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CN112745392A - 抗pd-l1/cd47双特异性抗体及其用途 - Google Patents

抗pd-l1/cd47双特异性抗体及其用途 Download PDF

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CN112745392A CN201911046449.0A CN201911046449A CN112745392A CN 112745392 A CN112745392 A CN 112745392A CN 201911046449 A CN201911046449 A CN 201911046449A CN 112745392 A CN112745392 A CN 112745392A
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Abstract

本发明提供了抗PD‑L1/CD47双特异性抗体及其用途。具体地，本发明提供了一种双特异性抗体，包括(a)PD‑L1单域抗体和(b)CD47单域抗体。本发明提供了编码上述双特异性抗体的编码序列、相应的表达载体和能够表达该双特异性抗体的宿主细胞，以及本发明双特异性抗体的生产方法。本发明双特异性抗体可以同时靶向PD‑L1和CD47，既能够显著地激活T细胞，又能够有效地促进巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬，且不会引起人红细胞凝集，具备良好的应用前景。

Description

抗PD-L1/CD47双特异性抗体及其用途
技术领域
本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，更具体地涉及一种抗PD-L1/CD47双特异性抗体及其用途。
背景技术
机体的肿瘤免疫应答是宿主免疫功能状态和肿瘤免疫原性综合作用的结果。肿瘤细胞可以通过异常表达免疫抑制分子，造成肿瘤细胞的免疫逃逸。近年来研究表明，PD-1/PD-L1抑制途径在肿瘤免疫应答、移植排斥反应的介导、自身免疫性疾病的发生发展以及慢性病毒感染中均发挥了重要作用。PD-L1表达于活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞及肿瘤细胞等，或免疫屏蔽组织(胎盘、血管内皮等)表面。靶向PD-1/PD-L1抗体通过阻断T细胞抑制信号通路，在体外促进T细胞的增殖与细胞因子释放。
CD47分子是一种广泛表达于多种细胞表面的跨膜糖蛋白，通过与其受体整合素配体、信号调节蛋白(SIRPα)、凝血酶敏感蛋白(TSP)等结合，在免疫应答、肿瘤免疫等方面发挥着重要的作用。近年来研究发现，CD47/SIRPα信号通路介导的“Don’t eat me”抑制巨噬细胞吞噬活性，并且与多种恶性实体瘤、血液肿瘤的发生密切相关。然而，CD47并非严格意义上的肿瘤组织特异性抗原，正常组织细胞，如血红细胞等也会表达CD47。抗CD47单克隆抗体在体内给药后会由于红细胞等细胞表面的大量CD47表达而出现“抗原沉没”现象，甚至由于脱靶效应导致严重的血液毒性。
肿瘤细胞通过高表达PD-L1分子传导“Don’t find me”信号，诱导效应CTL细胞失能或凋亡；通过高表达CD47分子传导“Don’t eat me”信号，避免巨噬细胞吞噬。靶向CD47的抗体可启动T细胞抗原递呈，诱发T细胞免疫功能，与抗PD-1/PD-L1在功能上互补。研究表明，同时阻断CD47与PD-L1信号通路，在小鼠体内可能具有肿瘤抑制的“协同效应”，不仅能够同时激活固有免疫和适应性免疫，而且能使固有免疫和适应性免疫相互促进，从而最大限度地利用机体自身免疫系统抑制肿瘤生长。中国专利CN107459578A公开了一种靶向CD47与PD-L1的双功能融合蛋白，中国专利CN109970860A公开了一种抗CD47/PD-L1双特异性抗体，台湾专利TW201922781A公开了一种对CD47和PD-L1特异性的抗体，PCT申请WO2019080883A1公开了一种可同时结合CD47、PD-L1和FcR的重组融合蛋白。
截止目前，市场上尚未有同时靶向PD-L1/CD47的双特异性单域抗体公开，而单域抗体作为新一代抗体诊断及治疗中的新兴力量，具有稳定性高、水溶性好、人源化简单、靶向性高、穿透性强等特点，在免疫实验、诊断与治疗中，发挥着超乎想象的巨大功能。因此，开发一种同时靶向PD-L1和CD47的双特异性单域抗体将具备潜在的市场价值以及临床应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗PD-L1/CD47双特异性抗体及其用途。
本发明第一方面，提供了一种双特异性抗体，所述的双特异性抗体包括：抗PD-L1单域抗体和抗CD47单域抗体。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体包括1-4个抗PD-L1单域抗体，较佳地，包括2个抗PD-L1单域抗体，更佳地，所述两个抗PD-L1单域抗体形成抗PD-L1单域抗体二聚体。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体包括1-4个抗CD47单域抗体，较佳地，包括2个抗CD47单域抗体，更佳地，所述两个抗CD47单域抗体形成抗CD47单域抗体二聚体。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体还包含Fc段，较佳地，所述的Fc段包含CH2结构域和CH3结构域。
在另一优选例中，所述的Fc段为IgG4型Fc段。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体从N端到C端具有式I(a)或I(b)所示的结构：
P-L1-P-L2-Fc-L3-B-L4-B 式I(a)
B-L1-B-L2-Fc-L3-P-L4-P 式I(b)
其中，
“-”为肽键；
L1、L2、L3、和L4各自独立地为肽键或接头元件；
P为抗PD-L1单域抗体，
B为抗CD47单域抗体，和
Fc为抗体的Fc段。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体从N端到C端具有式I(a)所示的结构。
在另一优选例中，所述的抗PD-L1单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.:8所示。
在另一优选例中，所述的PD-L1为人PD-L1。
在另一优选例中，所述的抗PD-L1单域抗体可以阻断PD-1和PD-L1的相互作用。
在另一优选例中，所述的抗CD47单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.:10所示。
在另一优选例中，所述的CD47为人CD47。
在另一优选例中，所述的抗CD47单域抗体可以阻断CD47和SIRPα的相互作用。
在另一优选例中，所述的L1、L3、和L4为接头元件。
在另一优选例中，所述的接头元件的序列为(4GS)n，其中，n为正整数(例如1、2、3、4、5或6)，优选地，n＝4。
在另一优选例中，所述接头元件的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.:9所示。
在另一优选例中，所述的L2为肽键。
在另一优选例中，所述的Fc段如SEQ ID NO.:6的第273-501位所示。
在另一优选例中，所述双特异性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:6所示。
本发明第二方面，提供了一种双特异性融合蛋白，所述的双特异性融合蛋白是由两个本发明第一方面所述的双特异性抗体形成的二聚体。
在另一优选例中，所述双特异性融合蛋白包含4个抗PD-L1单域抗体和4个CD47单域抗体。
在另一优选例中，所述双特异性融合蛋白通过Fc段形成二聚体。
在另一优选例中，所述的二聚体包括同源二聚体和异源二聚体。
在另一优选例中，所述双特异性融合蛋白从N端到C端具有式II所示的结构：
Figure BDA0002254258610000031
其中，
“-”为肽键，“║”为二硫键；
L1、L2、L3、和L4各自独立地为肽键或接头元件；
P为抗PD-L1单域抗体，
B为抗CD47单域抗体，和
Fc为抗体的Fc段。
本发明第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：本发明第一方面所述的双特异性抗体、本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的双特异性抗体，且所述多核苷酸如SEQ ID NO.:13所示。
在另一优选例中，所述的多核苷酸包括DNA或RNA。
本发明第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合；优选地，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒、或其组合。
本发明第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸；
或者，所述的宿主细胞表达本发明第一方面所述的双特异性抗体、本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
在本发明的第六方面，提供了一种产生双特异性抗体的方法，包括步骤：
(a)在合适的条件下，培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而获得含所述双特异性抗体的培养物；和
(b)对步骤(a)中得到的培养物进行纯化和/或分离，获得所述的双特异性抗体。
在另一优选例中，所述纯化可以通过蛋白A亲和柱纯化分离获得目标抗体。
在另一优选例中，所述经过纯化分离后的目标抗体纯度大于95％，大于96％、大于97％、大于98％、大于99％，优选为100％。
在本发明的第七方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：
(a)本发明第一方面所述的双特异性抗体、本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。
在另一优选例中，所述的放射性核素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133 Yb-169、Yb-177、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。
在另一优选例中，所述的药物为细胞毒性药物。
在另一优选例中，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或其组合。
特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))、长春花生物碱(vinca alkaloids)、或其组合。
