CN115044563A

CN115044563A - 棉花sina e3泛素连接酶基因在提高植物抗旱性中的应用

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Publication number: CN115044563A
Application number: CN202210717614.6A
Authority: CN
Inventors: 杨代刚; 李威; 周克海; 马雄风; 王悦力; 王星星; 任中英; 赵俊杰; 裴小雨; 刘艳改; 张飞; 贺昆仑; 周晓箭; 张文生; 郭金峰
Original assignee: Yangtze River Research Center Of Zhongmian Institute
Current assignee: Yangtze River Research Center Of Zhongmian Institute
Priority date: 2022-06-23
Filing date: 2022-06-23
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2042-06-23
Also published as: CN115044563B

Abstract

本发明提供了棉花SINA E3泛素连接酶基因在提高植物抗旱性中的应用，涉及植物分子生物学技术领域。所述棉花基因为GhSINA12基因，本发明实验研究发现当陆地棉受到干旱胁迫时，GhSINA12基因显著上调表达。同时，表明棉花GhSINA12转基因株系在干旱胁迫响应中具有正调控作用。利用病毒诱导的基因沉默技术沉默表达棉花GhSINA12基因，表明GhSINA12沉默株系在干旱胁迫中的耐旱性明显降低。本发明表明棉花GhSINA12基因可以响应干旱胁迫，在一定程度上提高了植株的抗旱性，并且可能通过依赖ABA通路来调控植物的抗旱性。本发明为调控目的植物应答干旱胁迫以及培育和筛选抗旱植物提供了新的方法。

Description

棉花SINA E3泛素连接酶基因在提高植物抗旱性中的应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学技术领域，尤其是涉及一种棉花SINA E3泛素连接酶基因在提高植物抗旱性中的应用。

背景技术

全球气候逐渐向一个更加干旱、降水量更加缺失的趋势发展(ARNETH等,2019)干旱已经成为导致作物减产的主要因素，是植物生长发育中遭受的主要环境胁迫之一，培育高品质抗旱植株迫在眉睫。

植株受到干旱胁迫时，其光合作用的变化表征了其受干旱胁迫的程度。当水分不足时，由于气孔扩张程度受限，CO₂吸收效率降低，直接导致光合作用的下降(FLEXAS等，2004)。还有研究表明叶绿素也是抵抗干旱胁迫的重要因素之一，当植株受到干旱胁迫时，其体内叶绿素含量也会随之降低，从而影响光合作用(FAROOQ等，2009)。除此之外，活性氧代谢在植株抗旱胁迫中也至关重要。活性氧(ROS)是当O₂被需氧生物利用时未被完全还原的物质，植株在正常生长状态下，ROS在植物体内处于动态平衡状态，但当植物受到胁迫时，使得ROS途径失衡导致ROS增加，但当ROS增加到一定程度时，会对植株产生毒害作用，使得植株细胞内的一些组分受到损害(ROUT和SHA，2001：FAROOQ等，2009)。活性氧的清除依赖于抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)及过氧化氢酶(CAT)等，来降低植物在干旱胁迫下所受的伤害(MILLER等，2010)。其次还有植物激素也同样参与植物抗旱胁迫的各个过程，主要激素如脱落酸(ABA)、细胞分裂素(CK)、赤霉素(GA)、生长素(IAA)和乙烯(ETH)等(WILKINSON等，2012)，其中ABA是响应植株非生物胁迫的主要激素。

农业干旱已经成为制约棉花产量和品质的重要因素。棉花的生长发育，如株高、叶面积指数、纤维质量、冠层和根系发育等被干旱胁迫严重制约(LOKA等，2011)。棉花已经进化出几种常见的对抗干旱胁迫的生理策略，例如棉花的GaMYB85基因通过降低气孔密度来增强植株耐旱性，棉花GhWRKY41基因正向调控植物的抗旱性，并通过调节气孔关闭和抗氧化相关基因的表达提高抗旱性(BUTT等，2017)。研究发现在棉花中过表达AtLOS5基因提高了转基因棉花的脱落酸水平和抗植株的旱性，中棉所35(Z35)和转基因棉花在正常条件下内源ABA和脯氨酸的积累相似，但干旱胁迫大大增加了Z35和转基因棉花叶片中内源ABA和脯氨酸的含量，转基因棉花比Z35棉花多积累了25％的内源ABA，结果表明AtLOS5转基因棉花通过提高ABA含量和ABA诱导的生理调控从而获得了较好的抗旱性表型(YUE等，2012)。

泛素-26S蛋白酶体系统(UPS)是普遍存在的一种蛋白修饰机制，主要介导蛋白质的翻译后修饰和底物蛋白的降解，在植物生长发育的各个方面发挥不可替代的作用，包括植物生长，胁迫等生理过程。参与泛素化过程的酶，主要包括E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶三种酶，E3连接酶在许多细胞过程中发挥重要作用。在植物中，部分SINA(Seven in absentia)家族的成员是E3泛素连接酶复合物的组成部分，SINA家族高度保守。目前，SINA E3泛素连接酶已经在多种植物中被发现，其中胡杨、拟南芥、水稻中分别鉴定出了10、5、6个SINA E3泛素连接酶，在植物生命活动的各个方面都发挥着十分重要的作用。

利用分子生物学手段寻找抗旱基因，明确棉花抗旱机制，创制抗旱的棉花品种是解决干旱胁迫这一问题的有效途径。鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供棉花SINA E3泛素连接酶基因在提高植物抗旱性中的应用，为调控目的植物应答干旱胁迫以及培育和筛选抗旱植物提供了一种新的方法。

在一个方面，本发明提供了棉花SINA E3泛素连接酶基因在提高植物抗旱性中的应用，所述棉花基因为GhSINA12基因。

本发明对棉花进行模拟干旱处理后，在24个陆地棉SINA基因中，通过实时荧光定量(qRT-PCR)分析发现，GhSINA12基因的表达量在PEG6000处理下受到显著诱导(GhSINA12在6h、12h时15％的PEG6000处理条件下被诱导表达最为明显)；同时，自然干旱中，GhSINA12基因的转录水平显著上升。对GhSINA12进行亚细胞定位实验，并通过DAPI染色来证明GhSINA12定位于细胞核。

