)(以下记作抗DNP抗体)。
图2表示测定CD40-FAP双特异性抗体的对人FAP的结合性而得到的结果。如图2所示，确认到实施例5制作的CD40-FAP双特异性抗体均对固相化的FAP-GST结合。
[实施例8]利用流式细胞仪进行的双特异性抗体的FAP结合性评价
按照以下方法评价实施例5制作的CD40-FAP双特异性抗体对人胚肾细胞HEK293细胞(ATCC NO.CRL-1573)和实施例2所得到的人 FAP/HEK293细胞的结合性。
将HEK293细胞或FAP/HEK293细胞以1×106cells/mL的浓度悬浮于染色缓冲液(含有1％BSA和2％FBS的D-PBS(-)，也记载为SB)中，以50μL/ 孔分注到96孔圆底板(Falcon公司制)中。离心分离(1500rpm、4℃、3分钟) 后，除去上清，向沉淀中以50μL/孔以终浓度为0.01、0.1、1或10μg/mL的方式加入实施例5中得到的抗体使其悬浮后，在冰温下静置30分钟。
进而进行离心分离(2000rpm、4℃、2分钟)除去上清，将沉淀用200μL/ 孔的SB清洗3次后，以50μL/孔加入1μg/mL的山羊F(ab’)2抗人IgG(γchain specific)别藻蓝蛋白(APC)Conjugate(Southern Biotech公司制)，在冰温下孵育30分钟。用SB清洗2次后，悬浮于200μL/孔的SB中，用流式细胞仪 FACSCANTO II、(Becton Dickinson公司制)测定各细胞的荧光强度。阴性对照使用DNP抗体。
图3的(A)示出对HEK293细胞进行测定的结果，图3的(B)示出对人 FAP/HEK293细胞进行测定的结果。通过图3的(A)和图3的(B)，示出被测抗体对HEK293细胞均不结合或极其微弱的结合性。另一方面，对人 FAP/HEK293细胞，从0.01μg/mL的低浓度就结合。
以上结果示出实施例5中制作的CD40-FAP双特异性抗体均为与FAP 特异性结合的抗体。
[实施例9]通过利用流式细胞仪的CD95表达量解析的CD40单克隆抗体的CD40信号诱导活性的评价
以Ramos细胞上的CD95的表达量增加作为指标，如下用FCM法评价实施例6中得到的CD40单克隆抗体R1090S55A和21.4.1的CD40信号诱导活性。
将2×106cells/mL的Ramos细胞以50μL/孔接种于U底96孔板(Falcon 公司制)，添加50μg/mL用包含10％FBS的RPMI1640培养基(Sigma Aldrich 公司制)稀释了的0.2、2或20μg/ml(终浓度0.1、1或10μg/ml)的被测抗体，在37℃、5.0％二氧化碳下培养16小时。
离心分离(2000rpm、4℃、2分钟)后，除去上清，将沉淀用200μL/孔的 SB清洗3次。离心分离(2000rpm、4℃、2分钟)后，除去上清，向沉淀中加入PE小鼠抗人CD95(BectonDickinson公司制)抗体使其悬浮后，在冰温下静置30分钟。
进而离心分离(2000rpm、4℃、2分钟)，除去上清，将沉淀用200μL/ 孔的SB清洗3次后，将稀释100倍的7-氨基放线菌素(7AAD)(Becton Dickinson公司制)悬浮于200μL/孔的SB中，用流式细胞仪FACSCANTO II(Becton Dickinson公司制)测定Ramos细胞上的CD95的荧光强度。阴性对照使用抗DNP抗体。
图4表示抗CD40抗体21.4.1和R1090S55A的评价结果。由图4可知，激动性抗CD40单克隆抗体21.4.1相比于抗DNP抗体，Ramos细胞上的 CD95的表达量有所增加。另一方面，抗CD40抗体单克隆R1090S55A为与抗DNP抗体同等的CD95表达量。
即表明，仅21.4.1为诱导CD40的信号的激动剂抗体，实施例6中所取得的抗CD40单克隆抗体R1090S55A为不会诱导CD40信号的非激动剂抗体。另外，在存在CD40配体的条件下进行同样的试验，结果抗CD40单克隆抗体R1090S55A不抑制通过CD40配体的Ramos细胞上的CD95的表达量的上升(无数据记载)。即表明，抗CD40单克隆抗体R1090S55A为不抑制通过CD40配体的CD40信号诱导的非拮抗性抗体。
[实施例10]通过利用流式细胞仪的CD95表达量解析的CD40-FAP双特异性抗体的CD40信号诱导活性的评价
以Ramos细胞上的CD95的表达量增加作为指标，如下用FCM法评价实施例5中得到的CD40-FAP双特异性抗体在FAP阳性或阴性细胞共存下向Ramos细胞的CD40信号诱导活性。
将4×106cells/mL的Ramos细胞以25μL/孔接种于U底96孔板(Falcon 公司制)，以50μL/孔添加用包含10％FBS的RPMI1640培养基(Sigma Aldrich 公司制)稀释了的0.002、0.02、0.2、2或20μg/ml(终浓度0.001、0.01、0.1、 1或10μg/ml)的被测抗体，进一步以25μL/孔添加HEK293细胞或人 FAP/HEK293细胞4×106cells/mL，在37℃、5.0％二氧化碳下培养16小时。
离心分离(2000rpm、4℃、2分钟)后，除去上清，将沉淀用200μL/孔的 SB清洗3次。离心分离(2000rpm、4℃、2分钟)后，除去上清，向沉淀中加入PE小鼠抗人CD95(BectonDickinson公司制)抗体和FITC小鼠抗人 CD20(Becton Dickinson公司制)使其悬浮后，在冰温下静置30分钟。
进而离心分离(2000rpm、4℃、2分钟)，除去上清，将沉淀用200μL/ 孔的SB清洗3次后，将稀释100倍的7-氨基放线菌素(7AAD)(Becton Dickinson公司制)悬浮于200μL/孔的SB中，用流式细胞仪FACSCANTO II(Becton Dickinson公司制)测定存在于CD20阳性组分的Ramos细胞上的 CD95的荧光强度。阴性对照使用抗DNP抗体，阳性对照使用21.4.1。
图5的(A)示出与HEK293细胞共培养的Ramos细胞的结果，图5的(B) 示出与人FAP/HEK293细胞共培养的Ramos细胞的结果。
由图5的(A)、图5的(B)可知，在所有共培养体系实验中，阴性对照的抗DNP抗体没有使Ramos细胞上的CD95的表达量增加，但是阳性对照的抗CD40抗体21.4.1使Ramos细胞上的CD95表达量增加。
另外，如图5的(A)所示，在共培养FAP阴性的HEK293细胞和Ramos 细胞的情况下，所有的CD40-FAP双特异性抗体均没有诱导CD40信号。另一方面，如图5的(B)所示，显示出在共培养FAP阳性的人FAP/HEK293细胞和Ramos细胞的情况下，CD40-FAP双特异性抗体使Ramos细胞上的 CD95的表达量增加，且诱导CD40信号。
这些结果表明，如图5的(A)所示，CD40-FAP双特异性抗体单独与Ramos细胞上的CD40结合时，未诱导CD40信号，如图5的(B)所示，仅在共存FAP阳性细胞时，诱导CD40信号。
如图4所示，可知确认到亲本抗体R1090S55A在Ramos细胞上没有诱导CD40信号，但CD40-FAP双特异性抗体具有亲本抗体所不具有的CD40 信号诱导活性。
由此，表明本发明的CD40-FAP双特异性抗体在如肿瘤和淋巴组织等存在表达FAP细胞的部位特异性地对B细胞等CD40阳性细胞诱导信号。
[实施例11]对树突状细胞的CD40信号诱导活性的评价
以树突状细胞上的活化标记物或树突状细胞产生的细胞因子的表达量增加为指标，用FCM法和ELISA法评价实施例5中得到的CD40-FAP双特异性抗体在FAP阳性或阴性细胞共存下向树突状细胞的CD40信号诱导活性。阴性对照使用抗DNP抗体，阳性对照使用21.4.1。
1.细胞的制备
解冻Untouched Frozen NPB―CD14+Monocytes(AllCells公司制)后，以包含10％血清、青霉素-链霉素(Nacalai社制)、100ng/mL的重组人 GM-CSF(R&D公司制)和100ng/mL的重组人IL4(R&D公司制)的 RPMI1640(Nacalai公司制)悬浮成1×106cells/mL的细胞密度，以3mL/孔添加至6well Flat Bottom Ultra-Low attachment Surface(CORNING公司制)。
培养2天和4天后，更换至新鲜培养基。培养开始7天后，回收细胞， 1500rpm、室温下离心分离5分钟。将沉淀细胞在包含100ng/mL的1L-4和 100ng/mL的GM-CSF的RPMI1640培养基中调制成2×105cells/mL，往24well Flat Bottom Ultra-Low attachment Surface(CORNING公司制)各添加250μL/ 孔。进而将人FAP/HEK293细胞或HEK293细胞调制成4×105/mL，分别添加125μL/孔。以125μL/孔添加终浓度调制为0.01、0.1、1、10μg/mL的评价抗体，在37℃、存在5％二氧化碳的条件下培养2天。
2.通过FCM法的树突状细胞上的活化标记物的表达测定
离心分离(2000rpm、4℃、5分钟)培养了2天的细胞。除去上清，各添加150μL1％(w/v)BSA-PBS(-)、pH7.0 without KCl(Nacalai公司制)(也记载为 FACS Buffer)。添加并悬浮BD Fc Block Reagent for Human(BD Pharmingen 公司制)，在冰上静置5分钟。
然后各添加50μL细胞悬浮液于U底96孔板(FALCON公司制)。分别以50μL/孔添加悬浮于FACS Buffer的标记抗体Brilliant Violet 421抗人 CD80抗体(Biolegend公司制)、PE人CD83抗体(Beckman Coulter公司制)、 PE小鼠抗人CD86(BD Pharmingen公司制)、FITC小鼠抗人HLA-ABC(BD Pharmingen公司制)、或APC抗人CD45(Biolegend公司制)，4℃下孵育30 分钟。
离心分离(1200rpm、4℃、2分钟)后，倾析上清。以200μL的FACS Buffer 清洗2次沉淀细胞。然后，以100μL的FACS缓冲液重悬细胞，用FACS Canto II(BD Biosciences公司制)测定荧光强度。解析上使用数据分析软件 FlowJo9.6.4，对于CD45阳性细胞上的CD80、CD83、CD86和HLA-ABC，经由结合抗体的平均应该强度(MFI)评价表达量。
3.通过ELISA法的树突状细胞产生IL-12的表达测定
作为树突状细胞的活性化指标，验证产生的IL-12的表达量变化。回收实施例11-1培养2天后的细胞的培养上清，按照推荐方法使用human IL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go！(Affymetrix公司制)，评价IL-12的表达量。
4.评价结果
与HEK293细胞共培养的树突状细胞的CD83、CD86、HLA-ABC和 IL-12的表达量增加的结果分别示于图6的(A)、图7的(A)、图8的(A)和图 9的(A)、图10的(A)。另外，与人FAP/HEK293细胞共培养的树突状细胞的CD83、CD80、CD86、HLA-ABC和IL-12的表达量的结果分别示于图6 的(B)、图7的(B)、图8的(B)、图9的(B)和图10的(B)。
所有图中，阳性对照抗CD40单克隆抗体21.4.1相比于阴性对照的抗 DNP抗体，树突状细胞表达的标记物、细胞因子的表达均有所增加。
另外，如图6的(A)、图7的(A)、图8的(A)、图9的(A)和图10的(A) 所示，在FAP阴性的HEK293细胞与树突状细胞的共培养下，所有的 CD40-FAP双特异性抗体均未使树突状细胞上的CD83、CD80、CD86和 HLA-ABC以及可溶性的IL-12的表达量增加，没有诱导CD40信号。另一方面，如图6的(B)、图7的(B)、图8的(B)、图9的(B)和图10的(B)所示，显示出在共培养FAP阳性的人FAP/HEK293细胞和Ramos细胞的情况下， CD40-FAP双特异性抗体均使树突状细胞上的CD83、CD80、CD86和 HLA-ABC以及可溶性的IL-12的表达量增加，并诱导CD40信号。
由此表明，本发明的CD40-FAP双特异性抗体在如肿瘤和淋巴组织等存在表达FAP细胞的部位特异性地向树突状细胞等CD40阳性细胞诱导信号。结合实施例10的结果，显示出本发明的CD40-FAP双特异性抗体与细胞类型无关地，对CD40阳性的免疫细胞诱导CD40信号。
[实施例12]取代了N型糖链加成氨基酸残基的CD40-FAP双特异性抗体的制作
实施例4取得的抗FAP抗体克隆中，序列编号52表示的Fa1046的重链氨基酸序列由于框架上具有N型糖链加成氨基酸残基，通过以下方法取代该氨基酸残基制作变异体。
由于将序列编号52表示的FAP抗体克隆FA1046的VH序列内包含的 N型糖链加成氨基酸残基被取代为代替的氨基酸残基，因此进行最合适在哺乳类细胞中表达的密码子转换，获得对应的碱基序列。表4记载了制作的变异体的克隆名称和编码各VH的碱基序列以及氨基酸序列。
[表4]
取代N结合糖链加成氨基酸残基的FAP抗体克隆
克隆名称 VH碱基序列 VH氨基酸序列
Fa1046-GTS 序列编号74 序列编号75
Fa1046-FTS 序列编号76 序列编号77
Fa1046-KTS 序列编号78 序列编号79
Fa1046-WTS 序列编号80 序列编号81
Fa1046-TTS 序列编号82 序列编号83
对于表4记载的各克隆，使用与实施例5同样的方法制作CD40-FAP 双特异性抗体。表5示出了该双特异性抗体的名称、制作该双特异性抗体(以下也记载为变异双特异性抗体)使用的抗CD40抗体的克隆和抗FAP抗体的克隆。表6示出了取得的编码包含各抗FAP抗体的VH的CD40-FAP双特异性抗体的重链的碱基序列和由该碱基序列推测的氨基酸序列。
[表5]
变异双特异性抗体所使用的克隆
Figure BDA0003354064220000751
Figure BDA0003354064220000761
[表6]
变异双特异性抗体重链的序列信息
双特异性抗体的名称 重链碱基序列 重链氨基酸序列
Ct-R1090-Fa1046-GTS 序列编号84 序列编号85
Ct-R1090-Fa1046-FTS 序列编号86 序列编号87
Ct-R1090-Fa1046-KTS 序列编号88 序列编号89
Ct-R1090-Fa1046-WTS 序列编号90 序列编号91
Ct-R1090-Fa1046-TTS 序列编号92 序列编号93
[实施例13]取代了N型糖链加成氨基酸残基的CD40-FAP双特异性抗体的使用流式细胞法的FAP结合性评价
使用与实施例7同样的方法评价实施例12所得的R1090S55A-Fa1046 的变异双特异性抗体的人FAP/HEK293细胞和对HEK293细胞的结合性。
图11的(A)示出HEK293的测定结果，图11的(B)示出对人FAP/HEK293 细胞的测定结果。如图11的(A)所示，被测抗体均不结合至FAP阴性的 HEK293细胞。另一方面，如图11的(B)所示，FAP阳性的人FAP/HEK293 细胞上，均从0.01μg/mL的低浓度结合，显示与变异前的R1090S55A-Fa1046 同等以上的活性。
以上结果示出，实施例12制作的R1090S55A-Fa1046的变异双特异性抗体均为与FAP特异性结合的抗体。
[实施例14]取代了N型糖链加成氨基酸残基的CD40-FAP双特异性抗体的通过使用流式细胞法的CD95表达量解析的CD40信号诱导活性的评价
以Ramos细胞上的CD95的表达量增加作为指标，用与实施例10同样的方法评价实施例12中得到的CD40-FAP双特异性抗体在FAP阳性或阴性细胞共存下向Ramos细胞的CD40信号诱导活性。阴性对照使用抗DNP抗体，阳性对照使用21.4.1。
图12的(A)示出与HEK293细胞共培养的Ramos细胞的结果，图12的 (B)示出与人FAP/HEK293细胞共培养的Ramos细胞的结果。
如图12的(A)所示，在FAP阴性的HEK293细胞和Ramos细胞的共培养下，针对所有的变异双特异性抗体，CD95的表达量为等同于抗DNP抗体的程度，没有诱导CD40信号。另一方面，如图12的(B)所示，在共培养 FAP阳性的人FAP/HEK293细胞和Ramos细胞的情况下，变异双特异性抗体使CD95的表达量与变异前的R1090S55A-Fa1046同等以上地增加。从而，显示出变异双特异性抗体诱导与变异前的R1090S55A-Fa1046同等以上的 CD40信号。
从而，实施例12制作的变异双特异性抗体表现出在如肿瘤和淋巴组织等存在表达FAP细胞的部位特异性地向B细胞、树突状细胞等的CD40阳性细胞诱导信号。
[实施例15]与CD40和FAP结合的双特异性抗体的制作
按照实施例5记载的方法，制作含有包含表7所示的VH1、VH2的重链和含有包含L6的氨基酸序列的LV的轻链双特异性抗体。表2示出分别编码FAP-CD40双特异性抗体的重链的碱基序列和由该碱基序列推测的氨基酸序列。
[表7]
FAP-CD40双特异性抗体中包含的VH克隆
双特异性抗体名称 VH1的克隆 VH2的克隆
Ct-Fa018-R1090 Fa018 R1090S55A
Ct-Fa1007-R1090 Fa1007 R1090S55A
Ct-Fa1013-R1090 Fa1013 R1090S55A
Ct-Fa1014-R1090 Fa1014 R1090S55A
Ct-Fa1046-GTS-R1090 Ct-Fa1046-GTS R1090S55A
Ct-Fa1046-FTS-R1090 Ct-Fa1046-FTS R1090S55A
Ct-Fa1046-KTS-R1090 Ct-Fa1046-KTS R1090S55A
Ct-Fa1046-WTS-R1090 Ct-Fa1046-WTS R1090S55A
Ct-Fa1046-TTS-R1090 Ct-Fa1046-TTS R1090S55A
[表8]
CD40-FAP双特异性抗体所含的碱基序列和氨基酸序列
Figure BDA0003354064220000771
Figure BDA0003354064220000781
[实施例16]通过利用流式细胞仪的CD95表达量解析对CD40-FAP双特异性抗体的CD40信号诱导活性的评价
与实施例9相同，确认实施例15制作的CD40-FAP双特异性抗体的 CD40信号诱导活性。
[实施例17]通过利用流式细胞仪的CD95表达量解析对CD40-FAP双特异性抗体的CD40信号诱导活性的评价
以Ramos细胞上的CD95的表达量增加作为指标，用与实施例10相同的方法评价实施例5中得到的CD40-FAP双特异性抗体(Ct-R1090-Fa1007、 Ct-R1090-Fa1013、Ct-R1090-Fa1014和Ct-R1090-Fa1046)的FAP阳性成纤维细胞和FAP阳性癌细胞中的向Ramos细胞的CD40信号诱导活性。
但是，被测抗体以0.02、0.2、2或20μg/mL(终浓度0.01、0.1、1或10μg/mL) 的浓度添加。另外，用FAP阳性成纤维细胞系IMR-90(ATCC NO.CCL-186) 或FAP阳性癌细胞系RPMI-7951(DSMZ NO.ACC 66)替代实施例10使用的 HEK293细胞或人FAP/HEK293细胞。
图13的(A)示出与IMR-90细胞共培养的Ramos细胞的结果，图13的 (B)示出与RPMI-7951细胞共培养的Ramos细胞的结果。
结果显示，在所有共培养体系实验中，阴性对照的抗DNP抗体没有使 Ramos细胞上的CD95的表达增加，但是阳性对照的抗CD40单克隆抗体 21.4.1使Ramos细胞上的CD95表达增加。
如图13的(A)和图13的(B)所示，显示出在共培养FAP阳性的成纤维细胞或FAP阳性的癌细胞和Ramos细胞的情况下，CD40-FAP双特异性抗体使Ramos细胞上的CD95的表达量增加，且诱导CD40信号。
由此表明，本发明的CD40-FAP双特异性抗体表现出在如肿瘤和淋巴组织等存在表达FAP成纤维细胞或癌细胞的部位特异性地向B细胞等CD40阳性细胞诱导信号。
[实施例18]通过利用流式细胞仪的CD83和CD95表达量解析对 CD40-FAP双特异性抗体的CD40信号诱导活性的评价
以Ramos细胞上的CD83和CD95的表达量增加作为指标，用与实施例10相同的方法评价实施例5和实施例12中得到的CD40-FAP双特异性抗体(Ct-R1090-Fa1013、Ct-R1090-Fa1014和Ct-R1090-Fa1046-GTS)的人FAP 固相化珠粒的向Ramos细胞的CD40信号诱导活性。
但是，被测抗体以2μg/mL(终浓度1μg/mL)的浓度添加，添加以下方法制作的FAP固相化珠粒替代实施例10使用的HEK293细胞或人 FAP/HEK293细胞。另外，作为CD83检测用抗体，使用APC小鼠抗人CD83 抗体(Biolegend公司制)。
