CN111662368A

CN111662368A - 橡胶草耐旱基因TkMYC2、蛋白质、引物、载体、宿主菌及其应用

Info

Publication number: CN111662368A
Application number: CN202010725600.XA
Authority: CN
Inventors: 闫洁; 黄�俊; 张云川; 孙军亭; 孙辉
Original assignee: Shihezi University
Current assignee: Shihezi University
Priority date: 2020-07-24
Filing date: 2020-07-24
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2040-07-24
Also published as: CN111662368B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及涉及橡胶草耐旱基因TkMYC2、蛋白质、引物、载体、宿主菌及其应用。所述TkMYC2基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。在自然干旱胁迫下，与野生型相比，过表达TkMYC2转基因橡胶草叶片生长状况良好。过表达TkMYC2基因能够明显提高POD，SOD，CAT酶活性来响应干旱压。本发明橡胶草TkMYC2基因为提高橡胶草抗旱性，提供一种新的解决途径。

Description

橡胶草耐旱基因TkMYC2、蛋白质、引物、载体、宿主菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及橡胶草耐旱基因TkMYC2、蛋白质、引物、载体、宿主菌及其应用。

背景技术

橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Rodin)，又称俄罗斯蒲公英，是多年生二倍体产胶植物。有研究发现橡胶草所产橡胶的理化性质与橡胶树所产橡胶相似且橡胶草根组织具有高达20％的干胶。但是，每年干旱会导致橡胶严重减产，造成巨大的经济损失。

TkMYC2基因是一个橡胶草耐旱基因，在转TkMYC2基因的橡胶草的耐旱性得到很大提高，目前该基因的耐旱性功能尚未见报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种与橡胶草耐旱性状有关的基因TkMYC2，所述基因TkMYC2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的目的之二是提供由所述的基因TkMYC2编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的目的之三是提供扩所述基因TkMYC2的引物，上游引物如SEQ ID NO：3所示，下游引物如SEQ ID NO：4所示。

本发明的目的之四是提供一种含有所述的基因TkMYC2的表达载体。

本发明的目的之五是提供一种含有所述的基因TkMYC2的宿主菌。

本发明的目的之六是提供所述基因TkMYC2在橡胶草耐旱遗传改良中的应用。

本发明的目的之七是提供所述基因TkMYC2在转化双子叶植物以产生耐旱转基因双子叶植物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明发现橡胶草TkMYC2基因编码的蛋白属于bhlh家族转录因子，含有一个Pfam bHLH-MYC_N和一个螺旋-环-螺旋保守结构域。该基因受到PEG诱导表达量提高，说明TkMYC2基因是抗旱相关的转录因子。

2、本发明首次报道TkMYC2转录因子能够提高橡胶草抗旱性。首先对前期茉莉酸甲酯处理橡胶草的转录组数据进行分析，筛选出目的片段。针对TkMYC2基因进行PEG诱导处理。通过PCR技术克隆出橡胶草TkMYC2 cDNA全长，与35S植物表达载体构建重组质粒，转化至GV3101根癌农杆菌中。利用农杆菌介导的TkMYC2导入橡胶草中，获得过表达转基因橡胶草。然后过表达TkMYC2橡胶草进行干旱表型分析以及各项生理指标测定。结果显示，过表达TkMYC2橡胶草植株耐旱性明显提高，为提高橡胶草抗旱性，提供了一种新的解决途径。

附图说明

图1为TkMYC2基因克隆电泳检测图，图中，M：DNA MarkerⅢ；1：TkMYC2基因。

图2为TkMYC2保守结构域分析。

图3为重组质粒pMD-19T-TkMYC2酶切鉴定，图中，M：DNA MarkerⅢ；1和2：BamHⅠ和PstⅠ酶切pMD-19T-TkMYC2；3：pMD-19T-TkMYC2重组质粒。

图4为重组质粒pCAMBIA2300-TkMYC2酶切鉴定，图中，M：DNA MarkerⅢ；1：BamHⅠ和PstⅠ酶切pCAMBIA2300-TkMYC2；2：pCAMBIA2300-TkMYC2重组质粒。

