CN119431576A - 一种tigit抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种TIGIT抗体及其制备方法。具体地，本发明开发了一种新的靶向TIGIT的嵌合抗体、或人源化克隆抗体。本发明还公开了制备所述单克隆抗体的方法。本发明的单克隆抗体能够高特异性地结合TIGIT蛋白，阻断TIGIT蛋白与其配体的结合，并能够促进T细胞分泌IFN‑γ。

Description

一种TIGIT抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种TIGIT抗体及其制备方法和应用.

背景技术

单克隆抗体的应用是过去20年时间肿瘤治疗中最成功及最具变革意义的治疗手段之一。与传统化学药物相比，抗体药物具有更高的特异性及更低的毒性。虽然单抗药物取得了持续不断的成功，但仍面临诸多挑战。

免疫检查点是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路，通过调节外周组织中免疫反应的持续性和强度避免组织损伤，并参与维持对于自身抗原的耐受。利用免疫检查点的抑制性信号通路抑制T细胞活性是肿瘤逃避免疫杀伤的重要机制。针对免疫检查点的阻断是众多激活抗肿瘤免疫的有效策略之一。

免疫检查点蛋白的抑制剂具有治疗各种肿瘤类型(如转移性黑素瘤，肺癌，乳腺癌，肾细胞癌等)的潜力。最近癌症免疫治疗方法的研究已经显示出可喜的成果，特别是对转移癌癌症病例。此外，癌症免疫治疗在治疗血液癌症方面具有巨大的潜力，包括霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良综合征，非霍奇金淋巴瘤等。免疫检查点抑制剂引起的副作用是可以忽略的，可逆的和可控的，有效的免疫检查点抑制剂可以显著提高癌症患者的总生存期。免疫检查点抑制剂可以与靶向治疗或常规放射治疗和化学疗法结合使用，并且这种组合疗法可有效治疗许多类型的癌症。

TIGIT(Ig和ITIM结构域T细胞免疫受体)，又被称作VSVG3或VSVG9(V-Set和免疫球蛋白结构域蛋白3或9)，是作为主要免疫检查点分子之一的I型跨膜蛋白,其包含细胞外Ig-V样结构域，跨膜结构域和胞内C-末端结构域。胞内C-末端结构域由一个ITIM(免疫受体酪氨酸抑制基序)和一个ITT(免疫球蛋白尾部酪氨酸)类似基序组成，此二者在人和鼠之间高度保守。TIGIT在激活后的T细胞中表达，同时也在NK细胞，记忆T细胞，部分Treg细胞和Tfh(滤泡辅助性T)中表达。与TIGIT结合的配体目前报道的主要有两个，CD155和CD112，他们在APCs，T细胞和多种非造血细胞中表达，特别是在多种肿瘤细胞中过表达，例如黑色素瘤细胞(melanoma cells)。TIGIT结合CD155的亲和力要高于CD112。TIGIT和配体结合之后，可通过TIGIT胞内端的ITIM(免疫受体酪氨酸抑制基序)诱导细胞下游的抑制性信号，抑制T细胞以及NK细胞的活化和增值，同时减少细胞因子的产生。此外，TIGTI在Treg细胞表面呈组成型高表达，参与Treg对其他效应T细胞，例如Th1和Th17细胞，活性的下调。

CD155和CD112除了其抑制型受体TIGIT之外，还有一个激活型受体，CD226。和TIGIT类似，CD226也通过结合配体CD155或CD112来激活下游的信号通路，不同的是CD226传递正向的共刺激信号，而TIGIT传递抑制信号。因此，TIGIT免疫抑制机制较为复杂，一方面TIGIT通过与CD226竞争配体抑制CD226下游正向的共刺激信号，另一方面是上述提及的通过TIGIT自身对TCR信号通路的抑制，调节T细胞对抗原的反应强度，此外还通过Treg对其他效应T细胞活性的下调，从而使机体表现出对自身抗原或外源弱抗原识别的耐受，最终导致机体抗击肿瘤能力的下降。

和其他几个典型的免疫检测点蛋白(例如CTLA-4，PD-1)一样，研究认为利用抗TIGIT的抗体特异性阻断TIGIT/CD155及CD112配体相互作用，可以提高机体对肿瘤抗原的识别活性，刺激抗原特异性T细胞的增殖，从而达到激活免疫系统并增强抗肿瘤免疫应答，并且已在多个同系小鼠肿瘤模型中被证明，TIGIT的阻断促进抗肿瘤活性。因此，药物阻断TIGIT/CD155和CD112途径可以为各种癌症和其他免疫疾病提供新的治疗方法。

目前，本领域现有的TIGIT抗体还有许多的不足，比如治疗窗口较小、适应症有限、治疗成本高等，所以迫切需要一种开发TIGIT的阻断型抗体来治疗多种癌症。

发明内容

本发明的目的在于提供一种TIGIT抗体及其制备方法。

在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

(1)SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.25所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.3所示的VH-CDR3；或

(2)SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.26所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.8所示的VH-CDR3；

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIGIT结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

(1)SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.2所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.3所示的VH-CDR3；或

SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.25所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.3所示的VH-CDR3；或

(2)SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.7所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.8所示的VH-CDR3；或

SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.26所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.8所示的VH-CDR3。

在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.10、12、27或28所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.29、31、32、或33所示的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区。

在另一优选例中，所述重链还包括重链恒定区。

在另一优选例中，所述重链恒定区为人源或鼠源的。

在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG1恒定区。

在另一优选例中，所述抗体的重链如SEQ ID NO.19或21所示。

本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

(1)SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.6所示的VL-CDR3；或

(2)SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.9所示的VL-CDR3；

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIGIT结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.6所示的VL-CDR3；或

SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.9所示的VL-CDR3。

在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.11或13所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.30、34、35或36所示的氨基酸序列。

本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明的第三方面所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述轻链还包括轻链恒定区。

在另一优选例中，所述轻链恒定区为人源或鼠源的。

在另一优选例中，所述抗体的轻链如SEQ ID NO.20或22所示。

本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：

(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区；和/或

(2)如本发明的第三方面所述的轻链可变区；

或者，所述抗体具有：如本发明的第二方面所述的重链；和/或如本发明的第四方面所述的轻链，

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIGIT结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，上述任一CDR的氨基酸序列中包含经过添加、缺失、修饰和/或取代1、2或3个氨基酸的衍生CDR序列，并且使得含有所述衍生CDR序列的VH和VL所构成的衍生抗体能够保留与TIGIT结合的亲和力。

在另一优选例中，所述的衍生抗体与TIGIT结合的亲和力F1与相应非衍生的抗体与TIGIT结合的亲和力F0之比(F1/F0)为0.5-2，较佳地为0.7-1.5，和更佳地0.8-1.2。

在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-5个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)。

在另一优选例中，所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIGIT结合亲和力的衍生序列为同源性或序列相同性为至少96％的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源的，和/或所述的轻链恒定区为人源的。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括鼠源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括鼠源的框架区。

在另一优选例中，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或其组合。

在另一优选例中，所述的嵌合抗体在人中的免疫原性Z1与非嵌合的抗体(如鼠源抗体)在人中的免疫原性Z0之比(Z1/Z0)为0-0.5，较佳地0-0.2，更佳地0-0.05(如0.001-0.05)。

在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为阻断型或非阻断型抗体，优选阻断型抗体。

在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。

在另一优选例中，所述抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。

在另一优选例中，所述抗体具有选自下组的一个或多个特性：

(a)促进NK细胞细胞毒性；

(b)阻断TIGIT蛋白与其配体CD155的结合；

(c)抑制肿瘤生长。

在另一优选例中，所述抗体具有如本发明的第一方面所述的重链可变区；和如本发明的第三方面所述的轻链可变区；其中，所述的重链可变区包括选自下组的CDR：

(1)SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.2所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.3所示的VH-CDR3；和

所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.6所示的VL-CDR3；或

SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.25所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.3所示的VH-CDR3；和

所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.6所示的VL-CDR3；或

(2)所述的重链可变区包括选自下组的CDR：

SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.7所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.8所示的VH-CDR3；和

所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.9所示的VL-CDR3；或

所述的重链可变区包括选自下组的CDR：

SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.26所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.8所示的VH-CDR3；和

所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.9所示的VL-CDR3。

在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.10、27、或33所示的氨基酸序列；和/或所述轻链可变区具有SEQ ID NO.11、34、35或36所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.12、28、29、31、32所示的氨基酸序列；和/或所述轻链可变区具有SEQ ID NO.13或30所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.33所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.34所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.33所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.35所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.33所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.32所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO.10、27、或33所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。

在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO.12、28、29、31、32所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。

本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包括：

(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：

(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；以及

(2)如本发明的第六方面所述的重组蛋白。

本发明的第八方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明的第七方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第七方面所述的多核苷酸。

本发明的第十方面，提供了一种抗体偶联物，该抗体偶联物含有：

(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、或其组合；和

(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。

本发明的第十一方面，提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的单克隆抗体抗原结合区域的scFv段为特异性结合于TIGIT的结合区，

并且，所述scFv的所述的重链可变区包括选自下组的CDR：

SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.2所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.3所示的VH-CDR3；和

所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.6所示的VL-CDR3；

或

所述的重链可变区包括选自下组的CDR：

SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.7所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.8所示的VH-CDR3；和

所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.9所示的VL-CDR3。

本发明的第十二方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明的第十一方面所述的CAR构建物。

在另一优选例中，所述的免疫细胞包括NK细胞、T细胞。

在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。

本发明的第十三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：

(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十二方面所述的免疫细胞、或其组合；以及

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。

本发明的第十四方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十二方面所述的免疫细胞、或其组合，其中所述活性成分被用于(a)制备诊断试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗与TIGIT表达或功能异常相关的疾病的药物。

