CN108976270B - 一种高纯度多拉菌素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度多拉菌素的制备方法，该方法将发酵液浸泡、分离，通过超滤膜进行纯化，再通过两次逆流萃取，得到的萃取液通过浓缩结晶。本发明的优点在于，工艺简单易行，得到的产品含量高。使用溶剂均全部可以通过较简单方式得到回收利用，生产成本降低，符合工艺绿色环保的大趋势。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种制备高纯度多拉菌素的方法。
背景技术
多拉菌素(doramectin，CAS号:117704-25-3)为20世纪90年代研制开发出的新一代大环内酯类抗寄生虫药，是以环已氨羧酸(cyclohexanecarboxylicacid)为前体，通过基因重组的阿维链霉菌(streptomyces avermitilis)新菌株发酵而成的一种阿维菌素类抗生素，是被认为目前阿维菌素族中最优秀的抗寄生虫药物之一，为内外兼杀剂，对线虫、节肢动物均有良好的驱杀效果，最早发现它驱杀寄生虫的能力是在驱鼠继代的蛇形毛圆线虫和杀兔痒螨的动物模型中，与其它市售的伊维菌素类产品比较，其抗寄生虫范围更广泛、效果更好，而且预防寄生虫再感染的有效时间更长，是目前具有开发潜力的兽用抗寄生虫药物。
中国专利CN201310383711.7“一种多拉菌素的分离纯化方法”中采用多次结晶的方式，混合溶剂种类较多，回收困难，不利于环保，且多次结晶必然导致收率偏低。其次专利中对菌渣萃取液采用浓度成膏状的方法，在实际生产中由于菌渣含水量及含量较低的问题，浓缩到后期需要将其浓缩到膏状，耗费的能源是很高的。
中国专利CN201310661993.2“一种高纯度多拉菌素的制备方法”中虽然对菌渣采用了干燥方法，降低了萃取液浓缩成膏状的难度，但是相应的干燥菌渣的动力成本依然不少。结晶溶剂依然难以常规方式回收，且得到产品的含量最高仅90％。
发明内容
为克服现有技术不足，本发明提供一种高纯度多拉菌素的制备方法，该方法将发酵液浸泡、分离，通过超滤膜进行纯化，再通过两次逆流萃取，得到的萃取液通过浓缩结晶。本发明方法工艺简单易行，得到的产品含量高；所使用溶剂均全部可以通过较简单方式得到回收利用，生产成本降低，符合工艺绿色环保的大趋势。
本发明技术方案如下：
一种高纯度多拉菌素的制备方法，包括以下步骤：
1)将多拉菌素发酵液过滤(可通过常规压滤)，得到菌渣(主要为菌丝体)；
2)向所得菌渣中加入极性溶剂，萃取，过滤，得到滤液；
3)调整步骤2)所得滤液中极性溶剂和水的浓度，使滤液中所述极性溶剂的浓度为70-73％(体积分数)；过滤；
4)将步骤3)所得滤液通过超滤膜进行超滤，得到超滤液；
5)将步骤4)所得超滤液进入逆流萃取器与第一溶剂进行萃取交换；
6)将步骤5)进行第一次逆流萃取交换后的超滤液再次进入逆流萃取器与第二溶剂进行萃取交换；
7)将步骤6)所得萃取液(即进行逆流萃取后的非水溶性的第二溶剂萃取液)浓缩到晶体析出，降温、养晶、过滤得到晶体；
8)将步骤7)所得晶体用丙酮溶解，滴加纯化水，降温、析晶、分离得到潮晶；
9)将所得潮晶真空减压干燥，即得到高纯度的多拉菌素结晶粉。
进一步地，步骤2)所述极性溶剂选自甲醇、乙醇等，优选为浓度75-80％(体积分数)甲醇溶液或乙醇溶液。
进一步地，步骤2)中，以g/mL计，菌渣干重与浓度75-80％甲醇溶液或乙醇溶液的重量体积比为1:5-7。