在另一优选例中，所述的毒素选自下组：
耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(如DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(如顺铂)。
在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白。
在另一优选例中，所述多价是指在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白。
在本发明的第八方面，提供了本发明第一方面所述的双特异性抗体、本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白的用途，用于制备(a)用于检测PD-L1和/或CD47分子的试剂；(b)防治肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物的偶联部分为诊断用同位素。
在另一优选例中，所述的试剂为选自下组的一种或多种试剂：同位素示踪剂、造影剂、流式检测试剂、细胞免疫荧光检测试剂、纳米磁粒和显像剂。
在另一优选例中，所述检测PD-L1和/或CD47分子的试剂为(体内)检测PD-L1和/或CD47分子的造影剂。
在另一优选例中，所述的检测为体内检测或体外检测。
在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。
在另一优选例中，所述的药物用于阻断PD-1和PD-L1的相互作用，同时阻断CD47和SIRPα的相互作用。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括但不限于急性髓细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓病、非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
在本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，含有：(i)本发明第一方面所述的双特异性抗体、本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白、或本发明第七方面所述的免疫偶联物；以及(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物的偶联部分为药物、毒素、和/或治疗用同位素。
在另一优选例中，所述的药物组合物中还含有治疗肿瘤的其他药物，如细胞毒性药物。
在另一优选例中，所述的治疗肿瘤的其他药物包括紫杉醇、多柔比星、环磷酰胺、阿西替尼、乐伐替尼、或派姆单抗。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于阻断PD-1和PD-L1的相互作用，同时阻断CD47和SIRPα的相互作用。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于阻断PD-1/PD-L1信号通路。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗表达PD-L1蛋白(即PD-L1阳性)的肿瘤。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备防治肿瘤的药物。
本发明的第十方面，提供了本发明第一方面所述的双特异性抗体、本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白的一种或多种选自下组的用途：(i)用于检测人PD-L1分子和/或CD47分子；(ii)用于流式检测；(iii)用于细胞免疫荧光检测；(iv)用于治疗肿瘤；(v)用于肿瘤诊断；(vi)用于阻断PD-1和PD-L1的相互作用；和(vii)用于阻断CD47和SIRPα的相互作用。
在另一优选例中，所述的肿瘤为表达PD-L1蛋白(即PD-L1阳性)的肿瘤。
在另一优选例中，所述用途为非诊断的和非治疗的。
在另一优选例中，所述的抗体为抗PD-L1和/或CD47的抗体。
在本发明的第十一方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：(i)本发明第一方面所述的双特异性抗体、本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签、HA标签和Fc标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合于PD-L1和/或CD47。
在本发明的第十二方面，提供了如本发明第一方面所述的双特异性抗体、如本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物的用途，它们被用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中PD-L1和/或CD47；其中，所述药剂用于治疗或预防表达PD-L1(即PD-L1阳性)的肿瘤或是表达CD47的肿瘤。
在本发明的第十三方面，提供了一种检测样品中PD-L1和/或CD47的方法，所述方法包括步骤：(1)将样品与如本发明第一方面所述的双特异性抗体、如本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白接触；(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在PD-L1和/或CD47。
在本发明的第十四方面，提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括，给需要的对象施用如本发明第一方面所述的双特异性抗体、如本发明第二方面所述的双特异性融合蛋白或本发明第七方面所述的免疫偶联物。
在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，如人。
在本发明的第十五方面，提供了一种PD-L1和/或CD47检测试剂，所述的检测试剂包含本发明第七方面所述的免疫偶联物和检测学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物的偶联部分为诊断用同位素。
在另一优选例中，所述的检测学上可接受的载体为无毒的、惰性的水性载体介质。
在另一优选例中，所述的检测试剂为选自下组的一种或多种试剂：同位素示踪剂、造影剂、流式检测试剂、细胞免疫荧光检测试剂、纳米磁粒和显像剂。
在另一优选例中，所述的检测试剂用于体内检测。
在另一优选例中，所述的检测试剂的剂型为液态或粉状(如水剂，针剂，冻干粉，片剂，含服剂，吸雾剂)。
本发明的第十六方面，提供了一种检测PD-L1和/或CD47的试剂盒，所述试剂盒含有本发明第七方面所述的免疫偶联物或本发明的第十五方面所述的检测试剂，以及说明书。
在另一优选例中，所述的说明书记载，所述的试剂盒用于非侵入性地检测待测对象的PD-L1和/或CD47表达。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于表达PD-L1蛋白(即PD-L1阳性)的肿瘤的检测。
在本发明的十七方面，提供了一种本发明第七方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备体内检测PD-L1蛋白和/或CD47蛋白的造影剂。
在另一优选例中，所述检测用于癌症的诊断或预后。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1A显示了抗PD-L1/CD47双特异性抗体A(双抗A)的结构示意图。
图1B显示了抗PD-L1/CD47双特异性抗体B(双抗B)的结构示意图。
图1C显示了抗PD-L1/CD47双特异性抗体C(双抗C)的结构示意图。
图1D显示了抗PD-L1/CD47双特异性抗体D(双抗D)的结构示意图。
图2显示了抗PD-L1/CD47双特异抗体对CD47/SIRPa通路的阻断活性检测结果。双抗C(IC50＝6.226nM)和双抗D(IC50＝4.907nM)较好地保留了阻断CD47/SIRPa相互作用的活性，其中双抗D的活性更优。
图3显示了抗PD-L1/CD47双特异性抗体对PD-1/PD-L1通路的阻断活性检测结果。双抗C的阻断活性与对照抗体较为接近，双抗C(IC50＝6.397nM)对PD-1/PD-L1的阻断活性优于双抗D(IC50＝10.04nM)。
图4A-图4D分别显示了抗PD-L1/CD47双特异性抗体的亲和力测定结果。具体地，图4A显示了对照抗体CD47 Nb-Fc的亲和力测定结果，亲和力为6.13E-09M。图4B显示了双抗C-CD47的亲和力测定结果，亲和力为6.15E-09M。图4A和图4B的结果表明，双抗C-CD47与对照抗体CD47 Nb-Fc的亲和力一致。图4C显示了对照抗体PD-L1 Nb-Fc的亲和力测定结果，亲和力为2.65E-08M。图4D显示了双抗C-PD-L1的亲和力测定结果，亲和力为2.66E-08M。图4C和图4D的结果表明，双抗C-PD-L1与对照抗体PD-L1 Nb-Fc的亲和力也一致。
图5A显示了抗PD-L1/CD47双特异性抗体包被CD47抗原时同时结合双靶点的活性鉴定结果。图5B显示了抗PD-L1/CD47双特异性抗体包被PD-L1抗原时同时结合双靶点的活性鉴定结果。图5A和图5B的结果表明，本发明的抗PD-L1/CD47双特异性抗体C可以同时结合CD47和PD-L1。
图6A和图6B分别显示了在Donor1和Donor2中抗PD-L1/CD47双特异性抗体对T细胞激活的功能检测结果。结果表明，实验组和对照组中IL-2的含量显著高于阴性对照组，候选双抗C和对照抗体均显示出显著的对T细胞的激活作用。
图7显示了抗PD-L1/CD47双特异性抗体诱导巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用检测结果。对照抗体和候选双抗C均能够有效的促进巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬。
图8A和图8B分别显示了在Donor1和Donor2中抗PD-L1/CD47双特异性抗体对人红细胞的凝集作用检测结果。结果表明，对照抗体Hu5F9能够明显引起人红细胞凝集，对照抗体B6H12在较低抗体浓度下会引起轻微的红细胞凝集反应，而CD47单域抗体和候选双抗C不会引起人红细胞凝集。
图9A和图9B分别显示了在4℃和25℃的条件下抗PD-L1/CD47双特异性抗体的稳定性检测结果。结果表明，该双抗C在4℃条件下较为稳定；在加速条件25℃时，双抗C会发生部分降解。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，意外地获得了一种抗PD-L1/CD47双特异性抗体，其包含抗PD-L1单域抗体和抗CD47单域抗体。实验表明，本发明的双特异性抗体对PD-L1和CD47分子均具有较好的结合活性，同时能够阻断PD-1与PD-L1的相互作用以及CD47与SIRPα的相互作用，具有良好的抗肿瘤活性。在此基础上完成了本发明。
