CN104774853B

CN104774853B - E3泛素连接酶基因OsPIW调控水稻根的功能与应用

Info

Publication number: CN104774853B
Application number: CN201510132891.0A
Authority: CN
Inventors: 赵毓; 蒋玮; 黄玉兰; 周道绣
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2015-03-26
Publication date: 2018-04-24
Anticipated expiration: 2035-03-26
Also published as: CN104774853A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及E3泛素连接酶基因OsPIW调控水稻根的功能与应用。分离并克隆到一个在根中表达量较高的RING H2家族蛋白，将编码这个蛋白的基因命名为OsPIW，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过RNAi的方法，得到该基因相应的抑制表达转基因水稻，发现该基因被抑制表达后，转基因植株主根长度和冠根数目明显比野生型对照植株变短、变少，主根的变短是由于分生区和伸长区长度变短引起的，而冠根数目变少主要是由于冠根起始滞后所致。进一步分析表明转该基因表达抑制后可以使根尖分生区细胞分裂速度变缓。这些研究结果表明该基因具有促进水稻根生长发育的功能。

Description

E3泛素连接酶基因OsPIW调控水稻根的功能与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一个E3泛素连接酶基因OsPIW在调控水稻根生长发育中的功能及应用。本发明所述的E3泛素连接酶基因OsPIW属于水稻RING-finger H2家族蛋白基因，我们通过转基因的方法对该基因在水稻根发育中的功能进行了分析，并提出其在农业生产上的应用价值。

背景技术

植物的根是位于土壤表面以下并能对周围环境因子变化做出快速应答的最重要器官。除此之外，根的正常生长与植物地上部分的生物量和对环境的适应性息息相关。对水稻根发育调控机理的研究有助于探究根对水稻产量、矿质元素和营养物质吸收以及生物和非生物胁迫中的作用。

双子叶模式植物拟南芥根系是由主根(Primary Root/PR)及其侧根(LateralRoot/LR)组成的直根系。而作为全球最重要的粮食作物水稻，其根系为须根系，其组成除了主根及其产生的侧根外，还具有在其一生中占有重要地位且发挥主要生物学功能的的冠状根(Crown Root/CR)(也叫不定根)及其侧根。到目前为止，水稻中已经鉴定并分离了一些调控冠根发育的基因，这些基因功能的研究对于我们进一步了解水稻根系的组成、发育及其对环境的适应性等方面起到了十分重要的作用。QHB是水稻中最早报道在根的不活动中心特异表达的WUSCHEL-type homeobox类基因(在拟南芥中同源基因是WOX5)，其超量表达的转基因植株中没有冠根的形成(Noriko Kamiya et al.,Isolation andcharacterization of a rice WUSCHEL-type homeobox gene that is specificallyexpressed in the central cells of a quiescent center in the root apicalmeristem.Plant Journal.2003,35,429-441)。CRL1在冠根起始部位合成，生长素通过降解AUXIN/INDOLE-3-ACETIC ACID蛋白从而诱导其表达，crl1突变体表现为冠根缺失，根的向重力性受损(Inukai et al.,Crown rootless1,Which Is Essential for Crown RootFormation in Rice,Is a Target of an AUXIN RESPONSE FACTOR in AuxinSignaling.Plant Cell,2005,17:1387–1396)。CRL4/OsGNOM1通过介导PIN家族蛋白的运输来调控水稻冠根的发育，其突变体几乎没有冠根的形成并且对重力的敏感性降低(Liu Set al.,Adventitious root formation in rice requires OsGNOM1and is mediated bythe OsPINs family.Cell Research,2009,19:1110-9)。水稻WUSCHEL-related Homeoboxgene WOX11通过调控细胞分裂素应答基因OsRR2影响冠根的发育(Zhao et al.,TheWUSCHEL-related homeobox gene WOX11is required to activate shoot-borne crownroot development in rice.Plant Cell,2009,21:736-48)。AP2/ERF(APETALA2/Ethylene-Responsive Factor)家族转录因子家族中CRL5(CROWN ROOTLESS 5)通过调控细胞分裂素应答基因OsRR1影响水稻冠根的发育，其突变体中冠根的起始受到影响，从而导致植株中冠根的数目变少(Kitomi et al.,The auxin responsive AP2/ERF transcriptionfactor CROWN ROOTLESS5 is involved in crown root initiation in rice throughthe induction of OsRR1,a type-A response regulator of cytokininsignaling.Plant Journal,2011,67:472-84)。从以上的研究结果来看，水稻根的发育与植物激素生长素和细胞分裂素密切相关。

