CN107474088B - 一种用于多杀菌素工业化大生产的提取工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于多杀菌素工业化大生产的提取工艺，包括步骤：发酵液预处理，板框过滤，闪蒸烘干；甲醇浸泡菌丝；浓缩浸提液，转相水洗；使用酒石酸反萃取；调节ph离心得到多杀菌素粗品；利用甲醇重结晶得到多杀菌素精品。本发明采用菌丝分离烘干后浸提的方式提取多杀菌素，浸取效率高，溶媒使用量小，仅为发酵液直接溶媒萃取的一半，且能耗相对较低，生产周期缩短；另外，板框过滤、闪蒸烘干、浸提、浓缩、水洗、反萃取、精制所需的设备比较普遍，很容易实现工业化生产；所得产品收率高，达到了85％～90％，采用溶媒重结晶纯化多杀菌素粗结晶后提升了多杀菌素的质量，产品含量达到了95％～98％。

Description

一种用于多杀菌素工业化大生产的提取工艺

技术领域：

本发明涉及一种用于多杀菌素工业化大生产的提取工艺，属于多杀菌素制备技术领域。

背景技术：

多杀菌素是一种由土壤放线菌多刺甘蔗多孢菌在培养介质下经有氧发酵后产生的次级代谢产物，具有对害虫广谱高效、对人、非靶标动物和环境安全、可生物降解的优异特点，并因此获得美国“总统绿色化学品挑战奖”。由于多杀菌素能有效防治多种储粮害虫、用药量极少、安全高效、低残留，因而被认为是一种极具前景的“绿色”储粮防护剂。

对于多杀菌素的提取，国内工艺的研究多数集中在溶媒萃取法和树脂吸附提取法，虽然树脂吸附提取法在一定程度上有较好的的效果，如纯度较高，但是在大规模工业化生产上，树脂吸附提取工艺存在处理量小、对设备要求高，耗时长、成本高等缺陷；虽然溶媒萃取法能在一定程度上克服这些缺点。但目前对多杀菌素的研究开发大多只停留在实验室小试阶段，无法进行工业化生产。

中国专利文献CN 101906124 B公开了一种从刺糖多孢发酵液中提取多杀菌素的工艺：它是将发酵液经过预处理后，加入高介电常数极性有机溶剂浸泡提取多杀菌素，进行固液分离，收集浸提清液，然后通过真空浓缩，挥发除去高介电常数极性溶剂，得到多杀菌素浓缩液；然后加入低介电常数或高碳醇萃取溶媒进行萃取，得到负载有机相；加入酸水进行反萃取，收集反萃取相；用NaOH溶液调节pH值＝8.5～11.5，使多杀菌素沉淀，过滤，用稀碱液将多杀菌素沉淀洗涤1～3次，真空干燥，得到多杀菌素粉剂。该工艺采用萃取与反萃取相结合的技术路线，所需设备发展相对成熟，较容易实现工业化生产。但由于该工艺采用的是发酵液直接溶剂萃取法，需要较大溶媒浸提(1.5倍发酵液体积)才能保证多杀的浸提收率，且浸提完成后还需要进一步将浓缩除去高介电常数极性溶剂，该过程存在溶媒使用量大，除去溶剂需要能耗较大，生产周期长(发酵液需搅拌提取4～20h)等问题；另外多杀菌素沉淀出多杀菌素粗品后该工艺仅采用稀碱液洗涤的方法未能较好的提高多杀菌素的内在质量，粗品的大部分色素以及调碱一同析出的杂质无法根除，且产品晶型较差(因为调碱析出结晶速率较快)。

发明内容：

针对现有多杀菌素工业化生产工艺中存在的溶媒使用量大、能耗高、生产周期长、产品内在质量较差等的技术问题，本发明提供一种低溶媒、高收率多杀菌素的工业化提取方法。

本发明的技术方案如下：

一种低溶媒、高收率多杀菌素的工业化提取方法，包括步骤如下：

(1)向发酵液中加入珍珠岩助滤剂、黄血盐和硫酸锌，混合均匀，然后升温至85-90℃，保温搅拌1-3小时，得预处理后发酵液；

(2)预处理后发酵液利用板框压滤机过滤，收集滤饼；

(3)将收集得到的滤饼闪蒸干燥至含水量为5％～10％，得到干菌丝；

(4)将干菌丝投入到浸提柱中，用低沸点有机溶剂浸泡1～2小时，从浸提柱顶端通入氮气，收集有机溶剂浸提浓液，然后以每小时0.3～0.5m³的流速从顶端加入低沸点有机溶剂进行洗脱，当料液效价达到100u/ml时停止，合并浸提液；