本发明的双特异性抗体可以通过Fc片段形成二聚体，即包含4个抗PD-L1单域抗体和4个抗CD47单域抗体的8价融合蛋白。申请人发现，相比包含2个抗PD-L1单域抗体和2个抗CD47单域抗体的4价融合蛋白，本发明的8价融合蛋白对于CD47/SIRPa通路具有更优的阻断活性。
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
如本文所用，术语“本发明的双特异性抗体”、“本发明的双抗”、“抗PD-L1/CD47双特异性抗体”具有相同的含义，均指特异性识别和结合PD-L1和CD47的双特异性抗体。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。存在两种类型的轻链，λ(l)和κ(k)。存在五种主要的重链种类(或同型)，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每种链包含不同的序列结构域。轻链包括两个结构域或区，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，重链可变区(VH)和三个恒定区(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区都决定对抗原的结合识别和特异性。轻链的恒定结构域(CL)和重链的恒定区(CH)赋予重要的生物性质如抗体链结合、分泌、经胎盘的移动性、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-末端部分且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性取决于抗体结合位点和抗原决定区间的结构互补。抗体结合位点由主要来自高度可变区或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔，来自非高度可变或框架区(FR)的残基影响整体结构域结构且进而影响结合位点。互补决定区或CDR指共同限定结合亲和力和天然免疫球蛋白结合位点天然Fv区的特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各具有三个CDR，分另称为CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。常规抗体抗原结合位点因此包括六个CDR，包含来自每个重链和轻链v区的CDR集合。
如本文所用，术语“单域抗体”、“纳米抗体VHH”、“纳米抗体”具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本文所用，术语“框架区”(FR)指插入CDR间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同的免疫球蛋白间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相应地，轻链可变结构域可因此称作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重链可变结构域可因此表示为(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。优选地，本发明的FR是人抗体FR或其衍生物，所述人抗体FR的衍生物与天然存在的人抗体FR基本相同，即序列同一性达到85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
获知CDR的氨基酸序列，本领域的技术人员可轻易确定框架区FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文所用，术语″人框架区″是与天然存在的人抗体的框架区基本相同的(约85％或更多，具体地90％、95％、97％、99％或100％)框架区。
如本文所用，术语“亲和力”理论上通过完整抗体和抗原间的平衡缔合来定义。本发明双抗的亲和力可以通过KD值(解离常数)(或其它测定方式)进行评估或测定，例如生物膜层干涉技术(Bio-layer interferometry BLI)，使用FortebioRed96仪器测量确定。
如本文所用，术语“接头”是指插入免疫球蛋白结构域中为轻链和重链的结构域提供足够的可动性以折叠成交换双重可变区免疫球蛋白的一个或多个氨基酸残基。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的PD-L1/CD47双特异性抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合PD-L1和/或CD47蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有PD-L1和/或CD47蛋白结合活性的双抗。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含相同CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含单域抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明单域抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
双特异性抗体
本发明提供了一种抗PD-L1/CD47双特异性抗体，其包括：抗PD-L1单域抗体和抗CD47单域抗体。
在优选的实施方式中，该双特异性抗体包含两个抗PD-L1单域抗体和两个抗CD47单域抗体，并且，该双特异性抗体可以形成二聚体，即包含4个抗PD-L1单域抗体和4个抗CD47单域抗体的双特异性融合蛋白，如图1C所示。
事实上，基于本发明中的抗CD47单域抗体和抗PD-L1单域抗体，申请人在双特异性抗体的构建过程中，构建了多种结构的双特异性抗体，除了包括2个抗PD-L1单域抗体和2个抗CD47单域抗体之外，还包括1个抗PD-L1单域抗体和1个抗CD47单域抗体。包括2个抗PD-L1单域抗体和2个抗CD47单域抗体形成的二聚体融合蛋白，结构如图1C和1D所示。包括1个抗PD-L1单域抗体和1个抗CD47单域抗体的双特异性抗体形成的二聚体融合蛋白，结构如图1A和1B所示。实验结果显示，与如图1A、1B所示结构的融合蛋白相比，图1C和图1D所示的融合蛋白对CD47/SIRPa通路具有更优的阻断活性；而与图1C所示的融合蛋白相比，图1D所示的融合蛋白于PD-1/PD-L1通路的阻断活性更佳。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合PD-L1和/或CD47蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单域抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
标记的单域抗体
在本发明的一个优选例中，所述单域抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，PD-L1/CD47双特异性抗体可以用胶体金标记，得到胶体金标记的单域抗体。
本发明的PD-L1/CD47双特异性抗体具有很好的特异性。
检测方法
本发明还涉及检测PD-L1和/或CD47蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中PD-L1和/或CD47蛋白的水平。
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明还提供了用于检测PD-L1和/或CD47水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别PD-L1和/或CD47蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
应用
如上所述，本发明的单域抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与PD-L1和/或CD47相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对PD-L1和/或CD47的临床诊断和靶向治疗，如肿瘤治疗。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的双特异性抗体可以同时结合CD47和PD-L1。
(b)本发明的双特异性抗体既能够显著地激活T细胞，又能够有效地促进巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬。
(c)本发明的双特异性抗体不会引起人红细胞凝集。
(d)本发明的双特异性抗体在4℃的非制剂条件下能够稳定储存。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：PD-L1/CD47双特异性抗体分子结构设计及表达
发明人设计了同时结合人PD-L1和CD47胞外结构域的双特异性抗体。其中，PD-L1单域抗体序列源自于中国专利CN201810151835.5，CD47单域抗体序列源自中国专利CN201810151752.6。
本发明设计多种不同结构的PD-L1/CD47双特异性抗体分子，并对其活性进行了测定，本实施例仅示例性地列举四种结构的双抗分子，分别是如图1A所示的双抗A、如图1B所示的双抗B、如图1C所示的双抗C和如图1D所示的双抗D，其中双抗A和双抗B为四价抗体形式，双抗C和双抗D是八价抗体形式。
其中，双抗A的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，核苷酸序列为SEQ ID NO:11；双抗B的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，核苷酸序列为SEQ ID NO:12；双抗C的氨基酸序列为SEQ IDNO:6，核苷酸序列为SEQ ID NO:13；双抗D的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，核苷酸序列为SEQID NO:14。
具体地，双抗A的N端为二价PD-L1单域抗体，C端为二价CD47单域抗体，之间由人Fc片段和柔性连接子连接；双抗B的N端为二价CD47单域抗体，C端为二价PD-L1单域抗体，之间由人Fc片段和柔性连接子连接；双抗C的N端为四价PD-L1单域抗体，C端为四价CD47单域抗体，之间由柔性连接子和人Fc片段连接；双抗D的N端为四价CD47单域抗体，N端为四价PD-L1单域抗体，之间由柔性连接子和人Fc片段连接。
将以上抗体氨基酸按照CHO物种密码子优化成碱基序列后克隆至pCHO1.0载体上的EcoRV和PacI酶切位点之间，然后将克隆好的质粒与等量MAX混合转染CHO-S细胞进行抗体表达，将表达上清液于Protein A结合获得纯化的多特异性抗体。
