CN102382158B - 一种高纯度两性霉素b的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用两性霉素B发酵液制备高纯度两性霉素B的方法。本发明制备的两性霉素B结晶粉的生物效价检测含量大于970γ/mg，HPLC检测含量大于95％，杂质含量低，适于工业化生产。

Description

一种高纯度两性霉素B的制备方法

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及到一种利用两性霉素B发酵液制备高纯度两性霉素B的方法。

背景技术

两性霉素B(AmphotericinB)是由结节性链霉菌(Streptomycesnodosus)产生的一种多烯大环内酯类抗生素，是一种黄色或橙黄色结晶粉。分子式为C₄₆H₇₃NO₁₇，分子量为924.09。两性霉素B的化学结构已经在20世纪70年代，通过X-ray衍射技术得到了确证(Mechlinski，W.；C.P.Schaffner，P.Gann.&g.Avitabile，StructureandabsoluteconfigurationofthepolyenemacrolideantibioticamphotericinB.Tetrahedronletter44：3873-3876(1970)，化学结构式如下：

两性霉素B临床上主要用于治疗系统性真菌感染，两性霉素B的抗真菌原理为通过与真菌细胞膜上麦角固醇特异性结合，从而分解细胞膜，使得细胞内容物外泄而导致真菌细胞死亡(Norman，A.W.，Spielvogel，A.M.，Wong，R.G.，Plyeneantibiotic-sterolinteraction.AdvLipidRes14：127-171(1976))，用于隐球菌、球孢子菌、念球菌、毛霉菌、曲菌等引起的全身感染，是一种疗效好但毒性也大的药物。

两性霉素B传统剂型的溶血性和肾松懈性副作用曾一度限制了该药品的使用，但是近年来AmB脂质体的发明，在保持抗菌活性不变的前提下，大大降低了毒副作用，使得该药物在临床上重新得到了广泛应用(SubiraM，MartinoR，etal，Low-doseamphotericinBlipidcomplexvs.conventionalamphotericinamphotericinBforempiricalantifungaltherapyofneutropenicfeverinpatientswithhematologicmalignancies-arandomized，controlledtrial.EurJHaematol72：342-7(2004))。正如两性霉素B的标准物质中存在杂质一样，两性霉素B药品及脂质体中杂质的控制亦不容忽视。两性霉素B已经被美国药典29版(UnitedStatesPharmacopoeia24thEditionNo.134)、英国药典2005版(BritishPharmacopoeia2005EditionNo.141)以及中国药典2005版(ChinesePharmacopoeia2005version)收载。两性霉素B作为微生物代谢产物，具有生物活性强、结构稳定性差、有关物质多等特点，所以其质量的稳定可控和质量的优劣对于保障人民的用药安全至关重要。

两性霉素B是含37个碳原子组成的大环内酯乳糖七烯类的抗生素，含有七个相连的双键结构，在其C-18上带有一羧基基团，决定了两性霉素B几乎不溶于水，在二甲亚砜中溶解，在二甲基甲酰胺中微溶，在甲醇中极微溶解，在无水乙醇、氯仿或乙醚中不溶。由于两性霉素B的溶解特性，很多用于两性霉素B分离的工艺为溶媒提取结晶和物理分离。

关于两性霉素B的分离纯化工艺，付瑞良等(抗生素工艺学下编[M].国家医药管理局，1992：28～30)公开了一种两性霉素B的提取方法，采用碱将发酵液的pH值调节至10.0-14.0后，固液分离得到两性霉素B提取液。将两性霉素B提取液酸化调pH值至5.0-7.0，析出50％左右两性霉素B产品。该方法得到的两性霉素B产品纯度较低(含量在50％左右)，即使再经过反复结晶和重结晶，两性霉素B甲酯、两性霉素A及其它单杂的含量仍然较高。

美国专利US4748117报道了一种不加有机溶剂而直接从发酵液中回收两性霉素B的分离方法。该方法在两性霉素B发酵结束时，首先将发酵液加热到120℃诱导两性霉素B晶体形成，然后冷却并保持温度为35℃，再加入溶菌酶溶解发酵液中的菌丝体，然后利用重力离心，从而获得两性霉素B。由于该工艺对发酵液质量和分离设备要求严格，没有脱热源工序，得到的两性霉素B纯度低。