植物在生长过程中不但要按照正常的时序进行分化发育，而且还要适应不同的环境条件，这就需要一个精确的调节机制及时合成相关的功能蛋白，同时也需要一定的机制及时清除已完成使命的蛋白。因此，蛋白质的降解及产生与其翻译后加工过程一样，对植物器官的生长发育起着非常重要的调节作用(Hellmann and Estelle,Plant development:regulation by protein degradation.Science,2002,297:793-797)。泛素(ubiquitin)是一种广泛存在于真核细胞中的小蛋白，由76个氨基酸组成，在酵母及动、植物等真核生物中高度保守(Hershko and Ciechanover,The ubiquitin system.Annual review ofbiochemistry,1998,67:425-479)，它的主要功能是标记细胞中需要分解掉的蛋白质，使其被水解。泛素/26S蛋白酶体途径(Ubiquitin/26S proteasome system,UPS)是目前研究较多的植物蛋白高效降解系统中的一种机制，也是真核生物中最精细的调控体系之一，主要负责真核细胞内蛋白的选择性降解。植物中很多重要途径的关键调节蛋白都受到泛素化修饰。该系统广泛地参与植物激素信号、光形态建成、植物衰老、自交不亲和反应、细胞周期调控、花的发育、生物钟节律和非生物胁迫响应等功能(Chen and Hellmann,Plant E3ligases:flexible enzymes in a sessile world.Molecular Plant,2013,6:1388-404)。泛素—蛋白酶体系统由泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)和26S蛋白酶体组成。植物中的E3泛素连接酶根据其结构域的不同可分为四大类型：HECT结构域家族、RING-finger结构域家族、U—box结构域家族和CRLs(cullin—RING Ligases)家族。HECT、RING、U—box结构域家族一般为单亚基E3；CRLs家族为多亚基E3，包括APC、BTB、DDB和SCF等4种多亚基复合体。RING-finger家族的E3发现较晚，数量庞大且功能复杂，是近年来研究的热点。其在结构上和U-box结构域比较相似，U-box通过盐桥、氢键或锌离子螯合作用来转移泛素，而RING结构域家族均包含相似的E2结合结构域和特异的底物结合部分，作为桥梁将活化的泛素从E2直接转移到靶蛋白，其本身并不与泛素发生作用(Joazeiro et al.,RINGfinger proteins:mediators of ubiquitin ligase activity.Cell,2000)。已经报道水稻基因组中有426个RING finger E3泛素连接酶，但是大多数的生物学功能还不是十分清楚。目前报道的E3泛素连接酶主要参与水稻的非生物胁迫(如抗旱、抗病反应)，而在调控水稻根发育方面的研究却很少。最近报道了水稻中一个RING-H2膜固定的泛素连接酶EL5，它可以与泛素结合酶OsUBC5b互作。进一步研究表明EL5在根原基起始后对维持分生区细胞活力起着重要作用。EL5是一种不稳定的蛋白质，可能被锌指结构域通过不依赖蛋白酶体的方式降解(Takai et al.,EL5,a rice N-acetylchitooligosaccharide elicitor-responsive RING-H2 finger protein,is a ubiquitin ligase which functions invitro in co-operation with an elicitor-responsive ubiquitin-conjugatingenzyme,OsUBC5b.Plant Journal,2002,30:447-455.；Koiwai et al.,RING-H2 typeubiquitin ligase EL5 is involved in root development through the maintenanceof cell viability in rice.Plant Journal,2007,51:92-104.；Mochizuki et al.,Ubiquitin ligase EL5 maintains the viability of root meristems by influencingcytokinin-mediated nitrogen effects in rice.Journal of Experimental Botany,2014,65:2307-2318)。

