CN105418409B

CN105418409B - 分离纯化高纯度青蒿酸的方法

Info

Publication number: CN105418409B
Application number: CN201410483576.8A
Authority: CN
Inventors: 唐恒; 郭明; 杨久林; 徐星灿; 袁建栋
Original assignee: CHONGQING QIANTAI BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: Chongqing Qiantai Pharmaceutical Research Institute Co ltd
Priority date: 2014-09-22
Filing date: 2014-09-22
Publication date: 2017-02-15
Anticipated expiration: 2034-09-22
Also published as: CN105418409A

Abstract

本发明涉及从酿酒酵母细胞发酵液中分离纯化高纯度青蒿酸的方法，具体采用萃取结合结晶的方法从发酵液中分离纯化青蒿酸，不需经过柱层析，工艺步骤简单，生产条件易于控制，适合大规模工业生产；本发明采用以水做溶剂，通过调节pH进行结晶，成本低，环境友好；并且通过本发明方法得到的青蒿酸纯度高。

Description

分离纯化高纯度青蒿酸的方法

技术领域

本发明涉及药物化学领域，更进一步的涉及一种从酿酒细胞中分离纯化高纯度青蒿酸的方法。

背景技术

我国科学工作者于二十世纪70年代首次从中药青蒿即菊科植物黄花蒿（Artemisiaannua L.）中分离出青蒿素，是一个含氧桥的倍半萜内酯类化合物，是中国发现的第一个被国际公认的天然药物。青蒿素不仅对多种对氯喹、甲氟喹、抗乙胺嘧啶等抗疟药具有搞药性的疟药具有抗药性的疟原是有显著的治疗效果，而且还具有很好的治疗肝炎、抑制肿瘤细胞生长、杀血吸虫等作用。

目前青蒿素主要有如下几种方法获得：

一、从中药青蒿即菊科植物黄药蒿的叶和花蕾中分离获得，这种方法仍然是青蒿素的主要来源。天然青蒿中青蒿素含量很低（0.01%~0.6%，少数能达到1%）。此外，不同基因型青蒿以及青蒿不同组织之间的青蒿含量差异很大。由于青蒿的采购、收获，直至工厂加工提取，环节较多，费时费力，且不同采集地和不同采集期青蒿品质有很大的差别，同时，大量采集自然资源，必然会破坏环境和生态平衡，导致资源枯竭。因此，通过扩大青蒿素的提取量，这种方式不能满足人们对青蒿素的日益高涨的需求。

二、通过细胞或愈伤组织来生产青蒿素。此以二氢青蒿酸为原料，采用光化学的方法来引入过氧键。由于光化学自身的限制，如操作繁琐，不宜大规模生产，因此很难实现工业化生产。

三、通过将青蒿素生物合成基因在微生物中组合表达，在微生物中重新组建青蒿酸生物合成途径，利用“微生物工厂”来生产青蒿素。此种方法可简便大量的获得清蒿酸，再以半合成的方式获得青蒿素。该方法可大规模工业生产，生产成本相对较低。

专利CN102718773公开了一种由青蒿酸制备表蒿素的方法。首先青蒿酸在还原剂如硼氢化钠/氯化镍或氢气/金属催化剂作用下得到二氢青蒿酸。然后，二氢青蒿酸在催化剂存在下被过氧化物氧化成过氧化二氢青蒿酸。最后在酸的催化下与氧气作用下高收率地得到目标产物。该方法合成路线短，反应选择性高，制备过程对环境有好，操作及后处理简单，总收率高等优点。

