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CN116333143A - Scube2中和抗体及其医药用途 - Google Patents

Scube2中和抗体及其医药用途 Download PDF

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CN116333143A
CN116333143A CN202111582701.7A CN202111582701A CN116333143A CN 116333143 A CN116333143 A CN 116333143A CN 202111582701 A CN202111582701 A CN 202111582701A CN 116333143 A CN116333143 A CN 116333143A
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CN
China
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antibody
seq
scube2
protein
gly
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CN202111582701.7A
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胡国宏
吴秋瑶
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Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Original Assignee
Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
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Publication date
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Abstract

本发明提供了一种SCUBE2中和抗体及其医药用途。具体地，本发明提供了能够竞争性地结合SCUBE2蛋白的抗体。本发明的抗体具有高亲和力，能够结合SCUBE2蛋白的CUB功能区域，竞争性地阻断Hedgehog信号配体(如SHH蛋白)与SCUBE2蛋白中CUB结构域的结合，从而抑制Hedgehog信号介导的乳腺癌骨转移过程。该抗体具有治疗乳腺癌骨转移的前景。

Description

SCUBE2中和抗体及其医药用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体地说，本发明涉及SCUBE2中和抗体及其医药用途。
背景技术
乳腺癌作为全球最常见的女性肿瘤，是对女性健康造成威胁的癌症元凶。与原位肿瘤相比，发生远程转移是造成乳腺癌患者死亡的主要原因。乳腺癌的转移器官有骨、肝、脑、肺等，其中骨是最常见的转移位点，临床上超过70％晚期乳腺癌患者被诊断出现骨转移，引发严重的骨痛、骨折及其他致死性并发症。目前针对乳腺癌骨转移主要治疗方案为抑制破骨细胞引发的骨溶解，例如双膦酸盐和狄诺塞麦，但这些药物只能缓解转移的恶化，并不能有效提高患者的总生存期。
SCUBE2是一个进化上高度保守的蛋白，含有9个类EGF重复序列，三个富含半胱氨酸重复组件和一个CUB区域。SCUBE2是Hedgehog信号传导中的重要蛋白，负责剪切释放锚定在细胞膜上的Hedgehog信号配体，如SHH，从而使游离的SHH与Hedgehog受体结合，启动下游Hedgehog信号。研究发现SCUBE2的CUB区域在剪切释放SHH蛋白中发挥关键作用，缺失CUB区域的截短体蛋白不能与SHH蛋白结合同时无法将其从细胞膜上释放。前期研究发现SCUBE2在乳腺癌骨转移中发挥着重要作用，SCUBE2通过促进乳腺癌细胞释放SHH从而帮助癌细胞定植在骨微环境中，因此靶向SCUBE2蛋白进行功能抑制成为治疗乳腺癌骨转移的潜在方案。目前市面上针对SCUBE2的抑制类分子或药物尚为空白。
因此本领域需要开发一种靶向SCUBE2的乳腺癌骨转移的新型治疗药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种靶向SCUBE2的乳腺癌骨转移的新型治疗药物。
在本发明的第一方面，提供了一种结合SCUBE2蛋白的抗体，所述抗体特异性结合于SCUBE2蛋白的CUB结构域，并且，所述抗体能够竞争性地阻断Hedgehog信号配体与所述SCUBE2蛋白的结合，
其中所述CUB结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在另一优选例中，所述的竞争性阻断指，使所述Hedgehog信号配体与SCUBE2蛋白的结合率下降50％，优选地下降70％，更优选地下降90％。
在另一优选例中，所述的抗体包括重链和轻链，
其中，所述重链的可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:9、15或20所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO:10、16或21所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO:11、17或22所示的VH-CDR3；
并且，所述轻链的可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:12、18或23所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO:13或24所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO:14、19或25所示的VL-CDR3；
并且，上述CDR序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并使得含有所述衍生CDR序列的重链和轻链所构成的衍生抗体能够保留SCUBE2结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
VH1)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的VH-CDR1，SEQ ID NO:10所示的VH-CDR2，和SEQ ID NO:11所示的VH-CDR3；
VH2)氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的VH-CDR1，SEQ ID NO:16所示的VH-CDR2，和SEQ ID NO:17所示的VH-CDR3；或
VH3)氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的VH-CDR1，SEQ ID NO:21所示的VH-CDR2，和EQ ID NO:22所示的VH-CDR3。
在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
VL1)氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的VL-CDR1，SEQ ID NO:13所示的VL-CDR2，和SEQ ID NO:14所示的VL-CDR3；
VL2)氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的VL-CDR1，SEQ ID NO:13所示的VL-CDR2，和SEQ ID NO:19所示的VL-CDR3；和
VL3)氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的VL-CDR1，SEQ ID NO:24所示的VL-CDR2，和SEQ ID NO:25所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:9所示的VH-CDR1，SEQ ID NO:10所示的VH-CDR2，和SEQ ID NO:11所示的VH-CDR3；
并且，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:12所示的VL-CDR1，SEQ ID NO:13所示的VL-CDR2，和SEQ ID NO:14所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:15所示的VH-CDR1，SEQ ID NO:16所示的VH-CDR2，和SEQ ID NO:17所示的VH-CDR3；