综上所述，水稻根的发育是受多种基因和植物激素的调控，而RING fingerE3泛素连接酶在调控水稻根发育中的作用机制并不是十分的清楚。

本发明从水稻数据库中筛选到多个RING finger类E3泛素连接酶基因，利用生物信息学和qRT-PCR的方法分析了这些基因在水稻根发育过程中的表达情况。分离并克隆出一个在根中表达量较高的RING finger类E3泛素连接酶基因，命名为OsPIW。通过转基因的方法，我们发现该基因被抑制表达后，转基因水稻植株主根长度变短、冠根数减少。细胞学研究表明该基因被抑制后，水稻根尖分生区变小，其细胞有丝分裂的频率降低；另外冠根的起始也滞后。这些结果表明该基因可能通过影响根尖分生区细胞分裂频率影响分生区的大小，最终导致水稻根的生长发育迟缓。

发明内容

本发明的主要目的是鉴定了一个参与调控水稻冠根发育的RING finger家族的E3泛素连接酶基因及分析其在水稻生产上的应用价值，该基因主要在根尖分生区表达。抑制其表达后，初生根(PR)长度和冠根(CR)数目变少，冠根(CR)分生区细胞变小，分生区细胞的分裂速度降低。

为了实现上述的目的，本发明通过以下技术方案实现：

从水稻数据库中筛选到多个在水稻根中高水平或者特异表达的RING finger家族的E3泛素连接酶基因。我们分离并克隆出了一个在根中表达量较高的基因，并其命名为OsPIW，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，由1503个碱基组成，编码的蛋白质序列是501个氨基酸，是序列1自5’端第1位碱基到1503位碱基组成(其中最后一个氨基酸是终止密码子)，如SEQ ID NO：2所示。

取野生型水稻发育不同时期的组织材料的mRNA,反转录成cDNA后，通过qRT-PCR检测发现OsPIW的表达量在根中较高(图1)，这说明OsPIW偏向于在水稻的根中表达，参与水稻根的生长发育。在此基因的保守结构域的C端设计一段该基因特异的片段，连接到一种用于抑制特异基因表达的载体pDS1301(图2A)上，然后转化水稻粳稻品种“中花11(zh11或称ZH11)”得到其转基因抑制水稻材料，在T2代转基因植株中，我们发现转基因植株在发芽1周、2周及水培40天时，其主根和冠根长度及数目明显比转基因阴性对照植株变短、变少(图3，4)，同时转基因阳性植株的根尖分生区、伸长区纵向变短；分生区的细胞明显变小(图5)；发芽3天、5天和7天冠根原基起始延缓(图6)。为了检测该基因是否影响水稻根分生区细胞的有丝分裂，我们将发芽3天幼苗的根置于含有EdU(一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶)染液的培养液中培养一段时间，发现阳性抑制植株的根分生区细胞的分裂水平明显低于其阴性对照植株(图7)。表明该基因主要是通过调控水稻根尖分生区细胞的分裂频率来调节水稻根分生区的大小的。与此同时，我们在转基因材料的根中发现，随着OsPIW表达量的下降，一些参与植物激素生长素和细胞分裂素信号转导途径上的一些基因的表达也收到了影响(图8)，这说明OsPIW对于水稻根发育的生长调控可能与这些激素密切而相关。

本发明的具体操作步骤如下：

1)扩增OsPIW基因的全长cDNA，将测序获得的序列与Rice Genome(http:// rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)上公布的水稻序列比对后，获知该基因的登录号为LOC_Os06g19680。根据测序的序列设计相关载体的引物，以水稻cDNA为模板，扩增其全长(翻译起始位点至下游1503个碱基)，获得DNA片段，如SEQ ID NO:1所示，所用引物序列如下：

OsPIW-F:5’-CGGGGTACCATGATTCGGCTGCAGACGTACG-3’,

OsPIW-R:5’-CGCGGATCCGTCGCTTTTTGTGTGCTCA-3’.

