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CN110062767B - 人抗体、药物组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文中公开了包含结合Globo H、阶段特异性胚胎抗原3(SSEA‑3)和阶段特异性胚胎抗原4(SSEA‑4)的抗体或其抗原结合片段的药物组合物，以及其使用方法。使用方法包括但不限于癌症疗法和诊断学。本公开的抗体可以结合某些癌细胞表面。本文中公开的抗体的示例性靶标可以包括癌，例如肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头和颈癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、结肠直肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌和前列腺癌。

Description

人抗体、药物组合物和方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2016年7月29日提交的美国临时专利申请No.62/368,407的优先权。上述申请的全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。在2019年1月28日创建的所述ASCII拷贝命名为G3004-00802_SL.txt，大小为137,284字节。
发明领域
本公开涉及结合碳水化合物抗原的人抗体及其结合片段，以及编码此类抗体的核酸、互补核酸、多肽、载体，宿主细胞及其制备和使用方法，包括包含所述抗体和/或结合片段的药物组合物。此外，提供了以有效抑制癌细胞的量向受试者施用抗体的方法。具体地，本文公开了结合阶段特异性胚胎抗原3(SSEA-3)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)和GloboH的抗体，以及相关的组合物和使用方法。使用方法包括但不限于癌症疗法和诊断学。
发明背景
人B细胞的分离、培养和扩增的最新进展使得能够分离大量人抗体以用于癌症诊断学和治疗学。几十年来，使用杂交瘤技术分离小鼠单克隆抗体。然而，这些抗体的治疗应用受到抗小鼠抗体的诱导和自身反应性的限制。最近，已经通过从具有感兴趣的体液应答的人产生的噬菌体展示文库分离单克隆抗体(Mao S,et al.(1999)Proc Natl Acad SciUSA；96:6953–6958.)。尽管该技术产生了许多有用的抗体，但其适用性受到细菌和真核细胞中表达的抗体之间结合特性差异的限制。另外，噬菌体展示可导致重链和轻链组合，其不在体内相同的B细胞中发生。
许多表面碳水化合物在恶性肿瘤细胞中表达。例如，首先分离碳水化合物抗原Globo H(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc)作为神经酰胺连接的糖脂，并在1984年从乳腺癌MCF-7细胞中鉴定。(Bremer E G,et al.(1984)J Biol Chem259:14773-14777)。先前的研究还表明Globo H和阶段特异性胚胎抗原3(2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1)(SSEA-3，也称为Gb5)在乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞上观察到(WW Chang et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA,105(33):11667-11672)。此外，SSEA-4(阶段特异性胚胎抗原-4)(Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1)已被普遍用作多能人胚胎干细胞的细胞表面标志物，并已用于分离间充质干细胞和富集神经祖细胞(Kannagi R et al.(1983)EMBO J,2:2355-2361)。因此，非常感兴趣的是鉴定与癌症相关和/或预测癌症的聚糖标志物，并开发针对该标志物的人单克隆抗体以用于诊断和治疗一大批癌症。
发明概述
因此，本公开基于以下发现：Globo系列抗原(Globo H、SSEA-3和SSEA-4)在一大批癌症中异常表达，但在正常细胞上不表达。因此，针对Globo系列抗原(Globo H、SSEA-3和SSEA-4)的人单克隆抗体可以解决对癌症的有效治疗和/或预防的未满足需求。表达Globo系列抗原的癌细胞可以包括但不限于：肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌和前列腺癌。
在一方面，本公开内容涉及对Globo系列抗原特异的抗体或其抗体结合片段。
为了产生抗Globo系列抗原人单克隆抗体，从接种疫苗的受试者的外周血中分离人B细胞，以每孔一个细胞的密度铺板并培养以进行分泌性IgG产生。测定分泌性IgG的Globo H、SSEA-3或SSEA-4结合特异性。使用RT-PCR回收来自阳性孔的编码Ig VH、IgVκ或IgVλ的基因，并克隆到表达载体中以产生抗Globo H、SSEA-3或SSEA-4人单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体的轻链是κ型。在一个实施方案中，抗体的轻链是λ型。
在一方面，本公开提供抗体和/或其抗原结合片段，其包含：重链可变域(VH)，其包含如本文中公开的相应的CDR和与如本文公开的氨基酸序列至少约80％、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97 98、或99％序列同源性的氨基酸序列，和/或轻链可变域(VL)，其包含如本文中公开的相应的CDR和与如本文公开的氨基酸序列至少约80％、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、9798、或99％序列同源性的氨基酸序列。
在一方面，本公开内容提供了能够靶向Globo系列碳水化合物抗原的抗体或其抗原结合片段，其包含：如本文中公开的每个相应克隆的3个重链CDR和相应的3个轻链CDR，例如表1-28中公开的那些。
在另一方面，本公开提供了抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变域，所述重链可变域包含与如表1-28中本文公开的每个克隆的全长重链序列具有至少约80％同一性的氨基酸序列，进一步包含所述相应克隆的3个相应的重链互补决定区(CDR)，CDR1、CDR2和CDR3序列；和轻链可变域，其包含与如表1-28中本文公开的每个克隆的全长轻链序列具有至少约80％同一性的氨基酸序列，进一步包含所述相应克隆的3个相应的轻链互补决定区(CDR)，CDR1、CDR2和CDR3序列。
例如，本公开内容提供了能够靶向Globo系列碳水化合物抗原的抗体或其抗原结合片段，其包含：a.SEQ ID NO:257、258和259的3个重链CDR或经保守修饰的氨基酸取代；和/或b.SEQ ID NO:260、261和262的3个轻链CDR或经保守修饰的氨基酸取代。在另一个实施方案中，上述抗体或其抗原结合片段，其包含：轻链可变域，所述轻链可变域包含与SEQID NO:3具有至少约80％同一性的氨基酸序列，还包含3个重链互补决定区(CDR)，CDR1、CDR2和CDR3(SEQ ID No 257、258、259)；和/或轻链可变域，所述轻链可变域包含与SEQ IDNO:4具有至少约80％同一性的氨基酸序列，还包含3个轻链互补决定区(CDR)，CDR1，CDR2和CDR3(SEQ ID No:260、261、262)。这可以对表1-28中列举的每个克隆重复，所述克隆具有每个克隆的各自的全长重链和轻链序列及其各自对应的重链和轻链CDR。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段选自：(a)完整免疫球蛋白分子；(b)scFv；(c)Fab片段；(d)F(ab')2；或(e)二硫化物连接的Fv。
在某些实施方案中，抗体是IgG或IgM。
在一方面，本发明提供药物组合物，其包含：
抗体或其抗原结合片段；和至少一种药学可接受载体。
在某些实施方案中，药物组合物进一步包含至少一种另外的治疗剂。
在一方面，本公开内容提供了用于抑制癌细胞增殖的方法，其包括对有此需要的受试者施用有效量的示例性药物组合物，其中抑制和/或降低癌细胞的增殖。
在某些实施方案中，本公开内容提供了治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用有效量的本文中所述的示例性人抗体。
在某些实施方案中，癌症选自下组：肉瘤(sarcoma)、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头和颈癌(head-and-neckcancer)、鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌(bile ductcancer)、胆囊癌(gallbladder cancer)、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、结肠直肠癌(colorectalcancer)、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌(buccal cancer)、口咽癌(oropharyngeal cancer)、喉癌(laryngeal cancer)和前列腺癌。
在一方面，本公开内容提供了对受试者中的癌症分期的方法，其包括：
(a)将一种或多种检测Globo系列抗原表达的抗体应用于从受试者获得的细胞或组织样品；
(b)测定一种或多种抗体对细胞或组织样品的结合；
(c)与正常对照比较结合以测定受试者中癌症的存在；并且
(d)基于与正常基线指数相比相应的抗体结合的相对水平对疾病进展阶段进行分类。
在一方面，本发明提供用于抑制癌细胞增殖的方法，包括对有此需要的受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含靶向Globo系列碳水化合物抗原的抗体或其抗原结合片段，其中癌细胞的增殖受到抑制。在一个实施方案中，受试者是人。
在一方面，本公开内容提供了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括对有此需要的受试者施用有效量的靶向Globo系列碳水化合物抗原的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，癌症选自下组：肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头和颈癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、结肠直肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌和前列腺癌。在一个实施方案中，受试者是人。
在一方面，本发明提供了用于受试者中的癌症诊断的方法，其包括：
(a).对从所述受试者获得的细胞或样品应用检测一组标志物表达的如本文中公开的一种或多种抗体或结合片段；
(b).测定所述一种或多种抗体对所述细胞或所述样品的结合；并且
(c).与正常对照比较所述结合以测定所述受试者中的所述癌症的存在。
在一个实施方案中，标志物由Globo-H、SSEA-3或SSEA-4组成。
在一个实施方案中，癌症选自肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头和颈癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、结肠直肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌和前列腺癌。
在一个实施方案中，细胞是癌症干细胞。
在另一个实施方案中，样品包括血清、血液、血浆、细胞、细胞培养基、唾液、尿液、淋巴结液淋巴结液、肿瘤活组织检查或组织培养物。在一个实施方案中，受试者是人。
在一方面，本公开提供了对受试者成像的方法，包括：
(a)施用有效量的如本文中公开的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与成像剂缀合；(b)检测受试者中的成像剂。
在一个实施方案中，成像剂是荧光团、染料、MRI造影剂或放射性核素。
在一个实施方案中，受试者患有癌症，该方法进一步定义为检测癌症转移的方法。在一个实施方案中，受试者是人。
在一方面，本发明提供了分离受试者中的抗体或抗原结合片段的方法，其包括：
(a).对所述受试者施用治疗有效剂量的Globo系列抗原疫苗和药学可接受载体；
(b).从所述受试者收集样品；
(c).从所述样品分离B细胞；并且
(d).培养并且筛选结合所述Globo系列抗原的B细胞。
在一个实施方案中，Globo系列抗原包含Globo-H、SSEA-3或SSEA-4。在一个实施方案中，受试者是人。
在一个实施方案中，样品包括血清、血液、血浆、细胞、细胞培养基、淋巴结液、肿瘤活组织检查或组织培养物。
在一方面，本公开内容提供抗体-药物缀合物(ADC)，其包含与结合Globo系列抗原的抗体或抗原结合片段缀合的药物，其中VH选自SEQ ID No:3、SEQ ID No:7、SEQ ID No:11、SEQ ID No:15、SEQ ID No:19、SEQ ID No:23、SEQ ID No:27、SEQ ID No:31、SEQ IDNo:35、SEQ ID No:39、SEQ ID No:43、SEQ ID No:47、SEQ ID No:51、SEQ ID No:55、SEQ IDNo:59、SEQ ID No:63、SEQ ID No:67、SEQ ID No:71、SEQ ID No:75、SEQ ID No:79、SEQ IDNo:83、SEQ ID No:87、SEQ ID No:91、SEQ ID No:95、SEQ ID No:99、SEQ ID No:103、或SEQID No:107，并且VL选自SEQ ID No:4、SEQ ID No:8、SEQ ID No:12、SEQ ID No:16、SEQ IDNo:20、SEQ ID No:24、SEQ ID No:28、SEQ ID No:32、SEQ ID No:36、SEQ ID No:40、SEQ IDNo:44、SEQ ID No:48、SEQ ID No:52、SEQ ID No:56、SEQ ID No:60、SEQ ID No:64、SEQ IDNo:68、SEQ ID No:72、SEQ ID No:76、SEQ ID No:80、SEQ ID No:84、SEQ ID No:88、SEQ IDNo:92、SEQ ID No:96、SEQ ID No:100、SEQ ID No:104、或SEQ ID No:108；并且其中所述药物通过接头与所述抗体或所述抗原结合片段共价缀合。
在一个实施方案中，Globo系列抗原包含Globo-H、SSEA-3或SSEA-4。
在一个实施方案中，接头包含对硝基苯基接头、4-(4-N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基酰肼(4-(4-N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxyl hydrazide)(MMCCH)接头、马来酰亚胺己酰基(maleimidocaproyl)(MC)接头或马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸酯(maleimidomethyl cyclohexane-1-carboxylate)(MCC)接头。在一个实施方案中，药物是化学化合物或生物剂。在一个实施方案中，药物是抗增殖剂。