通过原核表达纯化MBP标签融合的GhSINA12蛋白进行体外泛素化实验，利用泛素活化酶E1、泛素结合酶E2(UbcH5b)、与待测蛋白(MBP-GhSINA12,MBP)孵育，进行SDS-PAGE分析并通过生物素抗体anti-Biotin进行检测，说明GhSINA12具有E3泛素结合酶活性。

在本发明中，可以从棉花基因组数据库Cotton FGD(https://cottonfgd.org/)中下载GhSINA12(GH_A13G0056)基因的CDS序列。

在另一个方面，本发明提供了含有前述的GhSINA12基因的生物材料或编码所述GhSINA12基因的蛋白在提高植物抗旱性中的应用。

通过RT-PCR以及qRT-PCR检测拟南芥T3代过表达系中GhSINA12基因表达量水平变化，结果表明外源基因GhSINA12在转基因拟南芥株系中有不同程度的表达。将转GhSINA12基因拟南芥T₃代和野生型拟南芥种子点播在含有不同浓度的甘露醇MS培养基上，结果超表达株系根长显著长于WT株系。表明GhSINA12转基因株系在干旱胁迫响应中具有正调控作用。

对TM-1的棉花进行了VIGS实验，通过病毒介导的基因沉默技术沉默表达GhSINA12基因，在自然干旱处理8天左右，发现GhSINA12基因沉默植株的抗旱性明显下降，于TRV:00植株提前出现萎蔫表型，PEG6000模拟干旱处理结果同自然干旱胁迫相同。此外，TRV:00株系的SOD、POD、CAT都显著高于TRV:GhSINA12株系，MDA显著小于TRV:GhSINA12株系，表明在GhSINA12基因沉默后，棉花植株的抗旱性明显下降。

GhSINA12基因沉默后，与干旱胁迫相关的基因，例如转录因子BHLH1、激酶MAPKKK17、钙结合蛋白CML45、1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶ACS1、生长素响应蛋白SAUR36等表达量显著下降。

在一个实施方案中，所述生物材料为表达载体、克隆载体、工程菌或重组细胞。

在一个实施方案中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物，优选为双子叶植物；

更优选地，所述双子叶植物包括棉花或拟南芥。所述棉花优选地为陆地棉。

在一个实施方案中，所述应用包括上调目的植物中所述GhSINA12基因的表达以提高植物抗旱性。

在另一个方面，发明提供了一种提高植物抗旱性的方法，所述方法包括增加目的植物中所述GhSINA12基因的表达量或增加编码所述GhSINA12基因的蛋白的活性或含量。

在一个实施方案中，所述方法包括将棉花GhSINA12基因导入目的植物中获得抗旱性提高的转基因植物。

在一个实施方案中，所述方法包括将含有GhSINA12基因的植物表达载体经农杆菌介导转化到植物中。

在一个实施方案中，所述植物表达载体通过组成型或诱导型启动子驱动所述GhSINA12基因的过表达；优选地，所述组成型启动子为35S启动子。

在一个实施方案中，所述GhSINA12基因可通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。

在本发明中，对GhSINA12基因沉默后的干旱胁迫株系进行转录组测序(RNA-seq)分析，对上调基因和下调基因分别做了GO富集分析和KEGG分析，其中MAPK信号通路和植物激素信号转导通路富集程度都很高，两个通路中都同时含有脱落酸(ABA)通路的基因。随后通过qRT-PCR对部分基因转录组数据进行验证，结果表明GhSINA12可能通过ABA通路来响应棉花干旱胁迫。

在另一个方面，本发明提供了所述GhSINA12基因在鉴定和/或筛选耐旱棉花品种中的应用，以待鉴定的棉花基因组DNA为模板，利用所述GhSINA12基因的特异性PCR引物进行荧光定量PCR扩增，根据扩增结果确定待鉴定棉花的抗旱性状。

有益效果：

本发明提供实验表明了GhSINA12基因与棉花或者拟南芥抗旱能力的关系，发现上调该基因的转基因植株较野生型植株具有更好的耐干旱胁迫能力，本发明为培育耐旱性能的植物新品种提供了宝贵的基因资源。

本发明提供了调控植物耐干旱胁迫能力/提高植物抗旱性的方法，包括调控植物中GhSINA12基因的表达量，通过直接调控基因的表达影响植物的抗旱效果，方法效率高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明棉花PEG6000处理以及不同时间段的qRT-PCR分析(其中A为水培棉花在PEG6000处理下0、1、3、6、12、24h的表型；B为GhSINA基因在PEG6000处理下0、1、3、6、12、24h的qRT-PCR)；

图2为GhSINA12基因的表达分析(其中A为GhSINA12在6h中不同PEG6000浓度处理下的表达水平；B为GhSINA12在12h中不同PEG6000浓度处理下的表达水平；C为GhSINA12在自然干旱处理7天后的表达水平)；

图3为棉花中SINA E3泛素连接酶的结构(GhSINA12基因成员具有两个高度保守的结构域：从N端的RING-finger结构域和一个C端的SINA结构域)；

图4为GhSINA12基因的PCR产物；

图5为GhSINA12蛋白的亚细胞定位和E3泛素连接酶活性(GhSINA12的亚细胞定位，比例尺＝10μm；GhSINA12体外E3泛素连接酶活性实验)；

图6为GhSINA12基因在拟南芥中的异源表达(A为通过RT-PCR测定GhSINA12在野生型和过表达GhSINA12的植物中的转录水平，Actin作为对照；B为通过qRT-PCR测定GhSINA12在野生型和过表达GhSINA12的植物中的转录水平，Actin作为内参)；

图7为过表达GhSINA12基因拟南芥的抗旱性观察(A为WT和GhSINA12转基因株系在0mM、150mM甘露醇和300mM甘露醇培养基上生长14d后的表型情况；B为WT和GhSINA12转基因株系在0mM、150mM甘露醇和300mM甘露醇培养基上生长14d后的根长数据统计)；