青蒿酸是半合成青蒿素的一种重要的中间体，因此，急需找到一种高效的、低成本的获得高纯度青蒿酸的方法。

CN103087075A中采用有机溶剂萃取，碱性溶液处理，硅胶柱层析分离相结合的方法提取纯化青蒿酸。CN102702220A从青蒿素母液中提取青蒿酸，采用皂化、酸化、萃取、干法柱层析、精制五个步骤，分离纯化出高含量的青蒿酸，精制需要用到有机溶剂进行重结晶，操作复杂，结晶时间长。并且这些方法最后都采用了柱层析处理，大批量的柱层析分离，有机溶剂使用量大，带来严重的环境污染和安全隐患，并且提高了生产成本，不利于工业化生产。CN103467274A公开了一种从黄花蒿中提取青蒿酸的方法，包括使用CO₂超临界萃取，萃取液用活性炭脱色，浓缩后，无水甲醇重结晶，成本高，不适合工业化生产。CN103524525A公开了从青蒿素生产废弃物中提取青蒿酸的方法，包括先将废弃洗脱液进行浓缩，然后用有机溶剂加热溶解，降温后离心过滤浓缩，浓缩液用有机溶剂结晶。CN103570739A和CN103524527A也公开了从青蒿素废液中或青蒿素精油中分离提取青蒿酸的方法，都涉及使用有机溶剂进行重结晶，有机溶剂使用量大，环境不友好，生产成本高。

综上所述，现有的提取纯化青蒿酸的方法存在着分离效率低，操作复杂，成本高，不适合工业化生产等问题。

发明内容

为了克服现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种从酿酒酵母细胞发酵液中分离纯化高纯度青蒿酸的方法，所述方法包括以下步骤：

a）、将发酵液固液分离得到菌丝体，干燥，得到干菌丝体；

b）、向步骤a）所得的干菌丝体中加入有机溶剂搅拌，过滤，收集滤液；

c）、用碱性水溶液洗涤步骤b）所得的滤液，合并有机层；

d）、将步骤c）所得的有机层浓缩成浓度为50~200g/L的青蒿酸溶液；

e）、向步骤d）所得的青蒿酸溶液中加入等体积水，然后在保温下，加入碱液，调节pH为10~14，搅拌，静置分层，收集水层；

f）、在加热条件下，向步骤e）所得的水层中加入酸液，调节pH为5~8，搅拌下结晶；

g）、将步骤f）所得的晶体加入纯水，加入碱液使晶体完全溶解。在加热条件下加入酸液调节溶液pH为5~8，搅拌下结晶，抽滤、干燥得到高纯度青蒿酸固体。

其中，步骤a）所述的干燥，优选在50℃~60℃条件下干燥；

步骤b）所述有机溶剂是指水不互溶性有机溶剂，优选乙酸乙酯、乙酸丁酯、异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、甲苯、丙酮或甲基异丁基酮；更进一步优选甲基异丁基酮；所述有机溶剂的用量为干菌丝体的2~10倍（W/V），优选所述有机溶剂的用量为干菌丝体的3~5倍（W/V）；

步骤c）所述碱性水溶液的pH为8~10，其用量为有机层体积的0.5~5倍（V/V），优选1~1.5倍（V/V）；所碱性水溶液包括碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢铵等弱碱的水溶液，及氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、强氧化钙或氢氧化镁等强碱的水溶液，优选碳酸氢钠水溶液；

步骤d）所述浓缩优选在30℃~80℃下真空浓缩；

步骤e）中所述的保温是指温度控制在30℃~100℃，优选温度控制在50℃~100℃，更优选温度控制在50℃~80℃；

步骤e）和步骤g）所述的碱液是浓度为10%~40%的强碱性溶液，所述的强碱优选氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂，优先浓度为30%的强碱性溶液；

步骤f）和步骤g）所述的酸液为1%~30%的酸性溶液，优选10~15%的酸性溶液；所述的酸性溶液包括硫酸、盐酸或磷酸等溶液，优选硫酸溶液；

步骤f）和步骤g）所述加热条件下，是指将溶液温度加热到60℃~80℃；所述的结晶是在10℃~30℃条件下进行，优选结晶温度控制10~15℃；

任选的，在步骤g）之后，重复操作步骤g ）0至多次，得到高纯度青蒿酸固体，其HPLC纯度为99.5%以上，单个杂质含量小于0.1%。

进一步的，优选将步骤c）所得的有机层浓缩成浓度为150~180g/L的青蒿酸溶液。

进一步的，步骤e）加入碱液后，优选调节pH为11~12，搅拌，静置分层，收集水层

进一步的，步骤f）和步骤g），优选溶液加酸将pH调节为5~6，然后，搅拌下结晶。

本发明提供的从酿酒酵母细胞发酵液中分离纯化高纯度青蒿酸的方法，采用萃取结合结晶的方法，不需经过柱层析，工艺步骤简单，生产条件易于控制，适合大规模工业生产；本发明采用水溶液，通过调节pH进行结晶，成本低，环境友好；通过本发明方法得到的青蒿酸纯度高。