在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。

在另一优选例中，所述TIGIT表达或功能异常相关的疾病选自下组：癌症、肿瘤、感染性疾病。

在另一优选例中，所述诊断试剂或试剂盒用于：

(1)检测样品中TIGIT蛋白；和/或

(2)检测肿瘤细胞中内源性的TIGIT蛋白；和/或

(3)检测表达TIGIT蛋白的肿瘤细胞；

而所述药物用于预防和/或治疗与TIGIT表达或功能异常相关的疾病，所述与TIGIT表达或功能异常相关的疾病为癌症、肿瘤、感染性疾病。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：胚细胞瘤，淋巴瘤，血液瘤，肉瘤，黑素瘤，肺癌，乳腺癌，肾细胞癌。

在另一优选例中，所述血液瘤选自下组：霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良综合征，非霍奇金淋巴瘤。

在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。

在另一优选例中，所述的诊断试剂或试剂盒用于诊断TIGIT相关疾病。

在另一优选例中，所述的诊断试剂或试剂盒用于检测样品中TIGIT蛋白。

本发明的第十五方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中TIGIT蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(1)在体外，将所述样品与如本发明的第五方面所述的抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在TIGIT蛋白。

本发明的第十六方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养如本发明的第九方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明的第五方面所述的抗体或如本发明的第六方面所述的重组蛋白。

本发明的第十七方面，提供了一种药物组合，包括：

(i)第一活性成分，所述第一活性成分包括如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十二方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十三方面所述的药物组合物、或其组合；

(ii)第二活性成分，所述第二活性成分包括第二抗体、或化疗剂。

在另一优选例中，所述第二抗体选自下组：CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体。

在另一优选例中，所述第二抗体选自下组：伊匹木单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、兰姆伯单抗(lambrolizumab)和阿妥佐单抗(atezolizumab)。

在另一优选例中，所述的化疗剂选自下组：多西他赛、卡铂、或其组合。

本发明的第十八方面，提供了如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十二方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十三方面所述的药物组合物与第二抗体或化疗剂的组合在制备用于治疗TIGIT表达或功能异常相关的疾病的药物中的用途。

在另一优选例中，所述第二抗体选自下组：CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体。

本发明的第十九方面，提供了一种治疗与TIGIT表达或功能异常相关的疾病的方法，向有需要的对象施用有效量的如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十二方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十三方面所述的药物组合物、或其组合。

在另一优选例中，所述与TIGIT表达或功能异常相关的疾病为癌症、肿瘤、感染性疾病。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：胚细胞瘤，淋巴瘤，血液瘤，肉瘤，黑素瘤，肺癌，乳腺癌，肾细胞癌。

在另一优选例中，所述血液瘤选自下组：霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良综合征，非霍奇金淋巴瘤。

在另一优选例中，所述方法还包括向有需要的对象施用一种或多种免疫检查点受体或配体的抑制剂。

在另一优选例中，所述一种或多种免疫检查点受体或配体选自下组：CTLA-4、PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、BTLA、VISTA、CD96、A2aR、A2bR、CD39、CD73、IDO和TDO。

在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：伊匹木单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、兰姆伯单抗(lambrolizumab)和阿妥佐单抗(atezolizumab)。

在另一优选例中，所述的方法还包括：在施用第一活性成分之前、之中和/或之后，向所述对象施用安全有效量的第二抗体。

在另一优选例中，所述的第二抗体选自下组：PD-1抗体、CTLA4抗体。

在另一优选例中，所述的第二抗体为PD-1抗体。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了TIGIT-hFc蛋白与生物素标记的配体CD155-hFc和CD112-hFc的结合活性。

图2显示了TIGIT蛋白转染的HEK293细胞流式细胞实验(FACS)检测结果。

图3显示了pCP-hTIGIT质粒瞬时转染的HEK293细胞流式细胞实验(FACS)检测结果。紫色为未转染hTIGIT的空白对照细胞系，绿色为瞬时转染hTIGIT的HEK293细胞。图中显示有78.1％的HEK293细胞高表达TIGIT。

图4显示了酶联免疫吸附实验(ELISA)检测TIGIT-hFC蛋白免疫后小鼠血清抗体效价。

图5显示了酶联免疫吸附实验中嵌合抗体TIGIT抗体与人TIGIT胞外区蛋白反应活性。

图6显示了流式细胞实验(FACS)检测嵌合抗体与人TIGIT表达细胞的结合。

图7显示了流式细胞实验(FACS)检测嵌合抗体与猴TIGIT表达细胞的结合。

图8显示了嵌合抗体TIGIT抗体对TIGIT蛋白与其受体CD155的结合的抑制。

图9显示了嵌合抗体TIGIT抗体在Jurkat-NFAT/hTIGIT和293F-hCD155细胞共培养时促进NFAT下游报告基因的表达

图10显示了嵌合抗体TIGIT抗体在Jurkat-NFAT/hTIGIT和293F-hCD112细胞共培养时促进NFAT下游报告基因的表达。

图11显示了嵌合TIGIT抗体介导NK92-CD16a 176对HEK293-hTIGIT细胞的ADCC效应。

图12显示了嵌合TIGIT抗体介导NK92-hTIGIT-hCD226对HT1080细胞的杀伤效应

图13显示了酶联免疫吸附实验中HumAb053人源化TIGIT抗体与人TIGIT胞外区蛋白反应活性。

图14显示了流式细胞实验(FACS)检测HumAb053人源化TIGIT抗体与人TIGIT表达细胞的结合。

图15显示了流式细胞实验(FACS)检测HumAb053人源化TIGIT抗体与鼠TIGIT表达细胞的结合。

图16显示了流式细胞实验(FACS)检测HumAb053人源化TIGIT抗体与猴鼠TIGIT表达细胞的结合。

图17显示了HumAb053人源化TIGIT抗体对TIGIT蛋白与其受体CD155的结合的抑制。

图18显示了HumAb053人源化TIGIT抗体在Jurkat-NFAT/hTIGIT和293F-hCD155细胞共培养时促进NFAT下游报告基因的表达。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，通过大量筛选获得一组抗TIGIT抗体，具体地，采用重组蛋白hTIGIT-Fc，编码TIGIT的质粒载体pCP-hTIGIT，HEK293 hTIGIT细胞对小鼠进行免疫以得到序列不同和高活性的抗体。本发明的TIGIT抗体具有高亲和力、高活性等特点。此外，本发明获得的序列不同的抗体，能够与TIGIT蛋白特异性结合，其结合活性低于纳摩尔；此外，通过逆转TIGIT对T细胞激活活性的抑制，能够激活T细胞分泌IFNγ。在此基础上完成了本发明。

术语

本发明中，“VH”指重链可变区，“VL”指轻链可变区。“VH-CDR1”指重链可变区的CDR1；“VH-CDR2”指重链可变区的CDR2；“VH-CDR3”指重链可变区的CDR3。“VL-CDR1”指轻链可变区的CDR1；“VL-CDR2”指轻链可变区的CDR2；“VL-CDR3”指轻链可变区的CDR3。

TIGIT

TIGIT(T cell Ig and ITIM domain，Ig和ITIM结构域T细胞免疫受体)，又被称作VSVG3或VSVG9(V-Set和免疫球蛋白结构域蛋白3或9)，是作为主要免疫检查点分子之一的I型跨膜蛋白,其包含细胞外Ig-V样结构域，跨膜结构域和胞内C-末端结构域。胞内C-末端结构域由一个ITIM(免疫受体酪氨酸抑制基序)和一个ITT(免疫球蛋白尾部酪氨酸)类似基序组成，此二者在人和鼠之间高度保守。

抗体

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。

在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。

在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

抗TIGIT的抗体

本发明中，所述抗体为抗TIGIT的抗体。本发明提供一种针对TIGIT的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。

优选地，重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.2或或SEQ ID NO.25，或SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.7所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.8所示的VH-CDR3；和

所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.9所示的VL-CDR3；

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIGIT结合亲和力的衍生序列。

更佳地，所述的重链可变区包括选自下组的CDR：

(1)SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.2所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.3所示的VH-CDR3；和

所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.6所示的VL-CDR3；

或

SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.25所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.3所示的VH-CDR3；和

所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.6所示的VL-CDR3；或

(2)所述的重链可变区包括选自下组的CDR：

SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.7所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.8所示的VH-CDR3；和

所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.9所示的VL-CDR3；或

所述的重链可变区包括选自下组的CDR：

SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.26所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.8所示的VH-CDR3；和

所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.9所示的VL-CDR3。其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIGIT结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。

本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。

本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab'、(Fab')2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。

其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。

本发明抗体可以是靶向TIGIT(例如人TIGIT)的嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。

本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。

本发明上述内容中，更优选地，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，可以是1-7个，更优选为1-5个，更优选为1-3个，更优选为1-2个。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:10或12所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:11或13所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述靶向TIGIT的抗体为14F9A4(mAb015)或51F11A7(mAb053)。

重组蛋白

本发明还提供一种重组蛋白，其包括TIGIT抗体的重链CDR1(VH-CDR1)、重链CDR2(VH-CDR2)和重链CDR3(VH-CDR3)中的一种或多种，和/或，TIGIT抗体的轻链CDR1(VL-CDR1)、轻链CDR2(VL-CDR2)和轻链CDR3(VL-CDR3)中的一种或多种，包括

SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.2或或SEQ ID NO.25，或SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.7所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.8所示的VH-CDR3；和

所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.9所示的VL-CDR3；

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIGIT结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。

在另一优选例中，本发明所述的重组蛋白包括TIGIT抗体的重链可变区和TIGIT抗体的轻链可变区，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:10或12所示的氨基酸序列，且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:11或13所示的氨基酸序列。

