CN105018538B

CN105018538B - 一种基于结晶法发酵分离耦合生产乳酸镁的方法

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Publication number: CN105018538B
Application number: CN201510393681.7A
Authority: CN
Inventors: 谭天伟; 王勇; 贺美玲
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2015-07-07
Filing date: 2015-07-07
Publication date: 2018-10-23
Anticipated expiration: 2035-07-07
Also published as: CN105018538A

Abstract

本发明公开了一种基于结晶法发酵分离耦合生产L‑乳酸镁的方法。本发明通过鼠李糖乳酸杆菌以反复批次发酵的方式在37‑42℃下培养180‑220h，通过原位分离获得高纯度的乳酸镁晶体。发酵乳酸产量为140‑150g/L，生产速率为2.0‑2.5g/L/h，糖酸转化率可达94.5％。以结晶方式对乳酸镁的原位分离过程中，乳酸移除率可达79.10％，发酵废水回用率可达65.57％。本发明较传统的补料‑批次发酵过程可节约水用量40％，节约无机盐用量41％，节约酵母浸粉用量43％，并且在5个稳定的发酵循环中，L‑乳酸总产量达到单批发酵的3.82倍。以本工艺发酵生产乳酸避免了钙盐法生产过程中产生大量固体废弃物和废水的弊端，而且无需外加晶种和冷却、再加热过程，简化了生产步骤，缩短了生产时间，在保证工艺过程环保、可持续的同时降低了乳酸生产成本。

Description

一种基于结晶法发酵分离耦合生产乳酸镁的方法

技术领域

本发明属于乳酸发酵技术领域，涉及一种基于结晶法发酵分离耦合生产乳酸镁的改进方法。

背景技术

乳酸作为一种天然有机酸，在食品、医药、纺织、皮革和化学工业中有广泛应用，乳酸可以通过化学合成或者微生物发酵法制取，而大多数工业制备乳酸的方法都是以微生物发酵法为基础。在发酵过程中添加碱土碱类中和剂中和微生物分泌的酸以维持恒定的pH是所有发酵方法的共同特征。钙碱作为常规的中和剂应用最为普遍，WO 98/22611中描述了以钙碱作为中和剂发酵制备乳酸的方法，发酵得到含乳酸钙介质后，向介质中添加碳酸铵使乳酸钙转化为乳酸铵，最后通过盐分裂电渗析分离制得乳酸。如果目标产物为其它乳酸盐，则以常规方法获得乳酸钙介质后，通过硫酸酸化的方式获得乳酸和硫酸钙沉淀，固液分离后将乳酸与相应的碱土碱反应制取特定乳酸盐。CN 103952331 A中描述了在半连续发酵过程中原位分离乳酸钙的技术，鉴于乳酸钙在发酵温度下较高的溶解度，结晶沉淀需要配合降温和外加晶种，这无疑使生产过程繁琐、耗时。同时，后续分离过程中所产生的固体废物硫酸钙对环境的污染问题是钙盐法发酵产乳酸难以克服的弊端。

避免固体废物硫酸钙的产生，实现中和剂反复回用或产生其它有价值的副产品盐类是在发酵法制备乳酸方面研究的热点。以镁碱替代钙碱作为发酵中和剂使以上思路成为可能。同时，作为乳酸生产过程的中间产品，乳酸镁可以作为一种性能优良，比较经济的镁质有机强化剂，广泛应用于食品、饮料、奶制品、面粉、营养液和制药等，对镁质补充，防止各种缺镁症，增强生命活力有显著效果。

在现有技术中，几个文献描述了基于镁碱的乳酸或乳酸盐的生产方法：

CN 101886094 A中描述了以MgCO₃作为中和剂发酵生成乳酸镁后，在pH为9.5-10.8条件下与NaOH反应生成L-乳酸钠和Mg(OH)₂，L-乳酸钠经过脱色、纳滤和减压蒸馏纯化、浓缩后可以得到L-乳酸钠产品。

CN 101018756 A中描述了以含乳酸镁的介质与钠、钙、和/或铵的氢氧化物反应，形成钠、钙和/或氨的乳酸盐和氢氧化镁的方法。

在US 1,459,395公布的方法中，描述了从工业级乳酸中提纯乳酸的方法，向粗品乳酸中添加氧化镁、碳酸镁或氢氧化镁，生成的乳酸镁在合适的溶剂中以浓硫酸酸化，硫酸镁盐可以通过过滤除去，所得的含有乳酸的溶液经蒸馏除溶剂后可获得纯化的乳酸。

