CN110004167A

CN110004167A - 靶向vegfr-2和/或vegfr-3嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN110004167A
Application number: CN201910302677.3A
Authority: CN
Inventors: 王建祥; 王敏; 邢海燕; 饶青; 徐颖茜; 唐克晶; 田征
Original assignee: Hematology Hospital Of Chinese Academy Of Medical Sciences Institute Of Hematology
Current assignee: Hematology Hospital Of Chinese Academy Of Medical Sciences Institute Of Hematology
Priority date: 2019-04-16
Filing date: 2019-04-16
Publication date: 2019-07-12

Abstract

本发明公开了一种靶向VEGFR‑2和/或VEGFR‑3嵌合抗原受体及其应用。所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其编码的所述胞外区包含结合VEGFR‑2和/或VEGFR‑3的结合结构域，所述结合VEGFR‑2和/或VEGFR‑3的结合结构域为VEGFR‑2和/或VEGFR‑3的配体或与所述VEGFR‑2和/或VEGFR‑3的配体具有90‑99％同一性的氨基酸序列。实验证明该嵌合抗原受体修饰的T细胞对表达VEGFR‑2/3的肿瘤细胞以及脐静脉内皮细胞有很强的杀伤作用，同时能够破坏HUVEC的成管功能，可用于VEGFR‑2/3阳性的乳腺癌等肿瘤的治疗。

Description

靶向VEGFR-2和/或VEGFR-3嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及靶向VEGFR-2和/或VEGFR-3嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

血管/淋巴管新生与肿瘤细胞生长、存活、组织浸润及转移密切相关，血液系统疾病也存在病理性的血管新生，因此抗血管生成进而抑制肿瘤生长和转移已经成为治疗肿瘤的一个有效途径。

血管内皮生长因子是最主要的促血管新生因子之一，肿瘤细胞可分泌VEGF，与其自身或基质的血管内皮生长因子受体结合，通过自分泌和旁分泌途径促进肿瘤细胞生长、增殖和迁移，导致肿瘤发展、浸润和转移。多种实体瘤如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌，胰腺癌，黑色素瘤以及初诊急性白血病骨髓细胞中都高表达VEGF，复发病人的骨髓细胞表达更高。VEGF家族有五个主要成员：VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D和胎盘生长因子(placentagrowth factor,PlGF)。VEGF受体家族包含有三种亚型，即：VEGFR-1(F1t-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)。其中VEGFR-1主要分布在血管内皮细胞、造血干细胞、巨噬细胞和单核细胞，可与VEGF-A、VEGF-B和PlGF结合，与造血干细胞的生长调节有关。VEGFR-2是一种Ⅲ型的跨膜蛋白激酶，主要表达于血管内皮细胞，可以与VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E结合。VEGF与VEGFR-2的胞外区特异性结合后，引起受体的二聚化和自身磷酸化，随后激活下游的效应蛋白，调控内皮细胞的增殖、迁移、存活和通透性的改变，促进血管的新生。VEGFR-2^-/-小鼠由于血岛、血管内皮细胞和造血细胞的生长障碍，在胚胎期的8.5～9.5天死亡。与VEGFR-2相比，VEGFR-1与VEGF的亲和力高10倍，但调节内皮细胞的活性低很多，可能是对VEGFR-2活性具有负向调节作用。VEGFR-3主要表达在成熟机体淋巴管内皮细胞以及伤口和肿瘤组织毛细血管中，可以和所有阶段的VEGF-C蛋白结合调控淋巴内皮细胞的生长，与淋巴管的形成和通过淋巴管的转移密切相关。

研究发现VEGF与其受体VEGFR也在一些血液肿瘤细胞中表达和结合，还可促进骨髓血管内皮细胞增殖及骨髓血管伸展。在临床标本检测中发现多种急、慢性血液肿瘤细胞高表达VEGFR-2和VEGFR-3，同时又分泌VEGF-C，这些蛋白的表达与临床分期、疗效和预后有关。有研究证实内皮细胞来源的VEGF-C以一种旁分泌形式通过VEGFR-3途径，介导白血病细胞增殖、存活和耐药。

近年来阻断或干扰VEGF/VEGFR信号通路抑制血管新生，从而控制肿瘤的生长和转移已经成为肿瘤治疗中非常必要的手段。具有抑制血管新生作用的沙利度胺，已在难治性多发性骨髓瘤及骨髓增生异常综合征治疗方面获得了良好的效果。

与传统的细胞毒性药物相比，以VEGF/VEGFR为靶标的抗肿瘤药物有很大的优势。正常情况下血管新生仅发生在胚胎发育期、创伤愈合期和女性的生理周期，病理条件下则会出现异常的血管新生，尤其在肿瘤的生长侵袭过程中需要新生血管来供应营养物质和排泄代谢物。所以使用抗血管生成药物治疗肿瘤，对人体毒性作用小，血管内皮细胞与血液直接接触，通过静脉给药，药物更容易到达作用靶点。目前，抗血管生成的抑制剂研究方向主要有以下几点：1).利用单克隆抗体抑制VEGF或VEGFR，使其不能特异性结合，阻断信号传导。2).设计特定的小分子抑制剂，竞争性拮抗VEGF/VEGFR的结合。3).抑制VEGFR的胞内激酶域，主要竞争性拮抗三磷酸腺苷的结合。4).抑制胞内的VEGFR下游信号通路的关键性蛋白。