(FAP固相化珠粒的制作方法)
按以下方法制备固相化人FAP的Dynabeads M-280 Streptavidin(Invitrogen公司制)。通过Biotin Labeling Kit-NH2(同仁化学公司制)生物素标记实施例1获得的人FAP-FLAG-Fc，获得人 FAP-FLAG-Fc-Biotin。梯度1.5倍稀释1μg的人FAP-FLAG-Fc-Biotin，分别使其对6.5×106的Dynabeads M-280Streptavidin结合。从而，获得不同人FAP 量的固相化珠粒。
(固相化至珠粒的FAP的量的测定方法)
固相化至珠粒的FAP的量使用流式细胞仪FACSCANTO II(Becton Dickinson公司制)测定阴性对照的抗DNP抗体和抗FAP抗体对FAP的固相化珠粒的结合，作为相对性荧光强度值(RFI)计算。
图14的(A)示出Ramos细胞上的CD83的表达量的结果，图14的(B) 示出Ramos细胞上的CD95的表达量的结果。
结果显示，与固相化至共培养的珠粒上的人FAP的量无关，阴性对照的抗DNP抗体未使Ramos细胞上的CD83和CD95的表达量增加，但阳性对照的抗CD40单克隆抗体21.4.1则使Ramos细胞上的CD83和CD95表达量增加。
如图14的(A)和图14的(B)所示，显示出CD40-FAP双特异性抗体 Ct-R1090-Fa1013、Ct-R1090-Fa1014和Ct-R1090-Fa1046-GTS在固相化珠粒中，使有关FAP的量的Ramos细胞上的CD83和CD95的表达量增加并诱导CD40信号。
由此表明，本发明的CD40-FAP双特异性抗体表现出：与细胞的种类无关，在存在表面上表达FAP的细胞的部位特异性地向B细胞、树突状细胞等的CD40阳性细胞诱导信号，且存在该信号的强度与FAP的表达量相关的趋势。
[实施例19]作为对照的CD40-FAP双特异性抗体的制作
通过以下方法制作国际公开第2018/185045号记载的CD40-FAP双特异性抗体。
1.双特异性抗体的表达载体的制作
报告有国际公开第2018/185045号记载的抗体克隆P1AA9663为与FAP 结合的抗FAP抗体28H1和抗CD40抗体SGN-40组合而成的CD40-FAP双特异性抗体，且对CD40阳性细胞诱导信号(国际公开第2018/185045号、 Beatty GL et al.,Expert Rev AnticancerTher.2017Feb；17(2):175-186.)。基于构成P1AA9663氨基酸序列(序列编号112、113、114)，进行最适合于哺乳类细胞的表达的密码子转换，获得碱基序列(序列编号115、116、117)。人工合成包含序列编号115、116、117所示的碱基序列的基因片段，克隆至包含编码序列信号的碱基序列的pCI载体(Promega公司)的适当限制性内切酶位点，得到表达载体。
2.双特异性抗体的制备
使用实施例19的1.制作的双特异性抗体的表达载体，通过以下方法表达、纯化双特异性抗体。
将构成双特异性抗体的分子的表达载体通过Expi293(商标)表达系统(Expression System)(Thermo Fisher公司)在Expi293细胞中进行共基因导入，在16小时后添加转染增强剂(Transfection Enhancer)，利用瞬时表达体系表达双特异性抗体。
在载体导入4天后回收培养上清，用孔径0.22μm的膜过滤器(Millipore 制)过滤后，用蛋白A树脂(MabSelect GE health care公司)将抗体进行亲和性纯化。使用D-PBS(-)作为清洗液。将吸附于蛋白A的抗体用20mM柠檬酸钠-50mM NaCl缓冲液(pH3.0)洗脱，回收到包含200mM的磷酸钠缓冲液 (pH7.0)的试管中。
然后，使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司制)，通过超滤将缓冲液置换成D-PBS(-)后，用孔径0.22μm的膜过滤器Millex-Gv(Millipore公司制)过滤灭菌，取得CD40-FAP双特异性抗体P1AA9663。测定抗体溶液的波长280nm 的吸光度，使用由各抗体的氨基酸序列推测的吸光系数算出纯化抗体的浓度。
[实施例20]通过利用流式细胞仪的CD83表达量解析对CD40-FAP双特异性抗体的CD40信号诱导活性的评价
以Ramos细胞上的CD83的表达量增加作为指标，用与实施例10和实施例19相同的方法评价在有实施例5、实施例12和实施例19中得到的 CD40-FAP双特异性抗体(Ct-R1090-Fa1013、Ct-R1090-Fa1014和 Ct-R1090-Fa1046-GTS和P1AA9663)在FAP阳性细胞存在下对Ramos细胞的CD40信号诱导活性。
其中，被测抗体以0.02、0.2、2或20μg/mL(终浓度0.01、0.1、1或10μg/mL) 的浓度添加，用FAP阳性成纤维细胞系SC-00A05(NEUROMICS公司制)替代实施例10的HEK293细胞或人FAP/HEK293细胞。
图15示出Ramos细胞的CD83的表达量变化结果，其结果显示，在所有共培养体系实验中，阴性对照的抗DNP抗体没有使Ramos细胞上的CD83 的表达量增加，但是阳性对照的抗CD40抗体21.4.1使Ramos细胞上的CD83 的表达量增加。
显示出CD40-FAP双特异性抗体Ct-R1090-Fa1013、Ct-R1090-Fa1014 和Ct-R1090-Fa1046-GTS，均使Ramos细胞上的CD83的表达量增加，且诱导CD40信号。另外，该抗体比对照的CD40-FAP双特异性抗体P1AA9663 更能使CD83的表达量增加，并更强地诱导CD40信号。
由此表明，本发明的CD40-FAP双特异性抗体比现有的CD40-FAP双特异性抗体更强地对B细胞等的CD40阳性细胞诱导信号。
[实施例21]CD40-FAP双特异性抗体对树突状细胞的CD40信号诱导活性的评价
以树突状细胞的活化标记物CD83、CD86和HLA-ABC的表达量增加作为指标，用与实施例11相同的方法评价实施例5、实施例12和实施例 19中得到的CD40-FAP双特异性抗体(Ct-R1090-Fa1013、 Ct-R1090-Fa1046-GTS和P1AA9663)在FAP阳性细胞共存下的对树突状细胞的CD40信号诱导活性。
但是，使用FAP阳性成纤维细胞系SC-00A05(NEUROMICS公司制)替代实施例11的人FAP/HEK293细胞或HEK293细胞。另外，CD86的检测用抗体使用PE-Cy7小鼠抗人CD86(Biolegend公司制)。
树突状细胞上的CD83、CD86和HLA-ABC的表达量变化结果分别示于图16的(A)、图16的(B)和图16的(C)。
通过图16的(A)、图16的(B)和图16的(C)，对于所有的标记物，相对于阴性对照抗DNP抗体没有使表达量增加，阳性对照抗CD40单克隆抗体 21.4.1使表达量增加。
另外，对于所有的标记物，相比于P1AA9663，Ct-R1090-Fa1013和 Ct-R1090-Fa1046-GTS显示出使表达量增加，相比于P1AA9663， Ct-R1090-Fa1013和Ct-R1090-Fa1046-GTS显示出更强地诱导CD40信号。
通过这些，相比现有的CD40-FAP双特异性抗体，本发明的CD40-FAP 双特异性抗体表现出对于树突状细胞等CD40阳性细胞更强地诱导CD40信号。
[实施例22]在有交联抗体时的通过利用流式细胞仪的CD83和CD95表达量解析对CD40-FAP双特异性抗体的CD40信号诱导活性的评价
为了确认FAP表达细胞非依赖性的通过抗体交联的CD40信号诱导活性的有无，用与实施例10相同的方法，以Ramos细胞上的CD83和CD95 的表达量增加为指标，评价在实施例5和实施例19中所得的CD40-FAP双特异性抗体(Ct-R1090-Fa1013和P1AA9663)的交联抗体存在时的向Ramos 细胞的CD40信号诱导活性。
但是，未使用实施例10的HEK293细胞或人FAP/HEK293细胞，在添加被测抗体后，以25μL/孔添加80μg/mL(终浓度20μg/mL)中制备的交联抗体抗人IgG(FcγR specific)(Jackson Immunoresearch公司制)。
另外，CD83检测用抗体使用APC小鼠抗人CD83抗体(Biolegend公司制)。
图17的(A)示出Ramos细胞的CD83的表达量变化的结果，图17的(B) 示出CD95的表达量的结果。
从图17的(A)和(B)可知，阴性对照的抗DNP抗体未使Ramos细胞上的 CD83和D95的表达量增加。
另外，对照的P1AA9663在观察到FAP依赖性激动剂活性的0.1μg/mL 的浓度下明显使CD83和CD95的表达量增加，另一方面，Ct-R1090-Fa1013 在同等浓度下未明显使CD83和CD95的表达量增加。因此表明，在有交联抗体时，P1AA9663较强地诱导FAP表达细胞非依赖性CD40信号，另一方面，Ct-R1090-Fa1013未明显诱导FAP表达细胞非依赖性CD40信号。
综上所述表明，在生物体内经由抗体等交联的情况下，现有的 CD40-FAP双特异性抗体具有即便在不存在表达FAP细胞的部位也强烈诱导CD40信号的可能性，而本发明的CD40-FAP双特异性抗体具有在不存在表达FAP细胞的部位不诱导CD40信号的可能性。
使用特定的方式对本发明详细地进行了说明，但本领域技术人员应知晓可以不脱离本发明的意图和范围进行各种变更和变形。需要说明的是，本申请基于在2019年5月15日申请的日本专利申请(日本特愿2019-092298 号)，将其整体通过引用援引在此。
[序列表自由文本]
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序列表
<110> 协和麒麟株式会社
<120> 与CD40和FAP结合的双特异性抗体
<130> W529460
<150> JP2019-092298
<151> 2019-05-15
<160> 117
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 522
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
gaaccaccca ctgcatgcag agaaaaacag tacctaataa acagtcagtg ctgttctttg 60
tgccagccag gacagaaact ggtgagtgac tgcacagagt tcactgaaac ggaatgcctt 120
ccttgcggtg aaagcgaatt cctagacacc tggaacagag agacacactg ccaccagcac 180
aaatactgcg accccaacct agggcttcgg gtccagcaga agggcacctc agaaacagac 240
accatctgca cctgtgaaga aggctggcac tgtacgagtg aggcctgtga gagctgtgtc 300
ctgcaccgct catgctcgcc cggctttggg gtcaagcaga ttgctacagg ggtttctgat 360
accatctgcg agccctgccc agtcggcttc ttctccaatg tgtcatctgc tttcgaaaaa 420
tgtcaccctt ggacaagctg tgagaccaaa gacctggttg tgcaacaggc aggcacaaac 480
aagactgatg ttgtctgtgg tccccaggat cggctgagag cc 522
<210> 2
<211> 174
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln
1 5 10 15
Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr
20 25 30
Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu
35 40 45
Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp
50 55 60
Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp
65 70 75 80
Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys
85 90 95
Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys
100 105 110
Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val
115 120 125
Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp
130 135 140
Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn
145 150 155 160
Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu Arg Ala
165 170
<210> 3
<211> 522
<212> DNA
<213> 食蟹猴
<400> 3
gaaccaccca ctgcatgcag agaaaaacag tacctaataa acagtcagtg ctgttctttg 60
tgccagccag gacagaaact ggtgagtgac tgcacagagt tcaccgaaac agaatgcctt 120
ccttgcggtg aaagcgaatt cctagacacc tggaatagag agacacgctg ccaccagcac 180
aaatactgcg accccaacct agggcttcgg gtccagcaga agggcacctc agaaacagac 240
accatctgca cctgtgaaga aggcctgcac tgtacgagtg agtcctgtga gagctgtgtc 300
ccgcaccgct catgcttgcc tggctttggg gtcaagcaga ttgctacagg ggtttctgat 360
accatctgtg agccctgccc ggtcggcttc ttctccaatg tgtcatctgc ttttgaaaag 420
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aagactgatg ttgtctgtgg tccccaggat cggcagagag cc 522
<210> 4
<211> 174
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 4
Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln
1 5 10 15
Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr
20 25 30
Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu
35 40 45
Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr Arg Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp
50 55 60
Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp
65 70 75 80
Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Leu His Cys Thr Ser Glu Ser Cys
85 90 95
Glu Ser Cys Val Pro His Arg Ser Cys Leu Pro Gly Phe Gly Val Lys
100 105 110
Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val
115 120 125
Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys Arg Pro Trp
130 135 140
Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn
145 150 155 160
Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Gln Arg Ala
165 170
<210> 5
<211> 834
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
atggttcgtc tgcctctgca gtgcgtcctc tggggctgct tgctgaccgc tgtccatcca 60
gaaccaccca ctgcatgcag agaaaaacag tacctaataa acagtcagtg ctgttctttg 120
tgccagccag gacagaaact ggtgagtgac tgcacagagt tcactgaaac ggaatgcctt 180
ccttgcggtg aaagcgaatt cctagacacc tggaacagag agacacactg ccaccagcac 240
aaatactgcg accccaacct agggcttcgg gtccagcaga agggcacctc agaaacagac 300
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tgtcaccctt ggacaagctg tgagaccaaa gacctggttg tgcaacaggc aggcacaaac 540
aagactgatg ttgtctgtgg tccccaggat cggctgagag ccctggtggt gatccccatc 600
atcttcggga tcctgtttgc catcctcttg gtgctggtct ttatcaaaaa ggtggccaag 660
aagccaacca ataaggcccc ccaccccaag caggaacccc aggagatcaa ttttcccgac 720
gatcttcctg gctccaacac tgctgctcca gtgcaggaga ctttacatgg atgccaaccg 780
gtcacccagg aggatggcaa agagagtcgc atctcagtgc aggagagaca gtga 834
<210> 6
<211> 277
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195 200 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210 215 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225 230 235 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245 250 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260 265 270
Val Gln Glu Arg Gln
275
<210> 7
<211> 849
<212> DNA
<213> 食蟹猴
<400> 7
atggttcgtc tgcctctgca gtgcgtcctc tggggctgct tgctgaccgc tgtctatcca 60
gaaccaccca ctgcatgcag agaaaaacag tacctaataa acagtcagtg ctgttctttg 120
tgccagccag gacagaaact ggtgagtgac tgcacagagt tcaccgaaac agaatgcctt 180
ccttgcggtg aaagcgaatt cctagacacc tggaatagag agacacgctg ccaccagcac 240
aaatactgcg accccaacct agggcttcgg gtccagcaga agggcacctc agaaacagac 300
accatctgca cctgtgaaga aggcctgcac tgtacgagtg agtcctgtga gagctgtgtc 360