图8为TRV:00和TRV:GhSINA12基因沉默效率分析(A为土培棉花TRV:GhCLA1植株白化表型；B为qRT-PCR对土培棉花沉默效率进行检测，GhHIS3作为内部参考对照；C为水培棉花TRV:GhCLA1植株白化表型；qRT-PCR对水培棉花沉默效率进行检测，GhHIS3作为内部参考对照)；

图9为GhSINA12基因沉默棉花的抗旱性观察(A为对棉花进行自然干旱处理，8天左右出现表型差异，10天左右进行拍照；B为对受到干旱胁迫的棉花叶片中的MDA、POD、CAT、SOD生理指标进行检测；C为对棉花进行模拟PEG6000干旱处理，2.5小时左右进行拍照；D为对受到模拟干旱胁迫的棉花叶片中的MDA、POD、CAT、SOD生理指标进行检测)；

图10为MAPK以及激素信号转导通路相关基因转录水平验证；

图11为干旱胁迫通路以及相关基因转录水平变化情况(A为富集到与干旱胁迫相关的通路；B为干旱胁迫通路及通路基因表达量分析；C为对两通路基因进行转录组验证)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、材料与方法

棉花植株为陆地棉遗传标准系TM-1，烟草植株为本氏烟(Nicotianabenthamiana)，以及拟南芥植株为哥伦比亚型(Columbia)拟南芥，以上材料可通过商业途径购买得到。

三、实验方法与实验结果

1.植物RNA的提取以及cDNA合成

1.1RNA的提取以及质量与纯度检测

分别取TM-1的不同组织部位样品，包含根、茎以及叶。用RNA prep Pure试剂盒(TIANGEN，北京)提取不同组织部位的总RNA。提取步骤如下：在棉花生长合适时期，取样品保存于-80℃，用的时候将样品取出置于液氮中，再转移至超低温组织研磨仪中研磨1min(未研磨充分的样品再次研磨30s直至研磨成粉末)；用RNA prep Pure试剂盒提取RNA(按照试剂盒的使用说明进行操作)，得到RNA溶液；用1.6％的琼脂糖凝胶，检测RNA质量，用Nanodrop2000测量RNA纯度，检测具体步骤如下：RNA质量检测：称取1.6g琼脂糖，熔琼脂糖于100mL的1×TAE缓冲液，加入8μL的Super

(US

INC)核酸凝胶染料制胶。取上述提取RNA与loading buffer混匀液，加入上样孔。125V，电泳20min后，移至UV凝胶成像仪上观察。UV拍摄下所有样品均呈两条无弥散条带，大条带(5Kb)亮度约为小条带(2Kb)亮度的2倍，表明所提RNA质量高；RNA纯度检测：用移液枪吸取1μL灭菌的ddH₂O做空白对照，Nanodrop2000仪器检测下，空白对照条带几乎与横坐标重合，然后吸取1μL的上述步骤(12)中收集的RNA溶液逐个检测，标记RNA浓度，分析RNA样品的OD_260/280值，所有RNA样品的OD_260/280值均在2.0左右，表明所提RNA纯度高。

1.2植物cDNA的合成：

用Prime Script^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，中国)合成cDNA。分别以1.0μg不同组织的RNA为模板，先用gDNA Eraser去除样品中所含基因组DNA，然后经PrimeScript RT Enzyme Mix I反转录合成cDNA，具体步骤如下：

(1)配制去除基因组DNA体系(按照表1体系配制)；(2)42℃下孵育5min；(3)立即快速转移到冰上冷却；(4)配制反转录体系(在冰上按照表2体系配制)；(5)在PCR仪进行以下程序：37℃ 16min；85℃ 5s；4℃ Pause；(6)立即快速转移到冰上，将cDNA用灭菌的ddH₂O稀释4-5倍。(7)放于-20℃储存。

表1.去除基因组DNA体系

表2.反转录体系

2.实时荧光定量(qRT-PCR)实验

采用NCBI网址中的primer-Blast工具设计GhSINA引物，设计GhSINA的特异性引物，引物序列见下表3。

表3.实时荧光定量引物

使用Light Cycler 480II system(Roche，德国)进行qRT-PCR试验，以ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix(南京，诺唯赞)为试剂，以GhHIS3为内参基因。每个样品进行3次技术重复。用2^-ΔCT法分析qRT-PCR数据。qRT-PCR实验程序参照说明书，具体如下：

(1)qRT-PCR体系见表4：

表4.荧光定量PCR反应体系

(2)qRT-PCR反应过程：①95℃预变性30s，一个循环；②95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环；③95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s，1个循环；④荧光扫描并收集荧光信号。

3.基因克隆

3.1GhSINA12基因的扩增：

用GhSINA12(GH_A13G0056)的全长CDS序列设计特异性引物，如下表5：

表5.基因全长克隆引物

以提取的根茎叶的cDNA混合稀释液为模板，用TKS(TaKaRa，中国)酶扩增目的基因。按表6中体系在冰上配置上述混合溶液于200μL PCR管，轻微离心后，置于PCR反应仪中，PCR程序为：(1)94℃预变性3min；(2)98℃变性10s；(3)55℃退火15s；(4)68℃延伸60s；(5)把(2)、(3)、(4)循环30次；(6)68℃延伸7min；(7)4℃恒温。

表6.GhSINA12克隆PCR体系

PCR产物胶回收：使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit(Vazyme)对GhSINA12的PCR扩增产物进行胶回收，具体步骤按照试剂盒的使用说明进行操作，将回收得到的DNA测量浓度后，于-20℃条件保存，用于后续实验。

GhSINA12与pEASY-Blunt Zero载体连接：(1)将pEASY-Blunt Zero载体与目的基因回收产物按1：4的比例在冰上混合，最佳反应体系为3-5μL，若目的基因回收产物浓度过高，可先对其稀释；(2)用PCR仪控制温度，25℃反应15min。

大肠杆菌的转化：(1)取100μL感受态于冰上融化，无菌条件下加入带有目的片段的T载体，混匀，冰上放置25min；(2)42℃热激45s，将离心管转移到冰上，静置2min，勿晃动；(3)在超净台中，在离心管中加入600μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃200rpm条件下，振荡培养1.5h，使菌体复苏；(4)在超净台中，取50μL的复苏菌液涂布到蓝白斑筛选培养基上，将平板倒置于37℃恒温箱中培养12h左右，用于挑选单克隆。