较佳地，所述的重组蛋白还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区，所述的抗体重链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源抗体重链恒定区或人源抗体重链恒定区，更佳地为人源抗体重链恒定区。所述的抗体轻链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源轻链抗体恒定区或人源抗体轻链恒定区，更佳地为人源抗体轻链恒定区。

所述的重组蛋白为本领域常规的蛋白质，较佳地，其为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibodyfragment，scFv)、单域抗体(singledomain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domainantibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。

所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。

所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为本领域常规的抗原抗体结合域蛋白质片段，其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的Fd段。较佳地，所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为Fab和F(ab’)。

所述的单域抗体为本领域常规的单域抗体，其包括重链可变区和重链恒定区。

所述的单区抗体为本领域常规的单区抗体，其仅包括重链可变区。

其中，所述重组蛋白的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为：从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述重组蛋白。

核酸

本发明还提供一种核酸，其编码上述的抗体(例如抗TIGIT的抗体)或重组蛋白或抗TIGIT的抗体的重链可变区或轻链可变区。

所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。

本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

载体

本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。

其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。

本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。

其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或E.coli BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者HEK293或CHO细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。

抗体的制备

本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、HEK-293细胞。

通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。

本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

抗体-药物偶联物(ADC)

本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)。

典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。

本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。

抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。

抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。

连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。

药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。

有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。

在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。

通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。

本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。

在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。

在一些实施方式中，抗体药物偶联物ADC如下分子式所示：

其中：

Ab是抗体，

LU是接头；

D是药物；

而且下标p是选自1到8的值。

应用

本发明还提供了本发明抗体、抗体偶联物ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，例如用于制备诊断制剂或制备药物。

较佳地，所述的药物是用于预防和/或治疗与TIGIT表达或功能异常相关的疾病的药物。

本发明中，所述与TIGIT表达或功能异常相关的疾病是本领域常规的与TIGIT表达或功能异常相关的疾病。较佳地，所述与TIGIT表达或功能异常相关的疾病为癌症、肿瘤、感染性疾病。

本发明中，所述癌症为本领域常规的癌症，较佳地为胚细胞瘤，淋巴瘤，血液瘤，肉瘤，黑素瘤，肺癌，乳腺癌，肾细胞癌。本发明中，所述血液瘤为本领域常规的肿瘤疾病，例如白血病、霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良综合征，非霍奇金淋巴瘤，较佳地为白血病。

本发明抗体、ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途，包括(但并不限于)：

(i)诊断、预防和/或治疗肿瘤发生、生长和/或转移，所述肿瘤包括(但并不限于)：血液瘤、黑色素瘤、肉瘤、淋巴瘤、腺瘤、胚细胞瘤。

(ii)诊断、预防和/或治疗癌症，所述癌症包括(但并不限于)：胚细胞瘤，淋巴瘤，血液瘤，肉瘤，黑素瘤，肺癌，乳腺癌，肾细胞癌。

(iii)诊断、预防和/或治疗肿瘤，所述肿瘤包括(但并不限于)：黑色素瘤、霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤、成胶质细胞瘤、肝细胞瘤、神经胶质瘤、骨髓瘤、维尔姆斯氏瘤、血液瘤。

检测用途和试剂盒

本发明的抗体或其ADC可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。

本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。

本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。

本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。

配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。典型地，本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。

本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。

本发明所述的药物组合物是用于预防和/或治疗与TIGIT表达或功能异常相关的疾病的药物组合物。

本发明的药物组合物可直接用于结合TIGIT蛋白分子，因而可用于预防和治疗肿瘤等疾病。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

本发明中，较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。

本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提供上述药物组合物在制备预防和/或治疗与TIGIT表达或功能异常相关的疾病的药物中的应用。较佳地，所述与TIGIT表达或功能异常相关的疾病为癌症、肿瘤。

检测样品中TIGIT蛋白的方法、组合物

本发明还提供一种检测样品中TIGIT蛋白(例如检测过表达TIGIT细胞)的方法，包括如下的步骤：上述的抗体与待检样品在体外接触，检测上述的抗体与所述待检样品是否结合形成抗原-抗体复合物即可。

所述的过表达的含义为本领域常规，指TIGIT蛋白在待检样品中的RNA或蛋白质的过表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工以及蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运送模式改变(核定位增加)而导致的局部过表达和功能活性提高(如在底物的酶水解作用增加的情况下)。

本发明中，上述是否结合形成抗原-抗体复合物的检测方式是本领域常规的检测方式，较佳地为流式细胞实验(FACS)检测。

本发明提供一种检测样品中TIGIT蛋白的组合物，其包括上述的抗体、重组蛋白、抗体偶联物、免疫细胞、或其组合作为活性成分。较佳地，其还包括上述的抗体的功能片段组成的化合物作为活性成分。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明的主要优点包括

(1)本发明的抗体的可变区序列与现有抗体有较大差异，其序列同源性<92％。

(2)本发明的抗体具有较强的亲和力，与TIGIT蛋白特异性结合，其结合活性低于纳摩尔。

(3)本发明的抗体通过逆转TIGIT对T细胞激活活性的抑制，激活T细胞分泌IFNγ，具有很好的刺激T细胞激活活性。

(4)本发明采用杂交瘤技术获得抗体，与噬菌体库获得的抗体相比，抗体亲和力高，序列表达良好。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例中所述的室温为本领域常规的室温，一般为10～30℃。

若无特别说明，实施例中所述的PBS为PBS磷酸缓冲液，pH7.2。

本发明涉及的序列如下所示：

表B

实施例1TIGIT抗体的制备

(一)免疫原的制备

制备包括胞外区TIGIT蛋白、TIGIT重组细胞株、TIGIT DNA载体的表达质粒等免疫原。

免疫原1)，将人源TIGIT蛋白胞外区氨基酸序列Met22-Pro141(如序列表SEQIDNo.14的22位-141位所示。其氨基酸序列信息参见Uniprot数据库，编号Q495A1)克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体(购自Invitrogen，V044-50)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press)。对HEK293细胞(购自Invitrogen)进行瞬时转染(PEI，Polysciences)并使用FreeStyle ^TM 293(Invitrogen)在37℃下进行扩大培养。4天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，得含TIGIT蛋白胞外区的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A亲和层析柱(Mabselect Sure，购自GE Healthcare)，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)清洗蛋白A亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用0.1M甘氨酸盐酸(pH2.5)洗脱，收集从蛋白A亲和层析柱上洗脱下来的带hFc标签的TIGIT蛋白(TIGIT-hFc)，用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的免疫原1。免疫原1在使用前需要进行一系列质控检测，如检测其蛋白浓度、纯度、分子量和生物活性等。

结果如图1和表1所示。表1说明TIGIT与CD155在蛋白水平的结合随CD155的浓度变化而变化，表中的数据为OD_450nm值。

其中，免疫原1生物活性采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测，具体为：

将带hFc标签的TIGIT蛋白(TIGIT-hFc，即免疫原1)，用PBS稀释至0.5μg/mL，以100μl/孔加入ELISA微孔板，4℃孵育过夜。用ELISA封闭液(含1％BSA，pH7.4的PBS磷酸缓冲液，所述百分比为质量百分比)37℃封闭两小时后，再加入梯度稀释的生物素标记的CD155–hFc和CD112-hFc，37℃温育1小时。生物素标记的CD155-hFc和CD112-hFc的制备方法如下：将CD155-hFc和CD112-hFc与生物素化试剂反应即可。所述CD155-hFc和CD112-hFc的制备方法与免疫原1的制备方法相同，其中CD155胞外区蛋白(Gly27-Asp343)的氨基酸序列信息参见Uniprot数据库，编号P15151；CD112胞外区蛋白(Gln32-Leu360)的氨基酸序列信息参见Uniprot数据库，编号Q92692；所述生物素化试剂购自Sigma，商品号B3295；与生物素化试剂反应的操作步骤参见该生物素化试剂的说明书。加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(购自Sigma商品号S2438)，室温孵育30分钟后加入100微升/孔TMB显色液。室温孵育15分钟后，加入50微升1N盐酸终止显色反应，用ELISA读板机读取OD_450nm读数。

具体活性结果如表1和图1所示，TIGIT与CD155的结合能力较强，而与CD112的结合能力较弱，和文献资料描述基本一致。

表1 TIGIT-hFc蛋白与生物素标记的配体CD155-hFc和CD112-hFc的结合活性

免疫原2)，人源TIGIT全长氨基酸序列被克隆到pIRES载体(购自Clontech)并制备质粒。对HEK293细胞系和CHOK1细胞系(均购自Invitrogen)进行质粒转染(转染使用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent，购自Roche公司，货号Cat#06 366 236 001，并按说明书操作)后，在含0.5μg/ml嘌呤霉素的含10％(w/w)FBS的DMEM培养基中选择性培养2周，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃，5％(v/v)CO₂培养。大约2周后选择部分单克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用已知的TIGIT抗体染色，经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存，即获得免疫原2。

具体选择结果如表2和图2所示，表2中数值即为平均的荧光强度，数值越高表明TIGIT蛋白的表达量越高。表2中HEK293细胞为未转染hTIGIT的空白对照细胞系，其平均荧光强度值为4.2，选中作为免疫细胞的克隆号是4B10，其平均荧光强度值为520.3。图2说明，HEK293细胞有较高水平TIGIT的表达。

表2TIGIT蛋白转染的HEK293细胞流式细胞实验(FACS)筛选检测结果

免疫原3)，人源TIGIT全长氨基酸序列cDNA被克隆到pCP载体(pCP-hTIGIT)并包被到1.0um金胶体子弹上，用Helios基因枪(Bio-rad)免疫。详细方法根据Helios基因枪说明书进行制定。图3说明，pCP-hTIGIT瞬时转染后的HEK293细胞能够表达较高水平的TIGIT。