ccgcaccgct catgcttgcc tggctttggg gtcaagcaga ttgctacagg ggtttctgat 420
accatctgtg agccctgccc ggtcggcttc ttctccaatg tgtcatctgc ttttgaaaag 480
tgtcgccctt ggacaagctg tgagaccaaa gacctggttg tgcaacaggc aggcacaaac 540
aagactgatg ttgtctgtgg tccccaggat cggcagagag ccctggtggt gatccccatc 600
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agacagtga 849
<210> 8
<211> 282
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 8
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Tyr Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr Arg Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Leu His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ser Cys Glu Ser Cys Val Pro His Arg Ser Cys Leu Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys Arg Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Gln
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Cys Leu Gly Ile Leu Phe Val Ile
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Leu Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Ser Glu Ser Ser Glu Lys Val Ala
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Lys Lys Pro Asn Asp Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu
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Ile Asn Phe Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ser Asn Pro Ala Ala Pro Val
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Glu Ser Arg Ile Ser Val Gln Glu Arg Gln
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<210> 9
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 9
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tataccattt tgagtaatag aaccatgaaa agtgtgaatg cttcaaatta cggcttatca 240
cctgatcggc aatttgtata tctagaaagt gattattcaa agctttggag atactcttac 300
acagcaacat attacatcta tgaccttagc aatggagaat ttgtaagagg aaatgagctt 360
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caaaacaata tctatttgaa acaaagacca ggagatccac cttttcaaat aacatttaat 480
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atcgatacca cttaccctgc gtatgtaggt ccccaggaag tgcctgttcc agcaatgata 780
gcctcaagtg attattattt cagttggctc acgtgggtta ctgatgaacg agtatgtttg 840
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tttcaaaact cagcacagat tgctaaagct ctggttaatg cacaagtgga tttccaggca 2100
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<212> DNA
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<213> 小家鼠
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gccacttctt actacaaaat atttagcgac aaggatggtt acaaacatat tcactacatc 1140
aaagacactg tggaaaatgc tattcaaatt acaagtggca agtgggaggc catatatata 1200
ttccgcgtaa cacaggattc actgttttat tctagcaatg aatttgaagg ttaccctgga 1260
agaagaaaca tctacagaat tagcattgga aactctcctc cgagcaagaa gtgtgttact 1320
tgccatctaa ggaaagaaag gtgccaatat tacacagcaa gtttcagcta caaagccaag 1380
tactatgcac tcgtctgcta tggccctggc ctccccattt ccaccctcca tgatggccgc 1440
acagaccaag aaatacaagt attagaagaa aacaaagaac tggaaaattc tctgagaaat 1500
atccagctgc ctaaagtgga gattaagaag ctcaaagacg ggggactgac tttctggtac 1560
aagatgattc tgcctcctca gtttgacaga tcaaagaagt accctttgct aattcaagtg 1620
tatggtggtc cttgcagcca gagtgttaag tctgtgtttg ctgttaattg gataacttat 1680
ctcgcaagta aggaggggat agtcattgcc ctggtagatg gtcggggcac tgctttccaa 1740
ggtgacaaat tcctgcatgc cgtgtatcga aaactgggtg tatatgaagt tgaggaccag 1800
ctcacagctg tcagaaaatt catagaaatg ggtttcattg atgaagaaag aatagccata 1860
tggggctggt cctacggagg ttatgtttca tccctggccc ttgcatctgg aactggtctt 1920
ttcaaatgtg gcatagcagt ggctccagtc tccagctggg aatattacgc atctatctac 1980
tcagagagat tcatgggcct cccaacaaag gacgacaatc tcgaacacta taaaaattca 2040
actgtgatgg caagagcaga atatttcaga aatgtagact atcttctcat ccacggaaca 2100
gcagatgata atgtgcactt tcagaactca gcacagattg ctaaagcttt ggttaatgca 2160
caagtggatt tccaggcgat gtggtactct gaccagaacc atggtatatc atctgggcgc 2220
tcccagaatc atttatatac ccacatgacg cacttcctca agcaatgctt ttctttatca 2280
gac 2283
<210> 16
<211> 761
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 16
Met Lys Thr Trp Leu Lys Thr Val Phe Gly Val Thr Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Val Val Ile Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val Tyr
20 25 30
Lys Pro Glu Gly Asn Thr Lys Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr Phe Pro Asn Trp Ile Ser Glu
50 55 60
Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Glu Asp Asp Asn Ile Val Phe Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ser Thr Met Lys
85 90 95
Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val
100 105 110
Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gln Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Tyr
130 135 140
Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser
145 150 155 160
Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Glu Asn Arg Ile
180 185 190
Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr
195 200 205
Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asp Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Val
210 215 220
Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ile Pro Ile Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Gly Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly
245 250 255
Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Val Phe Ile Val Asp Thr Thr Tyr Pro
260 265 270
His His Val Gly Pro Met Glu Val Pro Val Pro Glu Met Ile Ala Ser
275 280 285
Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Ser Ser Glu Arg Val
290 295 300
Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile
305 310 315 320
Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp His Ala Trp Glu Cys Pro Lys Asn Gln
325 330 335
Glu His Val Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val
340 345 350
Ser Thr Pro Ala Phe Ser Gln Asp Ala Thr Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe
355 360 365
Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val
370 375 380
Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Tyr Ile
385 390 395 400
Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu
405 410 415
Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Asn Ser
420 425 430
Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys
435 440 445
Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Tyr Lys Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu
450 455 460
Val Cys Tyr Gly Pro Gly Leu Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg
465 470 475 480
Thr Asp Gln Glu Ile Gln Val Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
485 490 495
Ser Leu Arg Asn Ile Gln Leu Pro Lys Val Glu Ile Lys Lys Leu Lys
500 505 510
Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe
515 520 525
Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro
530 535 540
Cys Ser Gln Ser Val Lys Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Thr Tyr
545 550 555 560
Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly
565 570 575
Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Phe Leu His Ala Val Tyr Arg Lys Leu
580 585 590
Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Leu Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile
595 600 605
Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Glu Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser
610 615 620
Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu
625 630 635 640
Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr
645 650 655
Ala Ser Ile Tyr Ser Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp
660 665 670
Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr
675 680 685
Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn
690 695 700
Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala
705 710 715 720
Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Ile
725 730 735
Ser Ser Gly Arg Ser Gln Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe
740 745 750
Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp
755 760
<210> 17
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 17
gaaatagtgt tgacgcagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: L6的CDR1氨基酸序列
<400> 19
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: L6的CDR2氨基酸序列
<400> 20
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: L6的CDR3氨基酸序列
<400> 21
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr
1 5
<210> 22
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人
<400> 22
gaagtgcagc ttgtgcagtc cggggctgaa gtgaagaagc ccggggaatc cctgaagatc 60
tcctgtaagg gctccggcta ctccttcatc atctactgga tcggctgggt tcgccagatg 120
cctgggaagg ggctggagtg gatggggatc atctatccca atgatgccga tactcgctac 180
tccccctcct tccaggggca ggtgactatc tccgccgaca agtccatctc cactgcctat 240
ctgcagtggt cctccctgaa ggcctccgat actgccatgt actactgcgt gcgcctgggg 300
actcgcgatt ggttcgatcc ttgggggcag gggactcttg tgactgtgtc ctcc 354
<210> 23
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ile Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asn Asp Ala Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Leu Gly Thr Arg Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: R1090的HCDR1的氨基酸序列
<400> 24
Ile Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: R1090的HCDR2的氨基酸序列
<400> 25