进一步地，步骤3)所用过滤介质的孔径≤0.22um；可采用除菌板过滤或者同样孔径的滤袋、钛棒过滤器；优选采用0.22um孔径的除菌板过滤。
进一步地，步骤4)所述超滤膜的孔径为6000-5000道尔顿。
进一步地，步骤5)所述第一溶剂选自甲苯、对二甲苯等；优选为甲苯。
进一步地，步骤5)所述第一溶剂的用量为超滤液体积的1/3-1/2。
进一步地，步骤6)所述第二溶剂为正庚烷和二氯甲烷的混合液，其中正庚烷与二氯甲烷的体积比例为1:3-1:1(例如1:3、1:2或1:1)；更进一步地，所述第二溶剂的用量为超滤液体积的1/4-1/2。
进一步地，步骤7)所述浓缩温度为40-45℃，和/或，结晶温度为10℃-20℃，和/或，养晶时间为6-8小时。
进一步地，步骤8)中，以g/mL计，潮晶与丙酮的重量体积比为1:4-5；和/或，所加入纯化水的量为丙酮体积的2.5-3倍。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。
本发明各原料均可市售获得。
具体地，上述高纯度多拉菌素的制备方法，包括以下步骤：
1)将多拉菌素发酵液过滤，得到菌渣(主要为菌丝体)；
2)向所得菌渣中加入浓度75-80％(体积分数)甲醇溶液；萃取，过滤，得到滤液；
以g/mL计，菌渣干重与浓度75-80％甲醇溶液的重量体积比为1:5-7；
3)调整步骤2)所得滤液中极性溶剂和水的浓度，使滤液中所述极性溶剂的浓度为70-73％(体积百分数)；过滤；所用过滤介质的孔径≤0.22um；
4)将步骤3)所得滤液通过孔径为6000-5000道尔顿的超滤膜进行超滤，得到超滤液；
5)将步骤4)所得超滤液进入逆流萃取器与甲苯进行萃取交换；甲苯用量为超滤液体积的1/3-1/2；
6)将步骤5)进行第一次逆流萃取交换后的超滤液再次进入逆流萃取器与第二溶剂进行萃取交换；
所述第二溶剂为正庚烷和二氯甲烷的混合液，其中正庚烷与二氯甲烷的体积比例为1:3-1:1；所述第二溶剂的用量为超滤液体积的1/4-1/2；
7)将步骤6)所得萃取液浓缩到晶体析出，降温、养晶、过滤得到晶体；所述浓缩温度为40-45℃，和/或，结晶温度为10℃-20℃，和/或，养晶时间为6-8小时；
8)将步骤7)所得晶体用丙酮溶解，滴加纯化水，降温、析晶、分离得到潮晶；以g/mL计，潮晶与丙酮的重量体积比为1:4-5；和/或，所加入纯化水的量为丙酮体积的2.5-3倍；
9)将所得潮晶真空减压干燥，即得到高纯度的多拉菌素结晶粉。
可采用本领域常规方法获得多拉菌素发酵液。
本发明还包括上述方法所制备的多拉菌素。进一步地，所述多拉菌素色谱纯度≥96.0％，含量≥94.0％；优选地，所述多拉菌素色谱纯度96.5％-98.1％，含量94.1％-96.0％。
本发明和现有技术优势的对比，主要优点在于，通过两次逆流萃取，选择性的纯化了产品，并将多次结晶整合为2次结晶，其中一次结晶溶剂采用的是逆流萃取的溶剂，减少了溶剂的种类。其次所有需要浓缩的溶剂均为比较容易挥发溶剂，浓缩耗能少，溶剂能够重复利用。例如庚烷和二氯甲烷的混合物，可以根据两者沸点的绝大差异，很轻松的分离两相。丙酮水溶液也是非常容易回收的溶剂。工艺对减少污染物外排，及有机溶剂的再利用提供了较好的条件，更靠近国家对绿色环保工艺的倡导。此外得到多拉霉素成品的含量达到了94-96％的水平，纯度高。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