并且，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:18所示的VL-CDR1，SEQ ID NO:13所示的VL-CDR2，和SEQ ID NO:19所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:20所示的VH-CDR1，SEQ ID NO:21所示的VH-CDR2，和EQ ID NO:22所示的VH-CDR3；
并且，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:23所示的VL-CDR1，SEQ ID NO:24所示的VL-CDR2，和SEQ ID NO:25所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，所述重链的可变区具有SEQ ID NO:3、5或7所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源或鼠源的。
在另一优选例中，所述轻链的可变区具有SEQ ID NO:4、6或8所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述轻链恒定区为人源或鼠源的。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:3、5或7所示的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:4、6或8所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO:3、5或7所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO:4、6或8所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括鼠源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括鼠源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体、或多克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
在另一优选例中，所述抗体具有选自下组的一个或多个功能：
(a)抑制肿瘤细胞释放Hedgehog信号配体；
(b)抑制肿瘤周围内皮细胞释放Hedgehog信号配体；
(c)抑制Hedgehog信号配体介导的肿瘤细胞生长；
(d)抑制Hedgehog信号配体介导的肿瘤细胞转移。
在另一优选例中，所述的Hedgehog信号配体选自下组：SHH蛋白、IHH蛋白、DHH蛋白。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：乳腺癌、黑色素瘤、肺癌。
在另一优选例中，所述的肿瘤为乳腺癌。
在另一优选例中，所述的转移选自下组：骨转移。
在另一优选例中，所述的转移为骨转移。
在本发明的第二方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包括：
(i)如本发明第一方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签、GGGS序列、FLAG标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合SCUBE2蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合SCUBE2蛋白的CUB功能区域。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为融合蛋白。
在另一优选例中，所述的融合蛋白为单特异性抗体(即抗SCUBE2蛋白的单特异性抗体)、双特异性抗体、或多特异性抗体(如三特异性抗体)。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体或多特异性抗体不仅抗SCUBE2蛋白，还特异性结合于额外的靶抗原(如其他的肿瘤抗原，如乳腺癌的其他抗原或其他肿瘤的抗原)。
在本发明的第三方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)构建物，所述的嵌合抗原受体构建物的抗原结合区域的scFv段特异性结合于SCUBE2蛋白，并且所述scFv具有如本发明第一方面所述的重链可变区和轻链可变区。
在本发明的第四方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明第三方面所述的CAR构建物。
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在本发明的第五方面，提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明第一方面所述的抗体；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在本发明的第六方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第五方面所述的抗体偶联物、或其组合，其中所述活性成分被用于：
(a)制备诊断试剂、检测板或试剂盒；和/或
(b)制备预防和/或治疗与SCUBE2蛋白表达或功能异常相关的疾病的药物。
在另一优选例中，所述试剂用于检测SCUBE2蛋白。
在另一优选例中，所述试剂、检测板或试剂盒用于检测SCUBE2蛋白表达或功能异常相关的疾病。
在另一优选例中，所述试剂、检测板或试剂盒用于预测乳腺癌骨转移的风险。
在另一优选例中，所述药剂用于预防和/或治疗Hedgehog信号配体介导的肿瘤细胞转移。
在另一优选例中，所述的药剂用于预防和/或治疗抑制乳腺癌骨转移。
在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第四方面所述的免疫细胞、如本发明第五方面所述的抗体偶联物、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第四方面所述的免疫细胞、如本发明第五方面所述的抗体偶联物、或其组合和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于预防和/或治疗Hedgehog信号配体介导的肿瘤细胞转移。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于预防和/或治疗抑制乳腺癌骨转移。
在本发明的第八方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如本发明第一方面所述的抗体；
(2)如本发明第二方面所述的重组蛋白；或
(3)如本发明第三方面所述的嵌合抗原受体(CAR)构建物。
在本发明的第九方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第八方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明的第十方面，提供了一种工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第九方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第八方面所述的多核苷酸。
在本发明的第十一方面，提供了一种检测样品中SCUBE2蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)将所述样品与如本发明第一方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在SCUBE2蛋白。
在另一优选例中，所述检测为体外非治疗非诊断目的的。
在本发明的第十二方面，提供了一种体外检测样品中SCUBE2蛋白的组合物，其包括如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第五方面所述的抗体偶联物、本发明第四方面所述的免疫细胞、或其组合作为活性成分。
在本发明的第十三方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第五方面所述的抗体偶联物、本发明第四方面所述的免疫细胞、或其组合。