(二)杂交瘤细胞的制备和抗体筛选

免疫用小鼠为Balb/c和SJL小鼠。

A、免疫原1)免疫采用6～8周龄Balb/c和SJL小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，小鼠在SPF条件下饲养。初次免疫时，免疫原h TIGIT-hFc蛋白用弗氏完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，即每只小鼠注射50微克免疫原蛋白。加强免疫时，免疫原蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，即每只小鼠注射25微克免疫原蛋白。初次免疫与第一次加强免疫之间间隔2周，以后每次加强免疫之间间隔3周。每次加强免疫1周后采血，用酶联免疫吸附实验(ELISA)和流式细胞实验(FACS)检测血清中免疫原蛋白的抗体效价和特异性，结果如图4和表3所示。表3说明，经TIGIT-hFc免疫的小鼠的免疫后血清对免疫原均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应，其中最高稀释度在一万左右。其中空白对照为1％(w/w)BSA，其中批次指第二次加强免疫后第七天的小鼠血清，表中的数据为OD450nm值。

B、免疫原2)免疫采用6～8周龄Balb/c和SJL小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，小鼠在SPF条件下饲养。将得到的含人源TIGIT的HEK293-h TIGIT稳定细胞系在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基。用DMEM基础培养基(购自Invitrogen)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(购自Invitrogen)37℃处理直至细胞从培养皿壁上可脱落，收集细胞。用DMEM基础培养基洗涤2次，进行细胞计数后将细胞用磷酸盐缓冲液(pH7.2)稀释至2╳10⁷细胞每毫升。每只小鼠每次免疫时腹腔注射0.5毫升细胞悬液。第一次与第二次免疫之间间隔2周，以后每次免疫间隔3周。除第一次免疫以外，每次免疫1周后采血，用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中抗体效价和特异性。

C、免疫原3)免疫采用6～8周龄Balb/c和SJL小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，小鼠在SPF条件下饲养。所有小鼠经腹部用基因枪免疫3-4次，每次3-4枪，每枪1.0微克cDNA量。初次免疫与第一次加强免疫之间隔2周，以后每次免疫间隔3周。每次加强免疫7天后采血，用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中抗体效价。

通常大部分小鼠经2-3次免疫后酶联免疫吸附实验(ELISA)效价可达到1:1000以上。表3和图3为TIGIT-hFc蛋白免疫血清，用酶联免疫吸附实验(ELISA)进行抗体效价检测的结果。

表3酶联免疫吸附实验(ELISA)检测TIGIT-hFc蛋白免疫后小鼠血清抗体效价

结果表明：以免疫原进行免疫，大部分小鼠经3次免疫后酶联免疫吸附实验(ELISA)效价可达到1:1000以上，说明小鼠对免疫原产生较好的体液免疫反应，其脾细胞可以用来进行杂交瘤细胞制备。

效价符合要求的小鼠可选择进行细胞融合和杂交瘤制备。细胞融合前，小鼠最后一次免疫用每只50-100微克纯化的TIGIT-hFc腹腔注射。3-5天后处死小鼠，收集脾细胞。用DMEM基础培养基1000转每分钟离心清洗细胞3次，然后按活细胞数目5:1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合(购自ATCC)，采用高效电融合或PEG方法(参见METHODS IN ENZYMOLOGY,VOL.220)进行细胞融合。融合后的细胞稀释到含20％胎牛血清、1╳HAT的DMEM培养基中，所述百分比为质量百分比。然后按1╳10⁵/200微升每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％CO₂、37℃培养箱中，所述百分比为体积百分比。14天后用酶联免疫吸附实验(ELISA)和微孔板细胞检测法(Acumen)筛选细胞融合板上清，将天后用酶联免疫吸附实验(ELISA)中OD450nm>1.0和微孔板细胞检测法(Acumen)中平均荧光强度值>100的阳性克隆扩增到24孔板，在含10％(w/w)胎牛血清的DMEM(Invitrogen)的培养基中，在37℃，5％(v/v)CO₂条件下扩大培养。培养3天后取24孔板中扩大培养的培养液进行离心，收集上清液，对上清液进行抗体亚型分析。用天后用酶联免疫吸附实验(ELISA)、流式细胞实验(FACS)确定抗体对TIGIT蛋白和TIGIT阳性细胞的结合活性。

根据24孔板筛选结果，挑选天后用酶联免疫吸附实验(ELISA)中OD450nm>1.0、流式细胞实验(FACS)中平均荧光强度值>100的杂交瘤细胞为符合条件的阳性克隆。选择符合条件的杂交瘤细胞用有限稀释法在96孔板进行亚克隆，在含10％(w/w)FBS的DMEM培养基中(购自Invitrogen)37℃，5％(v/v)CO2条件下培养。亚克隆后10天用天后用酶联免疫吸附实验(ELISA)和微孔板细胞检测法(Acumen)进行初步筛选，挑选阳性单克隆扩增到24孔板继续培养。3天后用流式细胞实验(FACS)确定抗原结合阳性评估生物活性(评估标准为天后用酶联免疫吸附实验(ELISA)中OD450nm>1.0、流式细胞实验(FACS)中平均荧光强度值>100)。

根据24孔板样品检测结果，阳性克隆在含10％(w/w)FBS的DMEM(购自Invitrogen)培养基中，在37℃，5％(v/v)CO₂条件下进行扩大培养，细胞悬浮于冻存液[含有20％(w/w)FBS和10％(w/w)DMSO的DMEM]中，按常规方法液氮冻存即得本发明杂交瘤细胞，并可用于后续的抗体生产、纯化和氨基酸序列测定。

实施例2小鼠抗体的鉴定

(一)酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体与TIGIT蛋白的结合

将实施例1步骤中所述的人源TIGIT蛋白胞外区氨基酸序列Met22-Pro141(如序列表SEQ ID No.14中的22位-141位所示克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体，转染HEK293细胞，收集细胞培养液，纯化得到带hFc标签的人TIGIT蛋白(此处称为hTIGIT-hFc蛋白)。纯化的人TIGIT胞外区蛋白(hTIGIT-hFc)用PBS稀释到终浓度1.0μg/ml,然后以100μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2次，加入封闭液(PBS+0.01％ Tween20+1％BSA)室温封闭1-2小时。倒掉封闭液，加入待测抗体样品50-100μl每孔，37℃孵育1-2小时后，用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2-3次.加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗，37℃孵育1-2小时后，用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2-3次。加入TMB底物100μl每孔，室温孵育15-30分钟后，加入终止液(1.0NHCl)100μl每孔。用ELISA读板机(TiterMax 384plus,Molecular Device)读取A450nm数值。

结果如表4所示，待测抗体可很好地结合人TIGIT胞外区蛋白。其中，克隆号14F9A4(其中VH如SEQ ID NO.10所示，VL如SEQ ID NO.11所示)和51F11A7抗体(其中VH如SEQ IDNO.12所示，VL如SEQ ID NO.13所示)的EC50分别是0.118nM和0.0633nM。其中IgG对照为小鼠IgG，表中的数据为Absorbance OD450nm数值。

表4酶联免疫吸附实验中鼠TIGIT抗体与人TIGIT胞外区蛋白反应活性

(二)流式细胞实验(FACS)检测抗体与TIGIT表达细胞的结合

将实施例1步骤(一)免疫原2)中所述含有编码人源TIGIT全长核苷酸序列的pIRES质粒，其中人源TIGIT核苷酸序列的数据库登录号为NM_173799.4，转染CHOK1细胞株得含人TIGIT的CHOK1稳转细胞株(此处称为CHOK1-hTIGIT稳定细胞株)。将带有猴源TIGIT全长基因的pIRES质粒，其中猴源TIGIT核苷酸序列的数据库登录号为XM_015445425.1，转染CHOK1细胞株的含猴TIGIT的CHOK1稳转细胞株(此处称为CHOK1-cTIGIT稳定细胞株)。将带有鼠源TIGIT全长基因的pIRES质粒，其中鼠源TIGIT核苷酸序列的数据库登录号为NM_001146325.1，转染CHOK1细胞株的含小鼠TIGIT的CHOK1稳转细胞株(此处称为CHOK1-mTIGIT稳定细胞株)。将CHOK1-hTIGIT稳定细胞株，CHOK1-cTIGIT稳定细胞株和CHOK1-mTIGIT稳定细胞株在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用HBSS缓冲液(Hanks Balanced Salt Solution，购自Invitrogen)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(Versene solution，购自Life technology公司)处理和收集细胞。用HBSS缓冲液洗涤细胞2次，进行细胞计数后将细胞用HBSS缓冲液稀释至2╳10⁶细胞每毫升，加入1％山羊血清封闭液，所述百分比为质量百分比。冰上孵育30分钟，然后用HBSS缓冲液离心洗涤2次。将收集的细胞用FACS缓冲液(含有1％BSA的HBSS，所述百分比为质量百分比)悬浮至2╳10⁶细胞/mL，按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中，加入实施例2所得的纯化的TIGIT抗体待测样品每孔100微升，冰上孵育2小时。用FACS缓冲液离心洗涤2次，加入每孔100微升荧光(Alexa488)标记的二抗(购自Invitrogen)，冰上孵育1小时。用FACS缓冲液离心洗涤3次，加入每孔100微升固定液[4％(v/v)多聚甲醛]悬浮细胞，10分钟后用FACS缓冲液离心洗涤2次。用100微升FACS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACS Calibur，购自BD公司)检测和分析结果。