2)根据测序的OsPIW基因序列信息，设计双链抑制dsRNAi引物构建pDS1301基因抑制表达载体pDS1301-OsPIW，所用的引物DNA序列如下：

dsPIW-F:5’-GGGACTAGTGGTACCGAGTTCAGCCTGTTCC-3’，

dsPIW-R:5’-GGGGAGCTCGGATCCAGTTCCCTGGTAGTT-3’。

3)将步骤2)中扩增得到的片段用相应的限制性内切酶酶切，用相对应的限制性内切酶切割dsRNAi载体pDS1301，再用连接酶连接电转化到感受态DH10B中，获得转化载体OsPIW-pDS1301；利用农杆菌介导的转基因方法(Hieiet.al.,1994.Efficienttransformation ofrice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.Plant Journal.6:271-282)将所述的载体分别导入水稻受体中花11，获得转化植株dsPIW(依次命名为dsPIW 1-n，n＝1,2,3……代表转基因材料的不同家系)；

4)抽提转基因材料的基因组DNA和根组织的mRNA，用PCR和荧光定量PCR的方法分别鉴定转基因植株阳性及该基因的表达量；在培养基和水培条件下分析转基因植株根发育的表型，并进行统计分析；

5)通过细胞学方法分析转基因材料中根尖分生区的细胞数目、分生区大小，并进行统计分析；

6)将幼苗置于含有EdU(繁殖时期胸腺嘧啶替代剂)染液的培养液中培养一段时间，利用荧光显微镜观察根尖分生区细胞有丝分裂的频率；

7)在转基因抑制植株及对照植株根中检测根发育和生长细胞分裂素应答相关基因的表达；

与现有技术相比，本发明的优点如下：

水稻是全世界最重要的粮食作物之一，对缓解粮食短缺，尤其是保障我国的粮食安全有着重要的意义，如何提高水稻产量、品质已经成为一项具有重要意义的科学问题。根作为植物的重要器官，在整个植株的生长过程中发挥着重要角色，根的生长发育影响植株的生物量以及对环境的适应能力。水稻根的发育是受多种机制调控的，而RING finger类E3泛素连接酶在调控水稻根发育中的作用机制尚不清楚，本发明中所涉及的RING-H2类泛素连接酶基因OsPIW在水稻根发育过程中的作用。本发明通过遗传转化该基因双链抑制RNAi载体，得到相应的转基因植株。结果发现，抑制表达该基因后植株主根、冠根长度变短，冠根数目变少(图2、图3)。细胞学进一步研究表明该转基因植株中冠根变少的主要原因是是冠根原基起始延迟，起始之后的生长减慢(图5)。而生长减慢主要是由于分生区细胞的分裂频率降低引起的(图7)。与此同时，该基因抑制后，一些参与水稻冠根发育的A-type类的RR转录因子的表达发生了变化(图8)，表明该基因可能通过调节细胞分裂素信号来调节根尖细胞的分裂，从而调控水稻根的生长发育。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的RING H2类E3泛素连接酶基因OsPIW的核苷酸序列。序列长度为1503bp(含结尾处的终止密码子TGA)，编码501个氨基酸(第501位为终止密码子)。

序列表SEQ ID NO:2是E3泛素连接酶基因OsPIW编码的蛋白质序列。

序列表SEQ ID NO:3是本发明构建的的双链抑制RNAi载体(pDS1301-OsPIW)的核苷酸序列。序列长度为310bp。

图1：是OsPIW基因在幼苗(发芽10天)、幼叶(发芽15天)、成熟叶(剑叶)、茎(发芽15天)、愈伤(继代15天)、穗(4cm)、根尖(发芽15天)中RNA水平表达量检测。图中：纵坐标为相对表达量。

图2：是dsPIW材料构建载体示意图。其中：

图2A：OsPIW基因被抑制的特异片段位置示意图(抑制区段位置：1052-1361bp，红色方框标注)；图2B是该转基因植株所用抑制表达载体pDs1301的结构示意图。