在本发明的第十四方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有如本发明第一方面所述的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗如本发明第一方面所述抗体的二抗；
或者，
所述试剂盒含有如本发明第十三方面所述的检测板。
在本发明的第十五方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第十方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明第一方面所述的抗体或如本发明第二方面所述的重组蛋白。
在本发明的第十六方面，提供了一种药物组合，包括：
(i)第一活性成分，所述第一活性成分包括如本发明第一方面所述的抗体、或如本发明第二方面所述的重组蛋白、或如本发明第四方面所述的免疫细胞、或如本发明第五方面所述的抗体偶联物、或如本发明第七方面所述的药物组合物、或其组合；
(ii)第二活性成分，所述第二活性成分包括Hedgehog信号抑制剂、抗雌激素药物或化疗剂。
在另一优选例中，所述Hedgehog信号抑制剂选自下组：SHH中和抗体或SMO抑制剂。
在另一优选例中，所述抗雌激素药物选自下组：他莫昔芬、卵巢功能抑制剂、芳香化酶抑制剂或其组合。
在另一优选例中，所述化疗剂选自下组：蒽环类(阿霉素、表阿霉素、柔红霉素和阿克拉霉)、紫杉类药物(紫杉醇、紫杉醇脂质体、白蛋白紫杉醇和多西他赛)或其组合。
在本发明的第十七方面，提供了如本发明第一方面所述的抗体，或本发明第二方面所述的重组蛋白、或本发明第五方面所述的抗体偶联物、或本发明第四方面所述的免疫细胞、和/或如本发明第七方面所述的药物组合物与Hedgehog信号抑制剂或化疗剂的组合在制备用于治疗SCUBE2蛋白表达或功能异常相关的疾病的药物中的用途。
在另一优选例中，所述的SCUBE2蛋白表达异常指SCUBE2蛋白过度表达。
在另一优选例中，所述的过度表达指SCUBE2蛋白的表达量(F1)与生理情况下表达量(F0)之比(即F1/F0)≥2.0，优选地≥3.0，更优选地≥5.0。
在另一优选例中，所述的药物用于预防和/或治疗肿瘤发生、生长和/或转移。
在另一优选例中，所述的药物用于预防和/或治疗乳腺癌骨转移。
在另一优选例中，所述Hedgehog信号抑制剂选自下组：SHH中和抗体或SMO抑制剂。
在本发明的第十八方面，提供了一种治疗与SCUBE2蛋白表达或功能异常相关的疾病的方法，向有需要的对象施用有效量的如本发明第一方面所述的抗体、或如本发明第二方面所述的重组蛋白、或如本发明第五方面所述的抗体偶联物、或如本发明第四方面所述的免疫细胞、或如本发明第十六方面所述的药物组合物、或其组合。
在另一优选例中，所述与SCUBE2蛋白表达或功能异常相关的疾病为癌症、中枢神经系统结核病、脑动静脉畸形。
在另一优选例中，所述治疗包括预防和/或治疗肿瘤转移。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：乳腺癌、黑色素瘤、肺癌。
在另一优选例中，所述肿瘤转移为Hedgehog信号介导的肿瘤转移。
在另一优选例中，所述肿瘤转移为骨转移。
在另一优选例中，所述的方法还包括：在施用第一活性成分之前、之中和/或之后，向所述对象施用安全有效量的第二活性成分。
在另一优选例中，所述的第二活性成分包括Hedgehog信号抑制剂、抗雌激素药物、或化疗剂。
在另一优选例中，所述Hedgehog信号抑制剂选自下组：SHH中和抗体或SMO抑制剂。
在另一优选例中，所述抗雌激素药物选自下组：他莫昔芬、卵巢功能抑制剂、芳香化酶抑制剂或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了SCUBE2单克隆抗体的纯化与鉴定。(图1A)注射杂交瘤细胞后的小鼠腹水以及腹水中纯化抗体的考马斯亮蓝染色图。(图1B)ELISA试剂盒鉴定SCUBE2单克隆抗体亚型。(图1C)在过表达SCUBE2的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中使用单克隆抗体检测SCUBE2表达情况。
图2显示了SCUBE2单克隆抗体体外抑制SCUBE2蛋白功能。(图2A)IgG或SCUBE2单克隆抗体处理后，MCF7细胞上清诱导GLI报告系统激活情况。(图2B)IgG或SCUBE2单克隆抗体处理后，MCF7细胞上清诱导成骨细胞分化情况。(图2C)不同浓度IgG或SCUBE2单克隆抗体处理后，MCF7细胞上清中SHH蛋白的表达情况。
图3显示了SCUBE2单克隆抗体的体内疗效。(图3A-B)左心室注射人乳腺癌细胞系后对照IgG或SCUBE2单克隆抗体处理组小鼠全身骨转移光信号及示意图(图3A)和体外骨组织转移光信号及示意图(图3B)。(图3C-D)左心室注射小鼠乳腺癌细胞系后对照组或SCUBE2单克隆抗体处理组小鼠全身骨转移光信号及示意图(图3C)和体外骨组织转移光信号及示意图(图3D)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地获得了一类SCUBE2的中和性单克隆抗体。本发明的中和抗体能够竞争性地结合SCUBE2蛋白，并且具有高亲和力。出乎意料的是，本发明的抗体不仅在体外可以抑制SCUBE2蛋白剪切释放SHH的能力，而且在体内可以抑制乳腺癌细胞介导的SHH释放以及由此引发的骨转移进程，因而本发明抗体具有治疗乳腺癌骨转移的前景。在此基础上，完成了本发明。
实验表明，本发明的SCUBE2中和抗体能够结合的SCUBE2蛋白的CUB功能区域，竞争性地阻断Hedgehog信号配体(如SHH蛋白)与SCUBE2蛋白中CUB结构域的结合，从而阻止Hedgehog信号介导的乳腺癌骨转移过程。
术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的针对呼吸道合胞病毒融合蛋白(较佳地融合前F蛋白)的抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。
SCUBE2
SCUBE2是一个进化上高度保守的蛋白，含有9个类EGF重复序列，三个富含半胱氨酸重复组件和一个CUB区域。SCUBE2是Hedgehog信号传导中的重要蛋白，负责剪切释放锚定在细胞膜上的Hedgehog信号配体，如SHH，从而使游离的SHH与Hedgehog受体结合，启动下游Hedgehog信号。研究发现SCUBE2的CUB区域在剪切释放SHH蛋白中发挥关键作用，缺失CUB区域的截短体蛋白不能与SHH蛋白结合同时无法将其从细胞膜上释放。前期研究发现SCUBE2在乳腺癌骨转移中发挥着重要作用，SCUBE2通过促进乳腺癌细胞释放SHH从而帮助癌细胞定植在骨微环境中。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
术语“抗体的抗原结合片段”(或简称“抗体片段”)是指抗体的保持特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。己显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语“抗体的抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过较链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab')2片段；抗体重链；抗体轻链。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个连续或非连续的氨基酸。表位可以是抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7M，例如大约小于10-8M、10-9M或l0-10M或更小的亲和力(KD)结合。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
SCUBE2抗体
如本文所用，术语“本发明的抗体”、“本发明的SCUBE2抗体”和“本发明的SCUBE2中和抗体”可互换使用，均指本发明第一方面中所述的结合SCUBE2蛋白的抗体。
本发明的抗体的功能是由此抗体轻链和重链可变区基因特异性基因序列决定。本发明的抗体可以竞争性地高亲和力地结合SCUBE2蛋白，竞争性地阻断Hedgehog信号配体(如SHH蛋白)与SCUBE2蛋白中CUB结构域的结合，从而进一步抑制Hedgehog信号介导的乳腺癌骨转移过程。利用本发明抗体的可变区基因或互补决定区(CDR)基因，可在利用原核和真核细胞的任何表达系统中改造和生产不同形式的基因工程抗体。
