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CN110467645A - 一种分离提取高纯度两性霉素b的方法 - Google Patents

一种分离提取高纯度两性霉素b的方法 Download PDF

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CN110467645A
CN110467645A CN201910593800.1A CN201910593800A CN110467645A CN 110467645 A CN110467645 A CN 110467645A CN 201910593800 A CN201910593800 A CN 201910593800A CN 110467645 A CN110467645 A CN 110467645A
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柳志强
张博
郑裕国
陈燏
张雨涵
姜圣贤
黄恺
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Zhejiang University of Technology ZJUT
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Zhejiang University of Technology ZJUT
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明涉及一种分离提取高纯度两性霉素B的方法。将烘干含有两性霉素B的菌丝体投入萃取罐并加入甲醇和盐酸水溶液调至PH＝3.0溶解两性霉素B，抽滤得到两性霉素B的提取液并过膜除去热源和大分子物质，然后在两性霉素B提取液中加入水和碱液调至PH＝6.0使其结晶沉淀，过滤得沉淀并干燥后获得高纯度两性霉素B固体。本发明采用固液分离去除发酵液中的杂质，提高了产品质量。通过超滤膜过滤热源和大分子物质和杂蛋白后进一步去除杂质，提高净化液质量。最后通过洗涤再次去除杂质，从而获得高纯度产品。所得产品颜色为浅黄色，纯度高，两性霉素B产品纯度为93％以上。

Description

一种分离提取高纯度两性霉素B的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种分离提取高纯度两性霉素B的方法。
(二)背景技术
两性霉素B(Amphotericin B，AmB)是由结节链霉菌(Streptomyces nodosus)产生的一种多烯大环内酯类抗生素，是一种黄色或橙黄色结晶粉。其菌株于1955年从委内瑞拉奥里诺科河三角洲的土样中收集分离获得，并发现其具有抗真菌活性。1959年，在结节链霉菌发酵液中提取获得AmB。1966年开始上市，已使用近半个世纪，目前仍然是临床上不可替代的抗真菌药物。AmB分子式C47H 73NO 17，分子量为924.09，结构式如下：
两性霉素B是第一个用于深部真菌感染的药物，能有效抑制念珠菌、隐球菌和曲霉菌等大多数真菌，同时还具有有效的抗病毒、寄生虫药性，例如阮病毒、利什曼原虫等。AmB的抗真菌作用机制为：AmB能与真菌细胞膜上的麦角固醇结合，在膜上形成微孔，使膜的通透性发生改变，最终导致重要的细胞内容物K离子、核苷酸、氨基酸等无节制的流失而造成菌体死亡。
然而AmB也会在较小程度上与哺乳动物细胞膜上的胆固醇相互作用，造成一定的副作用，特别是肾毒性。虽然其具有一定的副作用，但 AmB仍然是目前治疗人类深部全身性真菌感染的最重要一种抗生素。人们加强了对AmB新给药形式的研究，例如在20世纪90年代出现的 Abelcet、Ambisome脂质体药物；Amphocil胶状悬浮液药物等AmB脂质体、乳剂、纳米粒子等新形式药物，为了降低毒性，提高药物到达作用区域的效率。正如两性霉素的标准物质中存在杂质一样，两性霉素药品及脂质体中杂质的控制亦不容忽视。两性霉素作为微生物代谢产物，具有生物活性强、结构稳定性差、相关副产物多等特点，所以其质量的稳定可控和质量的优劣对于保障人民的用药安全至关重要。
