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CN113527487A - 抗人b7-h3的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗人b7-h3的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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CN113527487A
CN113527487A CN202010324347.7A CN202010324347A CN113527487A CN 113527487 A CN113527487 A CN 113527487A CN 202010324347 A CN202010324347 A CN 202010324347A CN 113527487 A CN113527487 A CN 113527487A
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protein
seq
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张雷
徐敏
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Fosun Kaite Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种抗人B7‑H3的单克隆抗体及其应用。具体地，本发明公开了一种新的靶向B7‑H3的单克隆抗体尤其是单链抗体。本发明还公开了制备所述的单克隆抗体的方法。本发明的单克隆抗体能够高特异性地结合B7‑H3抗原，其具有很高的亲和力并且具有显著抗肿瘤等活性。

Description

抗人B7-H3的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学或生物制药技术，具体地，涉及人B7-H3的单克隆抗体及其衍生物如单链抗体、双特异性抗体、抗体偶连药物和CAR-T细胞等，以及其相应应用。
背景技术
B7-H3(也称为CD276)是一种I型跨膜蛋白，属于B7免疫球蛋白超家族。在人体中，B7-H3的mRNA在多种正常组织中广泛表达，但是蛋白却在正常组织中不表达或者低表达。B7-H3蛋白广泛表达于多种癌症组织中，如肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、卵巢癌和肝癌等，并且B7-H3蛋白的高表达与多种癌症的疾病进展和不良预后相关。此外，在肿瘤微环境中，B7-H3也过量表达于肿瘤相关血管内皮和成纤维细胞上，而在正常血管内皮以及生理性血管新生内皮细胞上不表达。鉴于B7-H3在正常组织中不表达或者低表达而在多种癌症组织中高表达的特性，B7-H3是一个极具潜力的肿瘤相关抗原。
因此，本领域急需开发具有高亲和力且高特异性的B7-H3结合的抗体。
发明内容
本发明的目的是提供高亲和力且高特异性的B7-H3结合的抗体。
在本发明的第一方面，提供了一种抗B7-H3的抗体，所述抗体具有重链可变区和轻链可变区，
所述的重链可变区具有3个互补决定区VH-CDR，3个VH-CDR选自下组：
SEQ ID NO.8n+2所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.8n+3所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.8n+4所示的VH-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、或34；
和/或所述的轻链可变区具有3个互补决定区VL-CDR，3个VL-CDR选自下组：
SEQ ID NO.8n+6所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.8n+7所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.8n+8所示的VL-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、或34；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸并能够保留其B7-H3结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述的抗体的重链具有SEQ ID NO.8n+1中任一所示氨基酸序列，其中，n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、或34。
在另一优选例中，所述的抗体的轻链具有SEQ ID NO.8n+5中任一所示氨基酸序列，其中，n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、或34。
在另一优选例中，n为0-8的任一整数。
在另一优选例中，n为9-16的任一整数。
在另一优选例中，上述任一CDR的氨基酸序列中包含经过添加、缺失、修饰和/或取代1、2或3个氨基酸的衍生CDR序列，并且使得含有所述衍生CDR序列的VH和VL所构成的衍生抗体能够保留与B7-H3结合的亲和力。
在另一优选例中，所述的衍生抗体与B7-H3结合的亲和力F1与相应非衍生的抗体与B7-H3结合的亲和力F0之比(F1/F0)为0.5-2，较佳地为0.7-1.5，和更佳地0.8-1.2。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-5个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)。