实施例2：PD-L1/CD47双特异抗体对CD47/SIRPa通路的阻断活性比较
(1)每个样品取5×105个Jurkat细胞(高表达人CD47)于0.5％BSA-PBS buffer中，加入梯度稀释的PD-L1/CD47双特异性抗体及阳性对照CD47单域抗体Fc融合蛋白(Nb-Fc)，抗体稀释梯度为514nM、257nM、129nM、64.3nM、32.1nM、16.1nM、8.03nM、4.02nM、2.00nM、1.00nM、0.50nM、0.25nM，每个样品加入100uL，所有样本中同时加入5ug hSIRPa(ECD)-Fc-Biotin，4℃孵育20min；(2)PBS洗涤2次细胞，加入eBioscience的SA-PE，4℃孵育20min，PBS洗涤2次细胞后用流式细胞仪(BD FACS Calibur)检测，使用graphpad prism 6软件进行数据处理。
结果如图2所示：八价抗体的阻断活性优于四价抗体的阻断活性，四价抗体A(IC50＝10.751nM)和B(IC50＝8.302nM)的阻断活性均相较于原始CD47单域抗体(IC50＝4.487nM)有所下降，而双抗C(IC50＝6.226nM)和双抗D(IC50＝4.907nM)较好地保留了阻断CD47/SIRPa相互作用的活性，其中双抗D的活性更优。
实施例3：PD-L1/CD47双特异性抗体对PD-1/PD-L1通路的阻断活性比较
每个样品取3×105个A375/PD-L1稳转细胞于0.5％BSA-PBS buffer中，加入梯度稀释的待测双抗及对照抗体PD-L1单域抗体Fc融合蛋白(Nb-Fc)，抗体稀释梯度为184nM、91.8nM、45.9nM、22.9nM、11.5nM、5.74nM、2.87nM、1.43nM、0.72nM、0.36nM、0.18nM、0.09nM，每个样品加入100uL，所有样本中同时加入3ug hPD-1(ECD)-Fc-Biotin，4℃孵育20min；(2)PBS洗涤2次细胞，加入eBioscience的SA-PE，4℃孵育20min，PBS洗涤2次细胞后用流式细胞仪(BDFACS Calibur)检测，使用graphpad prism 6软件进行数据处理。
结果如图3所示：不同结构的双特异性抗体其阻断PD1/PD-L1相互作用的活性相较于原始PD-L1单域抗体有所下降，其中双抗C的阻断活性与对照抗体较为接近，双抗C(IC50＝6.397nM)对PD-1/PD-L1的阻断活性优于双抗D(IC50＝10.04nM)。
结果显示，与PD-L1单抗相比，双抗D的PD-1/PD-L1阻断活性的活性损失较为严重，而双抗C则较好地保留了PD-1/PD-L1的阻断活性和CD47/SIRPa阻断活性，选择双抗C进行后续研究。
实施例4：PD-L1/CD47和双特异性抗体的亲和力测定
通过生物膜层干涉技术(Bio-layer interferometry BLI)和Fortebio Red96仪器，测定双抗C针对重组人PD-L1的结合动力学，具体方法如下：
(1)双抗C与CD47的亲和力检测：用PBST将待测抗体从100nM进行梯度稀释。将抗原蛋白hCD47(ECD)-Fc和Fc分别稀释至30ug/mL。设置仪器运行条件：温度30℃，Shake speed1000rpm。使用已包被ProteinA的探针捕获抗体，捕获时间180s；结合梯度稀释的抗原，结合时间120s；解离时间120s；10mM甘氨酸(PH 1.7)再生3次，每次5s。用ForteBio's OctetSystem进行上机检测。
(2)双抗C与PD-L1的亲和力检测：用PBST将待测抗体从200nM进行梯度稀释。将抗原蛋白hPD-L1(ECD)-Fc和Fc分别稀释至40ug/mL。设置仪器运行条件：温度30℃，Shakespeed 1000rpm。使用已包被Protein A的探针捕获抗体，捕获时间180s；结合梯度稀释的抗原，结合时间70s；解离时间120s；10mM甘氨酸(PH 1.7)再生3次，每次5s。用ForteBio'sOctet System进行上机检测。
检测结果如下：如图4A所示，对照抗体CD47 Nb-Fc的亲和力为6.13E-09M，如图4B所示，双抗C-CD47的亲和力为6.15E-09M，结果表明双抗C-CD47与对照抗体CD47 Nb-Fc的亲和力一致。如图4C所示，对照抗体PD-L1 Nb-Fc的亲和力为2.65E-08M，如图4D所示，双抗C-PD-L1的亲和力为2.66E-08M，结果表明双抗C-PD-L1与对照抗体PD-L1 Nb-Fc的亲和力也一致。
实施例5：PD-L1/CD47双特异性抗体同时结合双靶点的活性检测
利用ELISA方法检测候选双抗C是否能同时结合双靶点抗原蛋白。具体过程如下：(1)分别用NaHCO3溶液稀释CD47蛋白或者PD-L1蛋白，浓度为1ug/mL、100uL包被于酶标板中，4℃过夜；(2)PBST洗5遍；(3)每孔300uL的1％BSA 37℃封闭2h；(4)PBST洗5遍；(5)每孔100ul稀释好的双抗C于37℃孵育1h；(6)PBST洗5遍，每孔加入100uL的PD-L1-biotin或者CD47-biotin样品37℃孵育1h；(7)PBST洗5遍，加入100ul SA-HRP(1:5000PBS)37℃孵育1h；(8)PBST洗5遍，每孔加100uL TMB显色液，室温，避光反应5-7min；(9)加50ul 2M的H2SO4终止反应，450nm处读取吸光值。
结果如图5A和图5B所示，图5A为包被CD47时的检测结果，图5B为包被PD-L1时的检测结果，结果表明，本发明的抗PD-L1/CD47双特异性抗体C可以同时结合CD47和PD-L1。
实施例6：PD-L1/CD47双特异性抗体对T细胞激活的功能检测
检测方法如下：(1)在96孔细胞培养板中分别加入50uL的人PBMC细胞，每孔加入1x105个细胞；(2)将100uL抗体(终浓度：100nM，10nM)和50uL SEB(终浓度：0.1ug/mL)分别加入到对应的孔中；(3)37℃，5％CO2，培养72h；(4)用BDIL-2ELISA试剂盒检测上清中IL-2的含量。
结果如图6A和6B所示，实验组和对照组中IL-2的含量显著高于阴性对照组，表明在Donor 1和Donor 2中，候选双抗C和对照抗体PD-L1 Nb-Fc均显示出显著的对T细胞的激活作用。
实施例7：PD-L1/CD47双特异性抗体诱导巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用检测
具体过程如下：(1)PBMC在含40ng/ml M-CSF的RPMI1640(10％的FBS)诱导9-12天，收获巨噬细胞。(2)给Jurkat细胞标记CFSE(终浓度：1.5uM)，给macrophage标记eFlour670(终浓度：1.25uM)。(3)取macrophage(1E5个、100uL)和Jurkat细胞(3E5个、50uL)混匀，再加入50uL稀释好的抗体(终浓度30ug/mL、0.3ug/mL)。(4)37℃，5％CO2，3h。(5)将每个孔中的细胞转移至1.5ml EP管中，后用200uL的PBS冲洗各个孔，然后将冲洗后的PBS转移至对应的1.5mL EP管中。(6)3000rpm，4℃离心4min，加入500uL PBS/管，重悬。(7)3000rpm，4℃离心4min，加入200uL PBS/孔，重悬，流式检测。
结果如图7所示：对照抗体CD47 Nb-Fc和候选双抗C均能够有效的促进巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬。
实施例8：PD-L1/CD47双特异性抗体对人红细胞的凝集作用检测
将候选双抗C、CD47单域抗体、阳性对照抗体B6H12(序列来源见WO2011143624A2)、阳性对照抗体Hu5F9、阴性对照(IgG4)分别梯度稀释为4000nM、1000nM、250nM、62.5nM、15.625nM、3.906nM、0.976nM、0nM。将梯度稀释好的抗体分别加入到人的红细胞悬液(2％)中，置于37℃下反应过夜后观察结果。
结果如图8A和图8B所示：Hu5F9能够明显引起人红细胞凝集，B6H12在较低抗体浓度下会引起轻微的红细胞凝集反应，而CD47单域抗体和候选双抗C不会引起人红细胞凝集。
实施例9：PD-L1/CD47双特异性抗体的稳定性检测
具体方法如下：将1mg/mL的双抗C样品用0.22um的针式滤器将样品过滤至新的离心管内，样品所在的溶剂为1xPBS,pH7.0的溶液中。将样品分装至EP管中，并按照以下条件放置，分别放置在相应的培养箱内(见下表2)。待处理时间到时，取出样品进行SEC-HPLC上机检测其样品纯度。
表2PD-L1/CD47双特异性抗体的稳定性检测条件
Figure BDA0002254258610000201
SEC检测结果如图9A和图9B所示：处理15天该双抗C纯度未发生明显变化，该双抗C在非制剂条件下能够稳定储存于4℃；而在加速条件25℃时，双抗C发生部分降解，后续可通过调整制剂处方进行改善。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海洛启生物医药技术有限公司
<120> 抗PD-L1/CD47双特异性抗体及其用途
<130> P2019-1768
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> PRT
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
325 330 335
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
340 345 350
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
355 360 365
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
370 375 380
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
385 390 395 400
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
405 410 415
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
420 425 430
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
435 440 445
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
450 455 460
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
465 470 475 480
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
485 490 495
Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
500 505 510
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser
515 520 525
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
530 535 540
Ala Ser Gly Tyr Ala Tyr Thr Ser Asp Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln
545 550 555 560
Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Leu Ile Tyr Thr Pro Gly
565 570 575
Ala Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
580 585 590
Gln Asp Asn Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
595 600 605
Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Arg Gly Ala Cys
610 615 620
Ser Leu Arg Leu Pro Phe Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
625 630 635 640
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
645 650 655
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly
660 665 670
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
675 680 685
Gly Tyr Ala Tyr Thr Ser Asp Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro
690 695 700
Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Leu Ile Tyr Thr Pro Gly Ala Ser
705 710 715 720
Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp
725 730 735
Asn Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
740 745 750
Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Arg Gly Ala Cys Ser Leu
755 760 765
Arg Leu Pro Phe Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
770 775 780
Ser
785
<210> 7
<211> 765
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Tyr Thr Ser Asp
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Leu Ile Tyr Thr Pro Gly Ala Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Arg Gly Ala Cys Ser Leu Arg Leu Pro Phe Phe Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
145 150 155 160
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Tyr Thr Ser Asp Cys Met
165 170 175
Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Leu
180 185 190
Ile Tyr Thr Pro Gly Ala Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
195 200 205
Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gln
210 215 220
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala
225 230 235 240
Arg Arg Gly Ala Cys Ser Leu Arg Leu Pro Phe Phe Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
260 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
275 280 285
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
290 295 300
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
305 310 315 320
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
325 330 335
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
340 345 350
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
355 360 365
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
370 375 380
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
385 390 395 400
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
405 410 415
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
420 425 430
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
435 440 445
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
450 455 460
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
465 470 475 480
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gln Val Gln
485 490 495
Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
500 505 510
Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Asn Leu Ser Pro Ser Cys Met Gly
515 520 525
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Phe Thr
530 535 540
Asp Ala Asp Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Ala Arg Phe
545 550 555 560
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
565 570 575
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Phe
580 585 590
Phe Ser Tyr Cys Ser Val Val Phe Arg Ala Ser Ala Arg Asp Lys Tyr
595 600 605
Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
610 615 620
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
625 630 635 640
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
645 650 655
Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Asn Leu Ser Pro Ser Cys
660 665 670
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala
675 680 685
Phe Thr Asp Ala Asp Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Ala
690 695 700
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
705 710 715 720
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
725 730 735
Asp Phe Phe Ser Tyr Cys Ser Val Val Phe Arg Ala Ser Ala Arg Asp
740 745 750
Lys Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
755 760 765
<210> 8
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caggtgcagc tgcaggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgaggctg 60
tcctgcaccg cctccggcta caacctgtcc ccctcctgca tgggctggtt caggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggaggg cgtggccttc accgacgccg acggctccac caggtacgcc 180
gactccgtga aggccaggtt caccatctcc agggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccgc cgacttcttc 300