图5为PEG诱导TkMYC2基因表达分析。

图6为TkMYC2橡胶草转基因苗鉴定，图中，M：DNA MarkerⅢ；条带1-3为过表达TkMYC2转基因植株，条带4、条带6、条带7为过表达载体阳性对照，条带5、条带8为过表达载体阴性性对照。

图7为转基因橡胶草TkMYC2表达量分析，图中，WT表示野生型；OE-#1表示过表达TkMYC2转基因株系1；OE-#15表示过表达TkMYC2转基因株系15，OE-#45表示过表达TkMYC2转基因株系45；**表示转基因与野生型存在显著性差异(P<0.01)。

图8为干旱胁迫下TkMYC2转基因橡胶草和野生型橡胶草表型比较，图中，WT：野生型橡胶草；#1、#15、#45：三个不同TkMYC2转基因橡胶草株系；Control：未处理组；Drought：干旱胁迫处理组。

图9为TkMYC2转基因橡胶草抗旱生理指标测定，图中，A：POD酶活测定；B：SOD酶活测定；C：CAT酶活测定；D：MDA含量测定；E：电导率测定；*表示转基因与野生型存在显著性差异(P<0.05)；**表示转基因与野生型存在显著性差异(P<0.01)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供的橡胶草TkMYC2基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例1

转TkMYC2基因橡胶草的获得

(1)橡胶草总RNA提取

利用RNA提取试剂盒(EasyPure Plant RNA Kit)提取总RNA，该试剂盒购于北京全式金生物有限公司。

1)将0.5g不同组织样品在液氮中迅速充分研磨成粉末，加入提前混匀的1ml BB6和10μLβ-巯基乙醇(现用现配)，涡旋剧烈震荡混匀。室温静置3min。

2)12 000rpm离心4min，小心吸取离心管中上清液至无RNA酶的离心管中

3)向上清中加入0.5倍体积无水乙醇(提前4℃预冷)，混匀。

4)涡旋混匀，分散沉淀。

5)将沉淀混合液加入离心管中，12 000rpm离心30s，弃流出液。

6)加入500μL CB6，12 000rpm离心30s，弃留出液。

7)向离心柱中央加入80μL Dnase1工作液，室温静置15min，重复实验步骤6一次。

8)加入500μL WB6，12 000rpm离心30s，弃流出液。

9)重复实验步骤7一次。

10)室温12 000rpm离心2min，彻底去除残余乙醇。

11)在离心柱中加50μL RNAase-free H2O，静置1min。

12)室温12 000rpm离心2min，洗脱RNA。

13)将RNA放置于-80℃保存。

(2)反转录成cDNA

利用反转录试剂盒(EasyScript One-Step gDNA Removal Kit and cDNASynthesis Supermix)将RNA反转录成cDNA，该试剂盒购于北京全式金生物有限公司。

1)总RNA 2.5μL、Anchored Oligo(dT)₁₈Primer 0.5μL、2×ES Reaction Mix 5μL、RT/RI Enzyme Mix 0.5μL、gDNA Remover 0.5μL、Rnase-Free Water 1μL，共10μL体系。

2)42℃孵育30min。

3)然后85℃加热5s。

(3)TkMYC2基因的克隆

用primer5.0设计特异性引物(表1)。

表1引物序列信息I

以橡胶草根cDNA为模板进行扩增，PCR反应体系为上下游引物各0.5μL、根cDNA模板1μL、PCR Mix 10μL、ddH2O 8μL，共20μL体系。PCR反应程序设置为预变性温度95℃5min；变性温度95℃20s，退火温度58℃20s，延伸温度72℃2min 30s，共35个循环；再延伸72℃8min。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后使用普通琼脂糖DNA回收试剂盒进行回收，结果如图1所示，利用Normal SMART MODE和NCBI数据库CD-search在线工具分析TkMYC2保守结构域，结果如图2所示。