在另一优选例中，所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留B7-H3结合亲和力的衍生序列为同源性或序列相同性为至少95％的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源的，和/或所述的轻链恒定区为人源的。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG1恒定区，且所述轻链恒定区为人源抗体轻链kappa恒定区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
在另一优选例中，所述抗体具有选自下组的一个或多个特性：
(a)抑制肿瘤细胞迁移或转移；
(b)抑制肿瘤生长。
在另一优选例中，所述的抗体为单链抗体(scFV)。
在另一优选例中，所述的抗体具有下式I或II所示的结构：
Z1-L1-Z2-Z3 (I)
Z2-L1-Z1-Z3 (II)
式中，
Z1为重链可变区VH；
Z2为轻链可变区VL；
L1为无或肽接头；
Z3为抗体恒定区(Fc区)；
各“-”表示肽键。
在另一优选例中，L1为柔性肽接头，较佳地为(G4S)3。
在另一优选例中，scFv的连接片段(linker)为GSTSGSGKPGSGEGS或GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS。
在另一优选例中，Z3为IgG的Fc，较佳地为IgG1的Fc。
在另一优选例中，Z3为人抗体的Fc。
在另一优选例中，所述的抗体具有下式III所示的结构：
VH-(G4S)3-VL-huIgG1Fc (III)
式中，
VH为重链可变区；
VL为轻链可变区；
(G4S)3为肽接头；
huIgG1Fc为人IgG1抗体的恒定区。
在另一优选例中，所述的抗体的VH、VL和各自的CDR的序列号如表A中所示：
表A抗体克隆的VH、VL和各自CDR的序列号(SEQ ID No:)
Figure BDA0002462641910000031
Figure BDA0002462641910000041
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括框架区(FR)，并且所述抗体的轻链可变区还包括框架区(FR)。
在另一优选例中，在所述VH的框架区和/或VL的框架区的氨基酸序列，可包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸并能够保留其B7-H3结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述的重链可变区和所述的轻链可变区包括选自下组的CDR：
Figure BDA0002462641910000042
Figure BDA0002462641910000051
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留B7-H3结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述的抗体选自下组：
Figure BDA0002462641910000052
Figure BDA0002462641910000061
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO.1、9、17、25、33、41、49、57、65所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO.5、13、21、29、37、45、53、61、69所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在本发明的第二方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包括：
(i)本发明第一方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为膜蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为嵌合抗原受体(CAR)。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)第一方面所述的抗体；以及
(2)第二方面所述的重组蛋白。
在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明的第五方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有第四方面所述的载体或基因组中整合有第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括人细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括免疫细胞。
在本发明的第六方面，提供了一种抗体偶联物，该抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体如第一方面所述、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在本发明的第七方面，提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有第一方面所述的抗体及含所述抗体的融合蛋白。
在另一优选例中，所述的免疫细胞包括NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在另一优选例中，所述的融合蛋白为嵌合抗原受体(CAR)。