附图说明

图1显示实施例3方法制备的高纯度青蒿酸晶体的HPLC色谱图，其中，青蒿酸的保留时间约为17.1分钟。

具体实施方法

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具

体实施例，对本发明作进一步的说明。

本发明中的青蒿酸发酵液可以通过如下途径获得：

菌种：文献“Production of the artemisinin precursor amorpha-4,11-dieneby engineered saccharomyces cervisiae (Ann-Louise Lindahl等，Biotechnol Lett.2006 Apr; 28(8): 571-80)或公告号为CN101338309B的专利公开的可以生产青蒿酸的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

种子和发酵培养条件具体如下：

培养基组成：葡萄糖19.5g/L，甲硫氨酸0.25g/L，（NH₄）₂SO₄ 15g∕L，KH₂PO₄ 8g∕L，MgSO₄·7H₂O 6.15g∕L，维生素溶液12mL∕L，微量元素溶液 10mL∕L。其中：

（1）维生素溶液组成：生物素0.05g/L，泛酸钙1g/L，烟酸1g/L，肌醇25g/L，硫胺素1g/L，烟酸吡哆醇1g/L，对氨基苯甲酸0.2g/L；

（2）微量元素溶液组成：ZnSO₄·7 H₂O 5.75 g/L，MnCl₂·4 H₂O 0.32g/L，无水CuSO₄ 0.32 g/L，CoCl₂·6H₂O 0.47g/L，Na₂MoO₄·2 H₂O 0.48 g/L，CaCl₂·2 H₂O 2.9 g/L，FeSO₄·7 H₂O 2.8g/L，0.5M EDTA 80 ml/L；

种子瓶30℃下摇床220rpm培养24h；发酵罐温度30℃，搅拌转速200~800rpm，空气流量420L~840L/h，发酵全过程溶氧控制在20%以上。

将1ml冷冻保存的种子液接入含有100ml培养基的750ml摇瓶中，30℃培养24h，接入含有7L发酵培养基的发酵罐中培养，30℃，搅拌200rpm，空气流量420L/h，随着溶氧的变化增加搅拌速度和空气流量，控制溶氧在20%以上。发酵培养16h以后，开始补加葡萄糖和乙醇，葡萄糖浓度50%，按照每小时70ml（1%）的速度加入；乙醇的浓度为95%，按照每小时56ml（0.8%）的速度加入。培养36h时，开始加入正十二烷，补加速度210ml/（3%）天，连续补加，直到140h，放罐，离心得发酵液约900ml。

实施例1

将发酵液6L抽滤得到湿菌丝体1kg。将菌丝体于50℃下干燥12小时得到干菌丝体430g。向干菌丝体中加入乙酸丁脂1.6L，搅拌5小时。抽滤，收集乙酸丁脂层。加入1.6L pH为8的碳酸氢钠的水溶液。搅拌30分钟后分液，收集乙酸丁脂层。将乙酸丁脂层于70℃下浓缩至青蒿酸浓度为150g/L时停止，体积约为400ml。向乙酸丁脂层中加入400ml水，将料液加热至75℃，搅拌下滴入30%氢氧化钠溶液，将pH调至11.5。冷至室温后分层，收集水层。将水层加热至70℃。搅拌下加入10%硫酸，调pH至5.5。将料液缓慢降温至15℃，搅拌10小时。抽滤得到白色固体83g。纯度为94.3%。向白色固体中加入纯水400ml，加热至70℃，搅拌下滴入30%氢氧化钠溶液，调pH至11.5，使固体完全溶解。然后缓慢滴入10%硫酸，调pH至5.5。将料液缓慢降温至15℃，搅拌10小时。抽滤得到固体79g。纯度97.6%。向白色晶体中加入纯水250ml，加入至70℃，搅拌下滴入30%氢氧化钠溶液，调pH至11.5，使固体完全溶解。然后缓慢滴入10%硫酸，调pH至5.5。将料液缓慢降温至15℃，搅拌10小时。抽滤，于50℃下干燥得白色晶体50.9g，纯度99.8%