Ile Ile Tyr Pro Asn Asp Ala Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: R1090的HCDR3的氨基酸序列
<400> 26
Leu Gly Thr Arg Asp Trp Phe Asp Pro
1 5
<210> 27
<211> 378
<212> DNA
<213> 智人
<400> 27
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaaccctg acagtggtgg cacaaactat 180
gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga acaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatcag 300
cccctaggat attgtactaa tggtgtatgc tcctactttg actactgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcctca 378
<210> 28
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr
100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 29
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 29
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtatttac agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaacctcct gatctatact gcatccactt tacaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacattt tcccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tcgagatcaa a 321
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人
<400> 31
gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agtcactata tacactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt tcaatggtga cacaaactat 180
gcacagaagt tccaggacag agtcaccatg accacagaca cgtccacgag cacagtgtac 240
atggagctga ggggcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatagc 300
accaggtggt tcattgacta ctggggccag ggaaccacgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 32
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Phe Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Thr Arg Trp Phe Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa018的HCDR1的氨基酸序列
<400> 33
Ser His Tyr Ile His
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa018的HCDR2的氨基酸序列
<400> 34
Trp Ile Ser Ala Phe Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa018的HCDR3的氨基酸序列
<400> 35
Asp Ser Thr Arg Trp Phe Ile Asp Tyr
1 5
<210> 36
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<400> 36
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtga ctccatcagc agtggtagtt actactgggg ctggatccgc 120
cagccccccg ggaaggggct ggagtggatt gggagtatct attctagtgg gagcacctac 180
cacgacccgt ccctcaagaa tcgagtcacc atgtccgtag acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaggc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattattg tgcgagagat 300
aggggctact actacaatat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcttca 360
<210> 37
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr His Asp Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Asn Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asn Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1007的HCDR1的氨基酸序列
<400> 38
Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Gly
1 5
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1007的HCDR2的氨基酸序列
<400> 39
Ser Ile Tyr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr His Asp Pro Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1007的HCDR3的氨基酸序列
<400> 40
Asp Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asn Met Asp Val
1 5 10
<210> 41
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<400> 41
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtagtt actactggag ctggatccgg 120
cagtccccag ggaagggact ggagtggatt gggtttatct attacagtgg gaacaccaac 180
tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300
aggggctact actacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
<210> 42
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Phe Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1013的HCDR1的氨基酸序列
<400> 43
Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 44
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1013的HCDR2的氨基酸序列
<400> 44
Phe Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1013的HCDR3的氨基酸序列
<400> 45
Asp Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 46
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<400> 46
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtagtagtt cctactgggg ctggatccgc 120
cagcccccag gaaagggact ggagtggatt gggagtatct attatagtgg gagcaccaac 180
tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgaggtctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgtgagagat 300
aaaggctact actacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
<210> 47
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Lys Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1014的HCDR1的氨基酸序列
<400> 48
Ser Ser Ser Ser Tyr Trp Gly
1 5
<210> 49
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1014的HCDR2的氨基酸序列
<400> 49
Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1014的HCDR3的氨基酸序列
<400> 50
Asp Lys Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 51
<211> 366
<212> DNA
<213> 智人
<400> 51
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc aactctggta tcaactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtga cacaggctat 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccataag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagtccca 300
gtagtgggag ctacctacaa ctggttcgac ccctggggcc agggaaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 52
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Pro Val Val Gly Ala Thr Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 53
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1046的HCDR1的氨基酸序列
<400> 53
Asn Ser Gly Ile Asn
1 5
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1046的HCDR2的氨基酸序列
<400> 54
Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 55
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1046的HCDR3的氨基酸序列
<400> 55
Val Pro Val Val Gly Ala Thr Tyr Asn Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 56
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 西罗珠单抗的VH的碱基序列
<400> 56
caggtacagc ttgtgcagtc cggcgctgag gtcaaaaaac caggcgccag cgttaaggtg 60
tcatgcaaga ctagcaggta tacattcact gaatacacaa tacactgggt gcgacaggct 120
cccgggcaaa gactggagtg gattgggggc ataaacccca acaatgggat cccgaattat 180
aatcagaaat ttaagggtcg ggtgacaatc acagtagaca ctagcgcatc aaccgcctac 240
atggagctca gctcccttag gtctgaagac acagcagttt attactgcgc aaggcgccgc 300
atcgcctacg gctatgacga aggtcatgct atggactatt gggggcaagg gacactcgtg 360
actgtctcat ca 372
<210> 57
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 西罗珠单抗的VH的氨基酸序列
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Arg Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Arg Ile Ala Tyr Gly Tyr Asp Glu Gly His Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 58
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 西罗珠单抗的VL的碱基序列
<400> 58
gacattgtca tgacgcagag tcctgacagt ctcgccgtgt ccttgggaga gcgggcaaca 60
atcaattgta aaagcagcca atctctcctg tacagccgga accagaagaa ctacctcgcc 120
tggtaccagc agaaacccgg tcagccgccc aagctcctga ttttttgggc cagcactcgg 180
gaaagcggtg tccccgacag attttccgga tctggcttcg ggacagattt taccctgacg 240
atctcatcac ttcaggcaga ggatgtggcc gtctactact gtcaacagta tttttcctac 300
cccctcactt tcggccaagg aaccaaggtg gagattaaa 339
<210> 59
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 西罗珠单抗的VL的氨基酸序列
<400> 59
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 60
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: IgG4PE R409K的CH的碱基序列
<400> 60
gctagcacca aggggccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300
aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcgagggggg accatcagtc 360
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840
gacggctcct tcttcctcta cagcaagcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960
ctctccctgt ctctgggtaa a 981
<210> 61
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: IgG4PE R409K的CH的氨基酸序列
<400> 61
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 62
<211> 294
<212> DNA
<213> 智人
<400> 62
gctagcacca aaggaccttc tgtatttcct cttgcgccat gctctcgctc tacgtcagaa 60
tcaactgccg ctctggggtg cctggttaaa gactacttcc cggagcctgt gacagtgagt 120
tggaactccg gcgccctgac atcaggagtg catacatttc ccgccgtgct tcagagcagc 180
ggactttata gcctcagcag tgtggtgacc gtgccatctt ccagcctggg gaccaagacc 240
tacacctgta acgtggacca caaacccagc aacaccaagg ttgataagag ggtc 294
<210> 63
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 64
<211> 1983
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa018的重链的碱基序列
<400> 64
gaggtgcagc tggtgcagtc cggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagctttatc atctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatccta atgacgctga taccagatac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgt gagactgggt 300
acgagggact ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcaagt 360
accaaggggc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420
gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc 600
tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat 660
ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct gagttcgagg ggggaccatc agtcttcctg 720
ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 780
gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag 1080
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tctacagcaa gctaaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc 1320
ctgtccctag gtaaagaggt gcagctggtg cagtctgggg ctgaggtgaa gaagcctggg 1380
gcctcagtga aggtttcctg caaggcatct ggatacacct tcaccagtca ctatatacac 1440