在GB 173,479所描述的方法中，乳酸镁溶液采用硫酸酸化后，通过丙酮萃取的方式回收乳酸。也可以将乳酸镁盐溶液悬浮于丙酮中，同时实现乳酸酸化和萃取，除去硫酸镁沉淀后回收乳酸。

WO 00/17378所描述的糖发酵生产乳酸的方法中，涉及以氢氧化镁为中和剂将发酵pH控制在5.5-6.5。获得的含有乳酸镁的介质经盐酸酸化转化为乳酸和氯化镁后，采用有机溶剂异戊醇、胺或醚萃取乳酸。获得的氯化镁受热可分解为盐酸和氧化镁。

US 3,429,777提及了向乳酸镁溶液中添加纯碱、苛性钠或磷酸钠制得乳酸钠和碳酸镁或氢氧化镁的可能性。

WO 98/37050描述了由含有乳酸碱土金属盐的发酵介质制备乳酸的方法，即所谓的SWAP反应，通过将乳酸的碱土金属盐与碱金属碱反应形成乳酸的碱金属盐和碱土金属基，乳酸的碱金属盐可进一步酸化、萃取生成乳酸和碱金属盐。从而实现碱土金属基回用到发酵过程，同时生成碱金属盐副产品。

以上文献单纯验证了镁碱作为发酵中和剂的可能性，或者在以乳酸镁制取乳酸过程中如何实现镁碱回用或生成有价值的盐类产品方面进行了研究。但是，乳酸镁发酵方式的改进优化在以上文献中并未提及，常规的分批发酵模式产物浓度低，必要的种子培养及发酵液排放、罐体清洗等过程使生产周期延长，降低了发酵罐的利用率，使生产成本提高。另外，生产过程中发酵废水的大量排放会造成严重的环境污染。

基于镁碱的乳酸镁发酵制备同样被以下文献描述：

NL-A-288829描述了在维持发酵糖在恒定浓度及45-50℃发酵条件下，采用过滤法连续移除乳酸镁或乳酸锌盐的可能性。根据此方法(清楚地提及乳酸镁连续移除过程中维持恒定的糖浓度)，移除乳酸镁的同时不可避免地吸附夹带发酵糖，会使糖酸转化率降低。同时由于乳酸镁移除过程中没有“pH较正步骤”，而是在发酵pH 5-6下进行的，这会影响乳酸镁的结晶沉淀，降低产品移除率。此外，没有详细提供如何实施该过程以及在何种条件下进行，如发酵液的回用率存在优化值，反复回用的发酵液如果没有新鲜培养基的补充稀释，会使菌体培养环境不断恶化。伴随补料培养基和中和剂的添加，发酵液全部回用又会使料液体积不断增大，不利于反应系统的平衡，也会使乳酸移除率降低。如何使包含多个产品在线移除及补料循环的发酵反应体系达到稳态平衡，文献中没有提及。

为此，本发明提供一种改进的与发酵耦合的乳酸镁在线移除方法，无需外加晶种和冷却、再加热过程，简化了生产步骤，缩短了生产时间。实现了含菌体的发酵废水的高效回用，降低发酵用水量40％。同时，节约酵母浸粉用量43％，节约无机盐用量41％，降低了生产成本。

本发明的目的是提供一种基于结晶法发酵分离耦合生产乳酸镁的改进方法。

本发明的另一目的是提供一种在乳酸镁制备过程中，能够实现发酵废水高效回用，乳酸镁高效移除的改进方法。

本发明的又一目的是提供一种高效、平衡的乳酸镁发酵分离耦合方法。

随着后续描述，本发明的其它目的将变得显而易见。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种发酵分离耦合生产L-乳酸的方法。该方法以鼠李糖乳酸杆菌作为产酸菌种，以MgO作为中和剂进行包含多个产品在线移除及补料循环的反复批次发酵，发酵乳酸产量为140-150g/L，生产速率为2.0-2.5g/L/h，糖酸转化率可达94.5％。以结晶方式对乳酸镁的原位分离过程中，乳酸移除率可达79.10％，发酵废水回用率可达65.57％。本发明可节约水用量40％，节约无机盐用量41％，节约酵母浸粉用量43％，并且在5个稳定的发酵循环中，L-乳酸总产量达到单批发酵的3.82倍。以本工艺发酵生产乳酸避免了钙盐法生产过程中产生大量固体废弃物和废水的弊端，而且无需外加晶种和冷却、再加热过程，简化了生产步骤，缩短了生产时间，在保证工艺过程环保、可持续的同时降低了乳酸生产成本。