美国专利US4177265公开了一种两性霉素B的结晶方法，该方法将两性霉素B粗粉加入碱溶解，过滤，洗涤后得到滤液，再向滤液中加入DMF、水、甲醇和两性霉素B晶种，在50-52℃搅拌10分钟后冷却到5℃，16小时后过滤，得到两性霉素B结晶粉(962γ/mg)。该方法应用多种溶剂结晶，不利于溶剂回收和再利用，因此不适合规模化生产。

美国专利US2908611报道了从发酵液中用极性溶剂如异丙醇、丁醇和丙酮，采用萃取法提取两性霉素B，从而获得了一种抗真菌混合物原液，浓缩后从中可分离两性霉素B。这些提取过程一般要求多级纯化，操作费用比较昂贵，同时这些工艺均属于溶媒提取结晶工艺，使用的溶剂量，损耗大，造成两性霉素B的生产成本较高。

如何以最经济、简洁的步骤得到高纯度两性霉素B结晶粉，减少相关物质，减少异源杂质，在提高产品的安全性同时简化工艺、降低成本、提高产品竞争力是本领域技术人员着力解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，得到高纯度两性霉素B。

本发明通过加入助滤剂，提高发酵液滤速，通过固液分离去除杂质含量高的滤液，得到菌丝体。在菌丝体中加入乙醇碱水溶解两性霉素B，收集两性霉素B的碱水提取液并通过膜过滤，脱色、除去热源和大分子量杂质和杂蛋白后，得到淡黄色净化液。然后在净化液中加入酸水得到两性霉素B沉淀，将沉淀干燥后得到高纯度两性霉素B固体。

具体地，本发明涉及一种高纯度两性霉素B的制备方法，包括下述步骤：

1)在两性霉素B发酵液中加入酸性物质和助滤剂，搅拌；

2)固液分离，得两性霉素B菌丝体；

3)加入醇和碱水，搅拌；

4)固液分离，得两性霉素B提取液；

5)膜超滤，得净化液；

6)调节pH值≤7.0，析出两性霉素B结晶；

7)固液分离，得两性霉素B结晶粉。

更具体地，本发明涉及一种高纯度两性霉素B的制备方法，包括下述步骤：

1)在常温条件下，在两性霉素B发酵液中加入酸性物质，调节pH值至2.0-4.0，加入助滤剂，搅拌30分钟-2小时；

2)固液分离，得到两性霉素B菌丝体；

3)5-30℃条件下，在两性霉素B菌丝体中加入质量百分比为40-80％的醇和pH值为9.0-12.0的碱水，搅拌1-3小时；

4)固液分离，得到两性霉素B提取液；

5)将两性霉素B提取液通过截留分子量为5000-30000Da的膜超滤，除去热源、杂蛋白和色素等大分子量杂质后得到净化液；

6)常温下，用酸调节净化液pH值至4.5-7.0，析出两性霉素B结晶；

7)固液分离两性霉素B结晶，得到两性霉素B结晶粉。

其中，步骤1)所述酸性物质为有机酸或无机酸，其中的有机酸优选草酸或乙酸，无机酸优选盐酸。助滤剂为珍珠岩或硅藻土，优选为硅藻土。助滤剂用量为发酵液体积的2％-10％(W/V)，优选为5％-7％(W/V)。搅拌时间为30分钟-2小时，优选为1-1.5小时。

其中，步骤2)中的两性霉素B菌丝体为通过传统的固液分离过程如离心、板框压滤等方式得到两性霉素B干燥的菌丝体。水溶性蛋白、发酵过程中产生的水溶性强的其他次级代谢产物等杂质位于发酵液中，随着固液分离过程被舍弃。