图3：是转基因植株dsPIW中OsPIW表达量。图中：纵坐标为相对表达量。

图4：是dsPIW材料幼苗时期根表型及其统计分析。其中：

图4A：是dsPIW转基因阴性和对照植株初生根(PR)，冠根(CR)的形态学差异；图4B为其统计学分析，bar＝1cm。

图5：是dsPIW材料和阴性对照水培45天的表型。其中：

图5A：是dsPIW转基因和阴性对照植株在水培养液45天的形态差异，Bar＝5cm；图5B为这两种基因型材料冠根长度和冠根数目的统计学分析结果。

图6：是dsPIW和阴性对照根尖细胞学分析图。其中：

图6A：是dsPIW转基因和阴性对照植株中冠根(CR)分生区、伸长区的形态学比较(左边)和根尖分生区细胞纵向大小(右)；图6B为这两种基因型植株根尖分生区和伸长区长度的统计学分析，纵坐标为相对长度，单位：μm。

图7：是dsPIW转基因阳性和阴性对照植株冠根(CR)原基在种子萌发3天、5天和7天胚芽鞘节处冠根起始的情况比较。Bar＝100μm。

图8：dsPIW转基因阴性和对照植株冠根(CR)分生区细胞分裂频率比较。

图9：根发育和激素应答相关基因在dsPIW转基因植株与对照植株根中的表达量。

具体实施方式

实施例1：OsPIW基因的克隆

本发明的基因OsPIW的克隆(LOC_Os06g19680)主要通过RT-PCR的方法获得(方法参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，北京，科学出版社，2002版)。具体操作步骤如下：

1)抽提水稻品种“中花11”(中国农业科学院作物科学研究所惠赠)幼苗叶片RNA，RNA抽提用Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)；

2)RT-PCR反转录合成cDNA第一链的步骤如下：①配制混合液1：总RNA 4μg，DNaseI2U,10DNaseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA，②20分钟后将混合液1置于65℃水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液1中加入1μl500μg/ml的oligo(dT)，④将在冰上冷却的混合液1立即置于65℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟，⑤配制混合液2：混合液110μl，5×first strandbuffer 4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl，10mMdNTP mixture 1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时，⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴10分钟，⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司。

3)然后根据Rice Genome数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)公布的OsPIW基因的全长cDNA序列，设计引物PCR扩增片段。PCR用到的体系为20μl，具体配法为：cDNA第一链模板1μl，10×PCR buffer 2μl，10mMdNTP 1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，正向引物F和反向引物R各0.4μl，rTaq酶0.2μl，加水至20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、rTaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③58℃30秒，④72℃60秒，⑤从②－④循环35次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。

用来克隆OsPIW全长的引物为：

OsPIW-F:5’-CGGGGTACCATGATTCGGCTGCAGACGTACG-3’,

OsPIW-R:5’-CGCGGATCCGTCGCTTTTTGTGTGCTCA-3’.

最终得到OsPIW基因的全长cDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4)然后将扩增产物用KpnI和BamH I酶切，利用T4连接酶(购自美国Promega公司)连接到用对应酶酶切过的PVYCE(R)载体上。

实施例2：双链抑制dsRNAi载体的构建

根据Rice Genome数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)公布的OsPIW基因的全长cDNA序列，设计双链抑制dsRNAi引物，并在上游引物5’端添加SpeI和Kpn I限制性内切酶位点、在下游引物5’端依序添加Sac I和BamH I限制性内切酶位点。PCR扩增出该目的序列后，扩增产物通过T/A克隆连接到pGEMT-vector(购自美国Promega公司)进行测序验证其扩增的DNA片段如序列表SEQ ID NO:3所示。

具体步骤如下：

1)将带有OsPIW的RNAi片段的T/A克隆用Kpn I和BamHI限制性内切酶酶切，回收目标条带，与经Kpn I和BamHI酶切的载体质粒pDS1301(由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室已毕业博士储昭辉改造而成；图谱见图2B；参见文献：Chu等,Promoter mutationsof an essential gene for pollen development result in disease resistance inrice.Genes Development,2006,20:1250-1255.)连接(所使用的内切酶均购自宝生物工程大连有限公司，使用方法及用量按照该公司提供的产品说明书；连接酶购自美国Promega公司)；