在本发明提供的乳酸发酵分离耦合的生产方法中，其乳酸移除的基本原理为乳酸镁结晶以及结晶后实现的固液分离。其特征在于，包括以下步骤：

(1)斜面培养：实施本发明所使用的鼠李糖乳酸杆菌Lactobacillus rhamnosusCGMCC 1.2134购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

斜面菌种培养方法为：以划线的方式将Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.2134接种到含有15g/L琼脂的固体斜面培养基上，在37-42℃下培养24-48h；优选地，在40-42℃下培养24-36h。

(2)种子培养：将菌种转接到种子培养基，在37-42℃，120-220rpm下培养24-36h，然后将一级种子液按10％的接种量重新接入新鲜种子培养基，在37-42℃，120-220rpm下培养8-15h。优选地，在40-42℃，150-180rpm下培养一级种子液24-26h，在40-42℃，150-180rpm下培养二级种子液10-12h。液体种子培养基中添加15g/L的碳酸钙作为中和剂以维持恒定pH。

(3)发酵培养：将种子培养阶段得到的二级种子液按照3-10％(v/v)接种量接入发酵培养基，在搅拌转速180-240rpm，发酵温度37-42℃下，流加MgO控制pH 5.5-6.5。

(4)原位产物分离：反复批次发酵过程中包含多个乳酸镁在线移除和补料循环，在发酵乳酸浓度达到140-160g/L，且葡萄糖耗尽后暂停乳酸发酵，流加MgO，使发酵罐内发酵液pH上升并稳定至6.5-7.5，为下一步的结晶沉降做准备。将以上过饱和乳酸镁发酵液泵入结晶罐，在发酵温度下以结晶沉淀的方式实现固液分离，将包含菌体的上清液泵回发酵罐回用，同时获得高浓度的乳酸镁结晶体。

进一步地，发酵过程中采用流加的方式加入MgO调节pH在6.25±0.05，所述MgO浓度为10wt％-20wt％。优选所述MgO浓度为15wt％。

进一步地，补料-批次发酵过程中当葡萄糖耗尽后补加补料用培养基至葡萄糖含量为60-80g/L。补料-批次发酵结束后乳酸最终浓度为110-160g/L。

进一步地，发酵培养基初始葡萄糖含量为100-160g/L，酵母浸粉含量为10-30g/L。

进一步地，补料用培养基葡萄糖含量为300-500g/L,酵母浸粉含量为10-30g/L。

进一步地，本发明所述用语“反复批次发酵”是指多个“补料-批次发酵”过程的重复循环，从第二个补料-批次发酵起，补加补料用培养基至葡萄糖含量为60-80g/L，优选含量为70g/L，且当首次葡萄糖耗尽后补加补料用培养基维持葡萄糖低于30g/L。每个发酵循环结束后乳酸优选浓度为140g/L。

进一步地，在每个发酵循环结束后，补加MgO使pH上升并稳定至6.5-7.5，优选pH为7.0。所述MgO浓度为10wt％-20wt％。优选所述MgO浓度为15wt％。

进一步地，将发酵液总体积的80-85％泵入结晶罐，乳酸镁结晶温度为42℃，结晶时间为120min。发酵废水回用率为60-70％，其中废水回用率和乳酸移除率分别按以下计算：

其中，发酵液中L-乳酸，葡萄糖的测定方法为，发酵液以0.006mol/L的盐酸稀释到所需浓度范围，以0.22μm的微孔滤膜过滤后，采用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院)测定。培养基中的葡萄糖含量以去离子水稀释到所需浓度范围后采用上述设备测定。在高精度测量需求下，发酵液中的L-乳酸以高效液相色谱(HPLC)的方式测定，检测使用Bio-RadAminex HPX-87H色谱柱(300×7.8mm)，流动相为5mM H₂SO₄，流速为0.5ml/min，检测波长和柱温分别为205nm和55℃。