菌落PCR检测：(1)在已灭菌的超净工作台中挑取大且饱满的单克隆，放于含有卡那霉素的400μLLB培养液，37℃摇床，200rpm，3h；(2)使用EasyTaq(全式金，中国)酶，以pEASY-Blunt Zero载体上M13_F及GhSINA12的下游引物GhSINA12_R为引物对，进行检测，检测体系如下(表7)：

表7.GhSINA12的PCR检测体系

(3)在超净工作台吸取2μL菌液，按上述体系在冰上混匀后置于PCR仪；4)PCR程序如下：①94℃预变性6min；②98℃变性10s；③55℃退火15s；④72℃延伸60s，31个循环；⑤72℃终延伸6min；⑥4℃恒温；(5)制1.6％的琼脂糖凝胶，点样；(6)120V电泳16min，观察分析；(7)用移液枪吸取50μL目的条带正确的菌液送公司测序，测序返回序列用ClustalX比对，序列正确的菌液用于后续试验。

质粒提取：使用FastPure Plasmid Mini Kit(Vazyme，中国)提质粒，具体步骤按照试剂盒的使用说明进行操作。检测回收的质粒的浓度，保存-20℃备用。

4.结构分析

(1)用SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)将GhSINA12蛋白序列输入网站预测结构域。

(2)使用TBtools的Gene Location Visualize from GTF/GFF将棉花SINA基因在染色体上定位。

(3)将陆地棉、拟南芥、水稻SINA基因用MEGAX进行进化树构建。拟南芥和水稻SINA基因来网站phytozome(https://phytozome-next.jgi.doe.gov)。

5.亚细胞定位

(1)登陆诺唯赞官网下载同源引物设计软件CE Design(http://www.vazyme.com)，将陆地棉GhSINA12的CDS序列(去掉终止密码子)和pCambia2300完整载体序列输入到CE Design，选择BamHI和EcoRI两个酶切位点，自动生成引物如表8。

表8.亚细胞定位扩增引物

(2)以步骤3提取的质粒为模板，扩增带载体片段的目的基因，体系如下：

表9.扩增PCR体系

(3)扩增程序同基因扩增程序相同。

目的基因纯化：使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit(Vazyme)对产物回收，具体步骤按照试剂盒的使用说明进行操作。

载体的酶切：

(1)使用限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI，对pCambia2300(CAMBIA)载体的质粒进行双酶切反应使其成线性化酶切位点，双酶切体系如下：

表10.双酶切体系

(2)将溶液按上述体系在冰上配置混匀，4000g离心1min，于37℃水浴中放置6h；

(3)吸取5μL(2)中溶液，混入1μL10×Loadding Buffer，以pCambia2300(CAMBIA)质粒为对照，使用1.6％的琼脂糖电泳120V，19min，检测酶切效果，分析；

(4)按步骤3的回收方法纯化(3)中溶液。

目的基因与载体的连接：用诺唯赞公司的Clon

II One Step CloningKit试剂盒将目的基因GhSINA12与载体pCambia2300(CAMBIA)连接起来，连接体系如下：

表11.连接体系

按体系在冰上配混合液，4000g离心30s。然后移至37℃ PCR仪中反应30min，待反应完后迅速转移到冰上。

重组物转化大肠杆菌及菌落检测：将GhSINA12与pCambia2300(CAMBIA)重组物按步骤3转化大肠杆菌。

重组物质粒获取：以pCambia2300载体上游通用引物HP158_F及基因下游引物为菌落PCR检测引物对，按步骤3基因的克隆实验中所述方法进行菌落PCR检测，检测正确的条带送公司测序，测序正确后按步骤3中所述方法提取重组产物质粒。

农杆菌转化：(1)取GV3101感受态冰上融化，无菌条件下加入加入1μg的GhSINA12与pCambia2300重组产物质粒，轻轻混匀，冰上放置25min；(2)液氮5min；(3)37℃水浴5min，不可晃动水面；(4)立刻转至冰上静置4min；(5)在超净工作台中加入500μL配置好的无菌LB溶液，28℃200rpm条件下，振荡培养3h，使菌体复苏；(6)4000rmp，离心5min，收集120μL左右的菌液涂布双抗(卡那霉素和利福平)抗性的LB平板，28℃恒温培养箱培养48h；(7)挑单克隆，菌落PCR检测，保菌。

瞬时转化烟草：将本氏烟(Nicotiana benthamiana)种子散播在营养土与蛭石按1：1比例混合的营养土中，移至光照培养箱培养。将生长15天左右长势好的烟草小苗带老土移至新的小盆(一盆2棵苗)，敷上透明的塑料膜一星期后去掉塑料膜，待烟草长到4-6片叶子时，进行亚细胞定位，具体步骤如下：(1)在对烟草瞬时转化的前两天，将重组质粒GhSINA12-pCambia2300农杆菌菌液及空载体pCambia2300的农杆菌菌液从-80℃取出，在超净工作台中分别吸取100μL，移至600μL双抗性(卡那和利福平)LB溶液中，28℃、200rpm条件下，振荡培养12h活化；(2)无菌条件下，将活化后的菌液分别移至装有50mL LB溶液(卡那霉素和利福平双抗性)的150mL锥形瓶中，28℃200rpm培养至溶液成橙黄色；(3)移至50mL离心管，4800rmp离心9min，弃上清；(4)配制适当体积的重悬液100mL重悬液；(5)重悬液重悬菌体，并把重悬后的菌液OD600值调为1.0；(6)室温静置2-3h，挑取叶面平展的烟草注射；(7)注射72h后，剪取注射的叶子，用ddH2O冲洗干净后，使用激光共聚焦显微镜进行亚细胞定位观察实验。