在本发明中，多拉霉素的含量是指：多拉霉素固体在进行高压液相检测后，根据标准品计算出纯的多拉菌素在被检测多拉菌素固体中(要扣除固体检测出的水份占有的重量，即无水重量)占有的百分含量。以下实施例中提到的含量均为此含义。
高压液相上的纯度，仅仅表示在同一紫外条件下，多拉菌素在这堆有紫外吸收的物质中所占有的百分比。很多物质是没有紫外吸收的，或者杂质在紫外吸下收表现的含量和多拉菌素在实际的重量对比上没有任何参考。在以下实施例中均以色谱纯度表示。
实施例1
多拉菌素发酵液放罐，通过加入珍珠岩，压滤得到压滤菌渣2.3kg，向菌渣加入5倍的80％甲醇萃取，萃取完成压滤的萃取液体积为11.5L，高压液相检测多拉菌素含量46g。检测甲醇浓度为76％，加入去离子水调节甲醇浓度为73％。调节后的萃取液通过0.22um孔径的除菌板过滤。滤液倒入超滤机，在5000-6000道尔顿孔径范围的超滤膜中过滤。滤液体积20.1L。进行第一次逆流萃取，使用甲苯6.7L；超滤液进行第二次逆流萃取，使用正庚烷：二氯甲烷＝1:3，体积为10L；正庚烷和二氯甲烷混合的逆流萃取液倒入减压蒸馏釜进行浓缩结晶，浓缩温度控制在40-45℃，终点结晶温度为10℃，养晶时间为6小时。真空抽滤，得到约43g潮晶。用172mL的丙酮溶解潮晶，向丙酮溶液中加入430mL的纯化水，将析出晶体抽滤干，放入干燥箱内真空减压干燥，得到多拉菌素32.2g，色谱纯度检测96.5％，含量94.1％，收率70％。
实施例2
多拉菌素发酵液放罐，通过加入珍珠岩，压滤得到压滤菌渣1.47kg，向菌渣加入7倍的75％甲醇萃取，萃取完成压滤的萃取液体积为10.3L，高压液相检测多拉菌素含量41g。检测甲醇浓度为73％，加入去离子水调节甲醇浓度为72％。调节后的萃取液通过0.22um孔径的除菌板过滤。滤液倒入超滤机，在5000-6000道尔顿孔径范围的超滤膜中过滤。滤液体积23.6L。进行第一次逆流萃取，使用甲苯11.8L；超滤液进行第二次逆流萃取，使用正庚烷：二氯甲烷＝1:1，体积为5.9L；正庚烷和二氯甲烷混合的逆流萃取液倒入减压蒸馏釜进行浓缩结晶，浓缩温度控制在40-45℃，终点结晶温度为20℃，养晶时间为8小时。真空抽滤，得到约38g潮晶。用190mL的丙酮溶解潮晶，向丙酮溶液中加入570mL的纯化水，将析出晶体抽滤干，放入干燥箱内真空减压干燥，得到多拉菌素26.65g，色谱纯度检测98.1％，含量96.0％，收率65％。
实施例3
多拉菌素发酵液放罐，通过加入珍珠岩，压滤得到压滤菌渣2.1kg，向菌渣加入6倍的77％甲醇萃取，萃取完成压滤的萃取液体积为12.5L，高压液相检测多拉菌素含量47g。检测甲醇浓度为75％，加入去离子水调节甲醇浓度为72％。调节后的萃取液通过0.22um孔径的除菌板过滤。滤液倒入超滤机，在5000-6000道尔顿孔径范围的超滤膜中过滤。滤液体积25L。进行第一次逆流萃取，使用甲苯10L；超滤液进行第二次逆流萃取，使用正庚烷：二氯甲烷＝1:2，体积为8.3L；正庚烷和二氯甲烷混合的逆流萃取液倒入减压蒸馏釜进行浓缩结晶，浓缩温度控制在40-45℃，终点结晶温度为13℃，养晶时间为7小时。真空抽滤，得到约41g潮晶。用184.5mL的丙酮溶解潮晶，向丙酮溶液中加入500mL的纯化水，将析出晶体抽滤干，放入干燥箱内真空减压干燥，得到多拉菌素35.25g，色谱纯度检测97.6％，含量95.7％，收率75％。
实验例1