结果如表5，表6和表7所示，待测抗体可结合细胞表面的人或猴TIGIT蛋白，而不结合小鼠TIGIT蛋白。克隆号14F9A4和51F11A7抗体结合人TIGIT蛋白的EC50分别是1.13nM和0.81nM，结合猴TIGIT蛋白的EC50分别是0.80nM和0.27nM。其中IgG对照为鼠IgG，表中的数据为平均荧光强度所测细胞群的平均荧光强度值。

表5流式细胞实验(FACS)检测抗体与人TIGIT表达细胞的结合

表6流式细胞实验(FACS)检测抗体与猴TIGIT表达细胞的结合

表7流式细胞实验(FACS)检测抗体与鼠TIGIT表达细胞的结合

(三)检测TIGIT抗体阻断TIGIT蛋白与其配体CD155的结合

TIGIT蛋白的受体配体结合试验检测TIGIT抗体阻断TIGIT蛋白与其CD155的结合。由于TIGIT蛋白与另一个配体CD112的相互作用力比较弱，无法用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测，所以此处的TIGIT抗体阻断实验我们只查看了配体CD155。

TIGIT胞外区蛋白(TIGIT-hFc)用PBS稀释到终浓度1.0μg/mL，然后以100μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液[含0.01％(v/v)Tween20的PBS]洗板2次，加入封闭液[含0.01％(v/v)Tween20和1％(w/w)BSA的PBS]室温封闭2小时。倒掉封闭液，先加入实施例1所得的纯化的TIGIT抗体待测样品50μl每孔，后加入生物素标记的CD155胞外区蛋白(CD155-hFc)，每孔100微升，混匀后37℃孵育。2小时后，用洗板液[含0.01％(v/v)Tween20的PBS]洗板3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的亲和素稀释液(购自Sigma)每孔100微升，37℃孵育2小时后，用洗板液[含0.01％(v/v)Tween20的PBS]洗板3次。加入TMB底物100μl每孔，室温孵育30分钟后，加入终止液(1.0N HCl)100μl每孔。用ELISA读板机(SpectraMax 384plus,Molecular Device)读取A450nm数值。

结果如表8所示，说明所得抗体可不同程度的抑制TIGIT蛋白与其配体CD155的结合。其中IgG对照为小鼠IgG，表中的数据为抑制率(％)。

表8TIGIT抗体对TIGIT蛋白与其受体CD155的结合的抑制

(四)NFAT报告基因检测实验

目的是利用荧光素酶报告基因过表达技术，来研究抗TIGIT抗体是否能够通过结合免疫检查点TIGIT，解除TIGIT和CD155或者CD112相互作用导致的人T淋巴细胞系(Jurkat)NFAT信号通路的抑制。

1.Jurkat-NFAT/hTIGIT，293F-hCD155和293F-hCD112细胞系构建

将含有编码人源TIGIT全长核苷酸序列的pLVX-IRES-hTIGIT.Puro质粒，其中人源TIGIT核苷酸序列的数据库登录号为NM_173799.4，包装成慢病毒并感染Jurkat-NFAT细胞株得含人TIGIT的Jurkat-NFAT稳转细胞株(此处称为Jurkat-NFAT/hTIGIT稳定细胞株，克隆号为2G7-1D8)。

将含有编码人源CD155全长核苷酸序列的pLVX-IRES-hCD155.Puro质粒，其中CD155的氨基酸序列信息参见Uniprot数据库，编号P15151，转染293F细胞株得含人CD155的293F稳转细胞株(此处称为293F-hCD155稳定细胞株，克隆号3G2)。

将含有编码人源CD112全长核苷酸序列的pLVX-IRES-hCD112.Puro质粒，其中CD112的氨基酸序列信息参见Uniprot数据库，编号Q92692，转染293F细胞株得含人CD112的293F混合细胞株(此处称为293F-hCD112混合细胞株，编号为2F5 pool)。

将Jurkat-NFAT/hTIGIT稳定细胞株，293F-hCD155稳定细胞株和293F-hCD112混合细胞株在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用PBS缓冲液(购自Corning)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(TrypLE^TM Express Enzyme，购自Lifetechnology公司)处理和收集细胞(Jurkat为悬浮细胞，不用酶解离)。

2.NFAT报告基因检测实验

将Jurkat-NFAT/hTIGIT细胞传到Viewplate-96白板(Perkin Elmer,CatNo.6005181)，1*10E5细胞/孔，20ul RPMI-1640培养基(Gibco，Ref11875-093)悬浮细胞。将20ul RPMI-1640培养基稀释好的抗体加到对应的培养孔中，1:5梯度稀释，共8个浓度梯度，最高浓度10ug/ml。放置于细胞培养箱(37℃，5％ CO₂(v/v))中孵育20min。

每孔加入20ul RPMI-1640培养基悬浮的293F-hCD155细胞(2*10E4细胞/孔)或者293F-hCD112细胞(6*10E4细胞/孔)。放置于细胞培养箱(37℃，5％ CO₂(v/v))中孵育20min。

每孔加入20ul RPMI-1640培养基OKT3(终浓度2ug/ml)。放置于细胞培养箱(37℃，5％ CO₂(v/v))中孵育5小时。每孔加入80ulONE-Glo试剂，根据ONE-Glo荧光检测系统(Promega,Ref E6120)的实验手册完成检测。

在步骤1构建的Jurkat-NFAT/hTIGIT细胞株中，检测本发明的TIGIT抗体在NFAT报告基因检测实验中对NFAT下游报告基因荧光素酶分泌的影响。其中，Jurkat-NFAT/hTIGIT和293F-hCD155或者293F-hCD112共培养的目的是使得Jurkat细胞表面的TIGIT受体蛋白可以和293F细胞表面的CD155或者CD112配体蛋白结合，发挥免疫抑制的作用而抑制NFAT下游报告基因荧光素酶的表达和分泌。而TIGIT抗体的加入是为了结合并抑制TIGIT受体与CD155或者CD112配体之间的相互作用，解除免疫抑制信号，激活NFAT下游报告基因荧光素酶的表达和分泌。

结果如表9和表10所示，其中mIgG对照为小鼠IgG，表中的数据为荧光强度值(Foldinduction compared to mIgG control)。

结果表明，在NFAT报告基因检测实验中待测抗体可以抑制TIGIT和CD155或者CD112的相互作用，而使Jurkat-NFAT/hTIGIT细胞NFAT下游报告基因荧光素酶的表达分泌增强。

因此，本发明的抗TIGIT抗体能够通过结合免疫检查点TIGIT，解除TIGIT和CD155或者CD112相互作用导致的人T淋巴细胞系(Jurkat)NFAT信号通路的抑制。

表9TIGIT抗体在Jurkat-NFAT/hTIGIT和293F-hCD155细胞共培养时促进NFAT下游报告基因的表达

表10TIGIT抗体在Jurkat-NFAT/hTIGIT和293F-hCD112细胞共培养时促进NFAT下游报告基因的表达

实施例3轻重链可变区氨基酸序列测定

总RNA分离：将实施例1亚克隆培养所得的上清液检验过抗原结合后(即经过实施例2的检定和活性测定后)，通过离心搜集5×107个杂交瘤细胞，加入1mL Trizol混匀并转移到1.5mL离心管中，室温静置5分钟。加0.2mL氯仿，振荡15秒，静置2分钟后于4℃，12000g离心5分钟，取上清转移到新的1.5mL离心管中。加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟后于4℃，12000g离心15分钟，弃上清。加入1mL 75％乙醇(所述百分比为体积百分比)，轻轻洗涤沉淀，4℃，12000g离心5分钟后弃上清，将沉淀物晾干，加入DEPC处理过的H2O溶解(55℃水浴促溶10分钟)，即得总RNA。

逆转录与PCR：取1μg总RNA，配置20μl体系，加入逆转录酶后于42℃反应60分钟，于7℃反应10分钟终止反应。配置50μl PCR体系，包括1μl cDNA、每种引物25pmol、1μl DNA聚合酶以及相配的缓冲体系、250μmol dNTPs。设置PCR程序，预变性95℃3分钟，变性95℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃35秒，35个循环后再额外于72℃延伸5分钟，得PCR产物。其中逆转录所用的试剂盒为PrimeScript RT Master Mix，购自Takara，货号RR036；PCR所用的试剂盒为Q5超保真酶，购自NEB，货号M0492。

克隆与测序：取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用柱回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为Gel&PCR Clean-up，购自MACHEREY-NAGEL，货号740609。进行连接反应：样品50ng，T载体50ng，连接酶0.5μl，缓冲液1μl，反应体系10μl，于16℃反应半小时得连接产物，其中连接的试剂盒为T4 DNA连接酶，购自NEB，货号M0402；取5μl连接产物加入100μl的感受态细胞(Ecos 101competent cells，购自Yeastern，货号FYE607)中，冰浴5分钟。而后于42℃水浴热激1分钟，放回冰上1分钟后加入650μl无抗生素SOC培养基，于37℃摇床上以200RPM的速度复苏30分钟，取出200μl涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养。次日，使用T载体上引物M13F和M13R配置30μl PCR体系，进行菌落PCR，用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μl点于另一块含100nM氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株。PCR反应结束后，取出5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序。其中，测序的步骤参见Kabat，Sequences ofProteins of Immunological Interest，National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。

实施例4嵌合抗体的制备

(一)质粒构建与准备：

实施例2已从杂交瘤细胞的培养上清液中获得了纯化的TIGIT抗体，并根据实施例3的测序结果明确了TIGIT抗体的重链可变区和轻链可变区序列。将TIGIT抗体的重链可变区序列重组到包含信号肽和人源重链抗体IgG1恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤也由上海睿智化学完成)中，将TIGIT抗体的轻链可变区序列重组到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体当中，得重组质粒并经测序验证(测序方法与实施例3中测序方法相同)。使用碱裂解法试剂盒(购自MACHEREY-NAGEL)中量抽提高纯度的重组质粒，质量为500μg以上，经0.22μm滤膜(购自Millopore)过滤，供转染使用。