在一个实施方案中，抗增殖剂选自：环磷酰胺、阿片剂(opiate)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、雌激素抑制剂(他莫昔芬(tamoxifen)或法乐通(Fareston))、芳香酶抑制剂(aromatase inhibitor)(Arimidex、Aromasin或Femara)、垂体下调物(pituitarydownregulator)(Zoladex或Lupron)、Novaldex(他莫昔芬选择性雌激素受体调节物)、Evista(雷洛昔芬(Rolaxifene))、Faslodex(雌激素受体下调物)、抗凝血药(anticoagulant)(Refludan)、酶(Elitek)、造血生长因子、抗肿瘤剂(抗代谢物、混杂的细胞毒剂、长春花生物碱(vinca alkaloid)、表鬼臼毒素(Epipodophyllotoxin)、烷化剂、紫杉烷类(Taxanes)、抗肿瘤抗生素、喜树碱(Camptothecin)、亚硝基脲类)、HER1/EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Tarceva)、VEGF蛋白抑制剂(Avastin)、HER-2/ErbB2抑制剂(Tyverb/Tykerb)、干扰素、白介素、单克隆抗体或糖皮质激素(Glucocorticoid steroid)。在一个实施方案中，抗增殖剂选自：厄洛替尼(erlotinib)(TARCEVA)；多西他赛(docetaxel)(TAXOTERE)；吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR)；顺铂；卡铂；紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL)；曲妥珠单抗(HERCEPTIN)；替莫唑胺(temozolomide)(TEMODAL)；他莫昔芬(NOLVADEX,ISTUBAL,VALODEX)；多柔比星(doxorubicin)(ADRIAMYCIN)；奥沙利铂(oxaliplatin)(ELOXATIN)；硼替佐米(bortezomib)(VELCADE)；舒尼替尼(sutent)(SUNITINIB)；来曲唑(letrozole)(FEMARA)；甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)(GLEEVEC)；MEK抑制剂(Exelixis)；氟维司群(fulvestrant)(FASLODEX)；亚叶酸钙(leucovorin)(亚叶酸)；雷帕霉素(rapamycin)(RAPAMUNE)；拉帕替尼(lapatinib)(TYKERB)；洛那法尼(lonafarnib)(SARASAR)；索拉非尼(sorafenib)(NEXAVAR)；吉非替尼(gefitinib)(IRESSA)；伊立替康(irinotecan)(CAMPTOSAR)；tipifarnib(ZARNESTRA)；ABRAXANE(无克列莫佛(Cremophor-free))；紫杉醇；凡德他尼(vandetanib)(ZACTIMA)；苯丁酸氮芥(chloranmbucil)；西罗莫司(temsirolimus)(TORISEL)；帕唑帕尼(pazopanib)；canfosfamide(TELCYTA)；塞替派；环磷酰胺(cyclosphosphamide)(CYTOXAN,NEOSAR)；5-氟尿嘧啶(5-FU)；长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；卡培他滨(capecitabine)(XELODA)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；-二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；他莫昔芬(NOLVADEX)；雷洛昔芬(raloxifene)；屈洛昔芬(droloxifene)，4-羟基他莫昔芬；曲沃昔芬(trioxifene)；keoxifene；奥那司酮(onapristone)；FARESTON(枸橼酸托瑞米芬(toremifine citrate))；4(5)-咪唑；氨鲁米特(aminoglutethimide)；MEGASE(醋酸甲地孕酮)；AROMASIN(依西美坦(exemestane))；福美坦(formestanie)；法倔唑(fadrozole)；
Figure GDA0002003262010000071
(伏氯唑(vorozole))；FEMARA(来曲唑(letrozole))；ARIMIDEX(阿那曲唑(anastrozole))；氟他胺(flutamide)；尼鲁米特(nilutamide)；比卡鲁胺(bicalutamide)；亮丙瑞林(leuprolide)；戈舍瑞林(goserelin)；曲沙他滨(troxacitabine)(-1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；脂质激酶抑制剂；奥利默森(Oblimersen)(GENASENSE)；ANGIOZYME；ALLOVECTIN；LEUVECTIN；VAXID；PROLEUKIN；LURTOTECAN；ABARELIX；贝伐珠单抗(AVASTIN)；阿仑珠单抗(Campath)；贝伐珠单抗(AVASTIN)；西妥昔单抗(ERBITUX)；帕尼单抗(panitumumab)(VECTIBIX)；利妥昔单抗(rituximab)(RITUXAN)；帕妥珠单抗(pertuzumab)(OMNITARG)；曲妥珠单抗(trastuzumab)(HERCEPTIN)；托西莫单抗(tositumomab)(Bexxar,Corixia)；吉妥珠单抗(gemtuzumab)；或奥佐米星(ozogamicin)(MYLOTARG)。在一方面，本公开内容提供了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文公开的ADC。
在一个实施方案中，癌症选自下组：肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头和颈癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、结肠直肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌和前列腺癌。在一个实施方案中，受试者是人。
在下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。从以下附图和若干实施方案的详细描述以及所附权利要求书，本发明的其他特征或优点将变得显而易见。
附图简述
当结合随后的详细描述考虑时，可以通过参考附图获得对本发明的更完整的理解。附图中示出的实施方案仅旨在举例说明本发明，而不应解释为将本发明限制于所示实施方案。
图1显示通过滴定ELISA在不同人抗体克隆之间的结合效力表征。图1A使用GloboH-神经酰胺，并且图1B使用Globo H-脂质作为包被抗原。
图2显示通过滴定ELISA在不同人抗体克隆之间的结合效力表征。图2A使用SSEA-3-神经酰胺，并且图2B使用SSEA-3-脂质作为包被抗原。
图3显示通过滴定ELISA在不同人抗体克隆之间的结合效力表征。图3A使用SSEA-4-神经酰胺，并且图3B使用SSEA-4-脂质作为包被抗原。
发明详述
因此，提供了针对用于诊断和治疗一大批癌症的标志物的抗体方法和组合物。本文开发并公开了抗Globo系列抗原人抗体。使用方法包括但不限于癌症疗法和诊断学。本文描述的抗体可以结合一大批表达Globo系列抗原的癌细胞，从而促进癌症诊断和治疗。可以被抗体靶向的细胞包括癌，例如皮肤、血液、淋巴结、脑、肺、乳腺、小鼠、食道、胃、肝、胆管、胰腺、结肠、肾、宫颈、卵巢、前列腺等中的癌。
定义
除非另有说明，本发明的实践将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。此类技术在文献中有充分说明。参见例如Molecular Cloning A Laboratory Manual,第2版,Sambrook,Fritsch和Maniatis编(ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)；DNA Cloning,第I和II卷(D.N.Glover编,1985)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；ImmobilizedCells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To MolecularCloning(1984)；论文Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编,1987,Cold SpringHarbor Laboratory)；Methods In Enzymology,第154和155卷(Wu等人编),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编,AcademicPress,London,1987)；Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow和Lane s(Cold SpringHarbor Laboratory Press,1988)；以及Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编,1986)。
如本文所用，术语“聚糖”指多糖或寡糖。本文还使用聚糖来指糖缀合物的碳水化合物部分，例如糖蛋白、糖脂、糖肽、糖蛋白质组、肽聚糖、脂多糖或蛋白聚糖。聚糖通常仅由单糖之间的O-糖苷连接组成。例如，纤维素是由β-1,4-连接的D-葡萄糖组成的聚糖(或更具体地是葡聚糖)，并且几丁质是由β-1,4-连接的N-乙酰基-D-葡糖胺组成的聚糖。聚糖可以是单糖残基的同聚物或杂聚物，并且可以是直链或支链的。可以发现聚糖与蛋白质附接，如在糖蛋白和蛋白聚糖中。它们通常存在于细胞的外表面上。O-和N-连接的聚糖在真核生物中非常常见，但也可以在原核生物中发现，尽管不太常见。发现N-连接的聚糖对序列子(sequon)中的天冬酰胺的R-基团氮(N)附接。序列子是Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸。
如本文所用，术语“抗原”定义为能够引发免疫应答的任何物质。
如本文所用，术语“免疫原性”是指免疫原、抗原或疫苗刺激免疫应答的能力。
如本文所用，术语“表位”定义为与抗体或T细胞受体的抗原结合位点接触的抗原分子部分。
如本文所用，术语“疫苗”是指含有抗原的制剂，所述抗原由完整的致病生物体(被杀死或弱化的)或用于赋予针对生物体引起的疾病的免疫力的此类生物体的组分，例如蛋白质、肽或多糖组成。疫苗制剂可以是天然的，合成的或通过重组DNA技术衍生的。
如本文所用，术语“抗原特异性”是指细胞群的特性，使得特定抗原或抗原片段的供应导致特异性细胞增殖。
如本文所用，术语“特异性结合”是指结合对(例如抗体和抗原)之间的相互作用。在各种情况下，特异性结合可以通过约10-6摩尔/升，约10-7摩尔/升，或约10-8摩尔/升或更低的亲和常数来体现。
如本文所用，短语“基本上相似”、“基本上相同”、“等同”或“基本上等同”表示两个数值(例如，一个与分子相关的数值和另一个与参考/比较分子相关联的数值)之间的足够高的相似度，使得本领域技术人员将认为这两个值之间的差异在由所述数值测量的生物学特征(例如，Kd值、抗病毒效应等)的背景下具有很小或没有生物学和/或统计学意义。所述两个值之间的差异是例如，小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、和/或小于约10％，作为参考/比较分子的数值的函数。
如本文所用，短语“基本上减少”或“基本上不同”表示两个数值(通常一个与分子相关的数值和另一个与参考/比较分子相关的数值)之间的足够高的差异程度，使得本领域技术人员将认为两个值之间的差异在由所述数值测量的生物学特征(例如，Kd值)的背景下具有统计显著性。所述两个值之间的差异是例如大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％、和/或大于约50％，作为参考/比较分子数值的函数。
“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并且倾向于易于解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持结合更长。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中任何方法都可用于本发明的目的。以下描述具体的示例性实施方案。
如本文所用，术语“载体”意指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是噬菌体载体。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。
如本文中可互换使用，“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在的话，可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。可以在合成后进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记物缀合。其他类型的修饰包括，例如，“帽”，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷的连接的那些修饰(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯(phosphoamidates)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷的连接的那些修饰(例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)，含有侧链部分，诸如例如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的那些修饰，具有嵌入剂(例如，吖啶，补骨脂素(psoralen)等)的那些修饰，含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些修饰，含有烷化剂的那些修饰，具有修饰连接的那些修饰(例如，α端基核酸等)，以及多核苷酸的未修饰形式。此外，通常存在于糖中的任何羟基可以替换为例如膦酸基团、磷酸基团，通过标准保护基团保护，或经活化以制备与其他核苷酸的额外连接，或者可以缀合至固体或半固体支持物。5’和3’端OH可以被磷酸化或被胺或1-20个碳原子的有机帽化基团部分取代。其他羟基也可以衍生化为标准保护基团。多核苷酸还可以含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖，如阿拉伯糖、木糖或来苏糖，吡喃糖糖类、呋喃糖糖类、景天庚酮糖、无环类似物和碱性核苷类似物如甲基核苷。一个或多个磷酸二酯连接可以被备选的连接基团取代。这些备选连接基团包括但不限于其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酸酯(thioate)”)、P(S)S(“二硫代酸酯(dithioate)”)、(O)NR2(“酰胺化物(amidate)”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩醛(formacetal)”)替换的实施方案，其中每个R或R’独立地为H或取代或未取代的烷基(1-20C)，任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都需要相同。前面的描述适用于本文提到的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
如本文所用，“寡核苷酸”通常是指短的，通常是单链的，通常合成的多核苷酸，其通常但不是必需长度小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是相互排斥的。以上对多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。