6.体外泛素化实验

制胶：根据蛋白样品分子量制备合适浓度的SDS-PAGE胶(7.25％胶)。

电泳：向电泳槽中加入电泳液；电压调到80V，进行跑胶，当样品条带刚进入下层分离胶后，电压调至120V(电压恒压)；

加入样品体系如下：

表12.体外泛素化上样体系

待样品条带跑至距离胶板下沿0.5cm处，关闭电源，进行电转移；PVDF膜必须事先用纯甲醇浸泡30s-1min左右，然后浸泡于转膜液中备用。

取出胶后，在转膜液中平衡15min；打开凝胶夹，放置于一干净托盘中，倒入3/4体积的转膜液，依次放上纤维支持垫网一张、三张预切好的层析滤纸、凝胶、PVDF膜、三张预切好的层析滤纸、第二张纤维支持垫网(一定要赶尽各层材料之间的气泡，特别要使膜和凝胶紧密接触)；合上凝胶夹，放置于电转移槽中，倒入转膜液；将电泳槽放置于冰水中，连接电源，设置200mA，2h；

封闭和显色：转移完毕，夹盒放回盛有转膜液的托盘中，打开夹盒，取出PVDF膜，将凝胶接触面朝上，放入盛有TBST的培养皿中，室温下洗膜5min；转移至盛有3％BSA的TBST溶液，4'C下封闭过夜(或常温1h)；用20mLTBST洗膜5min，重复三次；倒入10mL一抗稀释缓冲液(Blocking Buffer+1:2000抗体)，在摇床上2-3h，55rpm左右；用20mLTBST洗膜10min，重复三次，80rpm左右；倒入10mL含有二抗(1:2000)的稀释缓冲液，室温下温和摇动1h；用20mLTBST洗膜8min，重复三次，用20mTBS再洗次；洗好的膜放于超高灵敏度化学发光成像机器中，于膜上滴入适量混合好的显色液，进行显色。

7.拟南芥遗传转化

拟南芥种植：

哥伦比亚型(columbia)拟南芥长出四片叶子时移栽至营养土。

拟南芥遗传转化:

(1)在拟南芥盛花期的前两天，将重组质粒GhSINA12-pCambia2300(含有终止密码子)农杆菌液从-80℃取出，在超净工作台中吸取100μL，加入600μL双抗性LB溶液(卡那和利福平)，28℃，200rpm培养13h；(2)在超净工作台中将上述700μL菌液移至装有50mL LB溶液(卡那霉素和利福平双抗性)的150mL锥形瓶中，28℃，200rpm培养至溶液成橙黄色；(3)移培养液至50mL离心管，5000g离心9min，弃上清液；(4)配制适当体积的重悬液；(5)用重悬液重悬菌体，以重悬液为空白对照把重悬后的菌液OD₆₀₀值调为1.0；(6)调好OD值后，加入0.02％的silwet-77，混匀；(7)将已事先剪去果荚的拟南芥花序浸泡在上述混匀液中1min，做好标记放置温室，黑暗处理，24h后摘掉黑布；(8)生长5天后重复转化操作一次。

拟南芥阳性苗筛选：

待拟南芥成熟后，收获种子为T₀代，去掉杂质置于37℃培养箱干燥一周，使拟南芥完成后熟，取出种子，将GhSINA12的T₀代种子撒播在MS(含有卡那抗生素)培养基上，4℃春化2天后移至培养箱，待生长15天左右可见拟南芥阳性苗。

拟南芥表型观察：

使用无菌的0.1％琼脂糖溶液将GhSINA12转基因拟南芥T₃代种子和野生型拟南芥用2.5μL移液枪点播在含有不同浓度的MS培养基上(0mM、150mM、300mM)做好标记，春化2天，培养箱培养14天，分别观察GhSINA12转基因拟南芥和野生型拟南芥根的表型区别。

8.棉花病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术

载体构建：选取GhSINA12序列中的80-200bp作为沉默片段，设计引物见表13。

表13.VIGS扩增引物

以T载体为模板，扩增带有烟草花叶病毒载体pTRV2同源臂的目的基因，体系同亚细胞定位实验，PCR程序为：(1)94℃预变性3min；(2)98℃变性10s；(3)55℃退火15s；(4)68℃延伸7s；(5)把(2)、(3)、(4)循环30次；(6)68℃延伸7min；(7)4℃恒温。

目的基因纯化：具体步骤同亚细胞定位实验纯化方式相同。

pTRV2载体的酶切：

(1)使用限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI，对pTRV2(CAMBIA)载体的质粒进行双酶切反应使其成线性化酶切位点，双酶切体系如下：

表14.双酶切体系

(3)吸取5μL(2)中溶液，混入1μL 10×Loadding Buffer，以pCambia2300(CAMBIA)质粒为对照，使用1.6％的琼脂糖电泳120V，19min，检测酶切效果，分析；

(4)按步骤3中PCR产物胶回收的方法纯化(3)中溶液。

目的基因与载体的连接：用诺唯赞公司的Clon

II One Step CloningKit试剂盒将目的基因GhSINA12与载体pTRV2连接起来，连接体系如下：

表15.连接体系

按体系在冰上配混合液，4000g离心30s。然后移至37℃PCR仪中反应30min，待反应完后迅速转移到冰上。

重组物转化大肠杆菌及菌落检测：将GhSINA12与pTRV₂重组物按步骤3转化大肠杆菌。

重组物质粒获取：以pTRV₂载体上游通用引物及基因下游引物GhSINA12_2R为菌落PCR检测引物对，按步骤3基因的克隆实验中所述方法进行菌落PCR检测，检测正确的条带送公司测序，测序正确后步骤3所述方法提取重组产物质粒。

农杆菌转化：(1)取GV3101感受态冰上融化，无菌条件下加入1μg的GhSINA12与pTRV₂重组产物质粒，轻轻混匀，冰上放置25min；(2)液氮5min；(3)37℃水浴5min，不可晃动；(4)立刻转至冰上静置4min；(5)在超净工作台中加入600μL配置好的无菌LB溶液，28℃、200rpm条件下，振荡培养3h，使菌体复苏；(6)4000g，离心5min，收集120μL左右的菌液涂布双抗(卡那霉素和利福平)抗性的LB平板，28℃恒温培养箱培养48h；(7)挑单克隆，菌落PCR检测，保菌。