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatgg gatggatcag cgctttcaat 1500
ggtgacacaa actatgcaca gaagttccag gacagagtca ccatgaccac agacacgtcc 1560
acgagcacag tgtacatgga gctgaggggc ctgagatctg aggacacggc cgtgtattac 1620
tgtgcgagag atagcaccag gtggttcatt gactactggg gccagggaac cacggtcacc 1680
gtctcctcag ctagcaccaa aggaccttct gtatttcctc ttgcgccatg ctctcgctct 1740
acgtcagaat caactgccgc tctggggtgc ctggttaaag actacttccc ggagcctgtg 1800
acagtgagtt ggaactccgg cgccctgaca tcaggagtgc atacatttcc cgccgtgctt 1860
cagagcagcg gactttatag cctcagcagt gtggtgaccg tgccatcttc cagcctgggg 1920
accaagacct acacctgtaa cgtggaccac aaacccagca acaccaaggt tgataagagg 1980
gtc 1983
<210> 65
<211> 661
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa018的重链的氨基酸序列
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ile Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asn Asp Ala Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Leu Gly Thr Arg Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Glu Val Gln
435 440 445
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
450 455 460
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His Tyr Ile His
465 470 475 480
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile
485 490 495
Ser Ala Phe Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Asp Arg
500 505 510
Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu
515 520 525
Arg Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
530 535 540
Ser Thr Arg Trp Phe Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
545 550 555 560
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
565 570 575
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
580 585 590
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
595 600 605
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
610 615 620
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
625 630 635 640
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
645 650 655
Val Asp Lys Arg Val
660
<210> 66
<211> 1989
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa1007的重链的碱基序列
<400> 66
gaggtgcagc tggtgcagtc cggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagctttatc atctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatccta atgacgctga taccagatac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgt gagactgggt 300
acgagggact ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcaagt 360
accaaggggc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420
gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc 600
tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat 660
ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct gagttcgagg ggggaccatc agtcttcctg 720
ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 780
gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag 1080
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tctacagcaa gctaaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc 1320
ctgtccctag gtaaacaggt gcagctgcag gagtcgggcc caggactggt gaagccttcg 1380
gagaccctgt ccctcacctg cactgtctct ggtgactcca tcagcagtgg tagttactac 1440
tggggctgga tccgccagcc ccccgggaag gggctggagt ggattgggag tatctattct 1500
agtgggagca cctaccacga cccgtccctc aagaatcgag tcaccatgtc cgtagacacg 1560
tccaagaacc agttctccct gaggctgagc tctgtgaccg ctgcggacac ggccgtgtat 1620
tattgtgcga gagatagggg ctactactac aatatggacg tctggggcca agggaccacg 1680
gtcaccgtct cttcagctag caccaaagga ccttctgtat ttcctcttgc gccatgctct 1740
cgctctacgt cagaatcaac tgccgctctg gggtgcctgg ttaaagacta cttcccggag 1800
cctgtgacag tgagttggaa ctccggcgcc ctgacatcag gagtgcatac atttcccgcc 1860
gtgcttcaga gcagcggact ttatagcctc agcagtgtgg tgaccgtgcc atcttccagc 1920
ctggggacca agacctacac ctgtaacgtg gaccacaaac ccagcaacac caaggttgat 1980
aagagggtc 1989
<210> 67
<211> 663
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa1007的重链的氨基酸序列
<400> 67
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ile Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asn Asp Ala Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Leu Gly Thr Arg Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa1013的重链的碱基序列
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<212> PRT
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa1014的重链的碱基序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa1014的重链的氨基酸序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa1046的重链的碱基序列
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<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa1046的重链的氨基酸序列
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Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Glu Val Gln
435 440 445
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
450 455 460
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser Gly Ile Asn
465 470 475 480
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met
485 490 495
Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg
500 505 510
Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu
515 520 525
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val
530 535 540
Pro Val Val Gly Ala Thr Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly
545 550 555 560
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
565 570 575
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
580 585 590
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
595 600 605
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
610 615 620
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
625 630 635 640
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
645 650 655
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
660 665
<210> 74
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1046-GTS的VH的碱基序列
<400> 74
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc aactctggta tcaactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtga cacaggctat 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggggga cctccataag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagtccca 300
gtagtgggag ctacctacaa ctggttcgac ccctggggcc agggaaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 75
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1046-GTS的VH的氨基酸序列
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Gly Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Pro Val Val Gly Ala Thr Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 76
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1046-FTS的VH的碱基序列
<400> 76
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc aactctggta tcaactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtga cacaggctat 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggttca cctccataag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagtccca 300
gtagtgggag ctacctacaa ctggttcgac ccctggggcc agggaaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 77
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1046-FTS的VH的氨基酸序列
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Phe Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Pro Val Val Gly Ala Thr Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 78
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1046-KTS的VH的碱基序列
<400> 78
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
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cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtga cacaggctat 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaga cctccataag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagtccca 300
gtagtgggag ctacctacaa ctggttcgac ccctggggcc agggaaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 79
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1046-KTS的VH的氨基酸序列
<400> 79
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Lys Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Pro Val Val Gly Ala Thr Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 80
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1046-WTS的VH的碱基序列
<400> 80
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc aactctggta tcaactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtga cacaggctat 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggtgga cctccataag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagtccca 300
gtagtgggag ctacctacaa ctggttcgac ccctggggcc agggaaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 81
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1046-WTS的VH的氨基酸序列
<400> 81
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Trp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Pro Val Val Gly Ala Thr Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 82
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1046-TTS的VH的碱基序列
<400> 82
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc aactctggta tcaactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtga cacaggctat 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggacaa cctccataag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagtccca 300
gtagtgggag ctacctacaa ctggttcgac ccctggggcc agggaaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 83
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Fa1046-TTS的VH的氨基酸序列
