CN111233990B - 人参cle家族多肽及其在植物根生长发育调控中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人参CLE家族多肽及其在植物根生长发育调控中的应用。本发明提供的多肽：(a)PgCLE45多肽：如序列表的序列1所示；(b)PgCLE12多肽：如序列表的序列2所示；(c)PgCLE25多肽：如序列表的序列3所示；(d)PgCLE27多肽：如序列表的序列4所示。本发明还保护以上任一所述多肽在抑制植物的根尖细胞增殖中的应用、在促进植物的根分化中的应用、在降低植物的根分生区的长度中的应用、在降低植物的根长中的应用、在降低植物的根分支数中的应用。人参CLE多肽作为植物多肽类激素，具有很好的研究潜能和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及人参CLE家族多肽及其在植物根生长发育调控中的应用。
背景技术
CLE(CLAVATA3/Embryo surrounding region-related)是近十年来研究最热的植物多肽，也是迄今为止最大的植物多肽分子家族，主要通过编码一小段分泌蛋白来参与细胞间的信号转导，进而在植物生长发育过程中维持干细胞增殖与分化间的平衡。目前为止，CLE多肽已被发现对种子发育、维管束形成、侧根生长、茎顶端和根顶端分生组织中干细胞分裂与分化之间的平衡等方面起着关键的作用。CLE多肽在拟南芥与水稻中有较深入研究，而药用植物中CLE多肽激素的研究尚属空白。
人参为五加科多年生草本植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根与根茎，被冠以“百草之王”的美誉，是我国出口额最大的中药材品种之一。由于人参具有丰富的根型，且不同根型市场价格差异极大，因此人参生长发育的研究非常重要。由于CLE多肽对根的生长发育具有重要调控作用，促进干细胞分化，促进组织器官形成，对人参根中CLE的研究将有助于阐释人参根的生长发育，为调控不同根型提供指导。但至今尚未有任何关于人参CLE基因及CLE多肽的报道，也未见到任何关于人参CLE家族多肽对植物可能的调控作用。
发明内容
本发明的目的是提供人参CLE家族多肽及其在植物根生长发育调控中的应用。
本发明提供的多肽，为如下(a)、(b)、(c)或(d)：
(a)PgCLE45多肽：如序列表的序列1所示(氨基酸序列：RRVRRGSDPIHN)；
(b)PgCLE12多肽：如序列表的序列2所示(氨基酸序列RLVPTGPNPLHH)；
(c)PgCLE25多肽：如序列表的序列3所示(氨基酸序列RRVPNGPDPIHN)；
(d)PgCLE27多肽：如序列表的序列4所示(氨基酸序列RRVPSCPDPLHN)。
本发明还保护以上任一所述多肽在抑制植物的根尖细胞增殖中的应用。
所述根尖细胞为不定根根尖细胞。
本发明还保护以上任一所述多肽在促进植物的根分化中的应用。
所述根分化为初生根根分化。
本发明还保护以上任一所述多肽在降低植物的根分生区的长度中的应用。
所述根分生区为初生根根分生区。
本发明还保护以上任一所述多肽在降低植物的根长中的应用。
所述根长为初生根根长。
本发明还保护以上任一所述多肽在降低植物的根分支数中的应用。
所述根分支数为初生根根分支数。
本发明还保护以上任一所述多肽在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(e1)和/或(e2)和/或(e3)和/或(e4)和/或(e5)：
(e1)抑制植物的根尖细胞增殖；
(e2)促进植物的根分化；
(e3)降低植物的根分生区的长度；
(e4)降低植物的根长；
(e5)降低植物的根分支数。
所述根尖细胞为不定根根尖细胞。
所述根分生区为初生根根分生区。
所述根分化为初生根根分化。
所述根长为初生根根长。
所述根分支数为初生根根分支数。
本发明还保护一种产品，包括以上任一所述多肽；所述产品的功能为如下(e1)和/或(e2)和/或(e3)和/或(e4)和/或(e5)：
(e1)抑制植物的根尖细胞增殖；
(e2)促进植物的根分化；
(e3)降低植物的根分生区的长度；
(e4)降低植物的根长；
(e5)降低植物的根分支数。
所述根尖细胞为不定根根尖细胞。
所述根分生区为初生根根分生区。
所述根分化为初生根根分化。
所述根长为初生根根长。
所述根分支数为初生根根分支数。
以上任一所述植物为双子叶植物。
所述双子叶植物为人参属植物或拟南芥属植物。
所述人参属植物具体可为人工种植人参。
所述人参属植物具体可为大马牙人参。
所述拟南芥属植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。