实施例2

将发酵液34L抽滤得到湿菌丝体3.6kg。将菌丝体于50℃下干燥12小时得到干菌丝体2.1kg。向干菌丝体中加入甲基异丁基酮8.4L，搅拌5小时。抽滤，收集甲基异丁基酮层。加入8.4L pH为9的碳酸钠的水溶液。搅拌30分钟后分液，收集甲基异丁基酮层。将甲基异丁基酮层于70℃下浓缩至青蒿酸浓度为约150g/L时停止，体积约为2.3L。向甲基异丁基酮层中加入2.3L水，将料液加热至75℃，搅拌下滴入20%氢氧化钾溶液，将pH调至13。冷至室温后分层，收集水层。将水层加热至70℃。搅拌下加入10%盐酸，调pH至6。将料液缓慢降温至20℃，搅拌10小时。抽滤得到白色固体485g。纯度为95.4%。向白色固体中加入纯水2L，加热至70℃，搅拌下滴入30%氢氧化钾溶液，调pH至13，使固体完全溶解。然后缓慢滴入10%盐酸，调pH至6。将料液缓慢降温至20℃，搅拌10小时。抽滤得到固体430g。纯度98.5%。向白色固体中加入纯水1.8L，加热至70℃，搅拌下滴入30%氢氧化钾溶液，调pH至13，使固体完全溶解。然后缓慢滴入10%盐酸，调pH至6。将料液缓慢降温至20℃，搅拌10小时。抽滤得到固体400g。将固体于50℃下干燥得白色晶体243g,纯度99.7%。

实施例3

将发酵液36L抽滤得到菌丝体3.6kg。将菌丝体于50℃下干燥过液得到干菌丝体。向干菌丝体中加入甲基异丁基酮8.4L，搅拌5小时。抽滤，收集甲基异丁基酮层。加入8.4LpH为8的碳酸氢钠的水溶液。搅拌30分钟后分液，收集甲基异丁基甲酮层。将甲基异丁基酮层于75℃下浓缩到青蒿酸浓度为约150g/L时停止，体积约2L。向甲基异丁基酮层中加入2L纯水，将料液加热至75℃，搅拌下滴入30%氢氧化钠溶液，将pH调至11.5。冷至室温后分层，收集水层。将水层加热至70℃。搅拌下加入10%硫酸，调pH至5.5。将料液缓慢降温至10℃，搅拌10小时。抽滤得到白色固体576g。纯度为98.7%。向白色固体中加入纯化水2L，加热至70℃，搅拌下滴入30%氢氧化钠溶液，调pH至11.5，使固体完全溶解。然后缓慢滴入10%硫酸，调pH至6。将料液缓慢降温至10℃，搅拌10小时。抽滤得到固体547g。将固体于50℃下干燥得到白色晶体328g。纯度99.8%，HPLC色谱图见附图1，对应色谱数据如下表1所示：

表1

实施例4

将发酵液34L抽滤得到湿菌丝体3.6kg。将菌丝体于60℃下干燥10小时得到干菌丝体2.1kg。向干菌丝体中加入二氯甲烷6.3L，搅拌5小时。抽滤，收集二氯甲烷层。加入3.5LpH为8的碳酸钠的水溶液。搅拌30分钟后分液，收集二氯甲烷。将二氯甲烷层在真空条件下浓缩至青蒿酸浓度为约200g/L时停止，体积约为2L。向二氯甲烷层中加入2L水，将料液加热至30℃，搅拌下滴入10%氢氧化钾溶液，将pH调至10。冷至室温后分层，收集水层。将水层加热至60℃。搅拌下加入10%盐酸，调pH至5。将料液缓慢降温至10℃，搅拌10小时。抽滤得到白色固体485g。纯度为96.4%。向白色固体中加入纯水2L，加热至60℃，搅拌下滴入10%氢氧化钾溶液，调pH至10，使固体完全溶解。然后缓慢滴入10%盐酸，调pH至5。将料液缓慢降温至10℃，搅拌10小时。抽滤得到固体430g。将固体于50℃下干燥得白色晶体258g，纯度99.7%。