在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如第一方面所述的抗体、如第二方面所述的重组蛋白、第六方面所述的抗体偶联物、第七方面所述的免疫细胞、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括(i)0.01～99.99wt％的如第一方面所述的抗体、如第二方面所述的重组蛋白、第六方面所述的抗体偶联物、第七方面所述的免疫细胞、或其组合，和(ii)0.01～99.99wt％的药学上可接受的载体，所述百分比为占所述药物组合物的重量百分比。
在本发明的第九方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如第一方面所述的抗体、如第二方面所述的重组蛋白、第六方面所述的抗体偶联物、第七方面所述的免疫细胞、或其组合，其中所述活性成分被用于(a)制备诊断试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗与B7-H3表达或功能异常相关的疾病的药物。
在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
在另一优选例中，所述B7-H3表达或功能异常相关的疾病选自下组：癌症、自身免疫性疾病。
在另一优选例中，所述癌症选自下组：肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、卵巢癌和肝癌。
在另一优选例中，所述诊断试剂或试剂盒用于：
(1)检测样品中B7-H3蛋白；和/或
(2)检测肿瘤细胞中内源性的B7-H3蛋白；和/或
(3)检测表达B7-H3蛋白的肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述药物用于预防和/或治疗与B7-H3表达或功能异常相关的疾病，所述与B7-H3表达或功能异常相关的疾病选自下组：癌症、自免疫疾病。
在另一优选例中，所述癌症选自下组：肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、卵巢癌和肝癌。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。
在另一优选例中，所述的诊断试剂或试剂盒用于诊断B7-H3相关疾病。
在另一优选例中，所述的诊断试剂或试剂盒用于检测样品中B7-H3蛋白。
在本发明的第十方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中B7-H3蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如本发明的第一方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在B7-H3蛋白。
在本发明的第十一方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明的第一方面所述的抗体。
在本发明的第十二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明第一方面所述的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明第一方面所述抗体的二抗；
或者，
所述试剂盒含有上述的的检测板。
在本发明的第十三方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明的第五方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明的第一方面所述的抗体或如本发明的第二方面所述的重组蛋白。
在本发明的第十四方面，提供了一种药物组合，包括：
(i)第一活性成分，所述第一活性成分选自下组：如第一方面所述的抗体、如第二方面所述的重组蛋白、第六方面所述的抗体偶联物、第七方面所述的免疫细胞、或其组合；
(ii)第二活性成分，所述第二活性成分包括第二抗体、或化疗剂。
在另一优选例中，所述第二抗体选自下组：CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体、4-1BB抗体。
在另一优选例中，所述化疗剂选自下组：多西他赛、卡铂、或其组合。
在本发明的第十五方面，提供了一种治疗与B7-H3表达或功能异常相关的疾病的方法，包括步骤：向有需要的对象施用有效量的如第一方面所述的抗体、如第二方面所述的重组蛋白、第六方面所述的抗体偶联物、第七方面所述的免疫细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述与B7-H3表达或功能异常相关的疾病选自下组：癌症、自身免疫性疾病。
在另一优选例中，所述癌症选自下组：肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、卵巢癌和肝癌等。
在另一优选例中，所述的方法还包括：在施用第一活性成分之前、之中和/或之后，向所述对象施用安全有效量的第二抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体选自下组：PD-1抗体、CTLA4抗体、PD-L1抗体、4-1BB抗体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了人4Ig-B7-H3过表达的胚胎肾细胞HEK 293T细胞株(命名为B细胞)的筛选结果。
图2显示了小鼠2Ig-B7-H3过表达的胚胎肾细胞HEK 293T细胞系(命名为C细胞)的筛选结果。