本发明公开了4种人参CLE家族功能性多肽。所述4种人参CLE多肽在植物根生长发育中的调控应用，具有抑制初生根长、促进初生根分化的作用。本发明填补了药用植物中CLE多肽的应用空白。人参CLE多肽作为植物多肽类激素，具有很好的研究潜能和广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例2的结果。
图2为实施例3的结果。
图3为实施例4的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、4种人参CLE多肽的发现
一、获得4个人参CLE基因
采用本地Local BLAST方法，调取人参转录组中与拟南芥CLE1-CLE45基因序列相似度高的序列(Expectation Value＝0.001)，筛选根中特异表达的CLE序列后，采用ORFFinder软件寻找到具有完整ORF框的基因序列，进行PCR引物设计。
取人参根的样品用液氮研磨粉碎，采用TRIzol法提取总RNA，并用1％琼脂糖凝胶电泳确定RNA完整性，核酸/蛋白定量仪测定RNA含量。采用Takara反转录试剂盒法(M-MLVRTase cDNA Synthesis Kit)合成cDNA。以cDNA为模板，采用设计的引物进行PCR扩增，得到PCR产物。
二、4个人参CLE基因的表达分析
将步骤一得到的核酸序列成功比对到不同年份吉林的林下参转录组数据库，调取其转录本表达数据，运用Heml软件(Heatmap Illustrator,version 1.0)对基因表达进行热图分析。发现：不同基因具有各自的表达特征。
三、发现并合成4个人参CLE多肽
CLE家族蛋白N端为信号肽，C端12个多肽为CLE domain，也是行使功能的关键信号分子。根据C端12个多肽结构特征，获得4个人参CLE多肽。
4个人参CLE多肽的氨基酸序列如下：
PgCLE12多肽(序列表的序列2)：RLVPTGPNPLHH；
PgCLE25多肽(序列表的序列3)：RRVPNGPDPIHN；
PgCLE27多肽(序列表的序列4)：RRVPSCPDPLHN；
PgCLE45多肽(序列表的序列1)：RRVRRGSDPIHN。
分别人工合成4个人参CLE多肽。
四、制备2个对照人参多肽
PgCLE3多肽：RLSPGGPEPKHH；
PgCLE5多肽：RVAPAGPNSQHN。
分别人工合成2个人参CLE多肽。
实施例2、人参CLE多肽可以调控拟南芥根长与根分支
供试多肽：PgCLE12多肽、PgCLE25多肽、PgCLE27多肽、PgCLE45多肽、PgCLE3多肽或PgCLE5多肽。
1、取哥伦比亚生态型拟南芥种子，用75％乙醇水溶液浸泡3min，然后用灭菌去离子水洗10遍。
2、分组处理：
第一组(Mock组)：取完成步骤1的种子，播种于1/2MS培养基平板，22±2℃、光照培养9天；
第二组(PgCLE3组)：取完成步骤1的种子，播种于含1μM PgCLE3多肽的1/2MS培养基平板，22±2℃、光照培养9天；
第三组(PgCLE5组)：取完成步骤1的种子，播种于含1μM PgCLE5多肽的1/2MS培养基平板，22±2℃、光照培养9天；
第四组(PgCLE12组)：取完成步骤1的种子，播种于含1μM PgCLE12多肽的1/2MS培养基平板，22±2℃、光照培养9天；
第五组(PgCLE25组)：取完成步骤1的种子，播种于含1μM PgCLE25多肽的1/2MS培养基平板，22±2℃、光照培养9天；
第六组(PgCLE27组)：取完成步骤1的种子，播种于含1μM PgCLE27多肽的1/2MS培养基平板，22±2℃、光照培养9天；
第七组(PgCLE45组)：取完成步骤1的种子，播种于含1μM PgCLE45多肽的1/2MS培养基平板，22±2℃、光照培养9天；
每组处理设置30粒种子以上的生物学重复。
3、完成步骤2后，拍照，用游标卡尺测量初生根根长，统计初生根上的侧根数作为根分支数。
照片见图1(a)，初生根根长平均值见图1(b)，根分支数平均值见图1(c)。
与Mock组相比，PgCLE3多肽和PgCLE5多肽对初生根根长及根分支数没有影响，PgCLE45多肽、PgCLE12多肽、PgCLE25多肽和PgCLE27多肽均可以显著抑制初生根根长，PgCLE45多肽、PgCLE12多肽和PgCLE25多肽均可以显著抑制根分支数。
实施例3、人参CLE多肽可以促进拟南芥初生根分化
实施例3中完成步骤2后，取植株的初生根，使用双光子激光共聚焦显微镜LSM880对初生根的分生区进行观察并拍照，对分生区长度进行检测。
照片见图2(a)，初生根分生区长度平均值见图2(b)。