实施例5

将发酵液36L抽滤得到菌丝体3.6kg。将菌丝体于55℃下干燥过液得到干菌丝体。向干菌丝体中加入甲基异丁基甲酮36L，搅拌5小时。抽滤，收集甲基异丁基酮层。加入18LpH为10的氢氧化钠的水溶液。搅拌30分钟后分液，收集甲基异丁基酮层。将甲基异丁基酮层于75℃下浓缩到青蒿酸浓度为约50g/L时停止，体积约7.2L。向甲基异丁基酮层中加入7.2L纯水，将料液加热至80℃，搅拌下滴入30%氢氧化钠溶液，将pH调至14。冷至室温后分层，收集水层。将水层加热至80℃。搅拌下加入10%硫酸，调pH至8。将料液缓慢降温至30℃，搅拌10小时。抽滤得到白色固体361g。纯度为98.7%。向白色固体中加入纯化水4L，加热至70℃，搅拌下滴入30%氢氧化钠溶液，调pH至14，使固体完全溶解。然后缓慢滴入10%硫酸，调pH至8。将料液缓慢降温至30℃，搅拌10小时。抽滤得到固体306g。将固体于50℃下干燥得到白色晶体217g。纯度99.8%。

应当说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种从酿酒酵母细胞发酵液中分离纯化高纯度青蒿酸的方法，包括以下步骤：

a)、将发酵液固液分离得到菌丝体，干燥，得到干菌丝体；

b)、向步骤a)所得的干菌丝体中加入有机溶剂搅拌，过滤，收集滤液；

c)、用碱性水溶液洗涤步骤b)所收集的滤液，合并有机层，其中所述碱性水溶液的pH为8～10，其用量为有机层体积的0.5～5倍V/V；

d)、将步骤c)所得的有机层浓缩成浓度为50～200g/L的青蒿酸溶液；

e)、向步骤d)所得的青蒿酸溶液中加入等体积水，然后在保温下，加入碱液，调节pH为10～14，搅拌，静置分层，收集水层；

f)、在加热条件下，向步骤e)所得的水层中加入酸液，调节pH为5～8，搅拌下结晶；

g)、将步骤f)所得的晶体加入纯水，加入碱液使晶体完全溶解，在加热条件下加入酸液调节溶液pH为5～8，搅拌下结晶，抽滤、干燥得到青蒿酸固体。

2.根据权利要求1所述方法，其中步骤a)所述的干燥，是在50℃～60℃条件下干燥。

3.根据权利要求1所述方法，其中步骤b)所述有机溶剂选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、甲苯、丙酮和甲基异丁基酮。

4.根据权利要求1所述方法，其中步骤b)所述有机溶剂，其用量为干菌丝体的2～10倍W/V。

5.根据权利要求1所述方法，其中步骤d)所述浓缩是在30℃～80℃下真空浓缩。

6.根据权利要求1所述方法，其中步骤e)中所述的保温是指温度保持50℃～100℃。

7.根据权利要求1所述方法，其中步骤e)和步骤g)所述的碱液是浓度为10％～40％的氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂溶液。

8.根据权利要求1所述方法，其中步骤f)和步骤g)所述的酸液为1％～30％的硫酸、盐酸或磷酸溶液。

9.根据权利要求1所述方法，其中步骤f)和步骤g)所述加热条件是将溶液温度加热到60℃～80℃；所述的结晶是在10℃～30℃条件下进行。

10.根据权利要求1所述方法，其中，任选的，在步骤g)之后，重复操作步骤g)0至多次，得到高纯度青蒿酸固体，其HPLC纯度为99.5％以上，单个杂质含量小于0.1％。