tcctactgct ccgtggtgtt cagggcctcc gccagggaca agtacagggg ccagggcacc 360
ctggtgaccg tgtcctcc 378
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggcggcggcg gctccggcgg cggcggctcc ggcggcggcg gctccggcgg cggcggctcc 60
<210> 10
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caggtgcagc tgcaggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgaggctg 60
tcctgcgccg cctccggcta cgcctacacc tccgactgca tgggctggtt caggcagacc 120
cccggcaagg gcctggaggg cgtggccctg atctacaccc ccggcgcctc caccaactac 180
gccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tcccaggaca actccaagtc caccgtgtac 240
ctgcagatga actccctgag ggccgaggac accgccatgt actactgcgc cgccaggagg 300
ggcgcctgct ccctgaggct gcccttcttc tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360
tcctcc 366
<210> 11
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caggtgcagc tgcaggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgaggctg 60
tcctgcaccg cctccggcta caacctgtcc ccctcctgca tgggctggtt caggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggaggg cgtggccttc accgacgccg acggctccac caggtacgcc 180
gactccgtga aggccaggtt caccatctcc agggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccgc cgacttcttc 300
tcctactgct ccgtggtgtt cagggcctcc gccagggaca agtacagggg ccagggcacc 360
ctggtgaccg tgtcctccga gtccaagtac ggccccccct gccccccctg ccccgccccc 420
gagttcctgg gcggcccctc cgtgttcctg ttccccccca agcccaagga caccctgatg 480
atctccagga cccccgaggt gacctgcgtg gtggtggacg tgtcccagga ggaccccgag 540
gtgcagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcaca acgccaagac caagcccagg 600
gaggagcagt tcaactccac ctacagggtg gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac 660
tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtgtccaaca agggcctgcc ctcctccatc 720
gagaagacca tctccaaggc caagggccag cccagggagc cccaggtgta caccctgccc 780
ccctcccagg aggagatgac caagaaccag gtgtccctga cctgcctggt gaagggcttc 840
tacccctccg acatcgccgt ggagtgggag tccaacggcc agcccgagaa caactacaag 900
accacccccc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tgtactccag gctgaccgtg 960
gacaagtcca ggtggcagga gggcaacgtg ttctcctgct ccgtgatgca cgaggccctg 1020
cacaaccact acacccagaa gtccctgtcc ctgtccctgg gcaagggcgg cggcggctcc 1080
ggcggcggcg gctccggcgg cggcggctcc ggcggcggcg gctcccaggt gcagctgcag 1140
gagtccggcg gcggcctggt gcagcccggc ggctccctga ggctgtcctg cgccgcctcc 1200
ggctacgcct acacctccga ctgcatgggc tggttcaggc agacccccgg caagggcctg 1260
gagggcgtgg ccctgatcta cacccccggc gcctccacca actacgccga ctccgtgaag 1320
ggcaggttca ccatctccca ggacaactcc aagtccaccg tgtacctgca gatgaactcc 1380
ctgagggccg aggacaccgc catgtactac tgcgccgcca ggaggggcgc ctgctccctg 1440
aggctgccct tcttctactg gggccagggc accctggtga ccgtgtcctc c 1491
<210> 12
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caggtgcagc tgcaggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgaggctg 60
tcctgcgccg cctccggcta cgcctacacc tccgactgca tgggctggtt caggcagacc 120
cccggcaagg gcctggaggg cgtggccctg atctacaccc ccggcgcctc caccaactac 180
gccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tcccaggaca actccaagtc caccgtgtac 240
ctgcagatga actccctgag ggccgaggac accgccatgt actactgcgc cgccaggagg 300
ggcgcctgct ccctgaggct gcccttcttc tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360
tcctccgagt ccaagtacgg ccccccctgc cccccctgcc ccgcccccga gttcctgggc 420
ggcccctccg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat ctccaggacc 480
cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccaggagg accccgaggt gcagttcaac 540
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agcccaggga ggagcagttc 600
aactccacct acagggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 660
aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccct cctccatcga gaagaccatc 720
tccaaggcca agggccagcc cagggagccc caggtgtaca ccctgccccc ctcccaggag 780
gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta cccctccgac 840
atcgccgtgg agtgggagtc caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccccccc 900
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctg tactccaggc tgaccgtgga caagtccagg 960
tggcaggagg gcaacgtgtt ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1020
acccagaagt ccctgtccct gtccctgggc aagggcggcg gcggctccgg cggcggcggc 1080
tccggcggcg gcggctccgg cggcggcggc tcccaggtgc agctgcagga gtccggcggc 1140
ggcctggtgc agcccggcgg ctccctgagg ctgtcctgca ccgcctccgg ctacaacctg 1200
tccccctcct gcatgggctg gttcaggcag gcccccggca agggcctgga gggcgtggcc 1260
ttcaccgacg ccgacggctc caccaggtac gccgactccg tgaaggccag gttcaccatc 1320
tccagggaca actccaagaa caccctgtac ctgcagatga actccctgag ggccgaggac 1380
accgccgtgt actactgcgc cgccgacttc ttctcctact gctccgtggt gttcagggcc 1440
tccgccaggg acaagtacag gggccagggc accctggtga ccgtgtcctc c 1491
<210> 13
<211> 2355
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caggtgcagc tgcaggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgaggctg 60