“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体表现出对特定抗原的结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体和通常缺乏抗原特异性的其他抗体样分子。后一种多肽例如通过淋巴系统以低水平产生并且通过骨髓瘤以增加的水平产生。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在最广泛的意义上可互换使用，包括单克隆抗体(例如，全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、单价、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出期望的生物学活性)，并且还可以包括某些抗体片段(如本文更详细描述的)。抗体可以是嵌合的、人的和/或亲和力成熟的。
抗体的“可变区”或“可变域”是指抗体的重链或轻链的氨基端域。这些域通常是抗体中变异最大的部分并含有抗原结合位点。
术语“可变”是指可变域的某些部分在抗体之间在序列上广泛不同，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性不是均匀地分布在抗体的可变域中。它集中在轻链和重链可变域两者中称为互补决定区(CDR)或高变区的3个区段中。可变域的更高保守部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含通过三个CDR连接的四个FR区，主要采用β-片层构造，所述CDR形成连接β-片层结构的环，并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每个链中的CDR通过FR区紧密靠近在一起，并且与来自另一条链的CDR促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定域不直接参与抗体对抗原的结合，但表现出各种效应器功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
木瓜蛋白酶对抗体的消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段(每个片段具有单个抗原结合位点)，和残留的“Fc”片段，其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，此区域由紧密非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以在类似于双链Fv种类中结构的“二聚体”结构中结合。在此构造中，每个可变域的3个CDR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。6个CDR总共赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使单一可变域(或仅包含三个对抗原特异的CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。
Fab片段还含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1域的羧基端的几个残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文中Fab’的名称，其中恒定域的半胱氨酸残基带有游离巯基基团。F(ab’)2抗体片段最初是作为Fab’片段对产生的，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可基于其恒定域的氨基酸序列分配为两种明显不同的类型之一，称为kappa(κ)和lambda(λ)。
根据其重链恒定域的氨基酸序列，可以将抗体(免疫球蛋白)分配到不同的类别。存在五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的，并且通常记载于例如Abbas et al.Cellular and Mol.Immunology,第4版(2000)。抗体可以是通过抗体与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的较大融合分子的一部分。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，是指基本上完整形式的抗体，而非如下文定义的抗体片段。术语特别指具有含有Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，其中该部分保留当存在于完整抗体中时通常与该部分相关的至少一种以及多达大多数或全部功能。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，因此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段(例如包含Fc区的抗体片段)保留当存在于完整抗体中时通常与Fc区相关的至少一种生物学功能，例如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是单价抗体，其体内半衰期基本上与完整抗体相似。例如，此类抗体片段可以包含与能够赋予片段以体内稳定性的Fc序列连接的抗原结合臂。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能的天然发生的突变之外，构成群体的各个抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”表示抗体不是离散抗体的混合物的特征。此类单克隆抗体通常包括含有结合靶标的多肽序列的抗体，其中通过包括从多个多肽序列中选择单一靶标结合多肽序列的方法获得靶标结合多肽序列。例如，选择过程可以是从多个克隆，例如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的合并物中选择独特的克隆。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体制剂的优点还在于它们通常不被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体从基本上同质的抗体群体获得的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括例如杂交瘤方法(例如Kohler et al.,Nature,256:495(1975)；Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)；Hammerling et al.,于:Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))，重组DNA方法(参见例如美国专利No.4,816,567)，噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Leeet al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)，以及在具有编码人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因座或基因的部分或全部的动物中产生人或人样抗体的技术(参见例如WO98/24893；WO96/34096；WO96/33735；WO91/10741；Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann et al.,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Marks etal.,Bio.Technology 10:779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild et al.,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)和Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物活性(美国专利No.4,816,567；和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
本发明的抗体还可包括由本发明的抗体产生的嵌合单克隆抗体。
抗体可以是全长的或可以包含具有抗原结合部分的抗体片段(或多个片段)，包括但不限于Fab、F(ab’)2、Fab’、F(ab)’、Fv、单链Fv(scFv)、二价scFv(bi-scFv)、三价scFv(tri-scFv)、Fd、dAb片段(例如Ward et al,Nature,341:544-546(1989))、CDR、双抗体、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。通过使用重组方法连接抗体片段或合成接头产生的单链抗体也包括在本发明中。Bird et al.Science,1988,242:423-426.Huston et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1988,85:5879-5883。
本发明的抗体或其抗原结合部分可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。
本发明涵盖所有抗体同种型，包括IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgAl、IgA2)、IgD或IgE(本发明涵盖所有类别和亚类)。抗体或其抗原结合部分可以是哺乳动物(例如小鼠，人)抗体或其抗原结合部分。抗体的轻链可以是κ或λ型。
因此，本发明的抗癌抗体包括与非鼠来源，优选人来源的重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何部分组合，其可以掺入本发明的抗体中。
具有可变重链区和可变轻链区的抗体，所述可变重链区和可变轻链区与由参考抗体产生的抗体的可变重链区和可变轻链区是至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约81％，至少约82％，至少约83％，至少约84％，至少约85％，至少约86％o，至少约87％>，至少约88％>，至少约89％>，至少约90％>，至少约91>，至少约92％>，至少约93％>，至少约94％>，至少约95％)，至少约96％>，至少约97％>，至少约98％>，至少约99％>或约100％同源，并且也可以结合碳水化合物抗原(例如Globo H、SSEA-3或SSEA-4)。同源性可以以氨基酸或核苷酸序列水平存在。
如本文所用，本发明的蛋白质的基本上“同源性”和/或“同源序列”包括但不限于保守氨基酸取代，或例如不影响抗体的VH、VL或CDR域的改变，例如，包括使用不同接头序列的scFv抗体或添加不促成抗原结合的标签序列或其他成分的抗体，或者将一种类型或形式的抗体分子或片段转换成另一种类型或形式的抗体分子或片段的改变(例如，从Fab转化为scFv或反之亦然)，或抗体分子转化为抗体分子的特定类别或亚类(例如，抗体分子转化成IgG或其亚类，例如，IgG1或IgG3)。
如本文所用，“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一种氨基酸残基取代的氨基酸取代。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
可以通过任何方便的方法评估同源性。然而，为了测定序列之间的同源性程度，进行序列的多重比对的计算机程序是有用的，例如Clustal W(Thompson et al.,1994)。若想要的话，Clustal W算法可以与BLOSUM 62评分矩阵(Henikoff和Henikoff,1992)和10的缺口开放罚分和0.1的缺口延伸罚分一起使用，使得在两个序列之间获得最高阶匹配，其中序列之一的总长度的至少50％牵涉比对。可以用于比对序列的其他方法是Needleman和Wunsch(1970)的比对方法，由Smith和Waterman(1981)修订，使得在两个序列之间获得最高阶匹配，并且在两个序列之间测定相同氨基酸的数目。计算两个氨基酸序列之间的百分比同一性的其他方法通常是本领域公认的，包括例如Carillo和Lipton(1988)描述的那些方法和记载于Computational Molecular Biology,Lesk编,Oxford University Press,NewYork,1988,Biocomputing:Informatics and Genomics Projects的那些方法。
通常，计算机程序可以用于此类计算。比较和比对序列对的程序，如ALIGN(Myersand Miller,1988)、FASTA(Pearson and Lipman,1988；Pearson,1990)和缺口BLAST(Altschul et al.,1997)、BLASTP、BLASTN或GCG(Devereux et al.,1984)也可用于此目的。此外，欧洲生物信息学研究所的Dali服务器提供基于结构的蛋白质序列比对(Holm,1993；1995；1998)。
抗体或抗原结合部分可以是肽。此类肽可以包括肽的变体、类似物、直向同源物、同源物和衍生物，其表现出生物活性，例如碳水化合物抗原的结合。肽可以含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然存在的氨基酸，仅在无关的生物系统中天然存在的氨基酸，来自哺乳动物系统的经修饰的氨基酸等)、具有取代的连接的肽以及本领域已知的其他修改。
抗体或其抗原结合部分也在本发明的范围内，其中特定氨基酸已被取代、缺失或添加。在一个示例性实施方案中，这些交替对肽的生物学性质如结合亲和力没有实质性影响。在另一个示例性实施方案中，抗体可以在框架区中具有氨基酸取代，例如以提高抗体对抗原的结合亲和力。在另一个示例性实施方案中，选择的少量受体框架残基可以被相应的供体氨基酸取代。供体框架可以是成熟或种系的人抗体框架序列或共有序列。Bowie etal.,Science,247:1306-1310(1990).Cunningham et al,Science,244:1081-1085(1989).Ausubel(编),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(1994).T.Maniatis,E.F.Fritsch and J.Sambrook,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989).Pearson,Methods Mol.Biol.243:307-31(1994).Gonnet et al.,Science 256:1443-45(1992)中提供了关于如何进行表型沉默氨基酸取代的指导。
抗体或其抗原结合部分可以衍生化或与另一种功能分子连接。例如，抗体可以与一种或多种其他分子实体(例如另一种抗体、可检测试剂、细胞毒性剂、药剂、蛋白质或肽)功能性连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价相互作用等)，所述其他分子实体可以介导与另一种分子(如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标签)、氨基酸接头、信号序列、免疫原性载体或可用于蛋白质纯化的配体(如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸标签和葡萄球菌蛋白A)的结合。通过交联两种或更多种蛋白质(相同类型或不同类型)产生一类衍生化蛋白质。合适的交联剂包括异双功能性的那些交联剂，具有由适当的间隔物分开的两个不同的反应基团(例如间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)，或同双功能的交联剂(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯(disuccinimidyl suberate))。此类接头可购自Pierce ChemicalCompany,Rockford,111。可以衍生化(或标记)蛋白质的有用的可检测试剂包括荧光化合物、各种酶、辅基、发光材料、生物发光材料和放射性材料。非限制性的示例性荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明和藻红蛋白。蛋白质或抗体也可以用可检测的酶衍生化，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶等。蛋白质也可以用辅基(例如，链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素)衍生化。