附图说明

图1基于乳酸镁结晶发酵分离耦合生产L-乳酸的工艺简图；

图2以MgO为中和剂的5L罐水平的补料-批次发酵；

图3 5L罐水平的基于乳酸镁结晶的发酵分离耦合过程；

图4补料-批次发酵与反复批次发酵在L-乳酸生产量的对比；

表1 发酵液中乳酸镁结晶后上清液乳酸浓度随温度的变化(初始乳酸浓度140g/L，结晶时间120min)

表2 结晶上清液乳酸浓度随不同初始乳酸浓度的变化(结晶时间120min，结晶温度42℃)

表3 结晶上清液乳酸浓度随不同结晶时间的变化(结晶温度42℃，初始乳酸浓度140g/L)

表4 5L罐水平的乳酸镁发酵分离耦合过程

表5 发酵分离耦合与补料-批次发酵产乳酸过程对比

具体实施方式

下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。各实施例中的材料均为分析试验用品。

实施例1

本实施例中所用的培养基如下：

固体斜面培养基组成为(g/L)：葡萄糖20，酵母膏5，大豆蛋白胨10，牛肉膏10，氯化钠10，乙酸钠5，柠檬酸铵2，七水硫酸镁0.2，七水硫酸锰0.05，琼脂15。pH为6.50。

液体种子培养基的组成为(g/L)：葡萄糖40，蛋白胨10，酵母浸粉10，氯化钠0.01，乙酸钠0.5，柠檬酸铵0.2，磷酸二氢钾0.4，七水硫酸镁0.2，七水硫酸锰0.05。pH为6.50。

发酵培养基的组成为(g/L)：葡萄糖150，酵母浸粉20，氯化钠0.01，乙酸钠0.5，柠檬酸铵0.2，磷酸二氢钾0.4，七水硫酸镁0.2，七水硫酸锰0.05。pH为6.00。

补料用培养基的组成为(g/L)：葡萄糖420，酵母浸粉20，氯化钠0.01，乙酸钠0.5，柠檬酸铵0.2，磷酸二氢钾0.4，七水硫酸镁0.2，七水硫酸锰0.05。pH为6.00。

本发明中以MgO作为中和剂，补料批次发酵生产L-乳酸镁的步骤如下：

(1)斜面培养：将鼠李糖乳酸杆菌CGMCC 1.2134接种到固体斜面培养基上，在42℃下培养24h。

(2)种子培养：将步骤(1)中培养获得的菌种在无菌条件下转接到100ml种子培养基，在42℃，180rpm下培养一级种子液24h，然后将20ml一级种子液在无菌条件下转接到180ml新鲜种子培养基，在42℃，180rpm下培养二级种子液12h。种子培养基中添加15g/L的碳酸钙作为中和剂以维持恒定pH。

(3)发酵培养：将步骤(2)所得的二级种子液按照10％(v/v)接种量接入2L发酵培养基，在搅拌转速200rpm，发酵温度42℃下，流加质量百分比浓度为15％的MgO控制pH 6.25±0.05。当葡萄糖首次耗尽后，补加补料培养基，使葡萄糖浓度提高至80g/L，当葡萄糖再次耗尽后发酵结束。

如图2所示，在5L发酵罐中补料批次发酵生产L-乳酸镁，发酵时间为65h，下罐乳酸产量为144g/L，糖酸转化率为96.1％，L-乳酸生产速率为2.15g/L/h。

实例2

一、结晶温度对发酵液中L-乳酸镁结晶的影响

以补料-批次发酵方式获得L-乳酸含量为140g/L的发酵液，将发酵液按每瓶100ml分装入250ml锥形瓶中，将锥形瓶置于不同温度下(温度梯度为25-42℃)静置120min，测定不同温度下，结晶沉淀后上清液乳酸含量的变化，每个温度条件下设置3个平行实验。

如表1所示，结晶上清液中乳酸浓度随温度的升高而增大，乳酸镁结晶所获得的拟合方程(R²＝0.996)为：

C＝78.03-0.542T+0.0113T²；

其中C代表上清液中乳酸的浓度(g/L)，T代表结晶温度(℃)。随着温度的降低，上清液中乳酸浓度越低，通过结晶方式对乳酸的移除效率越高。但是对比发现，在25℃下仅比42℃下多获得4.90％的乳酸镁晶体，结晶在发酵温度下(42℃)进行，既不会大幅降低乳酸移除率，同时由于节省了冷却、再加热的过程，能够使该工艺更加节能、省时。为此，在该工艺中选择42℃为结晶温度。