与Mock组相比，PgCLE3多肽和PgCLE5多肽对初生根分化没有影响，PgCLE45多肽、PgCLE12多肽、PgCLE25多肽和PgCLE27多肽均可以显著抑制初生根分生区的长度，促进成熟区提早形成，尤其以PgCLE45多肽的促进分化作用最明显。
实施例4、人参CLE多肽对人参不定根的根尖细胞增殖的调控
实施例中所用的人参为大马牙人参，产地为吉林抚松。参考文献：国产人参种质资源研究进展，马小军、汪小全、肖培根、洪德元，中国药学杂志2000年5月第35卷第5期，289-292。
一、人参不定根的获得
1、取大马牙人参的种子，用70％乙醇水溶液浸泡3min，然后用1％次氯酸钠溶液浸泡30min，然后用灭菌的去离子水洗五遍以上。
2、取完成步骤1的种子，去除种皮，取出种胚，置于含1.0mg·L-1 6-BA的MS培养基平板，培养，获得无菌苗。培养条件：静置、25±2℃、16h光照/8h黑暗。
3、取步骤2得到的无菌苗，取根，将根切成1.0cm长的根段。
4、取步骤3得到的根段(作为诱导不定根的外植体)，置于含3.0mg·L-1IBA的MS培养基平板，培养4周，此时在外植体上形成了不定根。培养条件：静置、25±2℃、暗培养。
5、完成步骤4后，分离不定根，将不定根置于含3.0mg·L-1IBA的MS液体培养基中培养，每3周继代一次，连续继代4次，此时不定根生长快速稳定。培养条件：100r·min-1、25±2℃、暗培养。
二、人参CLE多肽处理人参不定根
第一组(Control组)：取步骤一得到的不定根，置于液体培养基中，培养30h；
第二组(PgCLE12组)：取步骤一得到的不定根，置于含25μM PgCLE12多肽的液体培养基中，培养30h；
第三组(PgCLE25组)：取步骤一得到的不定根，置于含25μM PgCLE25多肽的液体培养基中，培养30h；
第四组(PgCLE27组)：取步骤一得到的不定根，置于含25μM PgCLE27多肽的液体培养基中，培养30h；
第五组(PgCLE45组)：取步骤一得到的不定根，置于含25μM PgCLE45多肽的液体培养基中，培养30h。
液体培养基：含3.0mg·L-1IBA的MS液体培养基。
培养条件：100r·min-1，(25±2)℃，暗培养。
每组设置5个平行处理。
分组处理完成后，取不定根，采用
EdU Alexa
647 Imaging Kit试剂盒(公司名称:Thermo Fisher Scientific；产品编号:C10340)，按说明书操作，检测不定根的根尖细胞的增殖情况。使用双光子激光共聚焦显微镜观察EdU及Hoechst33342标记的不定根。EdU激发光为650nm，发射光为670nm，Hoechst 33342的激发光为350nm，发射光为461nm。增殖细胞的细胞核为红色，其他细胞的细胞核为蓝色。
结果见图3。Control组的细胞增殖率为40.8％±8.3％，PgCLE12组的细胞增殖率为8.3％±4.0％，PgCLE25组的细胞增殖率为11.2％±6.1％，PgCLE27组的细胞增殖率为8.5％±4.4％，PgCLE45组的细胞增殖率为7.6％±6.0％。结果表明，加入人参CLE多肽的人参不定根的细胞增殖率显著下降。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国中医科学院中药研究所
<120> 人参CLE家族多肽及其在植物根生长发育调控中的应用
<130> GNCYX200606
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
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Arg Arg Val Pro Ser Cys Pro Asp Pro Leu His Asn
1 5 10
Claims (2)
1.多肽在抑制人参属植物的根尖细胞增殖中的应用；
所述多肽为如下(a)、(b)、(c)或(d)：
(a)PgCLE45多肽：如序列表的序列1所示；
(b)PgCLE12多肽：如序列表的序列2所示；
(c)PgCLE25多肽：如序列表的序列3所示；
(d)PgCLE27多肽：如序列表的序列4所示。
2.多肽在制备产品中的应用；
所述多肽为如下(a)、(b)、(c)或(d)：
(a)PgCLE45多肽：如序列表的序列1所示；
(b)PgCLE12多肽：如序列表的序列2所示；
(c)PgCLE25多肽：如序列表的序列3所示；
(d)PgCLE27多肽：如序列表的序列4所示；
所述产品的功能为抑制人参属植物的根尖细胞增殖。
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