编码本发明抗体的功能活性变体或其抗原结合部分的核酸也包括在本发明中。这些核酸分子可以在中等严格性、高严格性或非常高严格性条件下与编码任何本抗体或其抗原结合部分的核酸杂交。进行杂交反应的指导可以参见Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,N.Y.6.3.1-6.3.6,1989，其通过引用并入本文。本文提到的特异性杂交条件如下：1)中等严格性杂交条件：6X SSC于约45℃，接着在0.2X SSC,0.1％SDS中于清洗一次或多次；2)高严格性杂交条件：6X SSC于约45℃，接着在0.2XSSC,0.1％SDS中于65℃清洗一次或多次；3)非常高严格性杂交条件：0.5M磷酸钠，7％SDS，于65℃，接着在0.2XSSC,1％SDS，于65℃清洗一次或多次。
可以将编码本抗体或其抗原结合部分的核酸引入表达载体中，所述表达载体可以在合适的表达系统中表达，然后分离或纯化表达的抗体或其抗原结合部分。任选地，编码本抗体或其抗原结合部分的核酸可以在无细胞翻译系统中翻译。美国专利No.4,816,567.Queen et al,Proc Natl Acad Sci USA,86:10029-10033(1989)。
可以通过用编码期望抗体的轻链和重链(或其部分)的DNA转化的宿主细胞产生本抗体或其抗原结合部分。可以使用标准技术从这些培养物上清液和/或细胞中分离和纯化抗体。例如，可以用编码抗体的轻链，重链或两者的DNA转化宿主细胞。重组DNA技术也可以用于除去编码对于结合不必需的轻链和重链(例如恒定区)之任一或两者的一些或全部DNA。
如本文所用，“基本上纯化的”或“基本上分离的”是指分子(例如化合物)处于以下状态，使得它与在其天然状态中通常与其相关的基本上所有其他分子分离。优选地，基本上纯化的分子是制剂中存在的主要种类。特别地，基本上纯化的分子可以大于60％不含，优选75％不含，或85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、或99.5％不含，或任何两种所述百分比之间的任何范围不含天然混合物中存在的其他分子(排除溶剂)。
本核酸可以在各种合适的细胞中表达，包括原核细胞和真核细胞，例如细菌细胞(例如大肠杆菌)、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。许多哺乳动物细胞系是本领域已知的，包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系。细胞的非限制性实例包括哺乳动物来源或哺乳动物样特征的所有细胞系，包括但不限于猴肾细胞的亲本细胞、衍生物和/或工程化变体(COS，例如COS-1，COS-7)、HEK293、幼仓鼠肾(BHK，例如，BHK21)、中国仓鼠卵巢(CHO)、NSO、PerC6、BSC-1、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、SP2/0、HeLa、Madin-Darby牛肾(MDBK)、骨髓瘤和淋巴瘤细胞。工程化变体包括例如聚糖概况修饰的和/或位点特异性整合位点衍生物。
本发明还提供了包含本文所述的核酸的细胞。细胞可以是杂交瘤或转染子。
或者，本抗体或其抗原结合部分可以通过本领域中公知的固相程序合成。SolidPhase Peptide Synthesis:A Practical Approach by E.Atherton and R.C.Sheppard,IRL于Oxford University Press(1989)出版.Methods in Molecular Biology,第35卷:Peptide Synthesis Protocols(M.W.Pennington和B.M.Dunn),第7章.Solid PhasePeptide Synthesis,第2版,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984).G.Barany和R.B.Merrifield,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,E.Gross和J.Meienhofer编,第1卷和第2卷,Academic Press,New York,(1980),第3-254页.M.Bodansky,Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Berlin(1984)。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变域中在序列中高变和/或形成结构限定环的区域。通常，抗体包含6个高变区；VH中的三个(H1、H2、H3)和VL中的三个(L1、L2、L3)。许多高变区域描绘在使用中并且包含在本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性并且是最常用的(Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。Chothia指结构环的位置(Chothia and LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
“框架”或“FW”残基是除如本文定义的高变区残基之外的那些可变域残基。
术语“如Kabat中的可变域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变型指用于Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中抗体编译的重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可含有较少或额外的氨基酸，其对应于可变域的FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可以包含在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和重链FR残基82之后插入的残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体序列的同源性区域处与“标准”Kabat编号序列比对确定给定抗体的残基的Kabat编号。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL域，其中这些域存在于单一多肽链中。通常，scFv多肽还包含VH和VL域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun,于The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含与同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)。通过使用太短而不允许同一链上的两个域之间配对的接头，该域被迫与另一条链的互补域配对并创建两个抗原结合位点。双抗体更全面地记载于例如EP 404,097；WO93/1161；和Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。
“人抗体”是拥有与由人产生的抗体的氨基酸序列相对应和/或已经使用如本文公开的制备人抗体的任何技术制备的氨基酸序列。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个HVR中具有一个或多个改变的抗体，所述改变导致与不拥有那些改变的亲本抗体相比抗体对抗原的亲和力的改善。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。通过本领域已知的程序产生亲和力成熟的抗体。Marks et al.Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH和VL域改组的亲和力成熟。Barbas et al.Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier et al.Gene 169:147-155(1995)；Yelton et al.J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson et al.,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和Hawkins et al,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)描述可CDR和/或框架残基的随机诱变。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物活性的抗体。某些阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。
如本文所用，“激动剂抗体”是模拟感兴趣的多肽的至少一种功能活性的抗体。
“病症”是将受益于用本发明的抗体治疗的任何病症。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论的病症的那些病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性实例包括癌症。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”是指与某种程度的异常细胞增殖相关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性疾病是癌症。
如本文所用，“肿瘤”是指所有新生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌性细胞和组织。如本文所提及，术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”不是相互排斥的。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长/增殖为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌淋巴瘤(例如，何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、白血病和其他淋巴组织增殖性病症以及各种类型的头和颈癌。
如本文所用，“治疗”是指试图改变所治疗的个体或细胞的自然进程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学过程期间进行。“治疗”或“处理”在本文中称为对受试者施用治疗组合物，目的是治愈、减轻、缓解、治疗、预防或改善病症、病症的症状、病症继发的疾病状态、或病症的素因。治疗的理想效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防或减少炎症和/或组织/器官损害、降低疾病进展速率、疾病状态的改善或缓解、以及缓解或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病或病症的发展。
“个体”或“受试者”是脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于农场动物(例如牛)、运动动物、宠物(例如猫、狗和马)、灵长类、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，脊椎动物是人。
用于治疗目的的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，和动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等。实施方案中，哺乳动物是人。
“有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望治疗或预防结果的量。
本发明的物质/分子的“治疗有效量”可以随诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及物质/分子在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过物质/分子的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望预防结果的量。通常但不是必须的，由于在疾病之前或疾病的早期阶段在受试者中使用预防剂量，预防有效量将小于治疗有效量。
靶向Globo系列抗原的抗体
本公开内容的一方面的特征在于靶向Globo系列抗原(Globo H、SSEA-3、SSEA-4)的新抗体。
表达Globo系列抗原(SSEA-4、Globo H或SSEA-3)的癌症包括但不限于肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌和前列腺癌。
“SSEA-4部分”在本文中定义为SSEA-4或其片段或类似物的聚糖(即，含有糖部分的分子)。SSEA-4是含有六糖表位(Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1)和任选地非糖部分的聚糖。其片段是含有六糖表位的片段和(若适用的化)非糖部分的聚糖。
“Globo H部分”在本文中定义为Globo H或其片段或类似物的聚糖(即，含有糖部分的分子)。Globo H是含有六糖表位(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc)和任选地非糖部分的聚糖。其片段是含有六糖表位的片段和(若适用的化)非糖部分的聚糖。
“SSEA-3部分”在本文中定义为SSEA-3或其片段或类似物的聚糖(即，含有糖部分的分子)。SSEA-3是含有五糖表位(Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1)和任选地非糖部分的聚糖。其片段是含有六糖表位的片段和(若适用的化)非糖部分的聚糖。
以下提供了示例及其氨基酸和核酸结构/序列：
表1.人抗体2-8M的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000231
Figure GDA0002003262010000241
表2.抗体6-8N的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000242
表3.抗体2-20G的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000243
Figure GDA0002003262010000251
表4.抗体3-17I的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000252
Figure GDA0002003262010000261
表5.抗体B-21J的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000262
Figure GDA0002003262010000271
表6.抗体F-18D的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000272