将目的产物与pMD-19T载体进行连接构建pMD-19T-TkMYC2重组质粒，连接体系见表2，16℃连接过夜。

表2连接体系

(4)大肠杆菌转化

将10μL重组连接产物缓慢加入100μL大肠杆菌感受态中；用移液器轻轻地吹打使其混匀；立即进行30min冰浴处理；

1)在恒温水浴锅内42℃热激处理90s，立即迅速冰浴处理2～3min；

2)然后加入450μL LB培养基液体；在摇床上以37℃220rpm使其培养1h；

3)5000rpm离心5min，弃上清300μL；将剩余200μL菌液均匀涂布至携带抗生素(与载体对应的抗性)的LB固体培养基，37℃恒温培养过夜；

4)挑取阳性单菌落进行菌落PCR检测，提取质粒重组载体pMD-19T-TkMYC2，将重组载体送华大基因公司检测，结果如图3所示。

(5)植物过表达载体构建

利用primer 5.0软件设计带有酶切位点的引物(表3)，双酶切位点为BamHⅠ和PstⅠ。利用BamHⅠ和PstⅠ对携带有这两个酶切位点的重组质粒pMD-19T-TkMYC2和pCAMBIA2300(含有35S启动子)空载体分别进行双酶切，分别获得目的片段和载体片段，酶切体系为0.5μL BamHⅠ、1μL PstⅠ、2μL Tango Buffer、16.5μL载体，37℃酶切1h。将目的片段与载体片段进行重组连接(表4)和转化(同步骤(4))，50mg.L^-1kan抗性的平板上挑取阳性单菌落，进行菌落PCR验证(同步骤(4))和双酶切验证，提取质粒获得重组载体pCAMBIA2300-TkMYC2，送华大基因公司测序，结果如图4所示。

表3引物序列信息II

注：下划线部分为酶切位点，BamHⅠ(GGATCC)和PstⅠ(CTGCAG)

表4连接体系

(6)植物过表达重组载体转化农杆菌

通过农杆菌冻融转化法将pCAMBIA2300-TkMYC2重组质粒转化根癌农杆菌(GV3101)。

农杆菌冻融转化法如下：

1)移液枪吸取2μL重组质粒加入100μL农杆菌感受态中，缓慢吹打混匀；

2)将混合液冰上静置10min，立即迅速放入液氮中使其速冻5min，然后在37℃水浴锅中热激5min；

3)加入到不含任何抗生素1mL LB液体培养基，摇床温度和转速分别设置为28℃220rpm使其菌体恢复培养3h左右；

4)然后菌液以5000rpm的转速离心2min，弃菌体上清液，备留100μL上清液使其吹打菌体，充分混匀；

5)将菌液涂在含有三抗(Kan，Rif，Gen)的固体LB平板上，菌液一定要充分涂干；

6)平板倒置放入28℃恒温培养箱中，使其培养两到三天左右，直至有阳性菌落出现。

(7)农杆菌介导的橡胶草遗传转化

将橡胶草无菌苗剪成1cm×1cm左右小块正面朝上平铺在MS固体培养基上，暗培养2天。将携带pCAMBIA2300-TkMYC2重组质粒的根癌农杆菌于50mL的LB液体培养基中进行扩繁；220rpm 28℃震荡培养8h；5 000rpm 5min进行菌体离心收集菌体沉淀；吸取1mL MS液体培养基吹打沉淀呈菌悬液，将菌悬液加入50mL MS液体培养基中；同时加入10mmol.L^-1MES、10mmol.L^-1MgCl₂和200μmol.L^-1AS溶液。整个实验在无菌条件下操作。利用农杆菌侵染法将橡胶草叶盘与根癌农杆菌菌悬液进行共培养，220rpm 28℃震荡培养10～15min(共培养时间根据农杆菌菌液浓度而定)。将叶盘上表皮置于无菌滤纸上，用滤纸将橡胶草表皮细胞上多余菌悬液吸干，正面朝上放置在MS固体培养基的滤纸上，暗培养2d。将叶片转移到橡胶草愈伤诱导培养基上。经过多次倒板，防止培养基污染。等出芽较大时，转移到生根培养基中继续生根成苗。整个组培过程使用50mg.L^-1Kan抗生素进行转基因苗筛选。