农杆菌转化棉花：

选取自交龄TM-1的种子，胚根朝下种入3；1混合的营养土和蛭石中敷上透明的薄膜，并在真叶尚未长出的时期对幼苗进行农杆菌注射，具体步骤如下：(1)从-80℃冰箱取出保存的阳性菌液TRV₂-GhSINA12，辅助质粒TRV₁，空载体TRV₂-00，棉花对照白化基因GhCLA1菌液，将这四种菌液移入1mL含有卡那和利福平双抗性抗生素LB液体培养基中，220rmp，28℃振荡培养12h；(2)取出全部菌液放置在锥形瓶中继续扩大培养，加入50mL双抗性培养基中，220rmp，28℃振荡培养14h；(3)取出培养的菌液放置在离心管中，在离心机中6000rmp，离心8min，收集菌体；(4)将沉淀的菌液加入适量的重悬液，涡旋振荡重悬菌体，将菌液的OD₆₀₀值调整至1.3，室温下避光静置3h；(5)室温下避光静置3h后，将TRV₂-GhSINA12，空载体TRV₂-00，GhCLA1的菌液和辅助质粒TRV1的菌液按1:1比例混合均匀；(6)使用1mL无菌注射器，吸取菌液，用针头划伤子叶，然后在子叶背面注射，使叶片被菌液充满，并滴下水珠。

9.酶活指标测定

MDA活性指标测定：

当棉花VIGS受到逆境胁迫时，对植株进行采样处理，用苏州格锐思试MDA剂盒进行测定，具体步骤按照试剂盒的使用说明进行操作，计算公式如下：

MDA含量(nmol/g鲜重)＝[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)＝32.3×ΔA÷W；

V---样本提取液的总体积，1mL；V1---加入反应体系样本体积，0.2mL；V2---样本提取液与工作液总反应液体积，5×10^-4L；d---比色皿光径，0.5cm；ε---MDA摩尔消光系数，155×10³L/mol/cm；W---样本质量，g；

蛋白浓度测定：

当棉花VIGS受到逆境胁迫时，对植株进行采样处理，用Vazyme试剂盒BCA ProteinQuantification Kit进行测定，具体步骤按照试剂盒的使用说明进行操作，计算如下：

以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；根据测得的吸光值，在标准曲线上即可计算出样品的蛋白含量；计算蛋白浓度：以查得的蛋白含量除以样品体积20μL，再乘以相应的稀释倍数即可得到待测样品的实际浓度。

CAT活性指标测定：

当棉花VIGS受到逆境胁迫时，对植株进行采样处理，用苏州格锐思试CAT剂盒进行测定，具体步骤按照试剂盒的使用说明进行操作，计算公式如下：

CAT(μmoL/min/mg prot)＝[(ΔA+0.0137)÷0.1412]÷(V1×Cpr)÷T；

V---加入提取液体积，1mL；V1---加入样本体积，0.01mL；T---反应时间，5min；Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；

POD活性指标测定：

当棉花VIGS受到逆境胁迫时，对植株进行采样处理，用苏州格锐思试POD剂盒进行测定，具体步骤按照试剂盒的使用说明进行操作，计算公式如下：

POD(△OD470/min/g鲜重)＝ΔA÷(W×V1÷V)÷1÷T＝100×ΔA÷Cpr；

V---加入提取液体积，1mL；V1---加入样本体积，0.01mL；T---反应时间，1min；Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；

SOD活性指标测定：

当棉花VIGS受到逆境胁迫时，对植株进行采样处理，用苏州格锐思试SOD剂盒进行测定，具体步骤按照试剂盒的使用说明进行操作，计算公式如下：

抑制百分率＝[(A空白管1-A空白管2)-(A样本管-A样本对照管*)]/(A空白管1-A空白管2)×100％；

SOD活性(U/mg prot)＝[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V2]÷(V1×Cpr)×D＝10×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷Cpr×D；

V---加入提取液体积，1mL；V1---加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2---反应体系总体积，0.2mL；D---样本稀释倍数，未稀释即为1；Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL。

10.转录组测序分析

植物样品：首先将棉花进行VIGS实验，待GhSINA12基因确认被沉默掉后，对棉花沉默组与对照组进行干旱处理，植株遭受干旱胁迫后，对棉花组织进行取样，每组样品不少于0.4g。然后通过提取6组RNA以及构建文库，通过使用Illumina NovaSeq 6000平台进行测序。

差异表达基因火山图：通过使用DESeq2软件，对比两组数据之间的差异表达基因，通过构建数据集；然后，基于负二项式(Negative Binomial)分布，对数据进行DESeq差异分析。差异表达基因的GO富集分析：通过TBtools软件的GO Enrichment程序进行富集分析，完成富集分析后，再通过软件中的Enrichment Grapher程序进行富集分析结果的可视化，然后调整图片。差异表达基因的KEGG富集分析：通过TBtools软件的KEGG EnrichmentAnalysis程序进行富集分析，得到富集分析结果，再通过软件中的Enrichment Bar Plot小程序进行可视化，最后得到可视化图片，保存图片。

实验结果：

1.干旱胁迫下GhSINA基因的表达量变化

1.1GhSINA基因的筛选

为了筛选出可能与干旱胁迫相关的GhSINA基因，首先对棉花进行模拟干旱处理，对TM-1棉花进行水培，待其长出第二片真叶时用浓度为15％的PEG6000进行了干旱处理，同时分别对不同的6个时间点(0、1、3、6、12、24h)进行了取样(图1中A)。利用前期研究鉴定的24个陆地棉SINA基因设计特异性的引物(表3)。通过实时荧光定量(qRT-PCR)分析发现，GhSINA12基因的表达量在PEG6000处理下受到显著诱导，PEG6000处理1h时GhSINA12的转录水平迅速上升到对照水平的2倍左右，在12h时GhSINA12的诱导表达最为明显，24h后又开始迅速下降(图1中B)。