(5)合并后的浸提液真空浓缩除去低沸点有机溶剂，浓缩至油膏状，按照油膏重量：非水溶性有机溶剂体积＝1:5～6，单位：kg/m³；加入非水溶性有机溶剂，升温搅拌溶解，得到多杀菌素转相液；

(6)多杀菌素转相液进行水洗，水洗后的转相液中加入酸水进行反萃取，静置分层，收集酸水相；

(7)除酸水相中的有机溶剂，调节ph＝9.0～11.0，过滤得到多杀菌素粗结晶；

(8)向多杀菌素粗结晶中加入结晶溶剂，升温溶解后过滤除去不溶性杂质，收集滤液，真空浓缩滤液，然后缓慢滴加纯化水，缓慢降温至5～10℃，养晶，离心，真空烘干后，得到多杀菌素精粉。

根据本发明优选的，珍珠岩助滤剂的加入量为多杀菌素发酵液体积的1-4％，黄血盐的加入量为多杀菌素发酵液体积的0.2-0.6％，硫酸锌的加入量为多杀菌素发酵液体积的0.5-3％，优选的，珍珠岩助滤剂的加入量为多杀菌素发酵液体积的2％，黄血盐的加入量为多杀菌素发酵液体积的0.5％，硫酸锌的加入量为发酵液体积的1％。珍珠岩助滤剂为多杀菌素发酵液板框过滤时起助滤作用，黄血盐和硫酸锌为多杀发酵液的絮凝剂，其相互反应形成胶状沉淀除去杂蛋白从而提升多杀菌素发酵液滤速和澄清度。

多杀菌素发酵液是由土壤放线菌刺糖多孢菌在培养介质下经有氧发酵后产生的次级代谢产物。

根据本发明优选的，步骤(3)中，所述的闪蒸干燥的进风温度为80-100℃，风量10000—20000m³/h。湿滤饼经过闪蒸干燥粉碎后有利于物理破坏细胞壁、增大菌丝的比表面积有利于后续的浸取。

根据本发明优选的，步骤(4)中，所述的低沸点有机溶剂为甲醇或丙酮，优选为甲醇，低沸点有机溶剂的加入量为多杀菌素菌丝体体积的3-8倍，优选的，低沸点有机溶剂的加入量为多杀菌素菌丝体重量的5倍。

采用低沸点有机溶剂，主要是有利于工业化生产中菌丝浸提后溶剂的回收；

根据本发明优选的，步骤(4)结束后，从浸提柱顶端通入氮气将剩余的料液从底端压出对有机溶剂回收利用。

根据本发明优选的，步骤(5)，转相所使用的非水溶性有机溶剂为甲苯、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯中的一种，优选乙酸正丁酯。

根据本发明优选的，步骤(5)，升温至50℃搅拌至油膏溶解。

根据本发明优选的，步骤(6)，反萃取所用的酸水为草酸水溶液、酒石酸水溶液、柠檬酸水溶液，优选酒石酸水溶液，转相液：酸水的体积为1～5:1。

根据本发明优选的，步骤(7)，采用空气反吹法除酸水相中的有机溶剂，用氢氧化钠水溶液调节ph＝9.0～11.0。

根据本发明优选的，步骤(8)，所述的结晶剂为甲醇、丙酮中的一种。本步采用溶析结晶和低温结晶的相结合的方式提纯多杀菌素粗结晶，在保证了重结晶收率的同时提升了多杀菌素的质量。

根据本发明优选的，步骤(8)，粗结晶重量：结晶溶剂体积＝1:8，单位：kg/m³，真空浓缩滤液至粗粉重量的2倍，缓慢滴加饱和结晶液0.1倍体积的纯化水进行缓慢降温，养晶，养晶时间为1-4小时。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1.本发明采用菌丝分离烘干后浸提的方式提取多杀菌素，浸取效率高，溶媒使用量小，仅为发酵液直接溶媒萃取的一半，且能耗相对较低，生产周期缩短。

2.本发明所采用的板框过滤、闪蒸烘干、浸提、浓缩、水洗、反萃取、精制所需的设备比较普遍，很容易实现工业化生产。

3.本发明采用溶析结晶和低温结晶的相结合的方式提纯多杀菌素粗结晶，在保证了重结晶收率的同时提升了多杀菌素的质量，得到产品的晶形好、纯度高，产品含量达到95～98％。