实施例2

PEG诱导表达分析

将生长三个月的野生型橡胶草无菌苗进行三天的水培炼苗，炼苗方法如参考文献(De novo Transcriptome Sequencing of MeJA-Induced Taraxacum koksaghyz Rodinto Identify Genes Related to Rubber Formation)。用20％PEG处理野生型橡胶草使其完全浸没根部。PEG诱导时间梯度设置为0、6、12、24h，分别收集橡胶草根组织(叶基下1cm处)，尽可能保持相同部位取材；三个生物学重复，立即液氮速冻，放置-80℃冰箱保存。不同样品的根总RNA提取使用RNA提取试剂盒(EasyPure Plant RNA Kit)以及使用反转录试剂盒(EasyScript One-Step gDNA Removal Kit and cDNA Synthesis Supermix)的Anchored Oligo(dT)18引物来合成单链cDNA，实验方法与实例1步骤1)和步骤2)，为后续定量实验做准备。利用Primer 5.0设计定量引物(表5)；以GAPDH为内参基因在Light Cycler480System仪器上进行实时荧光定量PCR反应。反应程序为预变性温度95℃30s，变性温度95℃10s、退火温度58℃15s、延伸温度72℃20s，共45个循环。反应体系为PCR Mix 5μL，ddH2O4μL，上下游引物各0.25μL，cDNA模板量0.5μL，共计10μL体系。每个组织三个生物学重复和每个样品三个实验重复。采用2^–ΔΔCt方法计算TkMYC2基因在PEG诱导处理不同时间点的表达量。利用GraphPad Prism 8软件进行数据处理和分析。结果如图3所示。

表5引物序列信息III

实施例3

转TkMYC2基因橡胶草植株的鉴定

将实施例1成苗的转TkMYC2基因橡胶草进行2d室内炼苗，洗净根部多余培养基，移栽到营养土中。营养土由蛭石和腐殖质以1:2的比例组成。在栽培室内，正常条件下培养20d左右，候选转基因橡胶草的DNA提取按照试剂盒(EasyPure Plant Genomic DNA Kit)说明书方法进行。

1)取橡胶草叶组织0.5g，加入液氮充分研磨。

2)每个离心管加入250μL RB1和15μL Rnase A。

3)将样品加入步骤2的离心管中，混匀，55℃水浴15min。

4)12000rpm离心5min，吸取上清。

5)加入100μL PB1，混匀，冰浴5min，12000rpm离心5min。

6)吸取上清加入新的离心管中，加入375μL BB1，充分混匀。

7)将混合液吸入离心柱中，12000rpm离心30s，弃流出液。

8)加入500μL CB1，12000rpm离心30s，弃流出液。

9)加入500μL WB1，12000rpm离心30s，弃流出液。

10)重复步骤9)。

11)12000rpm离心2min，彻底去除WB1溶液。

12)将提前在65℃左右预热的100μL EB加入到离心柱中央，静置1min，12000rpm离心1min，洗脱DNA。

13)进行第二次洗脱，将DNA样保存-20℃冰箱。

TkMYC2过表达橡胶草本体中，使用35S引物作为上游引物和TkMYC2引物作为下游引物(表6)来验证转基因橡胶草植株，程序同实施例2，筛选出的成功过表达TkMYC2的转基因橡胶草植株记作T0代，结果如图6所示。

表6引物序列信息IV

实施例4

转TkMYC2基因橡胶草TkMYC2转录水平、干旱表型以及生理指标分析

(1)TkMYC2转录水平

收集T0代的过表达TkMYC2转基因橡胶草种子，种子萌发成小幼苗后移栽花盆中，记作T1代，每个盆种四株小幼苗。正常生长条件下，幼苗培养三个月。在RNA水平鉴定过表达TkMYC2转基因橡胶草，引物使用表5。总RNA提取如实施例1步骤1)，反转录过程如实施例1步骤2)。定量实验、数据分析、绘图方法均同实施例2，结果如图7所示。