<400> 83
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Thr Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Pro Val Val Gly Ala Thr Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 84
<211> 1995
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa1046-GTS的重链的碱基序列
<400> 84
gaggtgcagc tggtgcagtc cggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagctttatc atctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatccta atgacgctga taccagatac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgt gagactgggt 300
acgagggact ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcaagt 360
accaaggggc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420
gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc 600
tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat 660
ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct gagttcgagg ggggaccatc agtcttcctg 720
ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 780
gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag 1080
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tctacagcaa gctaaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc 1320
ctgtccctag gtaaagaggt gcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg 1380
gcctcagtga aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccaactc tggtatcaac 1440
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatgg gatggatgaa ccctaacagt 1500
ggtgacacag gctatgcaca gaagttccag ggcagagtca ccatgaccag ggggacctcc 1560
ataagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatctg aggacacggc cgtgtattac 1620
tgtgcgagag tcccagtagt gggagctacc tacaactggt tcgacccctg gggccaggga 1680
accacggtca ccgtctcctc agctagcacc aaaggacctt ctgtatttcc tcttgcgcca 1740
tgctctcgct ctacgtcaga atcaactgcc gctctggggt gcctggttaa agactacttc 1800
ccggagcctg tgacagtgag ttggaactcc ggcgccctga catcaggagt gcatacattt 1860
cccgccgtgc ttcagagcag cggactttat agcctcagca gtgtggtgac cgtgccatct 1920
tccagcctgg ggaccaagac ctacacctgt aacgtggacc acaaacccag caacaccaag 1980
gttgataaga gggtc 1995
<210> 85
<211> 665
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa1046-GTS的重链的氨基酸序列
<400> 85
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ile Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asn Asp Ala Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Val Arg Leu Gly Thr Arg Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
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Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
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385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Glu Val Gln
435 440 445
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450 455 460
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545 550 555 560
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580 585 590
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595 600 605
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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
645 650 655
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
660 665
<210> 86
<211> 1995
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa1046-FTS的重链的碱基序列
<400> 86
gaggtgcagc tggtgcagtc cggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagctttatc atctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatccta atgacgctga taccagatac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgt gagactgggt 300
acgagggact ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcaagt 360
accaaggggc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420
gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc 600
tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat 660
ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct gagttcgagg ggggaccatc agtcttcctg 720
ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 780
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gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
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agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tctacagcaa gctaaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc 1260
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ctgtccctag gtaaagaggt gcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg 1380
gcctcagtga aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccaactc tggtatcaac 1440
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatgg gatggatgaa ccctaacagt 1500
ggtgacacag gctatgcaca gaagttccag ggcagagtca ccatgaccag gttcacctcc 1560
ataagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatctg aggacacggc cgtgtattac 1620
tgtgcgagag tcccagtagt gggagctacc tacaactggt tcgacccctg gggccaggga 1680
accacggtca ccgtctcctc agctagcacc aaaggacctt ctgtatttcc tcttgcgcca 1740
tgctctcgct ctacgtcaga atcaactgcc gctctggggt gcctggttaa agactacttc 1800
ccggagcctg tgacagtgag ttggaactcc ggcgccctga catcaggagt gcatacattt 1860
cccgccgtgc ttcagagcag cggactttat agcctcagca gtgtggtgac cgtgccatct 1920
tccagcctgg ggaccaagac ctacacctgt aacgtggacc acaaacccag caacaccaag 1980
gttgataaga gggtc 1995
<210> 87
<211> 665
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa1046-FTS的重链的氨基酸序列
<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ile Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asn Asp Ala Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Leu Gly Thr Arg Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
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130 135 140
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa1046-KTS的重链的碱基序列
<400> 88
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acgagggact ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcaagt 360
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tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
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tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat 660
ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct gagttcgagg ggggaccatc agtcttcctg 720
ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 780
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gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
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tgtgcgagag tcccagtagt gggagctacc tacaactggt tcgacccctg gggccaggga 1680
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa1046-KTS的重链的氨基酸序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa1046-WTS的重链的碱基序列
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<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-R1090-Fa1046-WTS的重链的氨基酸序列
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<220>
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210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Glu Val Gln
435 440 445
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
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Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser Gly Ile Asn
465 470 475 480
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met
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500 505 510
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515 520 525
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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
645 650 655
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
660 665
<210> 94
<211> 1983
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-Fa018-R1090的重链的碱基序列
<400> 94
gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
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gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
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tgtgtgagac tgggtacgag ggactggttc gacccctggg gccagggaac cctggtcacc 1680
gtctcctcag ctagcaccaa aggaccttct gtatttcctc ttgcgccatg ctctcgctct 1740
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gtc 1983
<210> 95
<211> 661
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-Fa018-R1090的重链的氨基酸序列
<400> 95
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Ser Ala Phe Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
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Met Glu Leu Arg Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Ser Thr Arg Trp Phe Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
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Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
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Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
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<210> 96
<211> 1989
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-Fa1007-R1090的重链的碱基序列
<400> 96
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<211> 663
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-Fa1007-R1090的重链的氨基酸序列
<400> 97
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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
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<210> 98
<211> 1989
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-Fa1013-R1090的重链的碱基序列
<400> 98
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aagagggtc 1989