在本发明的第一方面，提供了一种结合SCUBE2蛋白的抗体，所述抗体特异性结合于SCUBE2蛋白的CUB结构域，并且，所述抗体能够竞争性地阻断Hedgehog信号配体与所述SCUBE2蛋白的结合，其中所述CUB结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的抗体包括重链和轻链，
其中，所述重链的可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:9、15或20所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO:10、16或21所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO:11、17或22所示的VH-CDR3；
并且，所述轻链的可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:12、18或23所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO:13或24所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO:14、19或25所示的VL-CDR3；
并且，上述CDR序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并使得含有所述衍生CDR序列的重链和轻链所构成的衍生抗体能够保留SCUBE2结合亲和力的衍生序列。
在本发明的一个优选实施方式中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
并且，所述的氨基酸序列还包括经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列，优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
较佳地，本文所述抗体为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)、单域抗体(singledomain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab'、(Fab')2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
本发明抗体可以是靶向SCUBE2(例如人SCUBE2)的嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
本发明上述内容中，更优选地，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，可以是1-7个，更优选为1-5个，更优选为1-3个，更优选为1-2个。
本发明的SCUBE2抗体能够切断肿瘤细胞释放SHH源头，同时，可以联用Hedgehog信号抑制剂，例如SHH中和抗体或SMO抑制剂，双管齐下抑制Hedgehog信号进而抑制肿瘤进程。
重组蛋白
本发明还提供一种重组蛋白，其包括本发明的抗体的重链CDR1(VH-CDR1)、重链CDR2(VH-CDR2)和重链CDR3(VH-CDR3)中的一种或多种，和/或，本发明SCUBE2的轻链CDR1(VL-CDR1)、轻链CDR2(VL-CDR2)和轻链CDR3(VL-CDR3)中的一种或多种。
较佳地，所述的重组蛋白还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区，所述的抗体重链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源抗体重链恒定区或人源抗体重链恒定区，更佳地为人源抗体重链恒定区。所述的抗体轻链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源轻链抗体恒定区或人源抗体轻链恒定区，更佳地为人源抗体轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的重组蛋白包括本发明的抗体。
所述的重组蛋白为本领域常规的蛋白质，较佳地，其为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibodyfragment，scFv)、单域抗体(single domain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domainantibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为本领域常规的抗原抗体结合域蛋白质片段，其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的Fd段。较佳地，所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为Fab和F(ab')。
所述的单域抗体为本领域常规的单域抗体，其包括重链可变区和重链恒定区。
所述的单区抗体为本领域常规的单区抗体，其仅包括重链可变区。
其中，所述重组蛋白的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为：从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述重组蛋白。
核酸
本发明还提供一种核酸，其编码上述的本发明的抗体或重组蛋白或本发明的的抗体的嵌合抗原受体(CAR)构建物。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
载体
本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或E.coli BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者HEK293或CHO细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
抗体的制备
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、HEK-293细胞。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)。
典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。
在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。
应用
本发明还提供了本发明抗体、抗体偶联物ADC、重组蛋白、嵌合抗原受体(CAR)构建物和/或免疫细胞的用途，例如用于制备诊断制剂或制备药物。
较佳地，所述的药物是用于预防和/或治疗与SCUBE2表达或功能异常相关的疾病的药物。
本发明中，所述与SCUBE2表达或功能异常相关的疾病是本领域常规的与SCUBE2表达或功能异常相关的疾病。较佳地，所述与SCUBE2表达或功能异常相关的疾病为癌症、中枢神经系统结核病和脑动静脉畸形。
本发明中，所述与SCUBE2表达或功能异常相关的疾病还包括癌症转移，较佳地，所述癌症转移为骨转移，例如乳腺癌骨转移。
本发明中，所述癌症为本领域常规的癌症，较佳地为乳腺癌、黑色素瘤、肺癌。
本发明的抗体能够有效地预防和/或减轻SCUBE2表达或功能异常导致的SHH过度释放，从而预防和/或治疗癌症骨转移。在已经观察到SHH过度释放的癌症中，本发明的抗体可以与SHH中和抗体、SMO抑制剂或其他任何具有Hedgehog信号抑制作用的治疗剂共同应用，以加强对癌症骨转移的抑制作用。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体或其ADC可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。典型地，本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、动脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明所述的药物组合物是用于预防和/或治疗与SCUBE2表达或功能异常相关的疾病的药物组合物。
本发明的药物组合物可直接用于结合SCUBE2蛋白分子，并阻断SCUBE2与SHH结合，抑制SHH释放，因而可用于预防和治疗肿瘤和肿瘤转移等疾病。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