多拉菌素发酵液放罐，通过加入珍珠岩，压滤得到压滤菌渣2.3kg，向菌渣加入5倍的80％甲醇萃取，得多拉菌素菌渣甲醇萃取液，加入去离子水调整甲醇浓度为70％，高压液相检测纯度为68.2％；取少量浓缩干燥检测含量为46.1％。通过5000-6000道尔顿的超滤膜，得到的超滤液进行逆流萃取实验。
多拉菌素发酵液放罐，通过加入珍珠岩，压滤得到压滤菌渣2.3kg，向菌渣加入5倍的80％乙醇萃取，得多拉菌素菌渣乙醇萃取液，加入去离子水调整乙醇浓度为72％，高压液相检测纯度为70.1％；取少量浓缩干燥检测含量为47.3％。通过5000-6000道尔顿的超滤膜，得到的超滤液进行逆流萃取实验。
分别取两种极性溶剂组成的超滤液进行逆流萃取实验，检测萃取后多拉菌素的色谱纯度、含量，并计算收率。结果见下表：
一次逆流萃取主要的目的是去除超滤液中极性比多拉菌素弱的杂质，包括部分色素及很多高压液相紫外检测不到的杂质，通过第一次逆流萃取起到的纯化作用大部分体现在多拉菌素绝对含量的提高上，少部分体现在色谱纯度上(液相图谱中，在多拉菌素之后出现的杂质峰个数及含量的减少)。
而第二次逆流萃取，主要是将超滤液中的多拉菌素转移到庚烷和二氯甲烷组成的混合溶剂中，主要纯化作用是去除超滤液中极性较强的色素和杂质，主要表现在色谱纯度的提高(液相图谱中，在多拉菌素之前出现的杂质峰个数及含量的减少)，含量的少量提高。
纯化作用的原理就是多拉菌素及杂质在两种不同的，相容度不高的溶剂中的分配情况来分离的。两种溶剂的极性和多拉菌素、杂质溶解强度的不同导致了两相中杂质和多拉菌素的含量不同，恰当的比例既可以让多拉菌素和杂质尽可能的分离，也能保证分配过程中多拉菌素较高的收率。在平衡过程中，大体趋势表现为：第一次逆流萃取是将杂质转出被萃取相，两相极性差异大，杂质和多拉菌素分配效果(色谱纯度和含量)会较高，但是收率会偏低；两相极性差异小，则效果相反。第二次逆流萃取是将多拉菌素转出到萃取溶剂，那么两相极性差异大，杂质和多拉菌素分配效果(色谱纯度和含量)会较差，但是收率会偏高；两相极性差异小，则效果相反。但是逆流萃取的两相体积的比例也会影响到分配的效果，例如：两相极性差异大，但是适当的增大被萃取相与萃取相的体积比例，也可以起到提高色谱纯度和含量的作用；两相极性相差小，但是适当减少被萃取相与萃取相的比例，收率也可以有明显的提高。
最佳参数比例需要多方去实验，找到最佳的比例，不仅体现在纯度、含量、收率上。也体现在溶媒使用量导致的生产成本、动力成本、环保成本上。所以每种不同情况的发酵来料，也可能导致最佳比例的大相径庭。
上述实验例1中列举的实验数据，仅仅对逆流萃取分离参数设置原理的一个展示，本发明通过大量实验确认了一个相对集中的，可以兼顾大多数发酵液来料情况，而得到结果相近的逆流萃取控制参数范围。但最优参数必须是根据发酵液来料的具体情况利用本发明思路来实验确认的。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种高纯度多拉菌素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将多拉菌素发酵液过滤，得到菌渣；
2)向所得菌渣中加入极性溶剂，萃取，过滤，得到滤液；所述极性溶剂选自甲醇、乙醇；
3)调整步骤2)所得滤液中极性溶剂和水的浓度，使滤液中所述极性溶剂的浓度为70-73％；过滤；
4)将步骤3)所得滤液通过超滤膜进行超滤，得到超滤液；
5)将步骤4)所得超滤液进入逆流萃取器与第一溶剂进行萃取交换；所述第一溶剂选自甲苯、对二甲苯；