(2)干旱表型

选择三个月大的T1代植株，在相同培养条件下，对转基因橡胶草和野生型植株进行自然干旱处理22d，拍照记录实验结果，结果如图8所示。

(3)生理指标

干旱胁迫处理转基因橡胶草和野生型植株，在干旱处理前进行采样收集野生型和过表达TkMYC2转基因橡胶草叶组织，立即液氮速冻，保存-80℃冰箱；直到干旱胁迫22d时，野生型与转基因植株表型存在明显的差异，再一次对它们的叶组织进行收集，液氮速冻，保存-80℃冰箱。橡胶草各项生理指标测定方法均采用南京建成生物生物工程研究所提供的试剂盒进行测定。实验方法参考试剂盒说明书。电导率测定使用电导仪(BANTE 540)，实验过程如：取野生型和转基因植物叶片0.5g，分别用蒸馏水冲洗三次，滤纸吸取组织表面水分。将叶片剪成1～2cm小长条(各15段)，将所剪材料放入50mL锥形瓶中，浸没叶片。室温放置2h后，用玻璃棒轻轻搅动叶片使其溶液混匀；用电导仪测定溶液中电导率。然后再放入沸水中充分煮沸30min，以达到植物组织死亡的目的，流水冲试管壁降温10min，在室温条件下测定该溶液的电导率。以上每个生理指标测定遵循三个生物学重复和三个实验重复，结果如图9所示。

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 石河子大学

<120> 橡胶草耐旱基因TkMYC2、蛋白质、引物、载体、宿主菌及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2055

<212> DNA

<213> 橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Rodin)