tcctgcaccg cctccggcta caacctgtcc ccctcctgca tgggctggtt caggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggaggg cgtggccttc accgacgccg acggctccac caggtacgcc 180
gactccgtga aggccaggtt caccatctcc agggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccgc cgacttcttc 300
tcctactgct ccgtggtgtt cagggcctcc gccagggaca agtacagggg ccagggcacc 360
ctggtgaccg tgtcctccgg cggcggcggc tccggcggcg gcggctccgg cggcggcggc 420
tccggcggcg gcggctccca ggtgcagctg caggagtccg gcggcggcct ggtgcagccc 480
ggcggctccc tgaggctgtc ctgcaccgcc tccggctaca acctgtcccc ctcctgcatg 540
ggctggttca ggcaggcccc cggcaagggc ctggagggcg tggccttcac cgacgccgac 600
ggctccacca ggtacgccga ctccgtgaag gccaggttca ccatctccag ggacaactcc 660
aagaacaccc tgtacctgca gatgaactcc ctgagggccg aggacaccgc cgtgtactac 720
tgcgccgccg acttcttctc ctactgctcc gtggtgttca gggcctccgc cagggacaag 780
tacaggggcc agggcaccct ggtgaccgtg tcctccgagt ccaagtacgg ccccccctgc 840
cccccctgcc ccgcccccga gttcctgggc ggcccctccg tgttcctgtt cccccccaag 900
cccaaggaca ccctgatgat ctccaggacc cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg 960
tcccaggagg accccgaggt gcagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac 1020
gccaagacca agcccaggga ggagcagttc aactccacct acagggtggt gtccgtgctg 1080
accgtgctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaag 1140
ggcctgccct cctccatcga gaagaccatc tccaaggcca agggccagcc cagggagccc 1200
caggtgtaca ccctgccccc ctcccaggag gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc 1260
tgcctggtga agggcttcta cccctccgac atcgccgtgg agtgggagtc caacggccag 1320
cccgagaaca actacaagac cacccccccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctg 1380
tactccaggc tgaccgtgga caagtccagg tggcaggagg gcaacgtgtt ctcctgctcc 1440
gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaagt ccctgtccct gtccctgggc 1500
aagggcggcg gcggctccgg cggcggcggc tccggcggcg gcggctccgg cggcggcggc 1560
tcccaggtgc agctgcagga gtccggcggc ggcctggtgc agcccggcgg ctccctgagg 1620
ctgtcctgcg ccgcctccgg ctacgcctac acctccgact gcatgggctg gttcaggcag 1680
acccccggca agggcctgga gggcgtggcc ctgatctaca cccccggcgc ctccaccaac 1740
tacgccgact ccgtgaaggg caggttcacc atctcccagg acaactccaa gtccaccgtg 1800
tacctgcaga tgaactccct gagggccgag gacaccgcca tgtactactg cgccgccagg 1860
aggggcgcct gctccctgag gctgcccttc ttctactggg gccagggcac cctggtgacc 1920
gtgtcctccg gcggcggcgg ctccggcggc ggcggctccg gcggcggcgg ctccggcggc 1980
ggcggctccc aggtgcagct gcaggagtcc ggcggcggcc tggtgcagcc cggcggctcc 2040
ctgaggctgt cctgcgccgc ctccggctac gcctacacct ccgactgcat gggctggttc 2100
aggcagaccc ccggcaaggg cctggagggc gtggccctga tctacacccc cggcgcctcc 2160
accaactacg ccgactccgt gaagggcagg ttcaccatct cccaggacaa ctccaagtcc 2220
accgtgtacc tgcagatgaa ctccctgagg gccgaggaca ccgccatgta ctactgcgcc 2280
gccaggaggg gcgcctgctc cctgaggctg cccttcttct actggggcca gggcaccctg 2340
gtgaccgtgt cctcc 2355
<210> 14
<211> 2355
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caggtgcagc tgcaggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgaggctg 60
tcctgcgccg cctccggcta cgcctacacc tccgactgca tgggctggtt caggcagacc 120
cccggcaagg gcctggaggg cgtggccctg atctacaccc ccggcgcctc caccaactac 180
gccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tcccaggaca actccaagtc caccgtgtac 240
ctgcagatga actccctgag ggccgaggac accgccatgt actactgcgc cgccaggagg 300
ggcgcctgct ccctgaggct gcccttcttc tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360
tcctccggcg gcggcggctc cggcggcggc ggctccggcg gcggcggctc cggcggcggc 420
ggctcccagg tgcagctgca ggagtccggc ggcggcctgg tgcagcccgg cggctccctg 480
aggctgtcct gcgccgcctc cggctacgcc tacacctccg actgcatggg ctggttcagg 540
cagacccccg gcaagggcct ggagggcgtg gccctgatct acacccccgg cgcctccacc 600
aactacgccg actccgtgaa gggcaggttc accatctccc aggacaactc caagtccacc 660
gtgtacctgc agatgaactc cctgagggcc gaggacaccg ccatgtacta ctgcgccgcc 720
aggaggggcg cctgctccct gaggctgccc ttcttctact ggggccaggg caccctggtg 780
accgtgtcct ccgagtccaa gtacggcccc ccctgccccc cctgccccgc ccccgagttc 840
ctgggcggcc cctccgtgtt cctgttcccc cccaagccca aggacaccct gatgatctcc 900
aggacccccg aggtgacctg cgtggtggtg gacgtgtccc aggaggaccc cgaggtgcag 960
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cacaacgcca agaccaagcc cagggaggag 1020
cagttcaact ccacctacag ggtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg 1080
aacggcaagg agtacaagtg caaggtgtcc aacaagggcc tgccctcctc catcgagaag 1140
accatctcca aggccaaggg ccagcccagg gagccccagg tgtacaccct gcccccctcc 1200
caggaggaga tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc 1260
tccgacatcg ccgtggagtg ggagtccaac ggccagcccg agaacaacta caagaccacc 1320
ccccccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctgtact ccaggctgac cgtggacaag 1380
tccaggtggc aggagggcaa cgtgttctcc tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1440
cactacaccc agaagtccct gtccctgtcc ctgggcaagg gcggcggcgg ctccggcggc 1500