2)将连接产物转到大肠杆菌DH10B感受态中，并挑取克隆子测序验证。

3)用Spe I和Sac I酶切相同的带有OsPIW的RNAi片段的T/A克隆和测序正确的含有第一链的质粒，并用DNA酶连接回收后的酶切产物、转化到大肠杆菌DH10B用载体引物测序验证。用来构建双链抑制dsRNAi载体的引物为：

dsPIW-F:5’-GGGACTAGTGGTACCGAGTTCAGCCTGTTCC-3’，

dsPIW-R:5’-GGGGAGCTCGGATCCAGTTCCCTGGTAGTT-3’。

最终得到的OsPIW基因双链抑制RNA载体pDS1301-OsPIW。

实施例3.OsPIW在水稻根生长发育中的功能验证，

本实施例的步骤如下所述：

A.双元Ti质粒载体的转化及转基因植株阳性和表达量检测：

1)实施例2中获得的载体pDs1301-OsPIW对水稻受体品种“中花11”进行转化，转化方法按照华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的标准方法(例如：专利号ZL200710053552.9，发明的名称：水稻广亲和基因S5的分离克隆及应用；专利公开号：CN101200725A；专利授权日：2010年04月21日的专利文献)进行。所获得的T0代转基因植株命名为dsPIW1-n,其中n＝1,2,3…代表转基因的不同家系。

2)取T0代转化植株叶片抽提总DNA。DNA抽提方法为CTAB法(Zhang等，geneticdiversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLPanalysis,1992,Theoretical and Applied Genetics,83,495-499)。以叶片总DNA为模板，用PCR方法对双链抑制T0代转化植株用载体第一链引物(pMCG1F和pMCG1R)和第二链引物(pMCG2F和pMCG2R)进行阳性检测。

所用载体引物如下：

pMCG1F：5'-CTGCTCCACACATGTCCATT-3’，

pMCG1R：5'-CCCACCATCTTGTGGAGCTA-3’；

pMCG2F：5’-GGCTCACCAAACCTTAAACAA-3’，

pMCG2R：5’-CTGAGCTACACATGCTCAGGTT-3’。

(以上引物均由上生物工程技术有限公司合成)

PCR反应总体积为20μl，具体配法是：模板100ng，10×PCR buffer 2μl，10mMdNTP1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，左、右引物(GUS-LF和GUS-LR)各0.4μl，r-Taq酶0.2μl,加去离子水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、r-Taq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③57℃30秒，④72℃1分钟，⑤从②－④循环32次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1％(质量/体积)的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测。因为载体第一链引物(pMCG1F和pMCG1R)和第二链引物(pMCG2F和pMCG2R)片段为转化载体所特有，这样能扩增出特异条带的转基因植株即为阳性植株。对T0代阳性植株收种子(称为T1代)，为T1代的大田种植和性状调查做准备。

3)为了检测双链抑制RNAi植株中目标基因的表达量，申请人采用Real-time PCR的方法对转基因T0代植株进行了表达分析。抽提了T0代转基因植株的总RNA并进行反转录，抽提用试剂为Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)，RT-PCR中反转录合成cDNA第一链的步骤如下：

①配混合液1：总RNA 4μg，DNaseI 2Μ,10×DNAseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA；

②20分钟后将混合液1置于65℃水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分钟；

③向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligo(dT)；

④将在冰上冷却的混合液1立即置于65℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟；

⑤配混合液2：混合液10μl，5×first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl，10mMdNTP mixture1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时；

⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴3分钟；

⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司。

得到产物后用实时荧光定量PCR的方法检测OsPIW的表达量。试剂购自宝生物工程大连有限公司，反应体系参见说明书。PCR仪为美国ABI公司的7500，PCR参数为95℃预变性10秒，进入循环后95℃变性5秒，60℃退火延伸40秒，45个循环。Real-time PCR所用引物序列为：