两性霉素B是含37个碳原子组成的大环内脂七烯类的抗生素，无臭或几乎无臭，无味，有引湿性，在日光下易被破坏失效。由于其分子结构中亲水基团与疏水基团的不对称分布和带有酸碱性的特点，使得AmB在水相及大部分有机相中的溶解度极低。在二甲亚砜中溶解，在二甲基甲酰胺中微溶，在甲醇中极微溶解，在水、无水乙醇、氯仿或乙醚中不溶。在中性或酸性介质中可形成盐，其水溶性增高但抗菌活性会下降。由于两性霉素B的溶解特性，很多用于两性霉素分离的工艺为溶媒提取结晶和物理分离。
美国专利US4748117公开报道了一种用物理方法不加有机溶剂直接从发酵液中分离回收两性霉素B的方法。该方法在两性霉素B发酵112 小时后，先将发酵液加热至120℃几分钟诱导两性霉素B晶体形成，然后将发酵液冷却并保持至35℃，保持PH约7.0。再将溶菌酶加入发酵液中溶解菌丝体，通过离心分离方法将两性霉素B晶体与发酵液分离，从而获得两性霉素B。该方法对发酵液要求无不溶物较难达到以及分离设备要求严格，也没有分离热源物质，所得到的两性霉素B纯度低。
美国专利US4177265公开报道了一种增加两性霉素B在丙酮中溶解度并且提纯两性霉素B粗粉的方法。该方法将两性霉素B粗粉加入丙酮中，并加入助溶剂碘化钠增加两性霉素B在丙酮中溶解度，通过过滤，洗涤得到滤液，再将滤液与含有二甲基甲酰胺、甲醇和水的溶剂混合物混合，加入微量两性霉素B晶种，溶液在50～52℃搅拌10分钟确保完全转化为结晶产物，将浆液冷却至5℃并储存约16小时后，过滤得到纯化的两性霉素B结晶粉(962γ/mg).由于该方法应用多种溶剂结晶，不利于溶剂回收和再利用，经济效益低，不适合工厂大规模生产。
德国专利DE4002351公开报道了一种四元溶剂体系提纯和结晶两性霉素B粗粉的方法。该四元溶剂体系组分由甲醇，二甲基甲酰胺，二氯甲烷和水组成。先将两性霉素B粗粉加入甲醇和二甲基甲酰胺中，再加入一种酸(可以是任何酸)与两性霉素B形成盐有助于其溶解，在15～20℃下搅拌直至两性霉素B原料溶解，通过过滤分离不溶物得到两性霉素B 混合溶液，溶液再加入二氯甲烷和水的溶剂混合物混合。溶液温度冷却至 5-10℃加入碱将PH调至5-7，再将溶液加热至45-55℃使两性霉素B晶体析出，通过离心或过滤方法分离，再用丙酮和水溶剂对两性霉素B晶体进行洗涤，最好烘干得到纯化两性霉素B晶体。但是该方法使用多种溶剂进行结晶提纯，损耗大，不利于回收再利用，造成两性霉素B生产成本较高。
涂志英等人以两性霉素B二次精制品为原料,开发了一种新型的两性霉素B精制工艺:吸附结晶工艺。该工艺通过使用弱极性树脂对溶解在二甲基甲酰胺和柠檬酸混合液中的两性霉素B中呈弱极性杂质进行吸附，通过过滤得到两性霉素B提取液，向提取液加入三乙胺乙醇液调pH 值至5.5左右,温度降至8-10℃使两性霉素B结晶，通过抽滤洗涤再干燥得到两性霉素B纯化结晶体。该方法操作简便，但对原料要求较高，回收率较低。
如何以最经济、简洁的步骤得到高纯度两性霉素结晶粉，减少相关物质，减少异源杂质，在提高产品的安全性同时简化工艺、降低成本、提高产品竞争力是本领域技术人员着力解决的问题。
(三)发明内容
本发明目的本发明目的是一种分离提取高纯度两性霉素B的方法。
本发明采用的技术方案是：
一种分离提取高纯度两性霉素B的方法，所述方法包括：
(1)将含有两性霉素B的发酵液固液分离得到两性霉素B菌丝体，烘干得到菌丝体；
(2)烘干后的菌丝体投入萃取罐，加入甲醇，温度降至2～10℃，调节 pH至3.0～4.0，搅拌1～2小时后固液分离，得到提取液；
(3)提取液通过截留分子量为5000～30000Da的超滤膜，除去热源、杂蛋白和色素等大分子量杂质后得到两性霉素B净化液；
(4)两性霉素B净化液加入结晶罐，调节pH至5.0～6.5，升温至 20～25℃，保温1～2小时待结晶完成，固液分离，得到高纯度两性霉素B 结晶粉；
(5)两性霉素B结晶粉加入甲醇洗涤，洗涤后固液分离烘干粉碎得到两性霉素B成品。
所述含有两性霉素B的发酵液为结节链霉菌经发酵获得的发酵液。所述结节链霉菌为结节链霉菌CCTCC NO：M 2017426。