ggcggctccg gcggcggcgg ctccggcggc ggcggctccc aggtgcagct gcaggagtcc 1560
ggcggcggcc tggtgcagcc cggcggctcc ctgaggctgt cctgcaccgc ctccggctac 1620
aacctgtccc cctcctgcat gggctggttc aggcaggccc ccggcaaggg cctggagggc 1680
gtggccttca ccgacgccga cggctccacc aggtacgccg actccgtgaa ggccaggttc 1740
accatctcca gggacaactc caagaacacc ctgtacctgc agatgaactc cctgagggcc 1800
gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccgcc gacttcttct cctactgctc cgtggtgttc 1860
agggcctccg ccagggacaa gtacaggggc cagggcaccc tggtgaccgt gtcctccggc 1920
ggcggcggct ccggcggcgg cggctccggc ggcggcggct ccggcggcgg cggctcccag 1980
gtgcagctgc aggagtccgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggctccct gaggctgtcc 2040
tgcaccgcct ccggctacaa cctgtccccc tcctgcatgg gctggttcag gcaggccccc 2100
ggcaagggcc tggagggcgt ggccttcacc gacgccgacg gctccaccag gtacgccgac 2160
tccgtgaagg ccaggttcac catctccagg gacaactcca agaacaccct gtacctgcag 2220
atgaactccc tgagggccga ggacaccgcc gtgtactact gcgccgccga cttcttctcc 2280
tactgctccg tggtgttcag ggcctccgcc agggacaagt acaggggcca gggcaccctg 2340
gtgaccgtgt cctcc 2355

Claims (10)

1.一种双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体包括：抗PD-L1单域抗体和抗CD47单域抗体。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体包括2个抗PD-L1单域抗体和抗CD47单域抗体。
3.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体从N端到C端具有式I(a)或I(b)所示的结构：
P-L1-P-L2-Fc-L3-B-L4-B 式I(a)
B-L1-B-L2-Fc-L3-P-L4-P 式I(b)
其中，
“-”为肽键；
L1、L2、L3、和L4各自独立地为肽键或接头元件；
P为抗PD-L1单域抗体，
B为抗CD47单域抗体，和
Fc为抗体的Fc段。
4.一种双特异性融合蛋白，其特征在于，所述的双特异性融合蛋白是由两个权利要求1所述的双特异性抗体形成的二聚体。
5.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的双特异性抗体或权利要求4所述的双特异性融合蛋白。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求6所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸；
或者，所述的宿主细胞表达权利要求1所述的双特异性抗体。
8.一种制备双特异性抗体的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在合适的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，从而获得含所述双特异性抗体的培养物；和
(b)对步骤(a)中得到的培养物进行纯化和/或分离，所述的获得所述的双特异性抗体。
9.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)权利要求1所述的双特异性抗体或权利要求4所述的双特异性融合蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。
10.权利要求1所述的双特异性抗体或权利要求4所述的双特异性融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备(a)用于检测PD-L1和/或CD47分子的试剂、试剂盒；(b)防治肿瘤的药物。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022235127A1 (ko) * 2021-05-07 2022-11-10 주식회사 이뮨온시아 Cd47 및 pd-l1에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체
CN115558029A (zh) * 2021-10-22 2023-01-03 立凌生物制药(苏州)有限公司 靶向pd-1的双特异性抗体、及其制备和应用
WO2023011644A1 (zh) * 2021-08-06 2023-02-09 百奥泰生物制药股份有限公司 抗pd-l1/cd47双特异抗体在治疗疾病中的应用
WO2023051680A1 (zh) * 2021-09-30 2023-04-06 正大天晴药业集团股份有限公司 针对免疫检查点的双特异性抗体
WO2023056970A1 (en) * 2021-10-09 2023-04-13 Hutchmed Limited Bispecific antibodies specifically binding to cd47 and her2, and uses thereof
WO2023224412A1 (ko) * 2022-05-19 2023-11-23 (주)샤페론 Pd-l1 및 cd47에 대한 이중특이적 인간화 단일 도메인 항체 및 이의 용도
WO2024140998A3 (en) * 2022-12-29 2024-08-15 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-pdl1 antibodies, multispecific antibodies and methods of use

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201922781A (zh) * 2017-10-03 2019-06-16 俄羅斯聯邦商Ｂｉｏｃａｄ股份有限公司 對cd47和pd-l1特異性的抗體
CN109970860A (zh) * 2017-12-27 2019-07-05 信达生物制药(苏州)有限公司 三链抗体、其制备方法及其用途
CN110144009A (zh) * 2018-02-14 2019-08-20 上海洛启生物医药技术有限公司 Cd47单域抗体及其用途
CN110144010A (zh) * 2018-02-14 2019-08-20 上海洛启生物医药技术有限公司 阻断型pd-l1驼源单域抗体及其用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201922781A (zh) * 2017-10-03 2019-06-16 俄羅斯聯邦商Ｂｉｏｃａｄ股份有限公司 對cd47和pd-l1特異性的抗體
CN109970860A (zh) * 2017-12-27 2019-07-05 信达生物制药(苏州)有限公司 三链抗体、其制备方法及其用途
CN110144009A (zh) * 2018-02-14 2019-08-20 上海洛启生物医药技术有限公司 Cd47单域抗体及其用途
CN110144010A (zh) * 2018-02-14 2019-08-20 上海洛启生物医药技术有限公司 阻断型pd-l1驼源单域抗体及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BONING LIU: "Elimination of tumor by CD47/PD-L1 dual-targeting fusion protein that engages innate and adaptive immune responses", 《MABS》 *
白银鹏: "抗CD47 靶向治疗研究现状及应用前景", 《中国肿瘤临床》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022235127A1 (ko) * 2021-05-07 2022-11-10 주식회사 이뮨온시아 Cd47 및 pd-l1에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체
WO2023011644A1 (zh) * 2021-08-06 2023-02-09 百奥泰生物制药股份有限公司 抗pd-l1/cd47双特异抗体在治疗疾病中的应用
WO2023051680A1 (zh) * 2021-09-30 2023-04-06 正大天晴药业集团股份有限公司 针对免疫检查点的双特异性抗体
WO2023056970A1 (en) * 2021-10-09 2023-04-13 Hutchmed Limited Bispecific antibodies specifically binding to cd47 and her2, and uses thereof
CN115558029A (zh) * 2021-10-22 2023-01-03 立凌生物制药(苏州)有限公司 靶向pd-1的双特异性抗体、及其制备和应用
CN115558029B (zh) * 2021-10-22 2024-01-30 立凌生物制药(苏州)有限公司 靶向pd-1的双特异性抗体、及其制备和应用
WO2023224412A1 (ko) * 2022-05-19 2023-11-23 (주)샤페론 Pd-l1 및 cd47에 대한 이중특이적 인간화 단일 도메인 항체 및 이의 용도
WO2024140998A3 (en) * 2022-12-29 2024-08-15 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-pdl1 antibodies, multispecific antibodies and methods of use

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