OsPIWRealtimePCR-F：5'-GCACGTGGTGCTGTTAGTTCA-3’

OsPIWRealtimePCR-R：5'-CAGCTGGATTTGCAACATCTCT-3’

最终得到的T0代双链抑制RNAi转基因植株中OsPIW表达量(图1)，家系1-12代表抑制表达转基因阳性植株不同家系的T1代植株，在所检测的12个家系中有11个家系RNA水平表达量下降，抑制效果较明显。

B.T2代性状调查和表达分析：

1)a.OsPIW转基因植株7天幼苗期表型统计及根尖组织和冠根原基组织切片分析；

发芽45天表型统计水稻种子于方皿生根培养基中生长7天后取dsPIW植株2个家系以及中花11各30株，发现OsPIW抑制植株地上高度普遍比野生型矮，冠根、初生根比野生型短，冠根数目比野生型少(图2A、2B)。

2)取发芽20天的dsPIW植株以及中花11各30株，于水培养混合液中培养45天，发现发芽45天OsPIW抑制植株地上高度普遍比野生型矮，冠根比野生型短，冠根数目比野生型少(图3)。

3)取发芽7天OsPIW的dsPIW及野生型根尖组织(长约1cm左右)，放入50％FAA固定液(甲醛5ml，冰醋酸5ml，50％酒精90ml)中固定后，在真空干燥箱(Hotpack Vacuum OVEN)中抽真空30min至组织不再有气泡冒出。室温下于50％甲醛溶液中继续固定24小时后，依次转移到75％、85％、90％和95％乙醇溶液中脱水1小时，最后于100％乙醇中加入曙红染料后继续脱水1小时，重复此步骤一次后用预渗透液(由等体积无水乙醇与base liquidTechnocit 7100混合而成)预渗透1-2小时，加入渗透液(1g硬化剂I溶于100mL baseliquid Technocit 7100中，现配现用)后渗透1-2小时(小于5小时)，65℃展片台上，先向半薄切片专用模具中加入150μl聚合液(1mL硬化剂II溶于15mL渗透剂中即可)，再用小镊子将材料轻放于模具右侧居中位置，待材料展平后迅速将模具滴满，65℃2小时烘干，(半薄切片中所用到的树脂，硬化剂，渗透剂等均购自HeraeusKulzer Dental公司)。转入37℃恒温箱(电热恒温隔水式培养箱，黄石恒丰医疗器械有限公司生产)中聚合3-4天，超薄切片机上切片，切片后于展片台上烘干切片，甲苯胺蓝染色5min,单蒸水漂洗掉染料，再于显微照相机上照相分析。选取清晰、可分辨组织切片进行分析和统计(见图4A、4B)，发现在植表达抑制植株分生区分生区、伸长区较对照植株明显变短，分生区及伸长区单个细胞也较对照植株明显变短，说明该基因可能通过细胞分裂和伸长影响根部生长发育。

1)取发芽3、5、7天OsPIW的dsRNA及野生型根尖及冠根原基组织，长约0.5cm左右，放入50％FAA固定液(甲醛5ml，冰醋酸5ml，50％酒精90ml)中固定后，在真空干燥箱(Hotpack Vacuum OVEN)中抽真空30min至组织不再有气泡冒出。室温下于50％甲醛溶液中继续固定24小时后，再分别用50％，60％，70％，80％，90％(体积/体积)脱水各1小时后，加入曙红染色过夜，除去染液后，用无水乙醇洗两次，每次1小时彻底挤出水分，再依次用乙醇:二甲苯＝体积比为1:1和1:3，以及纯二甲苯透明各1小时，再向其中加入碎的石蜡，待石蜡慢慢溶于二甲苯后再继续添加石蜡并置于37℃溶解，饱和后再置于60℃，直至饱和后再依次用溶于二甲苯的50％(体积比)，75％(体积比)和纯的石蜡替换，最后将材料包埋在纯的石蜡中，冷却后用于石蜡切片。切片后于展片台上烘干切片，甲苯胺蓝染色5min,单蒸水漂洗掉染料，再于显微照相机上照相分析。选取清晰、可分辨组织切片进行分析(5B)，发现OsPIW基因抑制后，植株的冠根起始速度变缓，造成冠根数目变少。