4.本发明的提取总收率高，达到了85％～90％。

附图说明：

图1为本发明制得的多杀菌素精品谱图；

具体实施方法：

下面结合实施案例对本发明作进一步说明。但本发明的保护范围不能认为仅局限于下述具体实施方法，在不脱离本发明基本构思的前提下，所属领域的技术人员据此作出的简单推演或者同等替代方案，均属于本方案的保护范围。

以下描述的发酵液均为含多杀菌素的刺糖多孢发酵液。

实施例1

一种低溶媒、高收率多杀菌素的工业化提取方法，具体步骤如下：

(1)10m³预处理罐接入4.95m³的发酵液(1201u/ml)，加入99kg珍珠岩，24.75kg黄血盐，49.5kg硫酸锌，直通蒸汽升温到90℃，保温搅拌2小时。

(2)将预处理好的发酵液利用板框压滤机过滤，压滤完后，收集滤饼，湿滤饼重量592kg。

(3)使用闪蒸烘干将湿滤饼烘干，闪蒸进风温度控制在80℃～100℃，烘干的多杀菌丝水份控制在8.1％，菌素干粉重量305kg，效价19277u/mg，收率为98.9％。

(4)将烘干后的多杀菌素菌丝体305kg效价19277u/mg投入到浸提柱中，用1.5m³甲醇浸泡1～2小时，然后从浸提柱顶端通入氮气，将浸提液压入到收集罐，然后以每小时0.3～0.5m³的流速从顶端加入甲醇洗脱，从底端收集料液到甲醇套用罐，检测料液效价100u/ml时停止，然后从浸提柱顶端通入氮气将剩余的料液压出，本步收率为96.5％。

(5)将浸提浓液通过真空浓缩除去甲醇，浓缩至油膏状，油膏重量约为100kg，加入500L乙酸正丁酯，升温至50℃搅拌溶解，得到多杀菌素转相液，然后水洗，本步收率为98.5％。

(6)向有机相中加入150L 0.2mol/L酸水进行反萃取，搅拌30分钟后静置分层，酸水相收集到收集罐中，有机相回收重复利用。

(7)利用空气反吹法，除去酸水中的有机溶剂，用氢氧化钠水溶液调节ph＝9.0～11.0，使多杀菌素以结晶的形式沉淀，过滤得到多杀菌素粗结晶,本步收率为96.3％。

(8)将多杀菌素粗粉加入结晶溶剂，按照粗粉重量：有机溶剂体积＝1:8，升温溶解后过滤除去不溶性杂质，收集滤液，真空浓缩滤液至粗粉重量的2倍，缓慢滴加饱和结晶液0.1倍体积的纯化水，程序降温至5～10℃，养晶2小时后，离心，真空烘干后，得到多杀菌素精粉5.28kg，含量97.5％，总收率为86.6％。

实施例2

一种低溶媒、高收率多杀菌素的工业化提取方法，具体步骤如下：

(1)10m³预处理罐接入5.5m³的发酵液(1355u/ml)，加入110kg珍珠岩，27.5kg黄血盐，55kg硫酸锌，直通蒸汽升温到90℃，保温搅拌2小时。

(2)将预处理好的发酵液利用板框压滤机过滤，压滤完后，收集滤饼，湿滤饼重量642kg

(3)使用闪蒸烘干将湿滤饼烘干，闪蒸进风温度控制在80℃～100℃，烘干的多杀菌丝水份8.3％，菌素干粉重量330kg，效价22245u/mg，收率为98.5％。

(4)将烘干后的多杀菌素菌丝体330kg效价22245u/mg投入到浸提柱中，用1.65m³甲醇浸泡1～2小时，然后从浸提柱顶端通入氮气，将浸提液压入到收集罐，然后以每小时0.3～0.5m³的流速从顶端加入甲醇洗脱，从底端收集料液到甲醇套用罐，检测料液效价100u/ml时停止，然后从浸提柱顶端通入氮气将剩余的料液压出，本步收率为97.1％。

(5)将浸提浓液通过真空浓缩除去甲醇，浓缩至油膏状，油膏重量约为100kg，加入500L乙酸正丁酯，升温至50℃搅拌溶解，得到多杀菌素转相液，然后水洗，本步收率为98.2％。

(6)向有机相中加入150L 0.2mol/L酸水进行反萃取，搅拌30分钟后静置分层，酸水相收集到收集罐中，有机相回收重复利用。

(7)利用空气反吹法，除去酸水中的有机溶剂，用氢氧化钠水溶液调节ph＝9.0～11.0，使多杀菌素以结晶的形式沉淀，过滤得到多杀菌素粗结晶,本步收率为96.8％。