(二)细胞转染：

在培养基CD FortiCHO(购自Invitrogen)培养CHO-S细胞(购自Invitrogen)。摇床设置为37℃、120RPM，8％ CO2(v/v)浓度。

取0.1mg DNA溶于5ml CD FortiCHO培养基，混匀，得培养基A。另取5mL CDFortiCHO培养基和0.5mg PEI(购自Sigma)混匀，得培养基B。取5mL培养基A和5ml培养基B合并，混匀，静置20分钟，得混合液C。将10mL混合液C缓缓加入100mL含CHO-S细胞的培养基CDFortiCHO中至CHO-S的细胞密度为4.0×10⁶/mL，边加边振荡，避免PEI过度集中，放入摇床培养。第二天加入蛋白胨至终浓度为10g/L。第3～9天，测培养液抗体效价。第8～9天，离心(3500RPM，30分钟)收集上清，经0.22μm滤膜过滤，得滤好的细胞上清液，以供纯化。

(三)抗体纯化：对于连续生产的无内毒素的层析柱和Protein A填料(购自GE)，使用0.1M NaOH处理30分钟或者5个柱体积的0.5M NaOH冲洗。对于长期未使用的柱料和层析柱至少使用1M NaOH浸泡1h，用无内毒的水冲洗至中性，用10倍柱体积的1％(v/v)Triton×100对柱料清洗。使用5个柱体积的PBS(PBS磷酸缓冲液，pH7.2)进行平衡，将步骤(二)所得过滤好的细胞上清液上柱，必要时收集流穿液。上柱完成后，使用5倍柱体积的PBS清洗。用5倍柱体积的0.1M pH3.0的Glycine-HCl进行洗脱，收集洗脱液，并用0.5倍柱体积洗脱液的pH8.5的1MTris-HCl(1.5M NaCl)中和，收获TIGIT嵌合抗体。上述所用溶液均需要新配置。收获TIGIT嵌合抗体后，在1╳PBS中透析4小时，避免内毒素污染。透析结束后，使用分光光度或试剂盒测定浓度，使用HPLC-SEC测定抗体纯度，使用内毒素检测试剂盒(购自Lonza)检测抗体内毒素含量。

实施例5嵌合抗体的鉴定

(一)酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体与TIGIT蛋白的结合

结果如表11，图5所示，嵌合TIGIT抗体可结合人TIGIT胞外区蛋白。各抗体活性相当，表明抗体与TIGIT结合能力较强。

克隆号14F9A4(mAb015)和51F11A7(mAb053)抗体结合人TIGIT蛋白的EC50分别是0.14nM和0.13nM。其中IgG对照为人IgG1，表中的数据为A450nm数值。

表11酶联免疫吸附实验中嵌合TIGIT抗体与人TIGIT胞外区蛋白反应活性

(二)流式细胞实验(FACS)检测抗体与TIGIT表达细胞的结合

结果如表12和表14，图6和图7所示，嵌合TIGIT抗体可不同程度地结合细胞表面的人和猴TIGIT蛋白。

克隆号14F9A4和51F11A7抗体结合人TIGIT蛋白的EC50分别是0.70nM和1.061nM，结合猴TIGIT蛋白的EC50分别是1.593nM和1.164nM。其中IgG对照为嵌合人IgG1，表中的数据为平均荧光强度所测细胞群的平均荧光强度值。

表12流式细胞实验(FACS)检测抗体与人TIGIT表达细胞的结合

表13流式细胞实验(FACS)检测抗体与猴TIGIT表达细胞的结合

(三)检测TIGIT抗体阻断TIGIT蛋白与其配体CD155的结合

结果如表14图8所示，说明嵌合TIGIT抗体可不同程度的抑制TIGIT蛋白与其配体CD155的结合。其中IgG对照为人IgG1，表中的数据为OD405。

表14TIGIT抗体对TIGIT蛋白与其受体CD155的结合的抑制

(四)NFAT报告基因检测实验

结果如表15和表16、图9、图10所示，其中嵌合IgG1对照为嵌合人IgG1，表中的数据为荧光强度值。

结果说明，在NFAT报告基因检测实验中嵌合TIGIT抗体可以抑制TIGIT和CD155或者CD112的相互作用，而使Jurkat-NFAT/hTIGIT细胞NFAT下游报告基因荧光素酶的表达分泌增强。

表15TIGIT抗体在Jurkat-NFAT/hTIGIT和293F-hCD155细胞共培养时促进NFAT下游报告基因的表达

表16TIGIT抗体在Jurkat-NFAT/hTIGIT和293F-hCD112细胞共培养时促进NFAT下游报告基因的表达

(5)TIGIT抗体依赖细胞介导的细胞毒性检测实验(ADCC)

将实施例1(免疫原制备章节)所述含有编码人源TIGIT全长核苷酸序列的pIRES质粒转染HEK293细胞株得到表达人TIGIT的HEK293稳转细胞株(此处称为HEK293-hTIGIT稳定细胞株)。用无酶细胞解离液(TrypLE^TM Express Enzyme，购自Life technology公司)消化处于对数生长期的靶细胞HEK293-hTIGIT稳定细胞株，用PBS磷酸盐缓冲液(购自Corning)洗涤两遍，并调整细胞密度为1×10⁶细胞/mL，每毫升细胞悬液分别加入1微升DELFIABATDA试剂(购自Perkin Elmer)进行标记，在37℃，5％ CO₂细胞培养箱孵育20分钟后，用10毫升PBS磷酸盐缓冲液洗涤细胞三遍，用实验缓冲液(RPMI Medium 1640，no Phenol Red+2％FBS，购自Gibio)重悬细胞为1×10⁵细胞/mL，将细胞悬液加入96孔V底细胞培养(购自Corning)板中，每孔100微升(每孔细胞数为1×10⁴)。将50微升实验缓冲液稀释好的抗体加到对应的培养孔中，1:5梯度稀释，共9个浓度梯度，最高浓度100nM。将培养板放置于37℃，5％ CO₂细胞培养箱中孵育20分钟。收集处于对数生长期的过表达CD16a 176V的效应细胞NK92(购自华博生物)，离心并用实验缓冲液重悬为密度为6×10⁵细胞/mL，并按照每孔50微升加到培养孔，效应细胞与靶细胞比例为3:1。将培养板放置于37℃，5％ CO₂细胞培养箱中孵育2.5小时。

同时设置空白溶剂对照组(background)、靶细胞自发释放对照组(T.S)、效应细胞自发释放对照组(E.S)，靶细胞与效应细胞混合自发释放组((T+E).S)(即抗体浓度为0nM时效应细胞与靶细胞释放组)，靶细胞最大释放组(T.M)。最大释放对照组每孔加入10微升裂解液，并放置于37℃，5％ CO₂细胞培养箱孵育30分钟，500g离心5分钟。取25微升上清置于无色透明底的96孔检测板(购自Perkin Elmer)中，加入200微升Europium Solution检测液混合，250转振动15分钟后，在EnVision 2105检测仪上(购自Perkin Elmer)检测发射波长为615nm荧光信号值。根据公式计算杀伤率ADCC＝[(实验组-靶细胞和效应细胞混合自发释放对照组)/(靶细胞最大释放组-靶细胞自发释放对照组)]×100％。结果如表17和图11所示。

其中，图11显示了TIGIT抗体通过Fab段与靶细胞表面的人TIGIT结合后，其IgG1Fc段可与NK细胞表面的CD16A结合，从而使NK细胞对靶细胞产生非特异性杀伤作用，即ADCC作用。

表17TIGIT抗体介导NK92-CD16a对HEK293-hTIGIT细胞的ADCC效应

(6)TIGIT抗体基于阻断TIGIT/CD155信号介导的细胞毒性实验

TIGIT抗体是通过结合NK细胞表面的TIGIT，阻断其与靶细胞表面的CD155相互作用导致CD155与NK细胞表面的共刺激分子CD226结合，从而增强NK细胞对靶细胞的杀伤能力。

将含有编码人源TIGIT全长核苷酸序列的pLVX-IRES-hTIGIT.Puro(NM_173799.4)质粒，含有编码人源CD226全长核苷酸序列的pLVX-IRES-CD226.neo(Q15762)质粒，包装成慢病毒并依次感染NK92细胞株得到表达人TIGIT和CD226的NK92稳转细胞株(此处称为NK92-hTIGIT-hCD226稳定细胞株)。将NK92-hTIGIT-hCD226稳定细胞株扩大培养，收集处于对数生长期的效应细胞NK92-hTIGIT-hCD226，离心并用实验缓冲液(RPMI Medium 1640，noPhenol Red+2％FBS，购自Gibco)重悬为密度为4×10⁶细胞/mL，并按照每孔50微升将细胞悬液加入96孔V底细胞培养(购自Corning)板。将50微升实验缓冲液稀释好的抗体加到对应的培养孔中，1:2梯度稀释，共5个浓度梯度，最高浓度50μg/ml。将培养板放置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育20分钟。用DELFIA BATDA试剂标记的靶细胞HT1080(标记步骤同步骤1)，将标记好的靶细胞加入培养孔，每孔100微升(每孔靶细胞数为1×10⁴)，效应细胞与靶细胞比例为20:1。将培养板放置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育2小时。对照组设置，检测，计算均同步骤1。结果如表18和图12所示。