b.OsPIW基因在不同组织部位的表达

分别取水稻品种中花11不同生长时期的不同组织，用Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)抽提RNA，反转录后用荧光定量PCR仪检测OsPIW基因在幼苗(shoot)、幼叶(leaf)、成熟叶(mature leaf)、茎(stem)、愈伤(cali)、穗(panical)、根尖(root tip)中的表达量，结果如图6，由图可知，该基因在水稻不同组织中均有表达，其中幼叶中表达量最高，剑叶次之，而OsPIW在根中表达量较高.

c.OsPIW转基因植株中检测根发育和激素应答相关基因表达量

按本实施例A中方法分别抽取T2代转基因植株及阴性对照根部RNA，反转录得到cDNA，利用荧光定量PCR检测根发育相关基因表达量，使用检测引物如下：

OsRR1 LOC_Os04g36070-F:5'--3’AGGATCAGCAGATGCATGAATG

LOC_Os04g36070-R:5'--3’GAGACGCTGTACGTCCTTGCTT，

OsRR5 LOC_Os04g44280-F:5'--3’ACCGAATGTGAGCATGATTATCA

LOC_Os04g44280-R:5'--3’CCTTGACCTTCTTCAGGAGTTCATA，

OsCRL1 LOC_Os 03g05510-F:5'--3’GCGATGATGAGATCAACCTCC

LOC Os 03g05510-R:5'--3’TTGCTTCACTATGACGTTGCAC，

OsIAA18 LOC_Os05g44810-F:5'--3’TGCTTCCCTACACATTCAAAGC

LOC_Os05g44810-R:5'--3’AACAATCGCAAAAAATCCTCTCTT，

OsIAA21 LOC_Os06g22870-F:5'--3’AGCTGCTTTACCGTCGGTCAT

LOC_Os06g22870-R:5'--3’GGCGGCAATCAGATAATCCA，

OsIAA22 LOC_Os06g24850-F:5'--3’CCAGAGATGCAGCCCAAGAG

LOC_Os06g24850-F:5'--3’ACAGCGTAGCCCTCCAGGTT，

OsIAA25 LOC_Os08g01780-F:5'--3’TGTTGCAAGCTGATCCTGAAA

LOC_Os08g01780-F:5'--3’TGATAAAAGCAGCAATCGATCTTT，

OsIAA27 LOC_Os11g11410-F:5'--3’CAGGGCACACCGCAACTAC

LOC_Os11g11410-F:5'--3’CGGCAGAAGAAATTATGAGTCATCT。

d.OsPIW转基因植株根尖分生区细胞分裂频率的检测

用双蒸水按体积比为1000：1的比例稀释EdU溶液，制备适量50μM EdU培养基。每管加入100μL50μMEdU培养基，于室温光照培养2小时，弃培养基。用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞1～2次，每次5分钟。每孔加入50μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液。每孔加入1mL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液。每孔加入1mLPBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS。将材料排列整齐，用5％的琼脂糖覆盖，待冷却后使用振动切片机切片(100μm),每孔加入1mL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟。每管加入100μL的1×Apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液。加入1mL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2～3次，每次10分钟，弃渗透剂。每孔每次加入100μL甲醇清洗1～2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。激光共聚焦显微镜观察，发现OsPIW抑制表达植株的根尖分生荧光明显较野生型弱(图7)，说明OsPIW抑制后植株根尖分生速度变缓，OsPIW可能通过影响根尖分生区细胞分裂频率来影响冠根的生长发育。

特别说明：本发明专利申请得到"国家自然科学基金项目(31371468和J1103510)和新世纪优秀人才计划(NCET-12-0863)"的资助。

Claims

1.一种调控水稻主根长度变短和冠根数减少的方法，其特征在于，抑制水稻中核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的E3泛素连接酶基因OsPIW的表达。