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<211> 663
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-Fa1013-R1090的重链的氨基酸序列
<400> 99
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Glu
435 440 445
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser
450 455 460
Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ile Tyr Trp
465 470 475 480
Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly
485 490 495
Ile Ile Tyr Pro Asn Asp Ala Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
500 505 510
Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu
515 520 525
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val
530 535 540
Arg Leu Gly Thr Arg Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
545 550 555 560
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
565 570 575
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
580 585 590
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
595 600 605
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
610 615 620
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
625 630 635 640
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
645 650 655
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
660
<210> 100
<211> 1989
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-Fa1014-R1090的重链的序列
<400> 100
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtagtagtt cctactgggg ctggatccgc 120
cagcccccag gaaagggact ggagtggatt gggagtatct attatagtgg gagcaccaac 180
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tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 600
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 660
aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcgagggggg accatcagtc 720
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaagcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1320
ctctccctgt ccctaggtaa agaggtgcag ctggtgcagt ccggagcaga ggtgaaaaag 1380
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atcggctggg tgcgccagat gcccgggaaa ggcctggagt ggatggggat catctatcct 1500
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aagtccatca gcaccgccta cctgcagtgg agcagcctga aggcctcgga caccgccatg 1620
tattactgtg tgagactggg tacgagggac tggttcgacc cctggggcca gggaaccctg 1680
gtcaccgtct cctcagctag caccaaagga ccttctgtat ttcctcttgc gccatgctct 1740
cgctctacgt cagaatcaac tgccgctctg gggtgcctgg ttaaagacta cttcccggag 1800
cctgtgacag tgagttggaa ctccggcgcc ctgacatcag gagtgcatac atttcccgcc 1860
gtgcttcaga gcagcggact ttatagcctc agcagtgtgg tgaccgtgcc atcttccagc 1920
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aagagggtc 1989
<210> 101
<211> 663
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-Fa1014-R1090的重链的氨基酸序列
<400> 101
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
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Ser Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Lys Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
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290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Glu
435 440 445
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser
450 455 460
Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ile Tyr Trp
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Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly
485 490 495
Ile Ile Tyr Pro Asn Asp Ala Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
500 505 510
Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu
515 520 525
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val
530 535 540
Arg Leu Gly Thr Arg Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
565 570 575
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
580 585 590
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
595 600 605
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
610 615 620
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
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Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
645 650 655
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
660
<210> 102
<211> 1995
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-Fa1046-GTS-R1090的重链的碱基序列
<400> 102
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
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tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 780
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gttgataaga gggtc 1995
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<211> 665
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-Fa1046-GTS-R1090的重链的氨基酸序列
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser
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Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Gly Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Val Pro Val Val Gly Ala Thr Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp
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Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
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Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
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Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
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Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
Lys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
450 455 460
Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ile
465 470 475 480
Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
485 490 495
Met Gly Ile Ile Tyr Pro Asn Asp Ala Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser
500 505 510
Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala
515 520 525
Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
530 535 540
Cys Val Arg Leu Gly Thr Arg Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly
545 550 555 560
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
565 570 575
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
580 585 590
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
595 600 605
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610 615 620
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
645 650 655
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
660 665
<210> 104
<211> 1995
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-Fa1046-FTS-R1090的重链的碱基序列
<400> 104
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
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ccggagcctg tgacagtgag ttggaactcc ggcgccctga catcaggagt gcatacattt 1860
cccgccgtgc ttcagagcag cggactttat agcctcagca gtgtggtgac cgtgccatct 1920
tccagcctgg ggaccaagac ctacacctgt aacgtggacc acaaacccag caacaccaag 1980
gttgataaga gggtc 1995
<210> 105
<211> 665
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-Fa1046-FTS-R1090的重链的氨基酸序列
<400> 105
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Phe Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Pro Val Val Gly Ala Thr Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
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165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
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210 215 220
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
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290 295 300
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
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<210> 106
<211> 1995
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-Fa1046-KTS-R1090的重链的碱基序列
<400> 106
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-Fa1046-KTS-R1090的重链的氨基酸序列
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-Fa1046-WTS-R1090的重链的氨基酸序列
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<220>
<223> 人工序列的描述: Ct-Fa1046-TTS-R1090的重链的氨基酸序列
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435 440 445
Lys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
450 455 460
Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ile
465 470 475 480
Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
485 490 495
Met Gly Ile Ile Tyr Pro Asn Asp Ala Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser
500 505 510
Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala
515 520 525
Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
530 535 540
Cys Val Arg Leu Gly Thr Arg Asp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly
545 550 555 560
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
565 570 575
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
580 585 590
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
595 600 605
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
610 615 620
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
625 630 635 640
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
645 650 655
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
660 665
<210> 112
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: P1AA9663的组成分子1的氨基酸序列
<400> 112
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Val Ile Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
340 345 350
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