1.2GhSINA12基因的表达分析

因为GhSINA12在6h、12h时15％的PEG6000处理条件下被诱导表达最为明显，所以为了了解该基因在何等条件下转录水平最高，对TM-1棉花进行了不同浓度的PEG6000处理分别为10％、20％、30％，通qRT-PCR实验发现，不管在6h还是12h时间段内都是10％的PEG6000处理时GhSINA12的转录水平最高，同时还发现在同等浓度下12h的转录水平都会高于同等浓度下6h的转录水平(图2中A和B)。我们又进行了自然干旱处理，将棉花土培，长到两叶一心时期将棉花的水盆撤去，进行缺水干旱处理作为干旱组，对照组按时浇水，待干旱组出现叶片萎蔫表型时，对两组叶片取样处理进行qRT-PCR分析，发现在自然干旱中GhSINA12基因的转录水平显著上升(图2中C)。

1.3GhSINA12基因的序列分析

对GhSINA12的编码序列进行结构域分析，发现GhSINA12同样具有SINA以及RING结构域(图3)；根据24个陆地棉SINA基因在陆地棉染色体上的具体位置信息，对SINA的染色体分布进行了分析:在24个陆地棉SINA基因中，共定位于16条染色体上，不同染色体上含有SINA数目不同。目的基因GhSINA12位于A亚族第13条染色体上。

1.4GhSINA12基因的克隆及功能验证

通过将棉花遗传标准系TM-1的根、茎、叶的cDNA进行混样，作为基因克隆模板，通过PCR扩增获得GhSINA12基因的CDS全长序列，如图所示(图4)，以水为模版作为阴性对照，GhSINA12的PCR检测条带位于1000bp左右，与GhSINA12基因片段大小一致。对GhSINA12进行亚细胞定位实验，通过激光共聚焦显微镜下观察采集图像。通过DAPI染液染色来证明GhSINA12定位于细胞核(图5中A)。结果发现，GhSINA12在细胞核上被观察到，并从合并图像中观察到与DAPI通道图像重合，表明GhSINA12定位于细胞核中。

为了检测其GhSINA12是否具有E3泛素结合酶活性，通过原核表达纯化MBP标签融合的GhSINA12蛋白进行体外泛素化实验(图5中B)，利用泛素活化酶E1、泛素结合酶E2(UbcH5b)、与待测蛋白(MBP-GhSINA12,MBP)进行2h 30℃孵育，进行SDS-PAGE分析并通过生物素抗体anti-Biotin进行检测。结果表明，在同时存在E1、E2、E3和泛素Ub的情况下能够观察到梯状条带，缺少上述任何一种则不能显示出梯状条带，因此说明GhSINA12具有E3泛素结合酶活性。

2.过表达GhSINA12的拟南芥对干旱胁迫的响应

2.1棉花GhSINA12在拟南芥中的异源表达

在拟南芥盛花期之前，将GhSINA12基因通过花序浸染法转入拟南芥，收获种子作为T₀代，将其种植在含卡那霉素抗性的MS培养基上筛选阳性苗。由于GhSINA12基因的超表达载体具有卡那霉素抗性，所以转入GhSINA12基因的拟南芥种子可以在含有卡那霉素抗性的MS培养基上正常生长，而野生型拟南芥不能正常生长。将拟南芥的种子繁殖到T₃代时，对种子进行群体阳性检测，通过RT-PCR以及qRT-PCR检测拟南芥T₃代过表达系中GhSINA12基因表达量水平变化(图6中A和B)，结果表明外源基因GhSINA12在转基因拟南芥株系中有不同程度的表达。

2.2过表达GhSINA12基因的拟南芥抗旱性观察

将转GhSINA12基因拟南芥T₃代种子和野生型拟南芥点播在含有不同浓度0mM、150mM、300mM甘露醇的MS培养基上，并分别做好标记，春化48h后，将培养基竖直放于培养箱中培养14天，对其表型进行观察，GhSINA12株系根系表型十分明显，其中在0mm甘露醇的MS培养基中WT和超表达株系没有显著差别，但在150mm和300mm的甘露醇培养基中超表达株系根长明显长于WT株系(图7中A)。同时，对植株根系长度进行观察，发现在在150mm和300mm的甘露醇MS培养基中超表达株系根长显著长于WT株系(图7中B)。这些数据表明转GhSINA12基因增强了拟南芥对干旱胁迫的抗性。

3.沉默表达GhSINA12的棉花对干旱胁迫的响应

3.1棉花沉默效率检测

为了了解棉花中GhSINA12基因对干旱的响应情况，我们研究了GhSINA12基因沉默后的株系对干旱的响应。对TM-1的棉花进行了VIGS实验，通过病毒介导的基因沉默技术沉默表达GhSINA12基因，在注射农杆菌10天左右，阳性对照棉花子叶白化十分明显时，进行自然干旱处理以及15％的PEG6000模拟干旱处理(图8中A和C)。同时，对棉花叶片取样，进行qRT-PCR实验，对GhSINA12基因在棉花植株中的沉默效率进行了分析。结果表明，GhSINA12在沉默植株中的沉默效率为50％左右(图8中B和D)。

3.2沉默表达GhSINA12降低棉花植株抗旱性

待棉花白化明显时，每天将水盆内倒满水。连续3天后撤去水盘对棉花进行自然干旱处理，在自然干旱处理8天左右，发现GhSINA12基因沉默植株的抗旱性明显下降，于TRV:00植株提前出现萎蔫表型(图9中A)。对水培处理的棉花，待白化明显时，进行PEG6000模拟干旱处理，于两个半小时左右进行拍照(图9中C)，结果同自然干旱胁迫相同。

通常，为防止细胞受到过量的ROS带来的不利影响，植物会形成CAT、POD等来消除过量的ROS。另外，植物在逆境下遭受伤害时，往往发生膜脂过氧化作用，而膜脂过氧化的最终分解产物是MDA，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。因此，这些指标在一定程度上可以反映植物的抗旱性。对这些抗旱生理指标进行检测，结果表示两种处理下，TRV:00株系的SOD、POD、CAT都显著高于TRV:GhSINA12株系，MDA显著小于TRV:GhSINA12株系(图9中B和D)。结果表明，在GhSINA12基因沉默后，棉花植株的抗旱性明显下降。综上，表明GhSINA12沉默表达株系在干旱胁迫中的抗性明显降低。