其中，步骤3)所述醇为甲醇或乙醇，所述碱水的量为菌丝重的2-6倍(V/W)，所述碱为氢氧化钾、氢氧化钠或有机碱。向两性霉素B菌丝体中加入醇-碱水的量为菌丝重的2-10倍(V/W)，优选为4-6倍。优选乙醇-碱水溶液，其中乙醇的重量百分比优选为60％-70％。碱水为氢氧化钾、氢氧化钠或有机碱的水溶液，优选为氢氧化钠的水溶液。碱水的pH值优选为11.0-12.0。碱水提取时的温度为5-30℃，优选为10-20℃。搅拌时间优选为2-3小时。

其中，步骤5)中的膜为陶瓷膜、不锈钢膜、中空纤维膜或其他材质的膜组件，优选为陶瓷膜膜组件，截留分子量为5000-30000Da(膜孔径为50-200nm)，更优选10000Da(200nm)的陶瓷膜。

其中，步骤6)调节pH值所用的酸类为盐酸、磷酸或有机酸，优选盐酸。调节净化液pH值优选5.5-6.5。

其中，步骤7)的固液分离可以采用常规手段，如离心、板框压滤等。

按照上述7个步骤得到两性霉素B结晶粉后，可以用真空干燥的方式在40-60℃条件下干燥至水分介于2.0-5.0％，进而得到高纯度两性霉素B。

本发明根据两性霉素B的溶解特性筛选到合适的提取溶剂，首次采用膜过滤这一绿色环保工序从提取液中将目的产物分别进行脱色、除杂和除热源和富集。

本发明取得了良好的技术效果：

1.固液分离过程中加入了助滤剂，提高了过滤速度，缩短了工艺周期。同时经过固液分离舍弃了含色素和蛋白质及其他极性大的杂质，提高了提取液的质量。

2.超滤膜分离技术的应用，去除了大部分色素、热源和大分子量杂质和杂蛋白后，提高了净化液的澄清度和质量。

3.工艺简洁，对两性霉素B纯化行之有效，提高了产品纯度，有效降低了色素比值，为生产药用级原料及两性霉素B脂质体提供了更加安全的技术保障，适于工业规模化生产高纯度两性霉素B。

4.所得产品颜色为浅黄色，纯度高。两性霉素B面积归一百分含量达到95％以上，生物检测效价达到970γ/mg以上，两性霉素B甲酯小于2.0％，两性霉素A小于2.0％，单杂小于0.5％，样品回收率大于70％。

附图说明

图1：实施例1制备的两性霉素B滤液的HPLC图谱；

图2：实施例1制备的两性霉素B结晶粉的HPLC图谱；

图3：实施例2制备的两性霉素B结晶粉的HPLC图谱；

图4：实施例3制备的两性霉素B结晶粉的HPLC图谱。

具体实施方式

下述实施例仅用于阐述实现本发明的方法，不应理解为对本发明的限制。

本发明所使用的两性霉素B发酵液均为华药新药研发有限责任公司用微生物培养手段，得到的两性霉素B发酵液。陶瓷膜为瑞通美邦生产的膜组件，型号为km1/fr1，盐酸、氢氧化钠等试剂均为市售。本发明使用的高效液相色谱仪为996型检测器，515泵(Waters公司)。

实施例1

取两性霉素B发酵液50.0L，发酵单位7.6g/L。在发酵液中加入2500g珍珠岩，用草酸调节pH值至3.0，搅拌30分钟后真空抽滤，得到12.3kg菌丝体。在菌丝体中加入40L质量百分比为60％的乙醇和用NaOH调节pH值至10.5的碱水(乙醇用量为24L，碱水加入量为16L)，温度维持在20℃搅拌1小时后真空抽滤，收集滤液(HPLC图谱见附图1)。将滤液通过孔径为200nm，型号为km1/fr1的陶瓷膜组件，进行脱色、除蛋白和脱热源，得到两性霉素B净化液。净化液用乙酸调节pH值至6.0-6.5使两性霉素B沉淀析出。离心分离结晶液得到两性霉素B结晶粉。用真空干燥的方式在40-60℃条件下干燥至水分介于2.0-5.0％，最后得到277.8g浅黄色两性霉素B结晶粉，样品回收率为72.6％。结晶粉面积归一百分含量达到96.5％，生物检测效价达到970γ/mg，两性霉素B甲酯小于2.0％，两性霉素A小于2.0％，单杂小于0.5％。(HPLC图谱见附图2)。