图3显示了重组蛋白(B7-H3蛋白的胞外区)的SDS-PAGE，其中，泳道B7-H3ECD(29-465)-6His(R)表示重组表达的人源B7-H3胞外区蛋白(带有6His标签)的还原性样品；泳道B7-H3 ECD(29-465)-6His(NR)表示重组表达的人源B7-H3胞外区蛋白(带有6His标签)的非还原性样品。
图4显示了重组蛋白(B7-H3蛋白的胞外区)的SEC-HPLC图。
图5显示了部分scFv单链抗体VH的CDR1氨基酸序列比对结果。
图6显示了部分scFv单链抗体VH的CDR2氨基酸序列比对结果。
图7显示了部分scFv单链抗体VH的CDR3氨基酸序列比对结果。
图8显示了部分scFv单链抗体VL的CDR1氨基酸序列比对结果。
图9显示了部分scFv单链抗体VL的CDR2氨基酸序列比对结果。
图10显示了部分scFv单链抗体VL的CDR3氨基酸序列比对结果。
图11显示了通过酶联免疫反应(ELISA)检测的部分scFv单链抗体和人4Ig-B7-H3ECD蛋白的亲和力曲线和IC50值。其中，图11的A至I分别显示了不同抗体的检测结果。
图12显示了通过流式细胞技术检测的部分scFv单链抗体与A，B，C细胞的结合情况。其中，从上至下分别包括以下单链抗体的结合情况。
(A)96-3,96-14,96-2,96-8,90-26,90-16,81A1,81A15单链抗体；
(B)81A55,81A9,81A58,81A68,81A53,81A40,81A14,81A5单链抗体；
(C)81A37,81A2,81A57,81A30,81A21,81A18,81A31,81A19单链抗体；
(D)81A6,81A8,81A71,81A56,81A66,81A70单链抗体；
(E)81A22,81A4,81A25,81A24,81A34单链抗体。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，以人源B7-H3蛋白、稳定表达B7-H3蛋白的细胞株作为免疫原，通过大量筛选，意外地获得一组具有全新氨基酸序列的B7-H3抗体。本发明所述的B7-H3抗体是一种具有优异的生物特性的B7-H3抗体，对人B7-H3蛋白具有高度亲和力和特异性，因此能够运用于治疗肿瘤和其他相关疾病。在此基础上完成了本发明。
术语
本发明中，“VH-CDR1”与“CDR-H1”可互换使用，均指重链可变区的CDR1；“VH-CDR2”与“CDR-H2”可互换使用，均指重链可变区的CDR2；“VH-CDR3”与“CDR-H3”可互换使用，均指重链可变区的CDR3。“VL-CDR1”与“CDR-L1”可互换使用，均指轻链可变区的CDR1；“VL-CDR2”与“CDR-L2”可互换使用，均指轻链可变区的CDR2；“VL-CDR3”与“CDR-L3”可互换使用，均指轻链可变区的CDR3。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。
B7-H3
B7-H3(也称为CD276)是一种I型跨膜蛋白，属于B7免疫球蛋白超家族，B7-H3和其它家族成员存在20-27％的同源性。在小鼠中，B7-h3基因位于鼠9号染色体，其蛋白的胞外结构是由一个IgV和一个IgC组成(VC，2Ig-B7-H3)；在人体中，B7-H3基因位于人15号染色体，人B7-H3蛋白存在两种形式，一种由一个IgV和IgC组成(VC，2Ig-B7-H3)，另一种是两对VC串联的形式(VCVC，4Ig-B7-H3),且后者是人体中最广泛表达的形式。
在人体中，B7-H3的mRNA在多种正常组织中广泛表达，但是蛋白的表达却受到严格的限制，在正常组织中不表达或者低表达。B7-H3蛋白广泛表达于多种癌症组织中，如肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、卵巢癌和肝癌等，并且B7-H3蛋白的高表达与多种癌症的疾病进展和不良预后相关。此外，在肿瘤微环境中，B7-H3也过量表达于肿瘤相关血管内皮和成纤维细胞上，而在正常血管内皮以及生理性血管新生内皮细胞上不表达。另外研究发现，B7-H3在免疫调节中发挥共抑制作用，它能够通过调节NFAT、NFκB和AP-1信号通路来抑制T细胞的分裂，在B7-H3缺陷的小鼠中，Th细胞更多地分化为Th1细胞而不是Th2细胞，从而导致更严重的气道炎症。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
单链抗体(scFv,single chain fragment variable)是由抗体的重链和轻链的可变区(VH和VL)组成的，大小约为30KDa。典型地，在VH和VL之间通过15-20个氨基酸的可变短肽连接子(linker)连接，该连接子短肽通常由疏水序列组成，最常见的设计就是由甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成的(G4S)3连接子。相比较全长抗体，单链抗体在保留了结合特异性和亲和力的同时，其分子量更小，能够更好更快地浸入肿瘤组织或者其它组织，同时单链抗体在体内的半衰期更短，能够更快地通过肾脏从血液中排出体外，因此，可以减少药物或者放射性核素连接的单链抗体在正常组织中的暴露时间。而且，单链抗体可以用于构建CAR-T细胞的亲和力原件，已经得到了广泛应用，并在临床应用中证明了其效果。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合能力和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIHPubl.NoNO.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗B7-H3蛋白抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合B7-H3蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有B7-H3蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者多特异性。