(8)将多杀菌素粗粉加入结晶溶剂，按照粗粉重量：有机溶剂体积＝1:8，升温溶解后过滤除去不溶性杂质，收集滤液，真空浓缩滤液至粗粉重量的2倍，缓慢滴加饱和结晶液0.1倍体积的纯化水，程序降温至5～10℃，养晶2小时后，离心，真空烘干后，得到多杀菌素精粉6.78kg，含量96.4％，总收率为87.7％。

实验例

以10m³发酵液为例

Claims (9)

1.一种低溶媒、高收率多杀菌素的工业化提取方法，包括步骤如下：

(1)向发酵液中加入珍珠岩助滤剂、黄血盐和硫酸锌，混合均匀，然后升温至85-90℃，保温搅拌1-3小时，得预处理后发酵液；

(2)预处理后发酵液利用板框压滤机过滤，收集滤饼；

(3)将收集得到的滤饼闪蒸干燥至含水量为5％～10％，得到干菌丝；所述的闪蒸干燥的进风温度为80-100℃，风量为10000—20000m³/h；

(4)将干菌丝投入到浸提柱中，用低沸点有机溶剂浸泡1～2小时，从浸提柱顶端通入氮气，收集有机溶剂浸提浓液，然后以每小时0.3～0.5m³ 的流速从顶端加入低沸点有机溶剂进行洗脱，当料液效价达到100u/ml时停止，合并浸提液；

(5)合并后的浸提液真空浓缩除去低沸点有机溶剂，浓缩至油膏状，按照油膏重量：非水溶性有机溶剂体积＝1:5～6，单位：kg/m³；加入非水溶性有机溶剂，升温搅拌溶解，得到多杀菌素转相液，转相所使用的非水溶性有机溶剂为甲苯、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯中的一种；

(6)多杀菌素转相液进行水洗，水洗后的转相液中加入酸水进行反萃取，静置分层，收集酸水相；反萃取所用的酸水为草酸水溶液、酒石酸水溶液、柠檬酸水溶液，转相液：酸水的体积为1～5:1；

(7)除酸水相中的有机溶剂，调节pH ＝9.0～11.0，过滤得到多杀菌素粗结晶；采用空气反吹法除酸水相中的有机溶剂，用氢氧化钠水溶液调节pH＝9.0～11.0；

(8)向多杀菌素粗结晶中加入结晶溶剂，升温溶解后过滤除去不溶性杂质，收集滤液，真空浓缩滤液，然后缓慢滴加纯化水，缓慢降温至5～10℃，养晶，离心，真空烘干后，得到多杀菌素精粉。

2.根据权利要求1所述的低溶媒、高收率多杀菌素的工业化提取方法，其特征在于，反萃取所用的酸水为酒石酸水溶液。

3.根据权利要求1所述的低溶媒、高收率多杀菌素的工业化提取方法，其特征在于，珍珠岩助滤剂的加入量为发酵液体积的1-4％，黄血盐的加入量为发酵液体积的0.2-0.6％，硫酸锌的加入量为发酵液体积的0.5-3％。

4.根据权利要求3所述的低溶媒、高收率多杀菌素的工业化提取方法，其特征在于，珍珠岩助滤剂的加入量为发酵液体积的2％，黄血盐的加入量为发酵液体积的0.5％，硫酸锌的加入量为发酵液体积的1％。

5.根据权利要求1所述的低溶媒、高收率多杀菌素的工业化提取方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的低沸点有机溶剂为甲醇或丙酮，低沸点有机溶剂的加入量为多杀菌素菌丝体体积的3-8倍。

6.根据权利要求5所述的低溶媒、高收率多杀菌素的工业化提取方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的低沸点有机溶剂为甲醇，低沸点有机溶剂的加入量为多杀菌素菌丝体体积的5倍。

7.根据权利要求1所述的低溶媒、高收率多杀菌素的工业化提取方法，其特征在于，步骤(4)结束后，从浸提柱顶端通入氮气将剩余的料液从底端压出对有机溶剂回收利用。

8.根据权利要求1所述的低溶媒、高收率多杀菌素的工业化提取方法，其特征在于，升温至50℃搅拌至油膏溶解。

9.根据权利要求1所述的低溶媒、高收率多杀菌素的工业化提取方法，其特征在于，步骤(8)，所述的结晶剂为甲醇、丙酮中的一种。

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