<400> 1

atgacggatt accggctaca gactatgaat cactggacct ccgatgagaa cgtttccatg 60

atcgatgcct tcataacttc cgacatggca tccatctggg ccaatccggc tgcttctcaa 120

tctcatacca acacgacggc gctacctgtt cctccggcgt cgtcatctgc ttcaacctcc 180

gatccgcaca agatagtcaa cgatttcaat ccggatactt tacagcaacg cctccagggg 240

ttgattgata cggcacggga gtcgtggact tacgctatat tctggcagtc gtctgacgtc 300

gattacacgg atactccggt gttggggtgg agagatgggt attacaaggg ggaggtgaat 360

aaggtgaaaa cgaagccgtc ggcgacttct ttggcggagc aacagtaccg gaagaaagtg 420

ctccgggagc ttaattcatt gatctctggc tcacaggcgc cggagagcga tgccgtggat 480

gaggaagtta ctgatacgga atggttcttt cttatctccg tgacgcagtc gtttgtcaac 540

ggtaacggtc ttcctggtca ggcggccttt agtaaccaac cggtttgggt ggccggacgg 600

gaacggttga tggcatctca ctgcgaacga gctcgtcaag gtcaaggttt tggattgcaa 660

acaatcgtgt gtatcccttc agccgatggg gttattgaat taggttcaac ggagttgata 720

tttcagagtg cagatgtgat gaagaaagtc aaggtttcgt ttaatttcag cggggatttg 780

atgcagatca gcacaataca gcctgccgga ggagataatg atccctcctc gatttggctt 840

acagatccgg tggctacatc tacggtgact accgacatcg caccaatcaa ggattccgtt 900

gacgtaatcg gctctcagac gacaagtgtc attccatcta ttacttcaca cgttcctaac 960

cctagctcca gttcgttacc tgaaaactcc agatacatta ataatcccaa tcgtgattcc 1020

ctacaaaatc aaggagtttt tggcagcagg gatttgaatt tctctgaatt tggatcggtc 1080

gacagagcaa ctgctggcag aaatgggaac actttatacc ctaagccaga atccggcaga 1140

atcctggatt tcagcgagag taaagggagt tctacaaaca acgcagcact gttctccggt 1200

caatcccagt tcctcggagc agaggagaac aacaacatca acaataagaa caagagcaag 1260

aagaagagat cgccaggttc gtgcggcagc aacgaagacg ggatgctttc tttcgtctcc 1320

ggtgtgctcc catcgtctag tatggggaaa tccgatggtg gcgctttcac tggagctgat 1380

cccgaccatt cagatctaga cgcatcgata atcagagaag tggaaagcat ccgagcggtg 1440

gaaccggaga aaaaaccacg aaaacgagga cgaaaaccgg cgaacggcag ggaggagcca 1500

ctgaatcatg tcgaagcaga gagacagagg agagagaaac taaaccagcg tttctacgct 1560

ctacgcgccg tcgtcccaaa cgtctcaaaa atggataaag cctcccttct cggcgacgcc 1620

atattataca tcaacgaact caaatcaaag ctcgacaaca ccgaatgcga caaagaagaa 1680

ctgagaaacc aaatcgacga actaaaaaga gaattactaa gcaaagaatc ccggcactca 1740

tcttcctccg ccatctcact cccggaagac atgaaaacgt cgaccacgac ccaccaaccc 1800

ccaatgaact tagatgtaga tgtgaaggtc atcggctggg acgccatgat tagggttcaa 1860

cgtaacaaaa agaaccaccc tgccgcccgg ctaatggcgg ctttgaaaga cctcgatttc 1920

gaagtcaacc atgctagtgt gtcggtggtg aatgatttga tgatccaaca agccaccgtg 1980

aaaatgggcg gtcggttgta cactcaagat cagctccgat tagccttaac aaacagattt 2040

tcagatccat tgtaa 2055

<210> 2

<211> 684

<212> PRT

<213> 橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Rodin)

<400> 2

Met Thr Asp Tyr Arg Leu Gln Thr Met Asn His Trp Thr Ser Asp Glu

1 5 10 15

Asn Val Ser Met Ile Asp Ala Phe Ile Thr Ser Asp Met Ala Ser Ile

20 25 30

Trp Ala Asn Pro Ala Ala Ser Gln Ser His Thr Asn Thr Thr Ala Leu

35 40 45

Pro Val Pro Pro Ala Ser Ser Ser Ala Ser Thr Ser Asp Pro His Lys

50 55 60

Ile Val Asn Asp Phe Asn Pro Asp Thr Leu Gln Gln Arg Leu Gln Gly

65 70 75 80

Leu Ile Asp Thr Ala Arg Glu Ser Trp Thr Tyr Ala Ile Phe Trp Gln

85 90 95

Ser Ser Asp Val Asp Tyr Thr Asp Thr Pro Val Leu Gly Trp Arg Asp

100 105 110

Gly Tyr Tyr Lys Gly Glu Val Asn Lys Val Lys Thr Lys Pro Ser Ala

115 120 125

Thr Ser Leu Ala Glu Gln Gln Tyr Arg Lys Lys Val Leu Arg Glu Leu

130 135 140

Asn Ser Leu Ile Ser Gly Ser Gln Ala Pro Glu Ser Asp Ala Val Asp

145 150 155 160

Glu Glu Val Thr Asp Thr Glu Trp Phe Phe Leu Ile Ser Val Thr Gln

165 170 175

Ser Phe Val Asn Gly Asn Gly Leu Pro Gly Gln Ala Ala Phe Ser Asn

180 185 190

Gln Pro Val Trp Val Ala Gly Arg Glu Arg Leu Met Ala Ser His Cys

195 200 205

Glu Arg Ala Arg Gln Gly Gln Gly Phe Gly Leu Gln Thr Ile Val Cys

210 215 220

Ile Pro Ser Ala Asp Gly Val Ile Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Ile

225 230 235 240

Phe Gln Ser Ala Asp Val Met Lys Lys Val Lys Val Ser Phe Asn Phe

245 250 255

Ser Gly Asp Leu Met Gln Ile Ser Thr Ile Gln Pro Ala Gly Gly Asp

260 265 270

Asn Asp Pro Ser Ser Ile Trp Leu Thr Asp Pro Val Ala Thr Ser Thr

275 280 285

Val Thr Thr Asp Ile Ala Pro Ile Lys Asp Ser Val Asp Val Ile Gly

290 295 300

Ser Gln Thr Thr Ser Val Ile Pro Ser Ile Thr Ser His Val Pro Asn

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ser Ser Leu Pro Glu Asn Ser Arg Tyr Ile Asn Asn Pro