所述两性霉素B菌丝体可通过固液分离方式如离心、板框过滤等方式得到，通过干燥得干菌丝体。发酵过程中产生的水溶性蛋白及其他水溶性次级代谢产物等杂质随发酵液被舍弃。
步骤(2)所用甲醇为菌丝体质量的6～8倍。
步骤(2)pH值调至3.0，提取温度为4℃，搅拌时间90分钟。
步骤(3)中超滤膜为陶瓷膜或中空纤维膜。
步骤(4)调节pH为6.0，结晶温度25℃，结晶时间为90分钟。
步骤(5)固液分离可以采用传统的离心、抽滤、板框压滤等，将获得的两性霉素B结晶粉放入60℃烘箱烘干至水分介于2.0-5.0％，进而得到高纯度两性霉素B。将所得的两性霉素B结晶粉不断加入甲醇洗涤，除去杂质，得到更高纯度的产品。
本发明的有益效果主要体现在：
(1)固液分离去除发酵液中的杂质，提高了产品质量。通过超滤膜过滤热源和大分子物质和杂蛋白后进一步去除杂质，提高净化液质量。最后通过洗涤再次去除杂质，从而获得高纯度产品。
(2)工艺简单，使用有机试剂类别少，有利于回收再利用，对两性霉素B分离纯化效果显著，提高了产品纯度，为生产医药级原材料提供了更加安全可靠的保障，适合大批量规模工业化生产高纯度两性霉素B。
(3)所得产品颜色为浅黄色，纯度高，两性霉素B产品纯度为93％以上，现有方法的产品纯度一般为70％～90％，发酵液通过液相色谱进行检查AmB含量为9.2g/L，经纯化粗成品两性霉素B通过液相色谱进行检查AmB含量为14～16g/L。
(四)附图说明
图1为实施例1制备的两性霉素B滤液的HPLC图谱；
图2为实施例1制备的两性霉素B结晶粉粗品HPLC图谱；
图3为实施例2制备的两性霉素B结晶粉粗品HPLC图谱。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：摇瓶发酵产AmB
(1)种子液的制备：将实施例2制备的高产两性霉素B的结节链霉菌诱变菌划线至GYM平板，26℃培养4天，挑选单菌落，接种至种子培养基中，26℃、220rpm培养48h，获得种子液。
种子培养基按以下方法制得：蛋白胨20g，NaCl 8g，葡萄糖15g，酵母粉10g，CaCO31g，加水定容至1L，pH 7.0，121℃灭菌20min。
(2)发酵培养
500mL规格摇瓶装样100mL发酵培养基，发酵时按体积浓度4％接种种子液，26℃，220rpm发酵培养144小时，得两性霉素B发酵液。
发酵培养基组成：葡萄糖70g/L，牛肉膏8g/L，大豆蛋白粉8g/L，棉子粉10g/L，CaCO3 10g/L，KH2PO4 0.2g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0， 121℃灭菌20min。
实施例2：两性霉素B分离纯化
取两性霉素B发酵液50L(AmB含量8.4g/L)。将发酵液经板框过滤得湿菌丝，烘干，得到0.9kg干菌重，把烘干的菌丝投入萃取罐中，加入8L甲醇，降温至4℃，用盐酸调至pH3.0，搅拌30分钟，过滤得滤液。滤液通过450nm有机超滤膜过滤去除热源和大分子物质，获得净化液进入结晶罐，用氢氧化钠碱液调pH至6.0，升温至25℃，保温一个小时，结晶完成，静置分层。过滤得固体物(即AmB结晶粉)，不断加甲醇洗涤，除去杂质，最后烘干，粉碎，得AmB粗成品，粗成品通过实液相色谱进行检测，产量为16g/L，产品纯度为93.1％。
实施例3：两性霉素B分离纯化
取两性霉素B发酵液500L(AmB含量9.2g/L)。将发酵液经板框过滤得湿菌丝，烘干，得到7.5kg干菌重，把烘干的菌丝投入萃取罐中，加入70L甲醇，降温至4℃，用盐酸调至pH3.0，稳定一个半小时，过滤得滤液。滤液通过超滤膜过滤去除热源和大分子物质，获得净化液进入结晶罐，加入纯化水10L，用氢氧化钠碱液调pH至6.0，升温至25℃，保温一个半小时，结晶完成，静置分层。过滤得固体物(即AmB 结晶粉)，不断加甲醇洗涤，除去杂质，最后烘干，粉碎，得AmB粗成品，粗成品通过实液相色谱进行检测，产量为14～16g/L。再次进行甲醇萃取，用甲醇对粗品进行萃取，调节萃取液pH＝5.0-6.0，进行结晶，离心得到粗品。粗品加入丙酮，搅拌洗涤，离心，烘干后得两性霉素B成品，纯度为96.2％。