表7.抗体J-5N的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000273
Figure GDA0002003262010000281
表8.抗体J-8G的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000282
Figure GDA0002003262010000291
表9.抗体4-22O的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000292
Figure GDA0002003262010000301
表10.抗体6-20C的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000302
表11.抗体12-14G的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000311
表12.抗体15-6J的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000312
Figure GDA0002003262010000321
表13.抗体18-11C的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000322
Figure GDA0002003262010000331
表14.抗体20-2D的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000332
Figure GDA0002003262010000341
表15.抗体9-5L的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000342
表16.抗体15-20G的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000343
Figure GDA0002003262010000351
表17.抗体23-12O的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000352
Figure GDA0002003262010000361
表18.抗体31-2C的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000362
Figure GDA0002003262010000371
表19.抗体36-19H的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000372
表20.抗体36-21L的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000373
Figure GDA0002003262010000381
表21.抗体41-18O的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000382
Figure GDA0002003262010000391
表22.抗体5-14N的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000392
Figure GDA0002003262010000401
表23.抗体11-19C的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000402
表24.抗体F-8C的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000411
表25.抗体21-6M的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000412
Figure GDA0002003262010000421
表26.抗体22-14F的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000422
Figure GDA0002003262010000431
表27.抗体24-5D的氨基酸和核苷酸序列
Figure GDA0002003262010000432
表28. 27种抗体互补决定区(CDRs)的氨基酸序列
Figure GDA0002003262010000441
Figure GDA0002003262010000451
Figure GDA0002003262010000461
Figure GDA0002003262010000471
Figure GDA0002003262010000481
Figure GDA0002003262010000491
Figure GDA0002003262010000501
Figure GDA0002003262010000511
Figure GDA0002003262010000521
本公开内容的一方面的特征在于对SSEA-4特异性的新抗体。抗SSEA-4抗体结合Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1。
本公开内容的一方面的特征在于对SSEA-3特异性的新抗体。抗SSEA-3抗体结合2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1。
本公开内容的一方面的特征在于对Globo H特异性的新抗体。抗Globo H抗体结合Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc。
本文描述的任何抗体可以是全长抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，抗原结合片段是Fab片段、F(ab')2片段或单链Fv片段。在一些实例中，抗原结合片段是Fab片段、F(ab')2片段或单链Fv片段。在一些实例中，抗体是人抗体、嵌合抗体或单链抗体。
本文所述的任何抗体具有以下一个或多个特征：(a)是重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、抗体片段、双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、IgG1抗体、IgG2抗体或抗体衍生物；(b)是人、鼠或嵌合抗体、抗原结合片段或抗体衍生物；(c)是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD同种型和/或其亚类的单链抗体片段、多抗体(multibody)、Fab片段和/或免疫球蛋白；(d)具有以下一种或多种特征：(i)介导癌细胞的ADCC和/或CDC；(ii)诱导和/或促进癌细胞的凋亡；(iii)抑制癌细胞的靶细胞的增殖；(iv)诱导和/或促进癌细胞的吞噬作用；和/或(v)诱导和/或促进细胞毒剂的释放；(e)特异性结合肿瘤相关的碳水化合物抗原，其是肿瘤特异性碳水化合物抗原；(f)不结合在非癌细胞、非肿瘤细胞、良性癌细胞和/或良性肿瘤细胞上表达的抗原；和/或(g)特异性结合在癌症干细胞和正常癌细胞上表达的肿瘤相关碳水化合物抗原。
优选地，抗体与其各自抗原的结合是特异性的。术语“特异性”通常用于指下述的情况，其中结合对的一个成员不会显示与除其特异性结合配偶体之外的分子的任何显著结合，并且例如与本文所规定的分子之外的任何其他分子具有小于约30％，优选20％，10％或1％的交叉反应性。
宿主动物的免疫和杂交瘤技术
在一个实施方案中，本发明提供了制备杂交瘤的方法，所述杂交瘤表达特异性结合碳水化合物抗原(例如Globo H)的抗体。该方法包括以下步骤：用包含碳水化合物抗原(例如Globo H)的组合物免疫动物；从动物中分离脾细胞；从脾细胞产生杂交瘤；并选择产生特异性结合Globo H的抗体的杂交瘤。Kohler and Milstein,Nature,256:495,1975.Harlow,E.and Lane,D.Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988。
在一个实施方案中，碳水化合物抗原用于皮下免疫小鼠。可以给予或可以不给予一个或多个加强。可以通过例如ELISA(酶联免疫吸附测定法)或流式细胞术监测血浆中抗体的滴度。具有足够滴度的抗碳水化合物抗原抗体的小鼠用于融合。可以在处死和取出脾脏之前3天用或不用抗原加强小鼠。分离小鼠脾细胞并用PEG与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后，筛选得到的杂交瘤以产生抗原特异性抗体。将细胞分配，然后在选择性培养基中温育。然后，通过ELISA筛选来自各孔的上清液的人抗碳水化合物抗原单克隆抗体。再分配分泌抗体的杂交瘤，再次筛选，并且若仍然对抗抗碳水化合物抗原抗体呈阳性，则可以通过有限稀释进行亚克隆。
针对抗Globo系列抗原抗体的示例性多克隆抗体可以通过从检查血清中期望抗体增加的经免疫的哺乳动物中采集血液，以及通过任何常规方法从血液中分离血清来制备。多克隆抗体包括含有多克隆抗体的血清，并且含有多克隆抗体的级份可以从血清中分离。
通常通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在宿主动物(例如，兔、小鼠、马或山羊)中制备多克隆抗体。使用双功能或衍生剂，例如马来酰亚胺基苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2等将相关抗原与待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质(例如，钥孔虫戚血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)偶联可能是有用的。
可以用抗原免疫任何哺乳动物以产生期望的抗体。通常，可以使用啮齿目(Rodentia)、兔形目或灵长类的动物。啮齿目动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形目动物包括例如兔。灵长类动物包括例如Catarrhini猴(旧世界猴)，例如成束猴(Macacafascicularis)、猕猴(rhesus monkey)、狒狒和黑猩猩。
用抗原免疫动物的方法是本领域已知的。腹膜内注射或皮下注射抗原是哺乳动物免疫的标准方法。更具体地，可以将抗原稀释并悬浮在适当量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中。若想要的话，可以将抗原悬浮液与适量的标准佐剂(例如弗氏完全佐剂)混合，制成乳剂，然后对哺乳动物施用。通过将1mg或1μg肽或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3体积的弗氏不完全佐剂组合，针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫动物。
可以每4至21天通过几次施用与适当量的弗氏不完全佐剂混合的抗原将动物加强直至滴度平台期。通过在多个部位皮下注射用弗氏完全佐剂中原始量的肽或缀合物的1/5至1/10加强动物。7至14天后，将动物放血并测定血清的抗体滴度。合适的载体也可用于免疫。如上所述免疫后，通过标准方法检查血清的期望抗体的量的增加。优选地，用相同抗原的但是与不同蛋白质和/或通过不同交联剂缀合的缀合物加强动物。缀合物也可以作为蛋白质融合物在重组细胞培养物中制备。此外，诸如明矾的聚集剂适合用于增强免疫应答。
在一些实施方案中，可以通过常规杂交瘤技术制备抗体。Kohler et al.,Nature,256:495(1975)。在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物，例如仓鼠或兔，以引发产生或能够产生可以特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。
为了制备单克隆抗体，从用抗原免疫的哺乳动物中收集免疫细胞，并如上所述检查血清中期望抗体水平的增加，并进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选从脾中获得。与上述免疫细胞融合的其他优选的亲本细胞包括例如哺乳动物的骨髓瘤细胞，更优选具有通过药物选择融合细胞的获得性质的骨髓瘤细胞。
优选的骨髓瘤细胞是有效融合，通过选择的抗体生成细胞支持稳定的高水平抗体产生，并且对诸如HAT培养基的培养基敏感的细胞。在这些中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，例如可购自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USA的源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系，以及可购自美国典型培养物保藏中心,Rockville,Md.USA的SP-2细胞。还描述了人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系用于产生人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
可以根据已知方法融合上述免疫细胞和骨髓瘤细胞，例如Milstein et al.(Galfre et al.,Methods Enzymol.73:3-46,1981)的方法。使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986))。通过细胞融合获得的所得杂交瘤可以通过在标准选择培养基(例如HAT培养基(次黄嘌呤、氨基蝶呤和含胸苷的培养基))中培养它们来选择。细胞培养通常在HAT培养基中继续数天至数周，该时间足以使除期望杂交瘤之外的所有其他细胞(非融合细胞)死亡。然后，进行标准有限稀释以筛选和克隆产生期望抗体的杂交瘤细胞。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种并培养，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。
测定杂交瘤细胞生长的培养基的针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定法测定。酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)和/或免疫荧光中吸光度的测量可用于测量本发明抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定化在板上，将本发明的蛋白质应用于板，然后应用含有期望抗体的样品，例如抗体生成细胞的培养上清液或纯化的抗体。然后，应用识别一抗并用酶(例如碱性磷酸酶)标记的二抗，并温育板。接下来，在清洗后，将诸如对硝基苯基磷酸盐的酶底物添加到板，并测量吸光度以评价样品的抗原结合活性。可以在该方法中使用蛋白质的片段，例如C端或N端片段。
应用任何常规方法(包括上述的那些方法)，可以鉴定和选择产生与本文所述表位结合的抗体的杂交瘤细胞以用于进一步表征。
在鉴定产生期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释程序亚克隆克隆并通过标准方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice,pp.59-103(Academic Press,1986))培养。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。由亚克隆分泌的单克隆抗体通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析适当地与培养基、腹水或血清分离。
此外，杂交瘤细胞可以在体内作为动物的腹水肿瘤培养。例如，随后可以将获得的杂交瘤移植到小鼠的腹腔中并收获腹水。
获得的单克隆抗体可以通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或与本发明蛋白偶联的亲和柱来纯化。本发明的抗体不仅可以用于纯化和检测本发明的蛋白质，而且还可以用作本发明蛋白质的激动剂和拮抗剂的候选物。另外，此抗体可以应用于针对与本发明蛋白质相关的疾病的抗体治疗。