二、产品浓度对发酵液中L-乳酸镁结晶的影响

以补料-批次发酵方式获得不同L-乳酸含量(110-160g/L)的乳酸镁发酵液，在特定浓度下的发酵液按每瓶100ml分装入250ml锥形瓶中，将锥形瓶置于42℃静置120min，测定不同产品浓度下，结晶沉淀后上清液乳酸含量的变化，每个浓度条件下设置3个平行实验。

与产品浓度相关的过饱和度是除了结晶时间外影响结晶的另一个重要因素，在乳酸镁的补料-批次发酵过程中，当乳酸浓度达到110g/L后，发酵液中出现少量乳酸镁晶体，这些少量的晶体可以在结晶过程中作为晶种使用，从而避免了外部添加晶种。如表2所示，随着发酵液中乳酸浓度的提高，在发酵过程中形成的晶种量逐渐增大，促进了乳酸镁晶体的形成，从而使上清液中乳酸浓度逐渐降低。但是，当乳酸浓度大于150g/L后，菌体产酸速率明显下降，因此，在该工艺中选择140g/L乳酸为结晶初始浓度。

三、结晶时间对发酵液中L-乳酸镁结晶的影响

以补料-批次发酵方式获得L-乳酸含量140g/L的乳酸镁发酵液，按每瓶100ml分装入250ml锥形瓶中，将锥形瓶置于42℃，不同时间下(0-300min)静置，测定不同静置时间下，结晶沉淀后上清液乳酸含量的变化，每个时间条件下设置3个平行实验。

如表3所示，在初始乳酸浓度140g/L，结晶温度42℃条件下，上清液中乳酸含量在120min内迅速下降46.4％，而后随着结晶时间的延长，上清液中乳酸含量下降趋势逐渐减缓，反映了乳酸镁晶体的形成速度下降。因此，在该工艺中选择120min为乳酸镁的结晶时间。

实例3

本实施例中所用的培养基如下：

本发明中以MgO作为中和剂，采用发酵分离耦合方式生产L-乳酸镁的步骤如下：

(3)发酵培养：将步骤(2)所得的二级种子液按照10％(v/v)接种量接入2L发酵培养基，在搅拌转速200rpm，发酵温度42℃下，流加15％MgO控制pH 6.25±0.05。在反复批次发酵过程中包含多个发酵循环和乳酸镁在线移除过程，在单个发酵循环内，当葡萄糖首次耗尽后补加补料培养基使葡萄糖浓度低于30g/L，以尽可能地降低葡萄糖抑制效应。当乳酸浓度达到140±5g/L且葡萄糖耗尽后暂停发酵过程。补加15％的MgO，使发酵罐内发酵液pH上升并稳定至7.0，为下一步的结晶沉降做准备。

(4)产物分离：将以上过饱和乳酸镁发酵液体积的80-85％泵入结晶罐，在42℃下结晶沉淀120min，将上清液泵回发酵罐回用，控制发酵废水回用率在60-70％，同时获得高浓度的乳酸镁结晶体。在将结晶上清液输送回发酵罐后，向发酵罐内补加补料培养基，使葡萄糖浓度上升至70g/L后进入下一轮的发酵产酸和在线移除循环。一共进行了四次乳酸镁原位移除。

其中，第一次补料-批次发酵结束后L-乳酸产量为144g/L，糖酸转化率为96.1％，时空产率为2.15g/L^/h。在将发酵罐内料液pH调节并稳定至7.0后，将2.5L料液泵入结晶罐(保温42℃)，发酵罐内剩余0.5L料液。发酵液在结晶罐内结晶、沉淀120min后，将1.5L上清液泵回发酵罐，此次发酵废水回用率为64.52％，乳酸移除率为76.67％。补加补料培养基0.71L后，进入第二次补料-批次发酵过程。

第二次补料-批次发酵结束后，L-乳酸产量为142g/L，糖酸转化率为98.16％，时空产率为2.18g/L^/h。在将发酵罐内料液pH调节并稳定至7.0后，将2.6L料液泵入结晶罐(保温42℃)，发酵罐内剩余0.5L料液。发酵液在结晶罐内结晶、沉淀120min后，将1.5L上清液泵回发酵罐，此次发酵废水回用率为65.57％，乳酸移除率为77.80％。补加补料培养基0.70L后，进入第三次补料-批次发酵过程。