本发明还提供了其他多肽，如包含单域抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明单域抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约70个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
Figure BDA0002462641910000131
Figure BDA0002462641910000141
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
本发明中，更优选地，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，可以是1-7个，更优选为1-5个，更优选为1-3个，更优选为1-2个。
核酸
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
制备方法
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
此外，还可将抗体的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入基因工程载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
载体和宿主细胞
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、HEK-293细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)。
典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。
在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。
在一些实施方式中，抗体药物偶联物ADC如下分子式所示：
Figure BDA0002462641910000171
其中：
Ab是抗体，
LU是接头；
D是药物；
而且下标p是选自1到8的值。
应用
本发明还提供了本发明抗体、抗体偶联物ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，例如用于制备诊断制剂或制备药物。
较佳地，所述的药物是用于预防和/或治疗与B7-H3表达或功能异常相关的疾病的药物。
本发明中，所述与B7-H3表达或功能异常相关的疾病是本领域常规的与B7-H3表达或功能异常相关的疾病。较佳地，所述与B7-H3表达或功能异常相关的疾病为癌症。
本发明中，所述癌症为本领域常规的癌症，较佳地为肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、卵巢癌和肝癌。
本发明抗体、ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，包括(但并不限于)：
(i)诊断、预防和/或治疗肿瘤发生、生长和/或转移，尤其是B7-H3高表达的肿瘤。所述肿瘤包括(但并不限于)：肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、卵巢癌和肝癌。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体或其ADC可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。典型地，本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明所述的药物组合物是用于预防和/或治疗与B7-H3表达或功能异常相关的疾病的药物组合物。
本发明的药物组合物可直接用于结合B7-H3蛋白分子，因而可用于预防和治疗肿瘤等疾病。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
本发明中，较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提供上述药物组合物在制备预防和/或治疗与B7-H3表达或功能异常相关的疾病的药物中的应用。较佳地，所述与B7-H3表达或功能异常相关的疾病为癌症、自身免疫性疾病。
检测样品中B7-H3蛋白的方法、组合物
本发明还提供一种检测样品中B7-H3蛋白(例如检测过表达B7-H3细胞)的方法，包括如下的步骤：上述的抗体与待检样品在体外接触，检测上述的抗体与所述待检样品是否结合形成抗原-抗体复合物即可。
所述的过表达的含义为本领域常规，指B7-H3蛋白在待检样品中的RNA或蛋白质的过表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工以及蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运送模式改变(核定位增加)而导致的局部过表达和功能活性提高(如在底物的酶水解作用增加的情况下)。
本发明中，上述是否结合形成抗原-抗体复合物的检测方式是本领域常规的检测方式，较佳地为流式细胞实验(FACS)检测。
本发明提供一种检测样品中B7-H3蛋白的组合物，其包括上述的抗体、重组蛋白、抗体偶联物、免疫细胞、或其组合作为活性成分。较佳地，其还包括上述的抗体的功能片段组成的化合物作为活性成分。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明抗体对人B7-H3具有高亲和力。