450 455 460
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu
465 470 475 480
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr
485 490 495
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
500 505 510
Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
515 520 525
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
530 535 540
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro
545 550 555 560
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
565 570 575
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
580 585 590
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
595 600 605
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
610 615 620
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
625 630 635 640
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
645 650 655
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
660 665 670
Pro Lys Ser Cys
675
<210> 113
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: P1AA9663的组成分子2的氨基酸序列
<400> 113
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg
115 120 125
Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 114
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: P1AA9663的组成分子3的氨基酸序列
<400> 114
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
115 120 125
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
130 135 140
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
145 150 155 160
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
165 170 175
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
180 185 190
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
195 200 205
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 115
<211> 2028
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: P1AA9663的组成分子1的碱基序列
<400> 115
gaagttcagt tggtcgaatc tggtggaggt ttggtccagc cggggggttc tcttaggttg 60
tcatgtgcgg caagcgggta ttcatttacc ggctattata tacactgggt tcggcaggca 120
cccggtaaag gcctcgaatg ggtagccaga gtcatcccaa atgccggagg gacttcctat 180
aatcaaaagt tcaaaggccg gtttactctt agcgtggata attctaaaaa tacggcctac 240
ctgcaaatga acagtctgcg agcggaagat accgccgtgt actattgcgc tcgggagggc 300
atctattggt ggggtcaggg aacgctcgtg actgtatcca gtgcttcaac taaagggccc 360
agcgtctttc ctctggcacc aagttcaaag tccacatcag gaggtacagc tgctttgggt 420
tgccttgtag aagattattt tccagaaccc gtcacagtct cctggaattc cggtgccctg 480
acgagcggtg tacacacctt tccggcggtg ctccagagct caggtctcta ttccttgtcc 540
agcgtagtca cagtaccgag ctccagtctg ggtactcaga catacatctg caacgtcaat 600
cacaaaccgt ccaatacaaa ggttgacgag aaggtggagc cgaagagttg tgacaaaaca 660
cacacctgtc caccttgtcc ggcaccagaa gctgctggtg gcccctccgt attcttgttt 720
cctccaaaac cgaaagatac tctcatgatt tctcgcaccc ccgaggtaac gtgcgtagtg 780
gtcgatgtat cacatgaaga ccccgaagta aaatttaatt ggtatgttga cggcgtagaa 840
gtgcataacg ccaagactaa gccacgcgag gagcaataca actccactta tagggtagtg 900
tctgttttga ctgtccttca ccaagactgg ttgaatggaa aggagtataa atgtaaggtc 960
tctaataagg ctctcggcgc acctatagag aagaccatct caaaagcaaa agggcaacca 1020
cgggagcctc aagtttatac cttgccccct agtcgcgatg agttgaccaa gaaccaggtg 1080
tcccttacct gtcttgttaa aggtttctat cccagtgaca tagcggtgga gtgggaaagt 1140
aacggtcagc ctgagaacaa ctataagacg acacctcctg ttctcgattc cgatggcagt 1200
tttttcctgt attctaaact taccgttgat aaatcacgct ggcagcaggg gaatgtcttt 1260
tcttgttcag ttatgcatga ggctttgcac aatcactaca cgcaaaaatc actcagtctc 1320
tctccgggag gcggaggggg gagtggggga ggggggtctg gaggaggagg aagtggaggt 1380
ggaggatctg aaattgtatt gacccaatct cccggaacgc tttctctgag ccctggagag 1440
cgggctaccc tgtcatgtcg agcaagccaa tcagtaagca gatcctacct cgcatggtac 1500
cagcagaaac ccggacaggc accacgcctc ctcataattg gcgccagcac cagggccacg 1560
ggcatacccg accgcttctc cggttctgga tcagggaccg atttcaccct caccatatct 1620
agactggaac cggaggattt tgccgtatat tactgccagc aaggacaggt catacctccc 1680
acgtttggac aagggacgaa agtcgaaatc aaaagctccg catcaaccaa gggaccgagt 1740
gtcttccccc tcgccccgag ctctaaaagc acgtctgggg gtactgcagc gctcggatgc 1800
cttgtgaagg attactttcc agaaccggtc acggtgagtt ggaatagtgg agcgctcacg 1860
tcaggagtac atacattccc tgcagtactg cagagtagtg gactttacag tttgagcagc 1920
gtggtcacag tccccagttc atccctgggt acccaaacgt atatatgtaa cgtcaaccat 1980
aaacccagta ataccaaggt ggataagaag gtggaaccga agtcatgc 2028
<210> 116
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: P1AA9663的组成分子2的碱基序列
<400> 116
gatattcaaa tgactcaatc cccatcctct ctttccgcat ctgttggtga cagggtgact 60
atcacttgta ggtcctctca gagcctggta cattctaacg gcaatacatt tttgcactgg 120
tatcagcaaa agccaggcaa ggctcccaaa ctgcttatct acaccgtaag taaccgcttc 180
tccggcgtcc ctagtaggtt ctccggtagc ggcagtggca ctgatttcac cctcactatc 240
agcagtcttc aaccggaaga ctttgccact tacttctgta gccagactac gcacgtccct 300
tggaccttcg gccagggcac gaaggtcgag ataaagcgca cagtggctgc tccgtctgta 360
ttcatcttcc ccccatcaga tcgaaaactg aagtcaggca cagccagtgt cgtttgcttg 420
ctgaataatt tctatccgcg cgaggccaaa gtccaatgga aagtcgataa tgctctccaa 480
tccggtaatt cccaagagtc tgtcaccgag caagattcaa aagatagcac ttactccttg 540
agctctactt tgacgctcag caaagcggac tacgagaagc ataaggtgta cgcttgcgaa 600
gttacacacc agggcttgag cagtccggtc accaaaagtt ttaatcgcgg cgagtgc 657
<210> 117
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: P1AA9663的组成分子3的碱基序列
<400> 117
gaggtccaat tgctcgaatc aggaggcggc cttgttcaac cgggcggatc actcaggctg 60
agttgcgccg cgtcaggctt tacctttagc tcacacgcca tgtcttgggt caggcaggct 120
cccggcaaag gcctcgaatg ggtatctgca atctgggctt caggtgagca gtactacgcc 180
gactctgtaa aaggacggtt tacaatttca agagacaaca gtaaaaatac actgtacctt 240
cagatgaata gtctgcgagc cgaggacact gccgtctact actgcgcaaa gggttggctt 300
ggcaacttcg attattgggg tcaggggaca ttggtgacgg tcagctccgc gagtgtagca 360
gcaccctccg tatttatatt cccgccatcc gacgagcagc tcaaaagtgg aacggcttct 420
gtagtttgtc ttcttaacaa tttttacccg cgagaagcca aggtccaatg gaaagtggat 480
aacgcgttgc agagcggcaa ttcccaagag agcgtaactg agcaagattc taaggattct 540
acctatagtc tttcttcaac actgaccttg agtaaagcag actacgagaa gcacaaagtt 600
tacgcctgcg aagttacgca tcaaggattg tcctctccag taactaaaag ttttaatagg 660
ggtgaatgc 669

Claims (32)

1.一种双特异性抗体，其包括包含第一抗原结合结构域的IgG部分和第二抗原结合结构域，该双特异性抗体与人CD40和人成纤维细胞活化蛋白α(FAP)结合，其中，该IgG部分的重链C末端直接或经由接头与该第二抗原结合结构域结合。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的任意一方源自非激动性抗CD40抗体。
3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体，其与人CD40和人FAP分别以二价结合。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述IgG部分的重链C末端与所述第二抗原结合结构域直接结合。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的双特异性抗体，其具有CD40激动剂活性。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的双特异性抗体，其中，在没有FAP表达细胞时不显示CD40激动剂活性，仅在有FAP表达细胞时显示CD40激动剂活性。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的任意一方为抗CD40 IgG抗体的Fab(抗CD40 Fab)。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的任意一方为抗FAP抗体的Fab(抗FAP Fab)。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域为抗CD40 Fab，所述第二抗原结合结构域为抗FAP Fab。
10.根据权利要求1～8中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原结合结构域为抗FAP Fab，所述第二抗原结合结构域为抗CD40 Fab。
11.根据权利要求7、9或10所述的双特异性抗体，其中，所述抗CD40Fab为包括：含有分别包含序列编号24～26所示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)1～3的重链可变区(VH)和含有分别包含序列编号19～21所示的氨基酸序列的CDR1～3的轻链可变区(VL)的Fab。
12.根据权利要求7和9～11中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述抗CD40 Fab为包括：含有序列编号23所示的氨基酸序列的VH和含有序列编号18所示的氨基酸序列的VL的Fab。
13.根据权利要求8～12中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述抗FAP Fab为包括：含有选自以下的(i)～(v)中的任意一个重链CDR1～3的VH和含有分别包含序列编号19～21所示的氨基酸序列的CDR1～3的VL的Fab，
(i)分别包含序列编号33～35所示的氨基酸序列的重链CDR1～3、
(ii)分别包含序列编号38～40所示的氨基酸序列的重链CDR1～3、
(iii)分别包含序列编号43～45所示的氨基酸序列的重链CDR1～3、
(iv)分别包含序列编号48～50所示的氨基酸序列的重链CDR1～3和
(v)分别包含序列编号53～55所示的氨基酸序列的重链CDR1～3。
14.根据权利要求8～13中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述抗FAP Fab为包括：包含选自序列编号32、37、42、47、52、75、77、79、81和83中的任意一个所示的氨基酸序列的VH和包含序列编号18所示的氨基酸序列的VL的Fab。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述IgG部分含有包含序列编号61所示的氨基酸序列的重链恒定区。
16.根据权利要求1～9和11～15中任一项所述的双特异性抗体，其中，由包含选自序列编号65、67、69、71、73、85、87、89、91和93中的任意一个所示的氨基酸序列的两条重链和含有包含序列编号18所示的氨基酸序列的VL的四条轻链构成。
17.根据权利要求1～8和10～15中任一项所述的双特异性抗体，其中，由包含选自序列编号95、97、99、101、103、105、107、109和111中的任意一个所示的氨基酸序列的两条重链和含有包含序列编号18所示的氨基酸序列的VL的四条轻链构成。
18.权利要求1～17中任一项所述的双特异性抗体的双特异性抗体片段。
19.编码权利要求1～17中任一项所述的双特异性抗体或权利要求18所述的双特异性抗体片段的DNA。
20.含有权利要求19所述的DNA的重组体载体。
21.将权利要求20所述的重组体载体导入至宿主细胞而得到的转化株。
22.一种权利要求1～17中任一项所述的双特异性抗体或权利要求18所述的双特异性抗体片段的制造方法，其特征在于，在培养基中培养权利要求21所述的转化株，使培养物中生产并累积权利要求1～17中任一项所述的双特异性抗体或权利要求18所述的双特异性抗体片段，从该培养物采集双特异性抗体或权利要求18所述的双特异性抗体片段。
23.一种与CD40和FAP的至少一者有关的疾病的治疗和/或诊断药物，其含有权利要求1～17中任一项所述的双特异性抗体或权利要求18所述的双特异性抗体片段作为有效成分。
24.根据权利要求23所述的治疗和/或诊断药物，其中，与CD40和FAP的至少一者有关的疾病为癌症。
25.一种与CD40和FAP的至少一者有关的疾病的治疗和/或诊断方法，其使用权利要求1～17中任一项所述的双特异性抗体或权利要求18所述的双特异性抗体片段。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，与CD40和FAP的至少一者有关的疾病为癌症。
27.根据权利要求1～17中任一项所述的双特异性抗体或权利要求18所述的双特异性抗体片段，其用于治疗和/或诊断与CD40和FAP的至少一者有关的疾病。
28.根据权利要求27所述的双特异性抗体或该双特异性抗体片段，其中，与CD40和FAP的至少一者有关的疾病为癌症。
29.权利要求1～17中任一项所述的双特异性抗体或权利要求18所述的双特异性抗体片段在制造与CD40和FAP的至少一者有关的疾病的治疗和/或诊断剂中的应用。
30.根据权利要求29所述的应用，其中，与CD40和FAP的至少一者有关的疾病为癌症。
31.一种用于检测或测定CD40和FAP的至少一者的试剂，其包含权利要求1～17中任一项所述的双特异性抗体或权利要求18所述的双特异性抗体片段。
32.一种双特异性抗体或该双特异性抗体片段的衍生物，其是使放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、蛋白质或抗体医药通过化学或基因工程学的方法结合到权利要求1～17中任一项所述的双特异性抗体或权利要求18所述的双特异性抗体片段得到的。
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