实施例2

取两性霉素B发酵液200.0L，发酵单位8.2g/L。在发酵液中加入10000g硅藻土，用乙酸调节pH值至2.5，搅拌1小时后真空抽滤，得到50.1kg菌丝体。在菌丝体中加入200L质量百分比为50％的甲醇和用NaOH调节pH值至11.5的碱水(乙醇用量为100L，碱水加入量为100L)，温度维持在30℃搅拌2小时后真空抽滤，收集滤液。将滤液通过孔径为50nm的陶瓷膜组件，进行脱色、除蛋白和脱热源，得到两性霉素B净化液。净化液用盐酸调节pH值至5.5-6.0使两性霉素B沉淀析出。离心分离结晶液得到两性霉素B结晶粉。用真空干燥的方式在40-60℃条件下干燥至水分介于2.0-5.0％，最后得到1232.3g浅黄色两性霉素B结晶粉，样品回收率为75.1％。结晶粉面积归一百分含量达到97.2％，生物检测效价达到982γ/mg，两性霉素B甲酯小于2.0％，两性霉素A小于2.0％，单杂小于0.5％。(见附图3)。

实施例3

取两性霉素B发酵液500.0L，发酵单位7.9g/L。在发酵液中加入27000g珍珠岩，用盐酸调节pH值至3.5，搅拌2小时后真空抽滤，得到253.7kg菌丝体。在菌丝体中加入600L质量百分比为70％的乙醇和用NaOH调节pH值至12.0的碱水(乙醇用量为420L，碱水加入量为180L)，温度维持在10℃搅拌3小时后真空抽滤，收集滤液。将滤液通过孔径为200nm的陶瓷膜组件，进行脱色、除蛋白和脱热源，得到两性霉素B净化液。净化液用盐酸调节pH值至5.5-6.0使两性霉素B沉淀析出。离心分离结晶液得到两性霉素B结晶粉。用真空干燥的方式在40-60℃条件下干燥至水分介于2.0-5.0％，最后得到2950.6g浅黄色两性霉素B结晶粉，样品回收率为74.1％。结晶粉面积归一百分含量达到97.5％，生物检测效价达到984γ/mg，两性霉素A小于2.0％，单杂小于0.5％，两性霉素B甲酯小于2.0％。(见附图4)。

Claims (7)

1.一种两性霉素B的制备方法，包括下述步骤：

1)在常温条件下，在两性霉素B发酵液中加入酸性物质，调节pH值至2.0-4.0，加入助滤剂，搅拌30分钟-2小时；

2)固液分离，得到两性霉素B菌丝体；

3)5-30℃条件下，在两性霉素B菌丝体中加入质量百分比为40-80％的醇和pH值为9.0-12.0的碱水，搅拌1-3小时；

4)固液分离，得到两性霉素B提取液；

5)将两性霉素B提取液通过截留分子量为5000-30000Da、膜孔径为50-200nm的陶瓷膜超滤，除去热源、杂蛋白和色素等大分子量杂质后得到净化液；

6)常温下，用酸调节净化液pH值至4.5-7.0，析出两性霉素B结晶；

7)固液分离两性霉素B结晶，得到两性霉素B粉末。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤1)所述酸性物质为有机酸或无机酸。

3.根据权利要求2的方法，其中有机酸为草酸或乙酸，无机酸为盐酸。

4.根据权利要求1的方法，其中步骤1)所述助滤剂为珍珠岩或硅藻土，用量为每100L发酵液加入2-10kg助滤剂。

5.根据权利要求1的方法，其中步骤3)为每kg菌丝体加入2-6L所述醇和碱水，所述醇为甲醇或乙醇，所述碱为氢氧化钾、氢氧化钠或有机碱。

6.根据权利要求1的方法，其中步骤6)所述酸为盐酸、磷酸或有机酸。

7.根据权利要求1的方法，其中步骤7)所述的经固液分离得到两性霉素B粉末后，用真空干燥的方式在40-60℃条件下干燥至水分介于2.0-5.0％，得到两性霉素B。