第三次补料-批次发酵结束后，L-乳酸产量为143g/L，糖酸转化率为96.31％，时空产率为2.17g/L^/h。在将发酵罐内料液pH调节并稳定至7.0后，将2.55L料液泵入结晶罐(保温42℃)，发酵罐内剩余0.5L料液。发酵液在结晶罐内结晶、沉淀120min后，将1.5L上清液泵回发酵罐，此次发酵废水回用率为63.49％，乳酸移除率为77.10％。补加补料培养基0.78L后，进入第四次补料-批次发酵过程。

第四次补料-批次发酵结束后，L-乳酸产量为148g/L，糖酸转化率为95.05％，时空产率为2.41g/L^/h。在将发酵罐内料液pH调节并稳定至7.0后，将2.65L料液泵入结晶罐(保温42℃)，发酵罐内剩余0.5L料液。发酵液在结晶罐内结晶、沉淀120min后，将1.5L上清液泵回发酵罐，此次发酵废水回用率为62.50％，乳酸移除率为79.10％。补加补料培养基0.80L后，进入第五次补料-批次发酵过程。

第五次补料-批次发酵结束后，L-乳酸产量为150g/L，糖酸转化率为96.43％，时空产率为1.85g/L^/h。在五批次包含四个产品原位移除过程的反复批次发酵中(表4)，共产L-乳酸1643.07g，总的糖酸转化率为94.5％。

如表5所示，通过补料-批次发酵与发酵分离耦合过程对比后发现，采用本发明所提供的方法生产乳酸镁，在产品得率、时空产率和每个循环的下罐浓度与补料-批次发酵相近的前提下，节约水用量40％，节约无机盐用量41％，节约酵母浸粉用量43％，并且发酵分离耦合过程L-乳酸总产量是单个补料-批次发酵过程(430.0g)的3.82倍。

实例4

本实施例中所用的培养基如下：

发酵培养基的组成为(g/L)：葡萄糖145，酵母浸粉25，氯化钠0.01，乙酸钠0.5，柠檬酸铵0.2，磷酸二氢钾0.4，七水硫酸镁0.2，七水硫酸锰0.05。pH为6.00。

补料用培养基的组成为(g/L)：葡萄糖450，酵母浸粉15，氯化钠0.01，乙酸钠0.5，柠檬酸铵0.2，磷酸二氢钾0.4，七水硫酸镁0.2，七水硫酸锰0.05。pH为6.00。

(2)种子培养：将步骤(1)中培养获得的菌种在无菌条件下转接到100ml种子培养基，在42℃，180rpm下培养一级种子液24h，然后将50ml一级种子液在无菌条件下转接到450ml新鲜种子培养基，在42℃，180rpm下培养二级种子液12h。种子培养基中添加15g/L的碳酸钙作为中和剂以维持恒定pH。

(3)发酵培养：将步骤(2)所得的二级种子液按照10％(v/v)接种量接入5L发酵培养基，在搅拌转速220rpm，发酵温度42℃下，流加15％MgO控制pH 6.25±0.05。在反复批次发酵过程中包含多个发酵循环和乳酸镁在线移除过程，在单个发酵循环内，当葡萄糖首次耗尽后补加补料培养基使葡萄糖浓度低于30g/L，以尽可能地降低葡萄糖抑制效应。当乳酸浓度达到140±5g/L且葡萄糖耗尽后暂停发酵过程。补加15％的MgO，使发酵罐内发酵液pH上升并稳定至7.0，为下一步的结晶沉降做准备。

在10L罐中进行的L-乳酸镁发酵分离耦合过程，L-乳酸浓度达到142g/L，发酵分离耦合过程共产L-乳酸4108g，发酵时间为206h，L-乳酸平均时空产率为2.23g/L/h，糖酸转化率为95.2％。

实例5

本实施例中所用的培养基如下：

发酵培养基的组成为(g/L)：葡萄糖140，酵母浸粉20，氯化钠0.01，乙酸钠0.5，柠檬酸铵0.2，磷酸二氢钾0.4，七水硫酸镁0.2，七水硫酸锰0.05。pH为6.00。