6)将步骤5)进行第一次逆流萃取交换后的超滤液再次进入逆流萃取器与第二溶剂进行萃取交换；所述第二溶剂为正庚烷和二氯甲烷的混合液，其中正庚烷与二氯甲烷的体积比例为1:3-1:1；
7)将步骤6)所得萃取液浓缩到晶体析出，降温、养晶、过滤得到晶体；
8)将步骤7)所得晶体用丙酮溶解，滴加纯化水，降温、析晶、分离得到潮晶；
9)将所得潮晶真空减压干燥，即得到高纯度的多拉菌素结晶粉。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述极性溶剂为浓度75-80％甲醇溶液或乙醇溶液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，以g/mL计，菌渣干重与浓度75-80％甲醇溶液或乙醇溶液的重量体积比为1:5-7。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所用过滤介质的孔径≤0.22um；和/或，步骤4)所述超滤膜的孔径为6000-5000道尔顿。
5.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤5)所述第一溶剂的用量为所述超滤液体积的1/3-1/2。
6.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤6)所述第二溶剂的用量为所述超滤液体积的1/4-1/2。
7.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤7)所述浓缩温度为40-45℃，和/或，结晶温度为10℃-20℃，和/或，养晶时间为6-8小时。
8.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤8)中，以g/mL计，潮晶与丙酮的重量体积比为1:4-5；和/或，所加入纯化水的量为丙酮体积的2.5-3倍。
9.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将多拉菌素发酵液过滤，得到菌渣；
2)向所得菌渣中加入浓度75-80％甲醇溶液；萃取，过滤，得到滤液；以g/mL计，菌渣干重与浓度75-80％甲醇溶液的重量体积比为1:5-7；
3)调整步骤2)所得滤液中极性溶剂和水的浓度，使滤液中所述极性溶剂的浓度为70-73％；过滤；所用过滤介质的孔径≤0.22um；
4)将步骤3)所得滤液通过孔径为6000-5000道尔顿的超滤膜进行超滤，得到超滤液；
5)将步骤4)所得超滤液进入逆流萃取器与甲苯进行萃取交换；甲苯用量为超滤液体积的1/3-1/2；
6)将步骤5)进行第一次逆流萃取交换后的超滤液再次进入逆流萃取器与第二溶剂进行萃取交换；所述第二溶剂为正庚烷和二氯甲烷的混合液，其中正庚烷与二氯甲烷的体积比例为1:3-1:1；所述第二溶剂的用量为超滤液体积的1/4-1/2；
7)将步骤6)所得萃取液浓缩到晶体析出，降温、养晶、过滤得到晶体；所述浓缩温度为40-45℃，和/或，结晶温度为10℃-20℃，和/或，养晶时间为6-8小时；
8)将步骤7)所得晶体用丙酮溶解，滴加纯化水，降温、析晶、分离得到潮晶；以g/mL计，潮晶与丙酮的重量体积比为1:4-5；和/或，所加入纯化水的量为丙酮体积的2.5-3倍；
9)将所得潮晶真空减压干燥，即得到高纯度的多拉菌素结晶粉。
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