(b)本发明抗体对人B7-H3具有高特异性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
实施例1构建人4Ig-B7-H3过表达的胚胎肾细胞HEK 293T细胞株(命名为B细胞)
复苏低代次的HEK 293T细胞株，培养条件为37℃，5％CO2，饱和水蒸气，培养基为含10％FBS(Gibco)的DMEM(Gibco)，其中培养基中加入1％的青霉素-链霉素(Gibco)。在培养2-3代后，将细胞接入6孔板中，待单层细胞汇合度为70-90％时，进行转染。每孔2μg质粒(表达B7-H3和eGFP荧光蛋白)，使用的转染试剂为X-tremeGENE HP DNA TransfectionReagent(Roche)。转染后的细胞，在连续培养2-3代后制备单细胞悬液，按照每孔0.8个细胞的密度将细胞接种到96孔板中，通过观察其GFP荧光情况挑选单克隆，并将单克隆逐级扩培。在扩培过程中通过流式细胞仪检测GFP单峰情况，剔除多峰克隆，最后通过B7-H3流式抗体对获得的GFP单峰克隆进行进一步验证，获得所需要的阳性克隆。
用于表达4Ig-B7-H3蛋白的核苷酸基因序列如下：
ATGCTGCGTCGGCGGGGCAGCCCTGGCATGGGTGTGCATGTGGGTGCAGCCCTGGGAGCACTGTGGTTCTGCCTCACAGGAGCCCTGGAGGTCCAGGTCCCTGAAGACCCAGTGGTGGCACTGGTGGGCACCGATGCCACCCTGTGCTGCTCCTTCTCCCCTGAGCCTGGCTTCAGCCTGGCACAGCTCAACCTCATCTGGCAGCTGACAGATACCAAACAGCTGGTGCACAGCTTTGCTGAGGGCCAGGACCAGGGCAGCGCCTATGCCAACCGCACGGCCCTCTTCCCGGACCTGCTGGCACAGGGCAACGCATCCCTGAGGCTGCAGCGCGTGCGTGTGGCGGACGAGGGCAGCTTCACCTGCTTCGTGAGCATCCGGGATTTCGGCAGCGCTGCCGTCAGCCTGCAGGTGGCCGCTCCCTACTCGAAGCCCAGCATGACCCTGGAGCCCAACAAGGACCTGCGGCCAGGGGACACGGTGACCATCACGTGCTCCAGCTACCAGGGCTACCCTGAGGCTGAGGTGTTCTGGCAGGATGGGCAGGGTGTGCCCCTGACTGGCAACGTGACCACGTCGCAGATGGCCAACGAGCAGGGCTTGTTTGATGTGCACAGCATCCTGCGGGTGGTGCTGGGTGCAAATGGCACCTACAGCTGCCTGGTGCGCAACCCCGTGCTGCAGCAGGATGCGCACAGCTCTGTCACCATCACACCCCAGAGAAGCCCCACAGGAGCCGTGGAGGTCCAGGTCCCTGAGGACCCGGTGGTGGCCCTAGTGGGCACCGATGCCACCCTGCGCTGCTCCTTCTCCCCCGAGCCTGGCTTCAGCCTGGCACAGCTCAACCTCATCTGGCAGCTGACAGACACCAAACAGCTGGTGCACAGTTTCACCGAAGGCCGGGACCAGGGCAGCGCCTATGCCAACCGCACGGCCCTCTTCCCGGACCTGCTGGCACAAGGCAATGCATCCCTGAGGCTGCAGCGCGTGCGTGTGGCGGACGAGGGCAGCTTCACCTGCTTCGTGAGCATCCGGGATTTCGGCAGCGCTGCCGTCAGCCTGCAGGTGGCCGCTCCCTACTCGAAGCCCAGCATGACCCTGGAGCCCAACAAGGACCTGCGGCCAGGGGACACGGTGACCATCACGTGCTCCAGCTACCGGGGCTACCCTGAGGCTGAGGTGTTCTGGCAGGATGGGCAGGGTGTGCCCCTGACTGGCAACGTGACCACGTCGCAGATGGCCAACGAGCAGGGCTTGTTTGATGTGCACAGCGTCCTGCGGGTGGTGCTGGGTGCGAATGGCACCTACAGCTGCCTGGTGCGCAACCCCGTGCTGCAGCAGGATGCGCACGGCTCTGTCACCATCACAGGGCAGCCTATGACATTCCCCCCAGAGGCCCTGTGGGTGACCGTGGGGCTGTCTGTCTGTCTCATTGCACTGCTGGTGGCCCTGGCTTTCGTGTGCTGGAGAAAGATCAAACAGAGCTGTGAGGAGGAGAATGCAGGAGCTGAGGACCAGGATGGGGAGGGAGAAGGCTCCAAGACAGCCCTGCAGCCTCTGAAACACTCTGACAGCAAAGAAGATGATGGACAAGAAATAGCCTGA(SEQ ID No:281)
实验结果：
结果如图1所示，根据流式分析结果，最终选择了3E11克隆作为B细胞进行后的筛选。
实施例2构建小鼠2Ig-B7-H3过表达的胚胎肾细胞HEK 293T细胞系(命名为C细胞)
重复实施例1,不同点在于，用小鼠2Ig-B7-H3的编码序列替换人4Ig-B7-H3的编码序列。
用于表达小鼠2Ig-B7-H3蛋白的核苷酸基因序列如下：