表18TIGIT抗体介导NK92-hTIGIT-hCD226对HT1080细胞的杀伤效应

实施例6热点突变抗体的改造和制备

6.1抗体序列的热点改造及鉴定

6.1.1热点点突变设计

抗体mAb015有2个需突变的热点，分别是重链的第55-56位天冬氨酸-甘氨酸DG和重链的第61-62位天冬酰胺-甘氨酸NG。其中，55-56位天冬氨酸-甘氨酸DG突变为谷氨酸-甘氨酸EG，或者突变为丝氨酸-甘氨酸SG，或者突变为天冬氨酸-丙氨酸DA。天冬酰胺-甘氨酸NG突变为天冬酰胺-丙氨酸NA，或者突变为谷氨酰胺-甘氨酸QG，或者突变为丝氨酸-甘氨酸SG。

抗体mAb053有2个需突变的热点，分别是重链的第55-56位天冬氨酸-甘氨酸DG和重链的第61-62位天冬酰胺-甘氨酸NG。其中，55-56位天冬氨酸-甘氨酸DG突变为谷氨酸-甘氨酸EG，或者突变为丝氨酸-甘氨酸SG，或者突变为天冬氨酸-丙氨酸DA，或者突变为甘氨酸-甘氨酸GG。61-62位天冬酰胺-甘氨酸NG突变为天冬酰胺-丙氨酸NA，或者突变为谷氨酰胺-甘氨酸QG，或者突变为丝氨酸-甘氨酸SG，或者突变为丙氨酸-甘氨酸AG，或者突变为天冬酰胺-天冬氨酸ND。

mAb015VH SEQ ID NO.23

mAb015VL SEQ ID NO.11

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSNPPIVTFGSGTKLEIK

mAb053_VH SEQ ID NO.24

mAb053_VL SEQ ID NO.13

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQLWSGNPPMLTFGAGTKLELK

6.2热点突变抗体的制备

6.2.1质粒构建和制备

利用PCR介导的定点突变方法改造抗体序列的热点。其原理为：以环状质粒为模板，采用一对完全匹配并引入突变的引物进行PCR扩增，因模板是从大肠杆菌提取的经甲基化修饰并对DpnI敏感的质粒，而PCR产物是未甲基化的带缺刻的开环质粒，所以可采用DpnI酶切方法消除模板，最后产物中仅剩余新扩增的突变质粒。

具体操作方式为，根据密码子表，先找到每个氨基酸对应的密码子。然后确定核苷酸突变位点，例如将天冬氨酸N突变成天冬酰胺D，天冬氨酸对应的密码子是AAT，天冬酰胺对应的密码子是GAT或GAC，我们选择将AAT突变成GAT，只需要突变一个位点。然后找出突变位点及其附近的碱基序列，然后以突变位点为中心，设计突变序列的引物，以野生型抗体质粒为模板进行PCR扩增。产物用DpnI消化1-3小时后转化DH5α，涂布平板后第二天挑取单菌落培养并测序，获得验证后用于转染的质粒。

6.2.2转染和纯化

转染前一天，将Expi 293F细胞密度传代到2.5-3×10⁶viable cells/mL。转染当天检测细胞密度和活率，密度达到4.5-5.5×10⁶viable cells/mL，活率在95-99％之间时，将细胞稀释到3×10⁶viable cells/mL，轻柔混合细胞，加入24孔培养板，每孔3mL，多余的细胞丢弃。

准备ExpiFectamine^TM 293/质粒DNA混合物

a.轻柔颠倒混匀ExpiFectamine^TM 293Reagent 4-5次

b.Opti-MEM^TM I Reduced Serum Medium稀释质粒DNA,旋转或颠倒混匀

c.Opti-MEM^TM I Reduced Serum Medium稀释ExpiFectamine^TM 293Reagent旋转或颠倒混匀2-3次，室温孵育5mins

d.将稀释的ExpiFectamine^TM 293Reagent加到稀释好的质粒DNA中，旋转或颠倒混匀2-3次，室温孵育10-20mins；

将孵育好的ExpiFectamine^TM 293/质粒DNA混合物缓慢加入细胞中，边加边震荡；37℃摇床培养。

18-22小时后添加ExpiFectamine^TM 293Transfection Enhancer 1andExpiFectamine^TM 293Transfection Enhancer 2，无需预热，可以混合好加入

转染6-7天后，将293F培养物离心(30分钟，3500rpm)，收集上清液并通过0.22uM过滤器过滤。过滤后的上清通过Protein A磁珠纯化。

平衡缓冲液：PBS磷酸盐缓冲液，pH7.2；

洗脱缓冲液：0.1mol/L甘氨酸-HCl，pH 3.0；

中和缓冲液：1mol/L Tris-HCl，1.5mol/L NaCl，pH8.5

纯化的抗体使用NanoDrop(分光光度计)在A280测定抗体浓度，用SEC-HPLC测定抗体的纯度。结果如表19所示。

表19热点突变抗体的生产检定结果汇总

6.3热点突变抗体鉴定

6.3.1Octet对热点突变抗体的亲和力筛选

使用Octet red96仪器(购自Fortiebio)进行单浓度亲和力检测和排序。具体操作和方法根据仪器说明书和厂家提供的详细方法。具体为：用抗人源抗体传感器(AHCsensor，购自Fortiebio)进行亲和力测定。将热点突变抗体稀释后与AHC传感器反应；结合热点突变抗体的传感器与100nM的human TIGIT ECD-His在30℃下温育三分钟，再和PBS溶液30℃温育5分钟；通过Octet仪器检测干涉波长的变化来检测抗体与TIGIT蛋白的结合与解离，然后用User Software软件拟合得到解离常数与结合常数，亲和力常数为解离常数与结合常数的比值。结果如表20所示：

表20热点突变抗体与TIGIT单浓度亲和力结果

6.3.2酶联免疫吸附实验(ELISA)检测热点突变抗体与TIGIT蛋白的结合

纯化的人TIGIT胞外区蛋白(hTIGIT-hFc)用PBS稀释到终浓度1.0μg/ml,然后以100μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2次，加入封闭液(PBS+0.01％ Tween20+1％BSA)室温封闭1-2小时。倒掉封闭液，加入待测抗体样品50-100μl每孔，37℃孵育1-2小时后，用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2-3次.加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗，37℃孵育1-2小时后，用洗板液(PBS+0.01％Tween20)洗板2-3次。加入TMB底物100μl每孔，室温孵育15-30分钟后，加入终止液(1.0N HCl)100μl每孔。用ELISA读板机(TiterMax 384plus,Molecular Device)读取A450nm数值。结果如表21所示，

表21酶联免疫吸附实验中热点突变抗体与人TIGIT胞外区蛋白反应活性

mAb	EC50(nM)	mAb	EC50(nM)
				hIgG1	12.94	mAb015-WT	0.18
mAb053-WT	0.21	mAb015-V1	0.16
				mAb053-V1	0.23	mAb015-V2	0.17
mAb053-V2	0.18	mAb015-V3	0.18
				mAb053-V3	0.18	mAb015-V4	0.21
mAb053-V4	0.15	mAb015-V5	0.27
				mAb053-V5	0.17	mAb015-V6	0.24
mAb053-V6	0.24	mAb015-V7	0.32
				mAb053-V7	0.22	mAb015-V8	0.29
mAb053-V8	0.22	mAb015-V9	0.21
				mAb053-V9	2.11	mAb015-V10	0.3
mAb053-V10	0.23	mAb015-V11	0.23
				mAb053-V11	0.17	mAb015-V12	1.24
mAb053-V12	0.27	mAb015-V13	0.28
				mAb053-V13	0.25	mAb015-V14	0.25
mAb053-V14	0.21	mAb015-V15	0.28
				mAb053-V15	0.7
mAb053-V16	0.21
				mAb053-V17	0.53
mAb053-V18

在结合试验中，热突变抗体表现出了对human TIGIT不同的结合，因此选择mAb015-V15和mAb053-V7作为这两个抗体的热突变改造结果。

mAb015-V15 VH SEQ ID NO.27

mAb015-V15 VL SEQ ID NO.11

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSNPPIVTFGSGTKLEIK

mAb053-V7 VH SEQ ID NO.28

mAb053-V7 VL SEQ ID NO.13

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQLWSGNPPMLTFGAGTKLELK

实施例7人源化抗体的制备和鉴定

对于mAb015和mAb053抗体经热点移除后分别得到的mAb015-V15和mAb053-V7序列进行人源化。

7.1mAb053-V7

7.1.1mAb053-V7的设计

通过序列比对(NCBI-Igblast)选择与候选抗体重链可变区，轻链可变区同源性最高的胚系基因序列作为可变区移植骨架：IGHV1-2*06(66.3％)和IGKV3-11*01(63.2％).在选定人抗体骨架后，通过同源建模，预测在鼠抗恒定区中可能决定结构的关键氨基酸,对嫁接的骨架区进行回复突变设计。

根据以上原则，分别设计5个重链可变区序列(HumAb053 VH 2-g0，HumAb053VH 2-g1，HumAb053 VH 2-g2，HumAb053 VH 2-g3，HumAb053 VH 2-g4)和4个轻链可变区序列(HumAb053 VL 2-g0，HumAb053 VL 2-g1，HumAb053 VL 2-g2，HumAb053 VL 2-g3)，随后做交叉组合进行表达，共20种表达组合，见表22。

表22mAb053人源化抗体表达组合

载体构建：扩增引物由Genewiz合成，随后通过PCR方法分别扩增轻链和重链的可变区。配置50μL反应体系，包括50-100ng的重链可变区，轻链可变区、正向反向引物各1ul、1ul pfxD酶(购自invitrogen，12344-012)、10*pfx缓冲液5ul(供应商同pfx同酶)以及加水补足至50μL。设置PCR程序，预变性95℃5分钟，变性95℃30秒，退火56℃30秒，延伸68℃30秒，25个循环后再额外68℃延伸10min，得到PCR产物。取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为PureLink Quick Gelextraction kit，购自Qiagen，货号28706。