活性测定法
可通过本领域已知的各种测定法表征本发明的抗体的物理/化学性质和生物学功能。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可以就其对抗原的结合亲和力进行描述或说明。抗体对碳水化合物抗原的亲和力可以使用任何合适的方法通过实验确定(参见例如Berzofsky et al,"Antibody-Antigen Interactions,"In FundamentalImmunology,Paul,W.E.,Ed.,Raven Press:New York,N.Y.(1984)；Kuby,JanisImmunology,W.H.Freeman and Company:New York,N.Y.(1992)；和本文所述的方法)。若在不同条件(例如，盐浓度，pH)下测量，则测量的特定抗体-碳水化合物抗原相互作用的亲和力可以变化。因此，亲和力和其他抗原结合参数(例如，KD，Ka，Ka)的测量优选用抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲液进行。
本抗体或其抗原结合部分具有体外和体内治疗、预防和/或诊断效用。例如，可以将这些抗体施用于培养中的细胞，例如体外或离体，或施用于受试者，例如体内，以治疗、抑制、预防复发和/或诊断癌症。
纯化的抗体可以通过一系列测定法进一步表征，包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)、质谱术、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。
必要时，分析抗体的生物活性。在一些实施方案中，测试本发明的抗体的抗原结合活性。本领域已知的并且可以在本文中使用的抗原结合测定法包括但不限于使用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法、纳米颗粒免疫测定法、适体免疫测定法和蛋白A免疫测定法的技术的任何直接或竞争性结合测定。
用途
本发明的抗体可以用于例如体外、离体和体内治疗方法。本发明的抗体可以用作拮抗剂，以在体外、离体和/或体内部分或完全阻断特异性抗原活性。此外，本发明的至少一些抗体可以中和来自其他物种的抗原活性。因此，本发明的抗体可以用于抑制特定抗原活性，例如在含有抗原的细胞培养物中，在人受试者中或在具有与本发明的抗体交叉反应的抗原的其他哺乳动物受试者(例如黑猩猩、狒狒、绒猴、短尾猴和猕猴、猪或小鼠)中。在一个实施方案中，本发明的抗体可以用于通过使抗体与抗原接触，从而抑制抗原活性来抑制抗原活性。在一个实施方案中，抗原是人蛋白质分子。
“施用”在本文中称为对患者提供本发明的治疗组合物。作为实例而非限制，组合物施用(例如注射)可通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射，皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射或肌内(i.m.)注射进行。可以采用一种或多种此类途径。例如，胃肠外施用可以通过推注或随时间逐渐灌注进行。或者，或同时，可以通过口服途径或鼻途径施用。另外，施用还可以通过推注的手术沉积或医疗装置的定位进行。
在一个实施方案中，本发明的抗体可以用于抑制患有抗原活性有害的病症的受试者中的抗原的方法，包括对受试者施用本发明的抗体，使得受试者中的抗原活性受到抑制。在一个实施方案中，抗原是人蛋白质分子，并且受试者是人受试者。或者，受试者可以是表达与本发明的抗体结合的抗原的哺乳动物。此外，受试者可以是已经引入抗原的哺乳动物(例如，通过施用抗原或通过表达抗原转基因)。可以将本发明的抗体施用于人受试者用于治疗目的。此外，本发明的抗体可以施用于表达与抗体交叉反应的抗原的非人哺乳动物(例如灵长类、猪或小鼠)用于兽医目的或作为人疾病的动物模型。关于后者，此类动物模型可以用于评估本发明抗体的治疗功效(例如，测试施用剂量和时间过程)。本发明的抗体可以用于治疗、抑制与Globo系列抗原(Globo H、SSEA-3、SSEA-4)的异常表达和/或活性相关的疾病、病症或状况，延缓该疾病、病症或状况的进展，预防/延迟该疾病、病症或状况的复发，改善或预防该疾病、病症或状况，其包括但不限于癌症、肌病症、泛素途径相关遗传病症、免疫/炎性病症、神经病症和其他泛素途径相关疾病。
在某些实施方案中，对患者施用包含与细胞毒剂缀合的本发明抗体的免疫缀合物。在一些实施方案中，与其结合的免疫缀合物和/或抗原被细胞内化，导致免疫缀合物杀死与其相关的靶细胞的治疗效力增加，所述细胞在其细胞表面上表达与Globo系列抗原相关的一种或多种蛋白质。在一个实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰靶细胞中的核酸。此类细胞毒性剂的实例包括本文提到的任何化学治疗剂(例如美登素类生物碱(maytansinoid)或加利车霉素)、放射性同位素或核糖核酸酶或DNA内切核酸酶。
本发明的抗体可以单独使用或与治疗中的其他组合物组合使用。例如，本发明的抗体可以与另一种抗体和/或佐剂/治疗剂(例如类固醇)共施用。例如，本发明的抗体可以与治疗方案中的抗炎药和/或杀菌剂组合，例如在治疗本文所述的任何疾病中，包括癌症、肌病症、泛素途径相关的遗传病症、免疫/炎性病症、神经病症和其他泛素途径相关病症。上文所述的此类组合疗法包括联合施用(其中两种或更多种试剂包括在相同或不同的配制剂中)和分开施用，在此情况下，本发明的抗体的施用可以在施用一种或多种辅助疗法之前和/或之后发生。
本发明的抗体(和辅助治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内，并且若想要的化，用于局部治疗、损伤内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。另外，适当地，抗体通过脉冲输注施用，特别以下降的抗体剂量。给药可以通过任何合适的途径，例如，通过注射，例如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。
治疗应用
本文描述了治疗方法，其包括对需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的包含一种或多种本文所述抗体的组合物。
在一些实施方案中，需要治疗的受试者(例如，人患者)诊断患有癌症，怀疑患有癌症癌症或具有癌症的风险。癌症的实例包括但不限于肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌和前列腺癌。在一些实施方案中，癌症是肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌或胰腺癌。在一些优选的实施方案中，癌症是脑癌或多形性胶质母细胞瘤(GBM)癌症。
在优选的实施方案中，抗体能够靶向表达Globo系列抗原的癌细胞。在一些实施方案中，抗体能够靶向癌细胞上的Globo系列抗原。在一些实施方案中，抗体能够靶向癌症中的Globo系列抗原。
治疗导致肿瘤尺寸的减小、恶性细胞的消除、转移的预防、复发的预防、播散性癌症的减少或杀死、存活的延长和/或肿瘤癌症进展前的时间延长。
在一些实施方案中，治疗还包括在抗体的所述施用之前、期间或之后向所述受试者施用另外的疗法。在一些实施方案中，另外的疗法是用化学治疗剂治疗。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法。
本发明的方法特别有利于治疗和预防早期肿瘤，从而防止进展到更晚期的阶段，导致与晚期癌症相关的发病率和死亡率降低。本发明的方法还有利于预防肿瘤的复发或肿瘤(例如在除去原发性肿瘤后持续存在的休眠肿瘤)的再生，或减少或预防肿瘤的发生。
在一些实施方案中，本文公开的方法可用于治疗或预防癌症，例如其中癌症的特征在于增加的Globo H、SSEA-3和/或SSEA-4表达。在一些实施方案中，癌症包括癌症干细胞。在一些实施方案中，癌症是癌前期和/或恶性癌症和/或疗法抗性癌症。在一些实施方案中，癌症是脑癌。
通过本文描述的方法治疗的受试者可以是哺乳动物，更优选是人。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类、马、狗、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人类受试者可以是具有、有风险具有或怀疑患有癌症的人患者，所述癌症包括但不限于肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌和前列腺癌。可以通过常规医学检查鉴定患有癌症的受试者。
如本文所用，“有效量”是指单独或与一种或多种其他活性剂组合对受试者赋予治疗效果所需的每种活性剂的量。如本领域技术人员所认识到的，有效量随所治疗的具体状况、状况的严重程度、个别患者参数(包括年龄、身体状况、体格、性别和体重)、治疗持续时间、同时疗法的性质(若有的话)、特定的施用途径以及健康从业者的知识和专业内的类似因素而变化。这些因素是本领域普通技术人员公知的，并且可以仅通过常规实验来解决。通常优选使用最大剂量的个别组分或其组合，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员将理解，出于医学原因、心理原因或实际上任何其他原因，患者可以坚持较低剂量或可耐受剂量。
如本文所用，术语“治疗”是指对患有癌症、癌症症状或癌症素因的受试者应用或施用包含一种或多种活性剂的组合物，目的是治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改进、改善或影响癌症、癌症症状或癌症素因。
癌症的“形成”或“进展”意指癌症的初始表现和/或随后的进展。可以使用如本领域中公知的标准临床技术检测和评估癌症的形成。然而，形成也指可能检测不到的进展。出于本公开的目的，形成或进展指症状的生物学过程。“形成”包括发生、复发和发作。如本文所用，癌症的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。
可以使用本领域普通技术人员已知的常规方法将药物组合物施用于受试者，这取决于待治疗的疾病类型或疾病部位。此组合物还可以通过其他常规途径施用，例如口服、胃肠外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔、阴道或通过植入的储库施用。如本文所用，术语“胃肠外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、损伤内和颅内注射或输注技术。另外，它可以通过可注射的贮库施用途径对受试者施用，例如使用1个月、3个月或6个月的可注射或可生物降解的材料和方法。
可注射组合物可以含有各种载体，例如植物油、二甲基乙酰胺(dimethylactamide)、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，可以通过滴注方法施用水溶性抗体，由此输注含有抗体和生理学上可接受的赋形剂的药物配制剂。生理学上可接受的赋形剂可以包括例如5％右旋糖、0.9％盐水、林格氏溶液或其他合适的赋形剂。可以将肌内制剂(例如抗体的合适可溶性盐形式的无菌配制剂)溶解并在药物赋形剂，例如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液中施用。
示例性治疗组合物(在本文中也称为药物组合物)通常包括药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、涂层材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。补充的活性化合物也可以掺入组合物中。配制药物组合物以与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、皮内、皮下、肌内、动脉内、口服(例如吸入)、透皮(局部)、经粘膜和直肠施用。用于胃肠外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、磷酸盐缓冲盐水、tris缓冲盐水、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇、或其他合成溶剂；抗细菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。pH值可以用酸或碱，例如盐酸或氢氧化钠调节。胃肠外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适用于可注射用途的示例性药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor
Figure GDA0002003262010000611
(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物应当是无菌的并且就存在容易的可注射性(syringability)而言应当具有流动性。它应当在制造和储存条件下保持稳定，并防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用诸如卵磷脂的涂层材料，通过在分散体的情况下维持需要的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现对微生物作用的预防。在许多情况下，优选在组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。
示例性的无菌可注射溶液可以通过将需要量的活性化合物掺入根据需要具有上文列举的成分之一或组合的合适溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有碱性分散介质和来自上文列举的那些成分的所需要的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤溶液的任何其他期望成分。
示例性口腔组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。对于口服治疗施用的目的，可以将活性化合物与赋形剂一起掺入并以片剂、糖锭(troche)或胶囊的形式使用，例如明胶胶囊。口服组合物也可以使用流体载体制备用作漱口剂。可以包含药学上相容的粘合剂或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、糖锭等可以含有下列任何成分或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖、崩解剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙调味剂。
此外，对于口服施用，本发明的示例性配制剂可以采取例如通过常规手段用药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊剂形式，所述药学上可接受的赋形剂如粘合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如月桂硫酸钠)。片剂可以通过本领域公知的方法包被。本发明的组合物也可以引入微球或微胶囊中，例如，从聚乙醇酸/乳酸(PGLA)制成(参见美国专利Nos.5,814,344；5,100,669和4,849,222；PCT公开Nos.WO 95/11010和WO 93/07861)。用于口服施用的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆、乳剂或悬浮液的形式，或者它们可以作为干燥产品存在，用于在使用前用水或其它合适的载体重建。此类液体制剂可以通过常规手段用药学上可接受的添加剂如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分级植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)制备。制剂还可以适当含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。口服施用的制剂可以适当配制，以控制活性化合物的释放。