在本发明的一个优选例中，本发明的多肽可以与Hedgehog信号抑制剂、抗雌激素药物或化疗剂等治疗和/或预防癌症和/或癌症转移的治疗剂联用。其中Hedgehog信号抑制剂可以是SHH中和抗体或SMO抑制剂；抗雌激素药物可以是他莫昔芬、卵巢功能抑制剂、芳香化酶抑制剂或其组合。化疗剂可以是蒽环类(阿霉素、表阿霉素、柔红霉素和阿克拉霉)、紫杉类药物(紫杉醇、紫杉醇脂质体、白蛋白紫杉醇和多西他赛)或其组合。
本发明中，较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提供上述药物组合物在制备预防和/或治疗与SCUBE2表达或功能异常相关的疾病的药物中的应用。较佳地，所述与SCUBE2表达或功能异常相关的疾病为癌症、中枢神经系统结核病和脑动静脉畸形。更佳地，所述与SCUBE2表达或功能异常相关的疾病为乳腺癌或乳腺癌骨转移。
检测样品中SCUBE2蛋白的方法、组合物
本发明还提供一种检测样品中SCUBE2蛋白(例如检测过表达SCUBE2细胞)的方法，包括如下的步骤：上述的抗体与待检样品在体外接触，检测上述的抗体与所述待检样品是否结合形成抗原-抗体复合物即可。
所述的过表达的含义为本领域常规，指SCUBE2蛋白在待检样品中的RNA或蛋白质的过表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工以及蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运送模式改变(核定位增加)而导致的局部过表达和功能活性提高(如在底物的酶水解作用增加的情况下)。
本发明中，上述是否结合形成抗原-抗体复合物的检测方式是本领域常规的检测方式，较佳地为流式细胞实验(FACS)检测。
本发明提供一种检测样品中SCUBE2蛋白的组合物，其包括上述的抗体、重组蛋白、抗体偶联物、免疫细胞、或其组合作为活性成分。较佳地，其还包括上述的抗体的功能片段组成的化合物作为活性成分。
本发明的主要优点包括：
1)本发明的抗体能够竞争性地结合SCUBE2蛋白，阻止SCUBE2蛋白与SHH结合，在体外可以抑制SCUBE2蛋白剪切释放SHH的能力，体内可以显著抑制乳腺癌细胞介导的SHH释放以及由此引发的骨转移进程，具有治疗乳腺癌骨转移的前景。
2)本发明的SCUBE2中和抗体对于除乳腺癌骨转移外的其他高表达SCUBE2并启动下游Hedgehog信号的肿瘤也具备治疗潜力，具有相应的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1 SCUBE2单克隆抗体的筛选
在本实施例中，筛选了针对人SCUBE2蛋白的鼠源单克隆中和抗体。
本实施例从人乳腺癌细胞MCF7中克隆出SCUBE2的全长序列(SEQ ID NO：1)，选取NCBI中注释的SCUBE2全长序列中的CUB功能区域(809-918aa SEQ ID NO：2)构建到pGEX4T-AB1载体上，原核系统表达纯化蛋白。
SCUBE2全长序列：
MGVAGRNRPGAAWAVLLLLLLLPPLLLLAGAVPPGRGRAAGPQEDVDECAQGLDDCHADALCQNTPTSYKCSCKPGYQGEGRQCEDIDECGNELNGGCVHDCLNIPGNYRCTCFDGFMLAHDGHNCLDVDECLENNGGCQHTCVNVMGSYECCCKEGFFLSDNQHTCIHRSEEGLSCMNKDHGCSHICKEAPRGSVACECRPGFELAKNQRDCILTCNHGNGGCQHSCDDTADGPECSCHPQYKMHTDGRSCLEREDTVLEVTESNTTSVVDGDKRVKRRLLMETCAVNNGGCDRTCKDTSTGVHCSCPVGFTLQLDGKTCKDIDECQTRNGGCDHFCKNIVGSFDCGCKKGFKLLTDEKSCQDVDECSLDRTCDHSCINHPGTFACACNRGYTLYGFTHCGDTNECSINNGGCQQVCVNTVGSYECQCHPGYKLHWNKKDCVEVKGLLPTSVSPRVSLHCGKSGGGDGCFLRCHSGIHLSSDVTTIRTSVTFKLNEGKCSLKNAELFPEGLRPALPEKHSSVKESFRYVNLTCSSGKQVPGAPGRPSTPKEMFITVEFELETNQKEVTASCDLSCIVKRTEKRLRKAIRTLRKAVHREQFHLQLSGMNLDVAKKPPRTSERQAESCGVGQGHAENQCVSCRAGTYYDGARERCILCPNGTFQNEEGQMTCEPCPRPGNSGALKTPEAWNMSECGGLCQPGEYSADGFAPCQLCALGTFQPEAGRTSCFPCGGGLATKHQGATSFQDCETRVQCSPGHFYNTTTHRCIRCPVGTYQPEFGKNNCVSCPGNTTTDFDGSTNITQCKNRRCGGELGDFTGYIESPNYPGNYPANTECTWTINPPPKRRILIVVPEIFLPIEDDCGDYLVMRKTSSSNSVTTYETCQTYERPIAFTSRSKKLWIQFKSNEGNSARGFQVPYVTYDEDYQELIEDIVRDGRLYASENHQEILKDKKLIKALFDVLAHPQNYFKYTAQESREMFPRSFIRLLRSKVSRFLRPYK(SEQ ID NO:1)
CUB结构域(SEQ ID NO:1的809-918aa)
CGGELGDFTGYIESPNYPGNYPANTECTWTINPPPKRRILIVVPEIFLPIEDDCGDYLVMRKTSSSNSVTTYETCQTYERPIAFTSRSKKLWIQFKSNEGNSARGFQVPY(SEQ ID NO:2)
使用纯化后的重组CUB结构域蛋白作为抗原，免疫Balb/C小鼠。3次免疫之后对小鼠血清进行ELISA检测与抗原的结合能力，获得有抗SCUBE2免疫球蛋白滴度的小鼠。同时使用人源重组SHH蛋白作为SCUBE2功能检测的竞争结合蛋白，与抗原蛋白一起进行血清的竞争ELISA检测，选择检测效果最佳的2只小鼠处死后取出脾与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。
将融合后的杂交瘤细胞进行抗体筛选，同时使用人源重组SHH蛋白进行杂交瘤细胞上清的竞争ELISA检测。选取阳性单克隆进行后续两次亚克隆，最后筛选得到3个阳性鼠单抗，分别命名为LTMA1F1、LTMA16D5和LTMA24C10。
实施例2 SCUBE2单克隆抗体与CUB结构域结合能力测定
在本实施例中，检测了实施例1中筛选到的SCUBE2单克隆抗体LTMA1F1、LTMA16D5和LTMA24C10与CUB结构域(SCUBE2蛋白809-918aa)结合的能力。
首先使用CUB结构域抗原蛋白包被96孔酶标板，加入杂交瘤细胞上清后室温孵育2小时。清洗3次后加入与小鼠抗体结合的山羊二抗，室温孵育1小时。清洗3次后加入反应底物，反应5-10分钟后终止，并立即使用酶标仪检测450nM处的吸收光信号。
结果：如表1所示，相比较于阴性对照和空白对照组，本发明筛选到的3株SCUBE2鼠单克隆抗体均与SCUBE2蛋白中的CUB结构域有着较强的结合能力。
表1：SCUBE2单克隆抗体与CUB结构域的结合能力
SCUBE2鼠单克隆抗体 450nM吸收值
LTMA1F1 1.268
LTMA16D5 1.279
LTMA24C10 0.695
阴性对照 0.067
空白对照 0.061
实施例3 SCUBE2鼠单克隆抗体阻断SCUBE2的蛋白功能
在本实施例中，检测了实施例1中所筛选到的3株SCUBE2鼠单克隆抗体LTMA1F1、LTMA16D5和LTMA24C10是否能阻断SCUBE2的蛋白功能。
由于SCUBE2蛋白的CUB结构域会与SHH蛋白进行结合，从而发挥剪切并释放SHH的功能。实施例1中筛选的抗体若能竞争性地阻断CUB结构域与SHH蛋白的结合，则可以抑制SCUBE2蛋白剪切释放SHH的能力。
本实施例中首先采取竞争ELISA实验进行验证。使用SCUBE2抗原蛋白包被96孔酶标板，加入杂交瘤细胞上清以及不同浓度的竞争蛋白SHH室温孵育2小时，阴性对照为加入商品化的SCUBE2抗体(该抗体识别位点为非CUB区域)的竞争结合结果。清洗3次后加入与小鼠抗体结合的山羊二抗，室温孵育1小时。清洗3次后加入反应底物，反应5-10分钟后终止，并立即使用酶标仪检测450nM处的吸收光信号。
结果：不同抗体与SHH蛋白竞争性结合SCUBE2蛋白的情况如表2所示。
表2：SCUBE2单克隆抗体和SHH蛋白竞争性结合SCUBE2蛋白
Figure BDA0003427493640000251
SHH蛋白与SCUBE2蛋白的CUB区域特异性结合。表2显示，随着体系中加入的竞争蛋白SHH的浓度增加，抗体识别位点为非CUB区域的阴性对照抗体与SCUBE2的结合情况无明显变化，而本发明的筛选到的三株SCUBE2鼠单克隆抗体与CUB结构域的结合均逐渐减弱。