人源化抗体的制备：进行连接反应：插入片段20-40ng，酶切过的表达载体60-100ng，重组酶Exnase(购自Vazyme，货号C112-01/02)1μL，缓冲液2μL，反应体系10μL，于37℃反应半小时得到连接产物，即构建好的重组载体。缓冲液为该重组酶配套购买使用的缓冲液；将重链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体重链IgG1恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤为常规步骤)，将轻链可变区定向克隆到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤为常规步骤)中。将10μL连接产物加入100μL的感受态细胞(Ecos 101competent cells，购自Yeastern，货号FYE607)中，42℃水浴热激60秒，放回冰上3分钟，取出80μL涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，于37℃孵箱过夜培养。次日，使用表达载体上引物pEF1A和pSV40，配置30μL PCR体系，进行菌落PCR。菌落PCR的体系为：引物各1μL，15μL的PCR预混液(购自Novoprotein)，补足至30μL。用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μL点于另一块含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株。PCR反应结束后，取出4.5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序。

7.1.2mAb053-V7人源化抗体的表达

将序列正确的重组抗体重、轻链的表达载体进行扩增，随后瞬时转染FreeStyle^TM293-F细胞(购自Invitrogen)以生产抗体。人源化的表达使用24孔板表达。

人源化抗体的鉴定：使用Octet red96仪器检测细胞上清中抗体与human TIGIT的结合。

表23人源化抗体与TIGIT单浓度亲和力结果

对亲和力与mAb053-V7差异在3倍以内的人源化抗体HumAb053-2-16，HumAb053-2-17，HumAb053-2-18，HumAb053-2-19，HumAb053-2-20的重、轻链表达载体进行扩增后，瞬时转染30mL FreeStyleTM 293-F细胞(购自Invitrogen)以生产抗体。转染时，293-F细胞的密度应为1-1.2×10⁶个/mL，30mL细胞需要30μg上述已构建好的重组载体和70μg的转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)。将重组载体和PEI分别加入到2mL培养基中，室温静置5分钟，0.22μm滤膜过滤后，将重组载体和PEI的混合物于室温静置15分钟。然后将上述混合物缓慢地加入到细胞中，在37℃、8％(v/v)CO2培养箱中以130rpm的转速培养。每天采取培养上清和细胞沉淀检测抗体的表达。5天后，3000g离心细胞培养液30分钟，收集上清液，0.22μm滤器过滤。用1mL MabSelectTMSuReTMcolumn(购自GE Healthcare)纯化200mL澄清上清液中的单克隆抗体。MabSelectTMSuReTMcolumn先用平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液，pH7.2)平衡，MabSelectTMSuReTMcolumn。上样完毕后用平衡缓冲液清洗MabSelectTMSuReTMcolumn，平衡缓冲液的体积为蛋白A柱柱床体积的5倍。用洗脱液(0.1M甘氨盐酸缓冲液，pH3.0)洗脱结合在MabSelectTMSuReTMcolumn上的单克隆抗体。收集洗脱的抗体，加入10％(v/v)1.0MTris-HCl缓冲液中和pH。然后立即用PBS磷酸缓冲液透析过夜。收集透析后的单克隆抗体，用0.22μm的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的TIGIT人源化抗体。将所得抗体进行蛋白浓度、纯度检测分析。

结果如下表24所示，结果显示抗体的产量，纯度分析均表现正常。

表24人源化抗体纯化结果分析

蛋白产品	体积(mL)	浓度(mg/ml)	产量(mg)	纯度(％；SEC)	缓冲液
						HumAb053-2-16	0.7	2.659	1.86	100	PBS PH7.4
HumAb053-2-17	0.7	3.914	2.74	100	PBS PH7.4
						HumAb053-2-18	0.7	2.808	1.97	100	PBS PH7.4
HumAb053-2-19	0.7	4.301	3.01	100	PBS PH7.4
						HumAb053-2-20	0.7	4.377	3.06	100	PBS PH7.4

7.1.3mAb053-V7人源化抗体的活性鉴定

酶联免疫实验(ELISA)检测抗体与hTIGIT-ECD-Fc的结合，结果如图13所示。流式细胞实验(FACS)检测抗体与hTIGIT(图14)，mTIGIT(图15)，cynoTIGIT(图16)表达细胞的结合。

结果表明，所得抗体均可结合细胞表面的人TIGIT，猴TIGIT，并不结合小鼠TIGIT。

对mAb053人源化改造后抗体的亲和力以及活性进行评估，结果显示其功能与mAb053-V7接近。结果见表25。

其中，优选的mAb053人源化抗体为HumAb053-2-16,HumAb053-2-17,HumAb053-2-18。

表25中的数据为MFI所测细胞群的平均荧光强度值。

表25人源化抗体活性鉴定结果

HumAb053-2-16VH SEQ ID NO.29

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIFPGDADTNYNAKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARYLSALDYWGQGTTVTVSS

HumAb053-2-16VL,HumAb053-2-17VL,HumAb053-2-18VL SEQ ID NO.30

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHWYQQKPGQSPRPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQLWSGNPPMLTFGGGTKVEIK

HumAb053-2-17VH SEQ ID NO.31

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIFPGDADTNYNAKFKGRVTMTADKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARYLSALDYWGQGTTVTVSS

HumAb053-2-18VH SEQ ID NO.32

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIFPGDADTNYNAKFKGRVTMTADKSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCARYLSALDYWGQGTTVTVSS

7.2mAb015-V15的设计、表达和鉴定

通过序列比对(NCBI-Igblast)选择与候选抗体重链可变区，轻链可变区同源性最高的胚系基因序列作为可变区移植骨架：IGHV5-51*01(65.3％)和IGKV3-20*01(61.5％).在选定人抗体骨架后，通过同源建模，预测在鼠抗恒定区中可能决定结构的关键氨基酸,对嫁接的骨架区进行回复突变设计。

根据以上原则，分别设计4个重链可变区序列(mAb015_VH1，mAb015_VH2，mAb015_VH3，mAb015_VH4)和4个轻链可变区序列(mAb015_VL1，mAb015_VL2，mAb015_VL3，mAb015_VL4)，随后做交叉组合进行表达，共16种表达组合，见表26。

表26mAb015人源化抗体表达组合

人源化抗体的鉴定：使用BIAcore T200，检测真核细胞表达的上清与TIGIT-hFc的结合。上清捕获时间120s，流速10ul/min，分析物100nM TIGIT-hFc的结合时间180s，解离时间600s，流速30ul/min。芯片使用10mM Glycine-HCl再生。数据经

Biacore T200 Evaluation software version 3.1处理，扣除参比通道和buffer信号。亲和力数据结果如表27。

表27mAb015人源化抗体亲和力数据

结果表明，对mAb015人源化改造后抗体的亲和力以及活性进行评估，结果显示Hu015_VH1+VL4，Hu015_VH1+VL3，Hu015_VH1+VL2，Hu015_VH2+VL3，Hu015_VH2+VL2，Hu015_VH2+VL4的亲和力与mAb015-V15接近。结果见表27。

优选的mAb015-V15人源化抗体为Hu015_VH1+VL4，Hu015_VH1+VL3，Hu015_VH1+VL2。

Hu015_VH1 SEQ ID NO.33

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAFSSYWMNWVRQMPGKGLEWMGQIFPGDADTKYSGKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARYLGGLDYWGQGTLVTVSS

Hu015_VL4 SEQ ID NO.34

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHWYQQKPGQSPRPWIYATSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPPIVTFGGGTKVEIK

Hu015_VL3 SEQ ID NO.35

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHWYQQKPGQAPRPWIYATSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPPIVTFGGGTKVEIK

Hu015_VL2 SEQ ID NO.36

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHWYQQKPGQAPRPWIYATSNLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPPIVTFGGGTKVEIK

讨论：

本领域人员知晓，制备抗体有不同的方法，例如：

可以通过对野生型小鼠进行免疫获得抗体，但是需要对鼠源抗体进行人源化改造而获得人源化抗体，缺点在于改造后的抗体免疫原性可能更强、抗体结构可能会改变从而导致活性丢失或可生产性变差；

可以通过对全人源转基因小鼠进行免疫获得全人抗体，但是所获得抗体的数量或亲和力会较差；

可通过构建免疫小鼠抗体库，用噬菌体展示技术对抗体进行表达和活性筛选，但是涉及到抗体重轻链的随机重新组合，会导致形成的抗体可生产性较差；

可通过构建人源抗体库用噬菌体展示技术对抗体进行表达和活性筛选，但是因为未经免疫，所得抗体亲和力会较差。

本发明采用杂交瘤技术获得抗体，与噬菌体库获得的抗体相比，抗体亲和力高，序列表达良好。此外，本发明获得了序列不同的抗体，能够与TIGIT抗体特异性结合，其结合活性低于纳摩尔，通过逆转TIGIT对T细胞激活活性的抑制，从而激活T细胞分泌IFNγ。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

(1)SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.25所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.3所示的VH-CDR3；或

(2)SEQ ID NO.1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.26所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.8所示的VH-CDR3；

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIGIT结合亲和力的衍生序列。

2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。

3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

(1)SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.6所示的VL-CDR3；或

(2)SEQ ID NO.4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.9所示的VL-CDR3；

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIGIT结合亲和力的衍生序列。

4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。

5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：

(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或

(2)如权利要求3所述的轻链可变区；

或者，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链，

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TIGIT结合亲和力的衍生序列。

6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白包括：

(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

7.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：

(1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；以及

(2)如权利要求6所述的重组蛋白。

8.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求7所述的多核苷酸。

9.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求8所述的载体或基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。

10.一种抗体偶联物，其特征在于，该抗体偶联物含有：

(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、或其组合；和

(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。