补料用培养基的组成为(g/L)：葡萄糖500，酵母浸粉15，氯化钠0.01，乙酸钠0.5，柠檬酸铵0.2，磷酸二氢钾0.4，七水硫酸镁0.2，七水硫酸锰0.05。pH为6.00。

(2)种子培养：将步骤(1)中培养获得的菌种在无菌条件下转接到100ml种子培养基，在42℃，180rpm下培养一级种子液24h，然后将50ml一级种子液在无菌条件下转接到400ml新鲜种子培养基，在42℃，180rpm下培养二级种子液12h。种子培养基中添加15g/L的碳酸钙作为中和剂以维持恒定pH。

(3)发酵培养：将步骤(2)所得的二级种子液按照3％(v/v)接种量接入15L发酵培养基，在搅拌转速240rpm，发酵温度42℃下，流加15％MgO控制pH 6.25±0.05。在反复批次发酵过程中包含多个发酵循环和乳酸镁在线移除过程，在单个发酵循环内，当葡萄糖首次耗尽后补加补料培养基使葡萄糖浓度低于30g/L，以尽可能地降低葡萄糖抑制效应。当乳酸浓度达到140±5g/L且葡萄糖耗尽后暂停发酵过程。补加15％的MgO，使发酵罐内发酵液pH上升并稳定至7.0，为下一步的结晶沉降做准备。

在30L罐中进行的L-乳酸镁发酵分离耦合过程，L-乳酸浓度达到140g/L，发酵分离耦合过程共获得12.30Kg L-乳酸，发酵时间为210h，L-乳酸平均时空产率为2.15g/L/h，糖酸转化率为94.1％。

Claims

1.一种基于结晶法发酵分离耦合生产乳酸镁的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)斜面培养：使用鼠李糖乳酸杆菌Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.2134斜面培养，斜面菌种培养方法为，以划线的方式将Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.2134接种到固体斜面培养基上，在37-42℃下培养24-48h；

(2)种子培养：将斜面培养后的菌种转接到种子培养基，在37-42℃，120-220rpm下培养24-36h，然后将一级种子液按10％的接种量重新接入新鲜种子培养基，在37-42℃，120-220rpm下培养二级种子液8-15h；液体种子培养基中添加15g/L的碳酸钙作为中和剂以维持恒定pH；

(3)发酵培养：将种子培养阶段得到的二级种子液按照3-10％(v/v)接种量接入发酵培养基，在搅拌转速180-240rpm，发酵温度37-42℃下，流加MgO控制pH 5.5-6.5；

(4)原位产物分离：反复批次发酵过程中包含多个乳酸镁在线移除和补料循环，在发酵乳酸浓度达到140-160g/L，且葡萄糖耗尽后暂停乳酸发酵，流加MgO，使发酵罐内发酵液pH上升并稳定至6.5-7.5，为下一步的结晶沉降做准备；将以上过饱和乳酸镁发酵液泵入结晶罐，在发酵温度下以结晶沉淀的方式实现固液分离，将包含菌体的上清液泵回发酵罐回用，同时获得高浓度的乳酸镁结晶体；

发酵分离耦合过程中，乳酸镁结晶温度为42℃，结晶时间为120min；反复批次发酵过程中，发酵乳酸初始浓度为140g/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵过程中采用流加的方式加入MgO调节pH在6.25±0.05，所述MgO浓度为10wt％-20wt％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵培养基初始葡萄糖含量为100-160g/L，酵母浸粉含量为10-30g/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：补料-批次发酵过程中，当葡萄糖耗尽后补加补料用培养基至葡萄糖含量为60-80g/L；补料-批次发酵结束后乳酸最终浓度为110-160g/L。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：补料用培养基葡萄糖含量为300-500g/L,酵母浸粉含量为10-30g/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：反复批次发酵过程中，在每个发酵循环结束后，补加MgO使pH上升并稳定至7.0；所述MgO浓度为10wt％-20wt％。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：反复批次发酵过程中，当葡萄糖耗尽后补加补料用培养基至葡萄糖含量为60-80g/L，发酵乳酸浓度为140g/L。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵分离耦合过程中，将发酵液总体积的80-85％泵入结晶罐，乳酸镁结晶温度为42℃，结晶时间为120min。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵分离耦合过程中，发酵废水回用率控制在60-70％。