这提示，这三株SCUBE2鼠单克隆抗体与SCUBE2的结合位点均为SHH蛋白与SCUBE2蛋白的结合位点，因此具备竞争性地阻断SHH蛋白与SCUBE2蛋白的结合的能力。
实施例4 SCUBE2单克隆抗体
在本实施例中，对产生上述三个抗体的阳性杂交瘤细胞进行二代测序，测得抗体可变区序列对应氨基酸序列如表3所示。
表3本发明抗体可变区序列
Figure BDA0003427493640000261
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，底线为CDR序列。
抗体重链及轻链CDR区对应氨基酸序列如表4所示。
表4各重链及轻链CDR区序列
Figure BDA0003427493640000271
实施例5 SCUBE2单克隆抗体纯化及亚型检测
在本实施例中进行了抗体的收集纯化。首先将200万个杂交瘤细胞注射入提前致敏的Balb/C小鼠腹腔中，观察7-14天后，处死小鼠收集腹水，使用Protein G抗体亲和柱纯化得到高浓度的SCUBE2单克隆抗体。随后利用考马斯亮蓝染色检测所得到的抗体纯度。在考马斯亮蓝染色结果中观察到不同单克隆抗体的重轻链条带位置大小有所差异，使用抗体亚型鉴定ELISA试剂盒检测抗体亚型。
结果：纯化后蛋白泳道出现清晰的抗体重轻链条带，并且无杂带，说明所得抗体纯度高(图1A)。检测到抗体LTMA1F1和LTMA16D5属于IgG1类型，抗体LTMA24C10属于IgM亚型(图1B)。
实施例6 SCUBE2单克隆抗体的结合特异性检测
为了检测本发明筛选得到的单克隆抗体的结合特异性，本实施例中利用免疫印迹实验(western blot)检测了本发明中三株SCUBE2鼠单克隆抗体LTMA1F1、LTMA16D5和LTMA24C10对乳腺癌细胞中全长SCUBE2蛋白的识别情况。
结果：在过表达SCUBE2的蛋白泳道中，SCUBE2单克隆抗体均展现出准确特异的识别效果(图1C)。说明本发明得到的SCUBE2单克隆抗体对人全长SCUBE2蛋白有着较高的识别特异性。
实施例7 SCUBE2单克隆抗体的体外中和效果
在本实施例中，检测SCUBE2单克隆抗体对CUB区域的体外中和效果。
SCUBE2单抗处理后抑制MCF7细胞上清诱导的GLI报告系统激活
SCUBE2中和抗体是通过竞争性地与SCUBE2的功能结构域CUB区域结合，从而阻碍SHH与SCUBE2的结合，封闭SCUBE2剪切释放SHH的能力。本领域常用GLI报告系统来检测细胞SHH的释放水平。因此，本实施例中采用体外GLI报告系统启动实验来检测SCUBE2抗体对肿瘤细胞释放SHH的影响。
将SCUBE2单克隆抗体与乳腺癌细胞MCF7共孵育24小时后，收集癌细胞的上清悬液，用于处理转入GLI报告系统的靶细胞MC3T3。
结果：相较于空白组DMEM，对照IgG处理组的乳腺癌上清明显启动了GLI报告系统，而加入SCUBE2单克隆抗体后，MCF7细胞上清诱导GLI启动的能力受到明显抑制(图2A)。说明SCUBE2单克隆抗体抑制了乳腺癌细胞释放SHH到胞外。
SCUBE2单抗处理后抑制MCF7细胞上清诱导的成骨细胞分化
SHH会显著促进成骨细胞分化，表现为ALP酶活的上调。在本实施例中从通过检验ALP酶活来检测SCUBE2单克隆抗体对肿瘤细胞释放SHH的影响。分别收集对照IgG和SCUBE2抗体处理后的MCF7细胞上清，体外诱导成骨细胞分化实验。
结果：对照IgG处理组MCF7上清明显促进了成骨细胞中ALP的酶活水平，说明乳腺癌细胞释放了高水平的SHH，可以启动成骨细胞分化。而SCUBE2单克隆抗体处理组均抑制了乳腺癌细胞诱导成骨细胞分化的程度(图2B)，说明本发明中的三株中和抗体均可抑制乳腺癌细胞SHH的释放，从而抑制肿瘤细胞诱导的成骨分化情况。
不同浓度SCUBE2单抗处理后乳腺癌细胞上清中SHH的表达
本实施例还检测了不同的SCUBE2单克隆抗体浓度处理后，乳腺癌细胞上清中SHH的表达。
结果：显示随着加入SCUBE2单克隆抗体的浓度增加，乳腺癌细胞释放到胞外的SHH含量越低(图2C)。
本实施例的结果证明，本发明中的三个SCUBE2单克隆抗体LTMA1F1、LTMA16D5和LTMA24C10均能体外抑制SCUBE2蛋白对SHH的剪切释放，起到中和SCUBE2蛋白功能的效果。
实施例8 SCUBE2单克隆抗体对乳腺癌骨转移的抑制
本实施例中检测了SCUBE2单克隆抗体在体内是否具有抑制乳腺癌骨转移的效果。
将带有荧光素酶标记的MCF7人乳腺癌细胞注射入免疫缺陷小鼠后，注射荧光素酶底物，观察与转移负荷相应的光信号。结果显示尾静脉注射SCUBE2单克隆抗体可以显著抑制小鼠体内乳腺癌的骨转移(图3A、B)。
将带有荧光素酶标记的4T1.2小鼠乳腺癌细胞左心室注射入Balb/C小鼠中。结果显示在免疫正常小鼠中，腹腔注射SCUBE2单克隆抗体同样可以明显抑制骨转移信号(图3C、D)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海营养与健康研究所
<120> SCUBE2中和抗体及其医药用途
<130> P2021-2822
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 999
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Gly Val Ala Gly Arg Asn Arg Pro Gly Ala Ala Trp Ala Val Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Leu Ala Gly Ala Val
20 25 30
Pro Pro Gly Arg Gly Arg Ala Ala Gly Pro Gln Glu Asp Val Asp Glu
35 40 45
Cys Ala Gln Gly Leu Asp Asp Cys His Ala Asp Ala Leu Cys Gln Asn
50 55 60
Thr Pro Thr Ser Tyr Lys Cys Ser Cys Lys Pro Gly Tyr Gln Gly Glu
65 70 75 80
Gly Arg Gln Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gly Asn Glu Leu Asn Gly
85 90 95
Gly Cys Val His Asp Cys Leu Asn Ile Pro Gly Asn Tyr Arg Cys Thr
100 105 110
Cys Phe Asp Gly Phe Met Leu Ala His Asp Gly His Asn Cys Leu Asp
115 120 125
Val Asp Glu Cys Leu Glu Asn Asn Gly Gly Cys Gln His Thr Cys Val
130 135 140
Asn Val Met Gly Ser Tyr Glu Cys Cys Cys Lys Glu Gly Phe Phe Leu
145 150 155 160
Ser Asp Asn Gln His Thr Cys Ile His Arg Ser Glu Glu Gly Leu Ser
165 170 175
Cys Met Asn Lys Asp His Gly Cys Ser His Ile Cys Lys Glu Ala Pro
180 185 190
Arg Gly Ser Val Ala Cys Glu Cys Arg Pro Gly Phe Glu Leu Ala Lys
195 200 205
Asn Gln Arg Asp Cys Ile Leu Thr Cys Asn His Gly Asn Gly Gly Cys
210 215 220
Gln His Ser Cys Asp Asp Thr Ala Asp Gly Pro Glu Cys Ser Cys His
225 230 235 240
Pro Gln Tyr Lys Met His Thr Asp Gly Arg Ser Cys Leu Glu Arg Glu
245 250 255
Asp Thr Val Leu Glu Val Thr Glu Ser Asn Thr Thr Ser Val Val Asp
260 265 270
Gly Asp Lys Arg Val Lys Arg Arg Leu Leu Met Glu Thr Cys Ala Val
275 280 285
Asn Asn Gly Gly Cys Asp Arg Thr Cys Lys Asp Thr Ser Thr Gly Val