对于通过吸入或鼻施用的施用，示例性化合物/配制剂可以自加压容器或分配器，或喷雾器以气溶胶喷雾的形式递送，所述加压容器或分配器含有合适的推进剂，例如气体，例如二氧化碳。
系统性施用也可以是透粘膜或透皮的。对于透粘膜或透皮施用，在配制剂中使用适合于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，并且包括例如对于经粘膜施用，去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于透皮施用，将活性化合物配制成软膏剂、油膏剂、凝胶或乳膏，如本领域公知的。化合物也可以以栓剂(例如，用常规的栓剂基质如可可脂和其它甘油酯)或保留灌肠的形式制备用于直肠递送。
根据实施方案，活性化合物用载体制备，所述载体将保护化合物免于从体内快速消除，例如受控释放配制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类配制剂的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。材料也可以从商业上获得。脂质体悬浮液(包括用针对细胞特异性抗原的单克隆抗体靶向到感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利No.4,522,811(其通过引用并入本文)中所述。
以剂量单位形式配制口服或胃肠外组合物以便于施用和剂量统一性是有利的。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为要治疗的受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算产生与所需要的药物载体结合产生期望治疗效果的活性化合物的预定量。
本发明的药物配制剂可以以胃肠外递送，即通过静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)、皮下(s.d.)或真皮内(i.d.)施用，通过直接注射，经由例如推注、连续输注或基因枪(例如，对受试者施用载体疫苗，例如裸DNA或RNA)。用于注射的配制剂可以以单位剂型存在，例如在具有添加的防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物可以采取诸如油性或水性载体中的赋形剂、悬浮液、溶液或乳剂的形式，并且可以含有配制试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合适的载体(例如无菌无热原水)重建。
剂量：此类治疗组合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序测定，例如，用于测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，并且它可以表示为LD50/ED50比率。表现出高治疗指数的治疗组合物是优选的。虽然可以使用表现出毒性副作用的化合物，但应当注意设计递送系统，其将此类化合物靶向到受影响位置的部位，以最小化对未感染细胞的潜在损害，从而减少副作用。
从细胞培养测定法和动物研究获得的数据可以用于配制用于人的剂量范围。此类化合物的剂量优选位于具有很少的毒性或无毒性的包括ED50的循环浓度范围内。剂量可以在此范围内变化，这取决于所采用的剂型和所利用的施用途径。对于本公开内容的方法中使用的任何化合物，最初可以从细胞培养测定法估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以达到循环血浆浓度范围，其包括如在细胞培养中测定的IC50(即，实现症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)。此类信息可以用于更准确测定人中的有用剂量。例如，可以通过高效液相层析测量血浆中的水平。
在一些实施方案中，治疗组合物的治疗有效量(即，有效剂量)的范围可以为约0.001μg/kg至约250g/kg、0.01μg/kg至10g/kg、或0.1μg/kg至l.0g/kg或约或至少：0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009；0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09；0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、或250克或微克/千克患者体重，或本文所列任何数字之间的任何范围，或技术人员无需过度实验明显和理解的其他范围。熟练技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗受试者所需要的剂量和时机，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康或年龄以及存在的其他疾病。
在其他实施方案中，治疗组合物中Globo系列部分的治疗有效量(即，有效剂量)的范围可以为约0.001μg/kg至约250g/kg、0.01μg/kg至10g/kg、或0.1μg/kg至l.0g/kg或约或至少：0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009；0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09；0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、或250克或微克/千克患者体重，或本文所列任何数字之间的任何范围，或技术人员无需过度实验明显和理解的其他范围。熟练技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗受试者所需要的剂量和时机，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康或年龄以及存在的其他疾病。在一个实施方案中，包含药学上可接受的载体的疫苗的免疫原性有效量的范围为约0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75至约5.0μg，或本文所列任何数字之间的任何范围。
在一些实施方案中，在方法中将本发明的治疗组合物施用于有此需要的受试者(例如，患有癌症如乳腺癌的受试者)，该方法相对于对照安慰剂，例如磷酸盐缓冲盐水安慰剂将无进展存活或总体存活平均延长约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50天、周、月或年。
无需进一步详细说明，相信本领域技术人员基于以上描述可以最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施方案应当解释为仅是示例性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文引用的目的或主题，本文引用的所有出版物均通过引用并入。
实施例
实施例1：临床样品收集
为了产生抗Globo系列抗原人单克隆抗体，从接种疫苗的患者的外周血中分离B细胞。在复发性卵巢癌患者中施用Globo H-KLH疫苗(OBI-822/OBI-821)后，收集血液样品用于以下分析程序。
实施例2：人单B细胞分选和培养
从人外周血中新鲜分离IgD-IgM-IgA-记忆B细胞，并使用荧光激活细胞分选仪以每孔1个细胞的密度分配到384孔组织培养板中。刺激分选的B细胞以分泌IgG并温育数天。温育后，分别收集B细胞裂解物和培养物上清液。
实施例3：抗体基因的扩增
在获得Globo H、SSEA-3或SSEA-4结合克隆中，使用RT-PCR从B细胞裂解物中回收编码Ig VH、IgVκ或IgVλ的基因，并克隆到IgG表达载体中。通过转染哺乳动物细胞表达重组抗体，并用于确认结合特异性或实施其他功能测定法。
实施例4：Globo H、SSEA-3和SSEA-4结合测定法
为了筛选抗Globo系列抗原人抗体，使用ELISA测定含有分泌性IgG的培养物上清液的Globo H、SSEA-3或SSEA-4结合特异性。
1.试剂/缓冲液制备：
A.将Globo H-神经酰胺、Globo H-脂质、SSEA-3-神经酰胺、SSEA-3-脂质、SSEA-4-神经酰胺和SSEA-4-脂质粉末溶解在乙醇中并在-20℃贮存。将20μg抗原加入5mL乙醇中并轻轻混合。
B.将50μL包被抗原(0.2μg抗原/孔)添加到每孔中。覆盖，标记并在室温温育过夜。
C.将100μL/孔封闭缓冲液(Sigma，产品目录编号B6429)添加到每孔中，并在室温温育30分钟。
2.对经抗原包被的板添加培养物上清液
A.封闭程序后，用200μL PBST清洗缓冲液清洗三次。
B.将50μL所有稀释的测试样品转移到经抗原包被/封闭的板中的相应孔。
C.将板在室温温育1小时。
D.温育后，用200μL PBST清洗缓冲液清洗三次。
3.将二抗添加到经抗原包被的板
A.将25μL二抗移液到4975μL封闭缓冲液中并轻轻混合。(用于IgG抗体检测的山羊抗人IgG-AP)
B.添加50μL二抗溶液并在室温温育45分钟。
C.温育后，用200μL清洗缓冲液清洗四次。
D.添加100μL底物溶液(Sigma，产品目录编号P7998)并在37℃温育20分钟。
E.通过添加50μL终止溶液(Sigma，产品目录编号A5852)停止反应，充分混合，然后在ELISA板读数器上读取405nm处的吸光度。
4.数据分析
A.给出高于截留值的读数的孔定义为潜在的Globo系列抗原结合克隆。
B.截留值＝X+0.1。(X是阴性对照的平均OD值)。
C.对照与测试样品相同处理。差异在于阳性对照具有一抗已知的阳性抗体(抗-Globo H、抗-SSEA-3、抗-SSEA-4抗体或不添加IgG，因为一抗是阴性对照)。
D.使用GraphPad Prism 5Software通过Mann-Whitney检验对数据进行统计分析。
5.结果
图1表明20-2D、31-2C和4-22O对Globo H具有更好的结合亲和力。图2表明20-2D、31-2C和F-8C对SSEA-3具有更好的结合亲和力。类似地，图3表明20-2D、31-2C和F-8C对SSEA-4具有更好的结合亲和力。此外，Globo系列抗体(Globo H、SSEA-3和SSEA-4)缀合的脂质的总体结合亲和力高于缀合的神经酰胺。下表显示了与Globo系列抗原(Globo H、SSEA-3和SSEA-4)结合的人抗体克隆的Kd值。
表29.人抗体对Globo H-神经酰胺和Globo H-脂质的示例性kD值
人抗体 Globo H-神经酰胺 Globo H-脂质
20-2D 1.7E-08M 2.7E-09M
31-2C 1.7E-08M 1.3E-09M
4-22O 7.0E-08M 3.6E-08M
15-6J 6.6E-08M 3.3E-09M
23-12O 8.1E-08M 2.7E-08M
36-19H 9.9E-08M 1E-09M
15-20G 1.6E-07M 1.8E-08M
F-8C 6.1E-07M 2.0E-09M
21-6M 3.8E-07M 5.8E-09M
24-5D 4.6E-07M 1.3E-08M
表30.人抗体对SSEA-3-神经酰胺和SSEA-3-脂质的示例性kD值
Figure GDA0002003262010000671
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表31.人抗体对SSEA-4-神经酰胺和SSEA-4-脂质的示例性kD值
人抗体 SSEA-4-神经酰胺 SSEA-4-脂质
20-2D 5.2E-08M 3.6E-09M
31-2C 2.2E-08M 4.0E-09M
4-22O 4.4E-08M 3.1E-09M
15-6J 7.0E-08M 4.3E-09M
23-12O 1.2E-07M 1.1E-08M
36-19H >1.2E-07M 1.6E-08M
15-20G >1.2E-07M 1.6E-07M
F-8C 8.8E-08M 2.9E-09M
21-6M >1.2E-07M >5.7E-07M
24-5D >1.2E-07M 5.7E-07M
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语以及任何首字母缩略词具有与本发明领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的组合物、方法、试剂盒和手段相似或等同的用于传递信息的任何组合物、方法、试剂盒和手段可以用于实施本发明，但是本文描述了用于传递信息的优选组合物、方法、试剂盒和手段。
本文引用的所有参考文献在法律允许的完整范围内通过引用并入本文。对这些参考文献的讨论仅仅是为了总结其作者所作的断言。不承认任何参考(或任何参考文献的一部分)是相关的现有技术。申请人保留质疑任何引用参考文献的准确性和针对性的权利。
序列列表
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Claims (25)

1.能够靶向选自Globo-H，SSEA-3或SSEA-4的Globo系列抗原的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含3个重链CDR和3个轻链CDR的组，所述组具有选自下述的氨基酸序列：
分别为SEQ ID NO:109,110,和111的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO:112,113,和114的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
分别为SEQ ID NO:115,116,和117的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO:118,119,和120的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
分别为SEQ ID NO:121,122,和123的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO:124,125,和126的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
分别为SEQ ID NO:127,128,和129的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO:130,131,和132的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
分别为SEQ ID NO:133,134,和135的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO:136,137,和138的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
分别为SEQ ID NO:151,152,和153的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO:154,155,和156的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
分别为SEQ ID NO:211,212,和213的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO:214,215,和216的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
分别为SEQ ID NO:223,224,和225的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO:226,227,和228的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
分别为SEQ ID NO:229,230,和231的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO:232,233,和234的3个轻链CDR；或