对比例1：
按照美国专利US4748117中的方法，取两性霉素B发酵112小时后发酵液(含960γ/ml AmB)加热至120℃几分钟诱导两性霉素B晶体形成，然后将发酵液冷却并保持至35℃，保持PH约7.0。再将溶菌酶加入发酵液中溶解菌丝体，冷却至室温后，通过离心分离方法将两性霉素B晶体与发酵液分离，从而获得两性霉素B。将分离得到的两性霉素B晶体在 15mmHg25℃下干燥3小时。干燥回收后的两性霉素B晶体含有AmB 79 γ/mg，总回收率为95％，纯度78.8％。
对比例2：
按照美国专利US4177265中的方法，将4.24g两性霉素B(含800γ/mg AmB)粗品加入到150ml烧杯中，加入55ml丙酮和22.41g碘化钠搅拌 60分钟，通过过滤分离得到滤液，滤饼用25ml丙酮洗涤，然后将洗涤液加入到滤液中。向滤液中加入98ml的N，N-二甲基甲酰胺，44.6ml的水， 49.4ml的甲醇和20mg的两性霉素B晶种。将混合液在50-52℃下保持10 分钟，再将混合液降温到5℃存放16小时，过滤得到纯化的两性霉素B 晶体。用50ml 75％甲醇水溶液洗涤晶体，过滤后将两性霉素B晶体并 40～45℃下真空干燥6小时。测得结晶两性霉素B 962γ/mg，重量为3.35g，纯度85.4％。
对比例3：
按照德国专利DE4002351中的方法，向565升甲醇中加入10kg两性霉素B粗品和225升二甲基甲酰胺，再加入约18.5kg水合柠檬酸，保持在15-20℃下搅拌直至材料基本溶解，然后将此浓溶液过滤澄清得到滤液，向滤液中加入约140升二氯甲烷，加入约225升冷却至5-10℃的水。然后使用40％(v/v)的三乙醇胺水溶液调节PH至6，将溶液加热至44-46℃约30分钟使产生两性霉素B结晶体，通过显微观察测定该产物已结晶时，将混合物在2-3小时内冷却至约10℃，然后过滤分离出纯化的两性霉素B 结晶体，并用约85升冷却的40％(v/v)甲醇水溶液洗涤，过滤后得到滤饼在约140升丙酮中调成浆，再次过滤后得到滤饼用28升丙酮洗涤，然后将得到的两性霉素B纯化晶体干燥至2％～6％的水含量，测得回收两性霉素B纯化晶体重量为9.7kg，纯度88.2％。

Claims (7)

1.一种分离提取高纯度两性霉素B的方法，所述方法包括：
(1)将含有两性霉素B的发酵液固液分离得到两性霉素B菌丝体，烘干得到菌丝体；
(2)烘干后的菌丝体投入萃取罐，加入甲醇，温度降至2～10℃，调节pH至3.0～4.0，搅拌1～2小时后固液分离，得到提取液；
(3)提取液通过截留分子量为5000～30000 Da的超滤膜，除去热源、杂蛋白和色素等大分子量杂质后得到两性霉素B净化液；
(4)两性霉素B净化液加入结晶罐，调节pH至5.0～6.5，升温至20～25℃，保温1～2小时待结晶完成，固液分离，得到高纯度两性霉素B结晶粉；
(5)两性霉素B结晶粉加入甲醇洗涤，洗涤后固液分离烘干粉碎得到两性霉素B成品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含有两性霉素B的发酵液为结节链霉菌经发酵获得的发酵液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在与所述结节链霉菌为结节链霉菌CCTCC NO：M2017426。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)所用甲醇为菌丝体质量的6～8倍。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)pH值调至3.0，提取温度为4℃，搅拌时间90分钟。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中超滤膜为陶瓷膜或中空纤维膜。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)调节pH为6.0，结晶温度25℃，结晶时间为90分钟。
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