290 295 300
His Cys Ser Cys Pro Val Gly Phe Thr Leu Gln Leu Asp Gly Lys Thr
305 310 315 320
Cys Lys Asp Ile Asp Glu Cys Gln Thr Arg Asn Gly Gly Cys Asp His
325 330 335
Phe Cys Lys Asn Ile Val Gly Ser Phe Asp Cys Gly Cys Lys Lys Gly
340 345 350
Phe Lys Leu Leu Thr Asp Glu Lys Ser Cys Gln Asp Val Asp Glu Cys
355 360 365
Ser Leu Asp Arg Thr Cys Asp His Ser Cys Ile Asn His Pro Gly Thr
370 375 380
Phe Ala Cys Ala Cys Asn Arg Gly Tyr Thr Leu Tyr Gly Phe Thr His
385 390 395 400
Cys Gly Asp Thr Asn Glu Cys Ser Ile Asn Asn Gly Gly Cys Gln Gln
405 410 415
Val Cys Val Asn Thr Val Gly Ser Tyr Glu Cys Gln Cys His Pro Gly
420 425 430
Tyr Lys Leu His Trp Asn Lys Lys Asp Cys Val Glu Val Lys Gly Leu
435 440 445
Leu Pro Thr Ser Val Ser Pro Arg Val Ser Leu His Cys Gly Lys Ser
450 455 460
Gly Gly Gly Asp Gly Cys Phe Leu Arg Cys His Ser Gly Ile His Leu
465 470 475 480
Ser Ser Asp Val Thr Thr Ile Arg Thr Ser Val Thr Phe Lys Leu Asn
485 490 495
Glu Gly Lys Cys Ser Leu Lys Asn Ala Glu Leu Phe Pro Glu Gly Leu
500 505 510
Arg Pro Ala Leu Pro Glu Lys His Ser Ser Val Lys Glu Ser Phe Arg
515 520 525
Tyr Val Asn Leu Thr Cys Ser Ser Gly Lys Gln Val Pro Gly Ala Pro
530 535 540
Gly Arg Pro Ser Thr Pro Lys Glu Met Phe Ile Thr Val Glu Phe Glu
545 550 555 560
Leu Glu Thr Asn Gln Lys Glu Val Thr Ala Ser Cys Asp Leu Ser Cys
565 570 575
Ile Val Lys Arg Thr Glu Lys Arg Leu Arg Lys Ala Ile Arg Thr Leu
580 585 590
Arg Lys Ala Val His Arg Glu Gln Phe His Leu Gln Leu Ser Gly Met
595 600 605
Asn Leu Asp Val Ala Lys Lys Pro Pro Arg Thr Ser Glu Arg Gln Ala
610 615 620
Glu Ser Cys Gly Val Gly Gln Gly His Ala Glu Asn Gln Cys Val Ser
625 630 635 640
Cys Arg Ala Gly Thr Tyr Tyr Asp Gly Ala Arg Glu Arg Cys Ile Leu
645 650 655
Cys Pro Asn Gly Thr Phe Gln Asn Glu Glu Gly Gln Met Thr Cys Glu
660 665 670
Pro Cys Pro Arg Pro Gly Asn Ser Gly Ala Leu Lys Thr Pro Glu Ala
675 680 685
Trp Asn Met Ser Glu Cys Gly Gly Leu Cys Gln Pro Gly Glu Tyr Ser
690 695 700
Ala Asp Gly Phe Ala Pro Cys Gln Leu Cys Ala Leu Gly Thr Phe Gln
705 710 715 720
Pro Glu Ala Gly Arg Thr Ser Cys Phe Pro Cys Gly Gly Gly Leu Ala
725 730 735
Thr Lys His Gln Gly Ala Thr Ser Phe Gln Asp Cys Glu Thr Arg Val
740 745 750
Gln Cys Ser Pro Gly His Phe Tyr Asn Thr Thr Thr His Arg Cys Ile
755 760 765
Arg Cys Pro Val Gly Thr Tyr Gln Pro Glu Phe Gly Lys Asn Asn Cys
770 775 780
Val Ser Cys Pro Gly Asn Thr Thr Thr Asp Phe Asp Gly Ser Thr Asn
785 790 795 800
Ile Thr Gln Cys Lys Asn Arg Arg Cys Gly Gly Glu Leu Gly Asp Phe
805 810 815
Thr Gly Tyr Ile Glu Ser Pro Asn Tyr Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Asn
820 825 830
Thr Glu Cys Thr Trp Thr Ile Asn Pro Pro Pro Lys Arg Arg Ile Leu
835 840 845
Ile Val Val Pro Glu Ile Phe Leu Pro Ile Glu Asp Asp Cys Gly Asp
850 855 860
Tyr Leu Val Met Arg Lys Thr Ser Ser Ser Asn Ser Val Thr Thr Tyr
865 870 875 880
Glu Thr Cys Gln Thr Tyr Glu Arg Pro Ile Ala Phe Thr Ser Arg Ser
885 890 895
Lys Lys Leu Trp Ile Gln Phe Lys Ser Asn Glu Gly Asn Ser Ala Arg
900 905 910
Gly Phe Gln Val Pro Tyr Val Thr Tyr Asp Glu Asp Tyr Gln Glu Leu
915 920 925
Ile Glu Asp Ile Val Arg Asp Gly Arg Leu Tyr Ala Ser Glu Asn His
930 935 940
Gln Glu Ile Leu Lys Asp Lys Lys Leu Ile Lys Ala Leu Phe Asp Val
945 950 955 960
Leu Ala His Pro Gln Asn Tyr Phe Lys Tyr Thr Ala Gln Glu Ser Arg
965 970 975
Glu Met Phe Pro Arg Ser Phe Ile Arg Leu Leu Arg Ser Lys Val Ser
980 985 990
Arg Phe Leu Arg Pro Tyr Lys
995
<210> 2
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Cys Gly Gly Glu Leu Gly Asp Phe Thr Gly Tyr Ile Glu Ser Pro Asn
1 5 10 15
Tyr Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Asn Thr Glu Cys Thr Trp Thr Ile Asn
20 25 30
Pro Pro Pro Lys Arg Arg Ile Leu Ile Val Val Pro Glu Ile Phe Leu
35 40 45
Pro Ile Glu Asp Asp Cys Gly Asp Tyr Leu Val Met Arg Lys Thr Ser
50 55 60