325 330 335

Asn Arg Asp Ser Leu Gln Asn Gln Gly Val Phe Gly Ser Arg Asp Leu

340 345 350

Asn Phe Ser Glu Phe Gly Ser Val Asp Arg Ala Thr Ala Gly Arg Asn

355 360 365

Gly Asn Thr Leu Tyr Pro Lys Pro Glu Ser Gly Arg Ile Leu Asp Phe

370 375 380

Ser Glu Ser Lys Gly Ser Ser Thr Asn Asn Ala Ala Leu Phe Ser Gly

385 390 395 400

Gln Ser Gln Phe Leu Gly Ala Glu Glu Asn Asn Asn Ile Asn Asn Lys

405 410 415

Asn Lys Ser Lys Lys Lys Arg Ser Pro Gly Ser Cys Gly Ser Asn Glu

420 425 430

Asp Gly Met Leu Ser Phe Val Ser Gly Val Leu Pro Ser Ser Ser Met

435 440 445

Gly Lys Ser Asp Gly Gly Ala Phe Thr Gly Ala Asp Pro Asp His Ser

450 455 460

Asp Leu Asp Ala Ser Ile Ile Arg Glu Val Glu Ser Ile Arg Ala Val

465 470 475 480

Glu Pro Glu Lys Lys Pro Arg Lys Arg Gly Arg Lys Pro Ala Asn Gly

485 490 495

Arg Glu Glu Pro Leu Asn His Val Glu Ala Glu Arg Gln Arg Arg Glu

500 505 510

Lys Leu Asn Gln Arg Phe Tyr Ala Leu Arg Ala Val Val Pro Asn Val

515 520 525

Ser Lys Met Asp Lys Ala Ser Leu Leu Gly Asp Ala Ile Leu Tyr Ile

530 535 540

Asn Glu Leu Lys Ser Lys Leu Asp Asn Thr Glu Cys Asp Lys Glu Glu

545 550 555 560

Leu Arg Asn Gln Ile Asp Glu Leu Lys Arg Glu Leu Leu Ser Lys Glu

565 570 575

Ser Arg His Ser Ser Ser Ser Ala Ile Ser Leu Pro Glu Asp Met Lys

580 585 590

Thr Ser Thr Thr Thr His Gln Pro Pro Met Asn Leu Asp Val Asp Val

595 600 605

Lys Val Ile Gly Trp Asp Ala Met Ile Arg Val Gln Arg Asn Lys Lys

610 615 620

Asn His Pro Ala Ala Arg Leu Met Ala Ala Leu Lys Asp Leu Asp Phe

625 630 635 640

Glu Val Asn His Ala Ser Val Ser Val Val Asn Asp Leu Met Ile Gln

645 650 655

Gln Ala Thr Val Lys Met Gly Gly Arg Leu Tyr Thr Gln Asp Gln Leu

660 665 670

Arg Leu Ala Leu Thr Asn Arg Phe Ser Asp Pro Leu

675 680

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgacggatt accggctaca g 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggagggacct tcacctgata at 22

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggatccatga cggattaccg gctacag 27

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctgcagcaat ggatctgaaa atctgtttgt aa 32

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gctctagaac caacccccaa tgaat 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cctcgagacc gcccattttc ac 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgcctcattt aacatcatcc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtcataccac gaaaccagct 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccatcattgc gataaaggaa agg 23

Claims

1.一种与橡胶草耐旱性状有关的基因TkMYC2，其特征在于，所述基因TkMYC2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种由权利要求1所述基因TkMYC2编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.扩增权利要求1所述基因TkMYC2的引物，其特征在于，上游引物如SEQ ID NO：3所示，下游引物如SEQ ID NO：4所示。

4.一种含有权利要求1所述的基因TkMYC2的表达载体。

5.一种含有权利要求1所述的基因TkMYC2的宿主菌。

6.如权利要求1所述基因TkMYC2在橡胶草耐旱遗传改良中的应用。

7.如权利要求1所述基因TkMYC2在转化双子叶植物以产生耐旱转基因双子叶植物中的应用。