分别为SEQ ID NO:235,236,和237的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO:238,239,和240的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3。
2.权利要求1的能够靶向选自Globo-H，SSEA-3或SSEA-4的Globo系列抗原的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变域和轻链可变域，其与选自下述的氨基酸序列具有大于90％的同一性：
SEQ ID NO：35和36，SEQ ID NO：47和48，SEQ ID NO：55和56，SEQ ID NO：63和64，SEQID NO：67和68，SEQ ID NO：71和72，SEQ ID NO：NO：75和76，SEQ ID NO：95和96，SEQ ID NO：99和100，或SEQ ID NO：107和108。
3.权利要求1-2中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中SSEA-4具有结构(Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1),SSEA-3具有结构(2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1)，或Globo H具有结构(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc)。
4.权利要求1-2中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是人IgG或IgM抗体。
5.权利要求1-2中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分选自：(a)整个免疫球蛋白分子；(b)scFv；(c)Fab片段；(d)F(ab')2；或(e)二硫化物连接的Fv。
6.药物组合物，其包含：
权利要求1-2中任一项的抗体或其抗原结合片段；和至少一种药学可接受载体。
7.权利要求6的药物组合物，其用于抑制癌细胞增殖，其中所述药物组合物以治疗有效量施用于患者。
8.包含权利要求1-2中任一项的抗体或其抗原结合片段的组合物，其用于患者中的癌症治疗，其中所述抗体或其抗原结合片段以治疗有效量施用于患者。
9.权利要求8的组合物，其中所述癌症选自下组：肉瘤(sarcoma)、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头和颈癌(head-and-neckcancer)、鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌(bileductcancer)、胆囊癌(gallbladder cancer)、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌(buccal cancer)、口咽癌(oropharyngeal cancer)、喉癌(laryngealcancer)和前列腺癌。
10.包含权利要求1-2中任一项的抗体或其抗原结合片段的组合物，用于测定有需要的患者中癌症的存在，所述测定包括以下程序：
a.对从所述患者获得的细胞或样品应用检测标志物组表达的一种或多种抗体；
b.测定所述一种或多种抗体对所述细胞或所述样品的结合；并且
c.与正常对照比较所述结合以测定所述患者中的所述癌症的存在，
其中所述标志物由Globo-H、SSEA-3或SSEA-4组成。
11.权利要求10的组合物，其中所述癌症选自下组：肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头和颈癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌和前列腺癌。
12.权利要求10的组合物，其中所述细胞是癌干细胞，和其中所述样品由下述组成：血清、血液、血浆、细胞、细胞培养基、唾液、尿液、淋巴结液(lymph node fluid)、肿瘤活组织检查或组织培养物。
13.包含与成像剂缀合的权利要求1-2中任一项的抗体或其抗原结合片段的组合物，其用于对患者成像，所述成像包括：
检测所述患者中的所述成像剂，所述患者已接受与成像剂缀合的抗体或其抗原结合片段，其中所述成像剂是荧光团、染料、MRI造影剂或放射性核素，和其中用途进一步定义为检测癌症转移的方法。
14.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含与结合Globo系列抗原的抗体或抗原结合片段缀合的药物，所述Globo系列抗原选自Globo-H，SSEA-3或SSEA-4，所述抗体或抗原结合片段包含三个重链CDR和三个轻链CDR的组，所述组具有选自下述的氨基酸序列：
分别为SEQ ID NO：109、110和111的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO：112、113和114的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
分别为SEQ ID NO：115、116和117的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO：118、119和120的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
分别为SEQ ID NO：121、122和123的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO：124、125和126的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
分别为SEQ ID NO：127、128和129的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO：130、131和132的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
分别为SEQ ID NO：133、134和135的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO：136、137和138的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
分别为SEQ ID NO：151、152和153的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO：154、155和156的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
分别为SEQ ID NO：211、212和213的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO：214、215和216的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
分别为SEQ ID NO：223、224和225的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO：226、227和228的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
分别为SEQ ID NO：229、230和231的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO：232、233和234的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；或
分别为SEQ ID NO：235、236和237的3个重链CDR1，CDR2，CDR3，与SEQ ID NO：238、239和240的3个轻链CDR1，CDR2，CDR3；
其中药物通过接头与抗体或抗原结合片段共价缀合，
其中所述Globo系列抗原包括Globo-H、SSEA-3或SSEA-4，和其中所述接头包含对硝基苯基接头、4-(4-N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基酰肼(4-(4-N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxyl hydrazide)(MMCCH)接头、马来酰亚胺己酰基(maleimidocaproyl)(MC)接头或马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸酯(maleimidomethylcyclohexane-1-carboxylate)(MCC)接头。
15.权利要求14的抗体-药物缀合物(ADC)，其中重链可变域和轻链可变域与选自下述的氨基酸序列具有大于90％的同一性：
SEQ ID NO:35和36、SEQ ID NO:47和48，SEQ ID NO：55和56，SEQ ID NO：63和64，SEQID NO：67和68，SEQ ID NO：71和72，SEQ ID NO：75和76，SEQ ID NO：95和96，SEQ ID NO：99和100，或SEQ ID NO：107和108；
其中药物通过接头与抗体或抗原结合片段共价缀合，其中Globo系列抗原包括Globo-H、SSEA-3或SSEA-4，并且其中接头包括对硝基苯基接头、4-(4-N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基酰肼(MMCCH)接头、马来酰亚胺己酰基(MC)接头或马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸酯(MCC)接头。
16.根据权利要求14或15所述的ADC，其中所述药物是化学化合物。
17.根据权利要求14或15所述的ADC，其中所述药物是抗增殖剂。
18.根据权利要求14或15所述的ADC，其中所述药物是生物剂。
19.权利要求17的ADC，其中所述药物是抗肿瘤剂。
20.权利要求17的ADC，其中所述药物是他莫昔芬。
21.权利要求17的ADC，其中所述抗增殖剂选自：环磷酰胺、阿片剂、粒细胞集落刺激因子、雌激素抑制剂、芳香酶抑制剂、垂体下调物、Novaldex、Evista、Faslodex、抗凝血药、酶、造血生长因子、混杂的细胞毒剂、长春花生物碱、表鬼臼毒素、烷化剂、紫杉烷类、抗肿瘤抗生素、喜树碱、HER1/EGFR酪氨酸激酶抑制剂、VEGF蛋白抑制剂、HER-2/ErbB2抑制剂、干扰素、白介素、单克隆抗体或糖皮质激素、厄洛替尼、多西他赛、吉西他滨、顺铂、卡铂、紫杉醇、替莫唑胺、多柔比星、奥沙利铂、硼替佐米、舒尼替尼、来曲唑、甲磺酸伊马替尼、MEK抑制剂、氟维司群、亚叶酸钙、雷帕霉素、拉帕替尼、洛那法尼、索拉非尼、吉非替尼、伊立替康、tipifarnib、ABRAXANE、凡德他尼、苯丁酸氮芥、西罗莫司、帕唑帕尼、canfosfamide、塞替派、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、长春瑞滨、米托蒽醌、替尼泊苷、依达曲沙、道诺霉素、氨基蝶呤、卡培他滨、伊班膦酸盐、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000、-二氟甲基鸟氨酸、雷洛昔芬、屈洛昔芬，4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、奥那司酮、FARESTON、4(5)-咪唑、氨鲁米特、MEGASE、AROMASIN、福美坦、法倔唑、RIVISOR、ARIMIDEX、氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲沙他滨、脂质激酶抑制剂、奥利默森、ANGIOZYME、ALLOVECTIN、LEUVECTIN、VAXID、PROLEUKIN、LURTOTECAN、ABARELIX、或奥佐米星。
22.权利要求21的ADC，其中所述单克隆抗体选自曲妥珠单抗、贝伐珠单抗、阿仑珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、帕妥珠单抗、托西莫单抗、吉妥珠单抗。
23.权利要求17的ADC，其中所述抗增殖剂选自法乐通、Aromasin、Femara、Zoladex、Lupron、他莫昔芬选择性雌激素受体调节物、Rolaxifene、雌激素受体下调物、Refludan、Elitek、抗代谢物、vinca alkaloid、Epipodophyllotoxin、Taxanes、Camptothecin、亚硝基脲类、Tarceva、Tyverb/Tykerb、Glucocorticoid steroid、erlotinib、TARCEVA、docetaxel、TAXOTERE、gemcitabine、GEMZAR、paclitaxel、TAXOL、HERCEPTIN、temozolomide、TEMODAL、NOLVADEX、ISTUBAL、VALODEX、doxorubicin、ADRIAMYCIN、oxaliplatin、ELOXATIN、bortezomib、VELCADE、sutent、SUNITINIB、letrozole、imatinibmesylate、GLEEVEC、Exelixis、fulvestrant、FASLODEX、leucovorin、亚叶酸、rapamycin、RAPAMUNE、lapatinib、TYKERB、lonafarnib、SARASAR、sorafenib、NEXAVAR、gefitinib、IRESSA、irinotecan、CAMPTOSAR、tipifarnib、ZARNESTRA、无克列莫佛、Cremophor-free、vandetanib、ZACTIMA、chloranmbucil、temsirolimus、TORISEL、pazopanib、TELCYTA、cyclosphosphamide、CYTOXAN、NEOSAR、5-氟尿嘧啶、vinorelbine、NAVELBINE、novantrone、teniposide、edatrexate、daunomycin、capecitabine、XELODA、ibandronate、DMFO、raloxifene、droloxifene，trioxifene、onapristone、枸橼酸托瑞米芬、toremifinecitrate、aminoglutethimide、醋酸甲地孕酮、依西美坦、exemestane、formestanie、fadrozole、伏氯唑、vorozole、来曲唑、letrozole、阿那曲唑、anastrozole、flutamide、nilutamide、bicalutamide、leuprolide、goserelin、troxacitabine、a-1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物、Oblimersen、GENASENSE、AVASTIN、Campath、ERBITUX、panitumumab、VECTIBIX、rituximab、RITUXAN、pertuzumab、OMNITARG、trastuzumab、HERCEPTIN、tositumomab、Bexxar、Corixia、gemtuzumab、ozogamicin或MYLOTARG。
24.包含权利要求14或15的抗体-药物缀合物(ADC)的组合物，其用于患者的癌症治疗，其中所述ADC以治疗有效量施用于患者。
25.权利要求24的组合物，其中所述癌症选自下组：肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头和颈癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌和前列腺癌。
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