Ser Ser Asn Ser Val Thr Thr Tyr Glu Thr Cys Gln Thr Tyr Glu Arg
65 70 75 80
Pro Ile Ala Phe Thr Ser Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Gln Phe Lys
85 90 95
Ser Asn Glu Gly Asn Ser Ala Arg Gly Phe Gln Val Pro Tyr
100 105 110
<210> 3
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ile Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Lys Leu Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Gly His Thr Ser Tyr Asn Pro Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Glu Lys Tyr Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Gly Arg Phe Thr Pro Val Val Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala
85 90 95
Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Ser Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Tyr Thr Phe Thr Ile Tyr Asn
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ile Tyr Pro Gly Asp Gly His Thr
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ala Arg Leu Glu Lys Tyr Thr Asp Tyr
1 5
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Ser Leu Leu Ala Ser Asp Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Leu Val Ser
1
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro
1 5
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gly Arg Phe Thr Pro Val Val Glu Asp Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Val Gln Ala Thr His Phe Pro His Thr
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr
1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr
1 5
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Ala Arg Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 24
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Tyr Ala Ser
1
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Trp Thr
1 5

Claims (10)

1.一种结合SCUBE2蛋白的抗体，其特征在于，所述抗体特异性结合于SCUBE2蛋白的CUB结构域，并且，所述抗体能够竞争性地阻断Hedgehog信号配体与所述SCUBE2蛋白的结合，
其中所述CUB结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包括重链和轻链，
其中，所述重链的可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
氨基酸序列如SEQ ID NO:9、15或20所示的VH-CDR1，
氨基酸序列如SEQ ID NO:10、16或21所示的VH-CDR2，和
氨基酸序列如SEQ ID NO:11、17或22所示的VH-CDR3；
并且，所述轻链的可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
氨基酸序列如SEQ ID NO:12、18或23所示的VL-CDR1，
氨基酸序列如SEQ ID NO:13或24所示的VL-CDR2，和
氨基酸序列如SEQ ID NO:14、19或25所示的VL-CDR3。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
VH1)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的VH-CDR1，SEQ ID NO:10所示的VH-CDR2，和SEQID NO:11所示的VH-CDR3；
VH2)氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的VH-CDR1，SEQ ID NO:16所示的VH-CDR2，和SEQID NO:17所示的VH-CDR3；或
VH3)氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的VH-CDR1，SEQ ID NO:21所示的VH-CDR2，和EQID NO:22所示的VH-CDR3。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
VL1)氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的VL-CDR1，SEQ ID NO:13所示的VL-CDR2，和SEQID NO:14所示的VL-CDR3；
VL2)氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的VL-CDR1，SEQ ID NO:13所示的VL-CDR2，和SEQID NO:19所示的VL-CDR3；和
VL3)氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的VL-CDR1，SEQ ID NO:24所示的VL-CDR2，和SEQID NO:25所示的VL-CDR3。
5.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:3、5或7所示的氨基酸序列，和/或所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:4、6或8所示的氨基酸序列。
6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白包括：
(i)如权利要求1所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
7.一种嵌合抗原受体(CAR)构建物，其特征在于，所述的嵌合抗原受体构建物的抗原结合区域的scFv段特异性结合于SCUBE2蛋白，并且所述scFv具有如权利要求1所述的抗体的重链可变区和轻链可变区。
8.一种重组的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞表达外源的如权利要求7所述的CAR构建物。
9.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的抗体；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
10.一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求6所述的重组蛋白、如权利要求9所述的抗体偶联物、或其组合，其中所述活性成分被用于：
(a)制备诊断试剂、检测板或试剂盒；和/或
(b)制备预防和/或治疗与SCUBE2蛋白表达或功能异常相关的疾病的药物。
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