ATGCTTCGAGGATGGGGTGGCCCCAGTGTGGGTGTGTGTGTGCGCACAGCACTGGGGGTGCTGTGCCTCTGCCTCACAGGAGCTGTGGAAGTCCAGGTCTCTGAAGACCCCGTGGTGGCCCTGGTGGACACGGATGCCACCCTACGCTGCTCCTTTTCCCCAGAGCCTGGCTTCAGTCTGGCACAGCTCAACCTCATCTGGCAGCTGACAGACACCAAACAGCTGGTGCACAGCTTCACGGAGGGCCGGGACCAAGGCAGTGCCTACTCCAACCGCACAGCGCTCTTCCCTGACCTGTTGGTGCAAGGCAATGCGTCCTTGAGGCTGCAGCGCGTCCGAGTAACCGACGAGGGCAGCTACACCTGCTTTGTGAGCATCCAGGACTTTGACAGCGCTGCTGTTAGCCTGCAGGTGGCCGCCCCCTACTCGAAGCCCAGCATGACCCTGGAGCCCAACAAGGACCTACGTCCAGGGAACATGGTGACCATCACGTGCTCTAGCTACCAGGGCTATCCGGAGGCCGAGGTGTTCTGGAAGGATGGACAGGGAGTGCCCTTGACTGGCAATGTGACCACATCCCAGATGGCCAACGAGCGGGGCTTGTTCGATGTTCACAGCGTGCTGAGGGTGGTGCTGGGTGCTAACGGCACCTACAGCTGCCTGGTACGCAACCCGGTGTTGCAGCAAGATGCTCACGGCTCAGTCACCATCACAGGGCAGCCCCTGACATTCCCCCCTGAGGCTCTGTGGGTAACCGTGGGGCTCTCTGTCTGTCTTGTGGTACTACTGGTGGCCCTGGCTTTCGTGTGCTGGAGAAAGATCAAGCAGAGCTGCGAGGAGGAGAATGCAGGTGCCGAGGACCAGGATGGAGATGGAGAAGGATCCAAGACAGCTCTACGGCCTCTGAAACCCTCTGAAAACAAAGAAGATGACGGACAAGAAATTGCTTGA(SEQ ID No:282)
结果见图2，根据流式分析结果，最终选择了2B3克隆作为C细胞进行后续的筛选。
A细胞构建方法和B、C细胞相同，只是使用的质粒只表达eGFP荧光蛋白，无其他目的基因，用作筛选过程的对照。
实施例3提取B7-H3 ECD蛋白
采用真核表达系统HEK 293-6E(可购自Thermo Fisher Scientific)，表达人4Ig-B7-H3的胞外区(ECD，氨基酸29-465位)重组蛋白，其序列为：
LEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHSSVTITPQRSPTGAVEVQVPEDPVVALVGTDATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYRGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPMTFPPE(SEQ ID No:283)
通过镍柱亲和纯化，从而制得重组蛋白(B7-H3蛋白的胞外区)。
SDS-PAGE的鉴定结果如图3所示，SEC-HPLC鉴定结果如图4所示，结果表明，重组蛋白的纯度>95％。
实施例4筛选能够结合4Ig-B7-H3过表达的细胞的克隆
使用噬菌体展示技术筛选全人源天然抗体库，得到不同的Fab库。
方法一、通过ELISA和流式细胞技术从中进行筛选，得到能够结合B细胞和/或者C细胞的克隆。经过测序比对去除重复克隆，得到能够结合B细胞和/或者C细胞的特异性克隆。
方法二、通过B7-H3 ECD蛋白筛选全人源天然抗体库，采用免疫管固相免疫亲和以及磁珠液相免疫亲和的方法进行筛选，测序比对去除重复克隆，得到能够结合B细胞和/或者C细胞的特异性克隆。
通过ELISA和流式细胞技术对上述细胞筛选获得的特异性克隆进行复核验证，结合测序比对后，去除了序列重复的克隆后得到29个具有独特性序列的能够结合B细胞和/或者C细胞的克隆；通过B7-H3 ECD蛋白筛选全人源天然抗体库，从中获得了9个具有独特性序列的能够结合B细胞和/或者C细胞的克隆。
因此，通过以上两条不同的技术路线，排除序列冗余的3个克隆后，总共获得了35个能够结合B细胞的具备序列独特性的阳性抗体克隆；且其中30个抗体克隆能够同时结合B细胞和C细胞。
实施例5构建单链抗体与亲和力特性排序
5.1构建单链抗体
将上述获得抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的通过(G4S)3连接片段连接在一起，构建成单链抗体(single chain fragment variable,scFv)，并和人IgG1-Fc片段融合，构建成结构形式为VH-(G4S)3-VL-huIgG1 Fc的融合蛋白。使用293T细胞，对这35个单链抗体进行重组表达，并纯化得到这些抗体。
5.2亲和力测试
以上述的A，B，C细胞和B7-H3 ECD蛋白为基础，采用流式细胞术和酶联免疫反应(ELISA)实验，对这35个单链抗体进行复核，对其结合B7-H3分子的亲和力和特异性进行归类排序。
5.3结果
构建的35种单链抗体的结构列于表1。
表1
Figure BDA0002462641910000231
Figure BDA0002462641910000241
相应的氨基酸序列如表2所示
表2 VH和VL的氨基酸序列
Figure BDA0002462641910000242
Figure BDA0002462641910000251
Figure BDA0002462641910000261
Figure BDA0002462641910000271
相应的DNA序列如表3所示。
表3 VH和VL的核苷酸序列
Figure BDA0002462641910000272
Figure BDA0002462641910000281
Figure BDA0002462641910000291
Figure BDA0002462641910000301
Figure BDA0002462641910000311