4.RNA-seq分析GhSINA12基因沉默后的差异表达基因

为了探究GhSINA12基因导致棉花抗旱性减弱机制，我们将干旱后的TRV:00和TRV:GhSINA12植株进行RNA-seq分析。从中筛选出差异表达明显，并有相关研究证明与干旱胁迫相关的基因，例如转录因子BHLH1、激酶MAPKKK17、钙结合蛋白CML45、1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶ACS1、生长素响应蛋白SAUR36等，我们对以上5个基因进行qRT-PCR分析来验证，结果与RNA-seq一致(图10)。

为了更全面的了解GhSINA12基因沉默后在干旱胁迫中的响应情况，首先对整体转录组数据进行分析，在GhSINA12基因沉默后差异表达基因3305个中，上调基因765个，下调基因2540个。对整体差异表达基因进行GO富集分析，我们发现差异表达基因在分子功能(MF)中的催化活性以及生物过程(BP)中的代谢过程富集程度较高，而催化活性同代谢过程都与干旱胁迫密切相关。然后分别对差异表达基因的上下调基因进行KEGG分析，发现不管是在上调还是下调的差异表达基因，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路和植物激素信号转导通路富集程度都很高。

而这两个通路中都同时含有ABA通路基因的表达水平的变化(图11中A)，其中对MAPK和植物激素信号转导通路中关于调控干旱响应机制通路进行了热图分析，通过热图以及MAPK通路图分析，发现在干旱胁迫下，当GhSINA12基因沉默时，ABA信号通路中的植物脱落酸受体(PYR/PYL)的相关基因的转录水平会发生下调，从而使得2C型蛋白磷酸酶(PP2C)相关基因的转录水平上调，并通过去磷酸化抑制了蔗糖非发酵相关的蛋白激酶2(SnRK2)，这就间接使得MAPK激酶激酶17_18(MAPKKK17_18)相关基因的转录水平下调，通过减少磷酸化而降低MAPK激酶3(MKK3)，降低分裂活化蛋白激酶(MPK7_14)的相关基因下调，最后使得植株对胁迫的适应能力下降，在ABA通路下，可以发现SnRK2通过调控转录因子ABF来影响气孔的开闭情况(图11中B)。最后对这两通路中的相关基因进行了转录组验证(图11中C)qRT-PCR结果符合转录组结果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中棉所长江科研中心

<120> 棉花SINA E3泛素连接酶基因在提高植物抗旱性中的应用

<130> PA22015711

<160> 50

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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cgtccttaca attgccccta 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcgtgcatgt cgaccttatg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

attccaagga gcattcgcga 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcctatcacc acccgagaag 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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ttccttatct tgtggcccat 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ccaaagcaac tgaaaaccgt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cattgctttg gtcagtattt ttg 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctacgtgggg tgccttca 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gatgaggccg aggctaggaa 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ccccgccaga gaagaaaagt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgtcaaatcc aatcccca 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gtcacccatg aaccgcag 18

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<212> DNA

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<212> DNA

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cctcaaggct gtagctgtag ttc 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctattacagc aaactcaaac acg 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctcaaatggg caacaagga 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

acttctggaa tgtcctgttt gt 22

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ccgattgtgt acccttgttt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctaactgtat ttcattgttt tggtca 26

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tctcttatgc ttctcggggt g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tgcttctctt gagcttccc 19

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aacattgata ctcgtgtttt gg 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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tttaggtgga aatcttggag ca 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cttacaaatc gaacatacag tgtgg 25

<210> 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tcgtcaagag ctgtcacgtc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cgctgacttc acgaagggta 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

agtggaagcg aaccatggag 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ggagttcgca tcggcaattc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

atctcggcga tgatgtgacc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tcagccaacc gggacttaac 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

cgggcatcca tttgtctcgt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ctggtggatt gcaccttgga 20

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<213> 人工序列

<400> 33

gttctggtcc ggggtatgtc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

ccatgtacac cgcaacatgc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

atcaggggaa cgcctttgag 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

atcaccaaac tcaaactata 20

<210> 38

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

cctaaagctg tcataac 17

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

attagcttcg gcctagacgc 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gcctgctttg gacgatgaac 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

tggacttgtg gcgagtgatt 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

gcaaagcaaa ccctgaacca 20

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

tcaagactga tttgcgtttc ca 22

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

gcgcaaaggt tggtgtcttc 20

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

atggcacctg gtggtggtat c 21

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

tcattgttct ttccaaatcc gg 22

<210> 47

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

acgggggact cttgaggatc catggcacct ggtggtggta tc 42

<210> 48

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

ccgggtaccg agctcgaatt cttgttcttt ccaaatccgg c 41

<210> 49

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gtgagtaagg ttaccgaatt catggcacct ggtggtggta tc 42

<210> 50

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

cgtgagctcg gtaccggatc cggacactgg taaatcggag gata 44

Claims

1.棉花SINA E3泛素连接酶基因在提高植物抗旱性中的应用，其特征在于，所述棉花基因为GhSINA12基因。

2.含有权利要求1所述的GhSINA12基因的生物材料或编码所述GhSINA12基因的蛋白在提高植物抗旱性中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生物材料为表达载体、克隆载体、工程菌或重组细胞。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物或单子叶植物，优选为双子叶植物；

更优选地，所述双子叶植物包括棉花或拟南芥。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括上调目的植物中所述GhSINA12基因的表达以提高植物抗旱性。

6.一种提高植物抗旱性的方法，其特征在于，所述方法包括增加目的植物中权利要求1所述GhSINA12基因的表达量或增加编码所述GhSINA12基因的蛋白的活性或含量。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括将棉花GhSINA12基因导入目的植物中获得抗旱性提高的转基因植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括将含有GhSINA12基因的植物表达载体经农杆菌介导转化到植物中。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物表达载体通过组成型或诱导型启动子驱动所述GhSINA12基因的过表达；优选地，所述组成型启动子为35S启动子。

10.权利要求1所述的GhSINA12基因在鉴定和/或筛选耐旱棉花品种中的应用，其特征在于，以待鉴定的棉花基因组DNA为模板，利用所述GhSINA12基因的特异性PCR引物进行荧光定量PCR扩增，根据扩增结果确定待鉴定棉花的抗旱性状。