Figure BDA0002462641910000321
Figure BDA0002462641910000331
Figure BDA0002462641910000341
Figure BDA0002462641910000351
Figure BDA0002462641910000361
部分抗体的VH和VL的CDR列于表4，其中，部分抗体克隆的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3的序列比对结果示于图5-10。
表4部分抗体的CDR氨基酸序列
Figure BDA0002462641910000362
Figure BDA0002462641910000371
Figure BDA0002462641910000381
Figure BDA0002462641910000391
部分抗体的VH和VL的CDR的核苷酸序列示于表5。
表5部分抗体的CDR的核苷酸序列
Figure BDA0002462641910000392
Figure BDA0002462641910000401
Figure BDA0002462641910000411
Figure BDA0002462641910000421
部分抗体的亲和力的测定如表6、图11和图12所示。
表6部分scFv单链抗体的亲和力
Figure BDA0002462641910000422
如图11所示，酶联免疫反应(ELISA)检测显示，本发明的scFv单链抗体和人4Ig-B7-H3ECD蛋白具有优异的亲和力和EC50值。
如图12所示，流式细胞检测显示，本发明scFv单链抗体可特异性结合于人的B7-H3ECD蛋白，且能特异的识别鼠B7-H3(其序列和结构与人源B7-H3高度保守)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种抗B7-H3的抗体，其特征在于，所述抗体具有重链可变区和轻链可变区，
所述的重链可变区具有3个互补决定区VH-CDR，3个VH-CDR选自下组：
SEQ ID NO.8n+2所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO.8n+3所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO.8n+4所示的VH-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、或34；
和/或所述的轻链可变区具有3个互补决定区VL-CDR，3个VL-CDR选自下组：
SEQ ID NO.8n+6所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO.8n+7所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO.8n+8所示的VL-CDR3；
其中，各n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、或34；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸并能够保留其B7-H3结合亲和力的衍生序列。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体的重链具有SEQ ID NO.8n+1中任一所示氨基酸序列，其中，n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、或34。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体的轻链具有SEQ ID NO.8n+5中任一所示氨基酸序列，其中，n独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、或34。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体为单链抗体(scFV)。
5.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体具有下式I或II所示的结构：
Z1-L1-Z2-Z3 (I)
Z2-L1-Z1-Z3 (II)
式中，
Z1为重链可变区VH；
Z2为轻链可变区VL；
L1为无或肽接头；
Z3为抗体恒定区(Fc区)；
各“-”表示肽键。
6.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体具有下式III所示的结构：
VH-(G4S)3-VL-huIgG1Fc (III)
式中，
VH为重链可变区；
VL为轻链可变区；
(G4S)3为肽接头；
huIgG1Fc为人IgG1抗体的恒定区。
7.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白包括：
(i)如权利要求1-6中任一项所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
8.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1-6中任一项所述的抗体；以及
(2)如权利要求7所述的重组蛋白。
9.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求8所述的多核苷酸。
10.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求9所述的载体或基因组中整合有权利要求8所述的多核苷酸。
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