贝伐单抗(Bevacizumab，Avastin)是VEGF-A的人源化的鼠单克隆抗体，是2004年被美国食品药品监督管理局(FDA)审批的第一个抑制血管新生的抗体类药物，与5-氟尿嘧啶、伊立替康等化学药物联合治疗转移性结肠癌。此外，一些以VEGFR胞内酪氨酸激酶域为靶点的小分子抑制剂，如索拉非尼和舒尼替尼等，都已被美国FDA批准用于肿瘤的临床治疗。这些抗血管生成的药物可以延长患者的无进展生存期，提高治疗的有效率，但一般只用作晚期或转移性肿瘤的联合治疗，对总生存期影响不大。

随着细胞免疫治疗研究进展，国内外针对急性淋巴细胞白血病(ALL)以CD19作为靶抗原的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞免疫治疗取得了令人振奋的成效。已有报道在不同国家，不同诊疗中心，使用不同结构CAR修饰的T细胞(CAR-T)、淋巴细胞清除方案、自体或异体T细胞以及不同的CAR-T回输数量治疗难治复发的B-ALL患者，有50％～90％的患者可达到完全缓解。

CAR-T在血液肿瘤治疗中的成功，也为实体肿瘤治疗带来新的希望。目前CAR-T在实体瘤治疗中的基础研究及临床试验也多有报道，如针对EGFR、HER-2、EpCAM、MUC-1及MART-1的CAR-T细胞分别用于治疗前列腺癌、上皮癌、胰腺癌、非小细胞肺癌等实体肿瘤，是目前最有前景的肿瘤治疗方式之一。

CAR是一种人工合成的跨膜蛋白，主要由胞外区、跨膜区和胞内信号转导区构成。胞外区包括信号肽、抗原识别区以及铰链区。常用于CAR结构的信号肽有CD8α和GM-CSF信号肽，可引导抗原识别区及铰链区转移到胞外。抗原识别区具有特异性识别并结合肿瘤细胞表面抗原的功能，通常由抗体的轻链和重链通过柔性连接肽连接而成的单链抗体(singlechain variable fragment,scFv)构成，也可使用抗原的配体或受体识别靶细胞。胞内信号转导区主要来源于T细胞受体的CD3ζ链，目前将仅包含CD3ζ的CAR称为一代CAR，将包含一个共刺激因子CD28或4-1BB等的胞内区与CD3ζ串联组成的CAR称为二代CAR，将包含两个共刺激因子的胞内区与CD3ζ串联组成的CAR称为三代CAR。由临床前及临床试验证实，二代CAR和三代CAR比一代CAR具有更强的杀伤肿瘤细胞的能力，但三代CAR和二代CAR相比并没有展现出明显的优势。

常用的CAR-T制备方法是从患者或供者外周血中分离出单个核细胞(PeripheralBlood Mononuclear Cell,PBMCs)或CD3⁺ T细胞，使用包被抗CD3/CD28的磁珠或抗CD3抗体或滋养细胞以及细胞因子IL2，诱导T细胞快速增殖；再使用慢病毒或睡美人转座子系统(sleeping beauty transposon system)把CAR转入细胞中稳定表达，待CAR-T细胞扩增至足量后回输到患者体内。遇到肿瘤细胞的CAR-T细胞会分泌包括穿孔素、颗粒酶、IFN-γ、TNF-α等细胞因子发挥杀伤肿瘤细胞的作用。

目前CAR-T治疗的毒性作用除了会引发细胞因子释放综合症(cytokine releasesyndrome,CRS)外(可使用IL-6单抗——托珠单抗进行治疗)，还可能存在脱靶效应(offtarget/off tumor toxicity)，既对表达有CAR靶向的肿瘤抗原的正常细胞存在杀伤作用。Rosenberg研究组报道了1例晚期直肠癌患者在回输抗HER2/neu CAR-T细胞后发生了严重的脱靶效应，最终患者并发急性肺损伤而死亡。因此，防范CAR-T的脱靶效应是至关重要的。因血管新生除了在肿瘤生长和发展期活跃之外仅发生在创伤愈合期和女性的生理周期，针对VEGFR的CAR-T相比非特异性肿瘤抗原来说更具有优势。常规抗血管生成药物可能引起瘤内缺氧而导致肿瘤进展，细胞免疫激活则可使肿瘤血管正常化和重塑，减轻缺氧等对血管的刺激，并可增加免疫效应细胞向肿瘤部位的浸润，从而产生更强效的抗肿瘤作用。魏于全等设计了针对VEGFR-1的scFv CAR，具有杀伤乳腺癌、肺癌、宫颈癌细胞的作用，并且可抑制肺癌细胞系A549在NOD/SCID小鼠皮下成瘤的生长以及肺转移。但由于scFv的片段较大，使其与靶点结合的空间位阻增大，并且可操作性差，使得CAR的制备周期和难度相应加大。

因此，急需寻找一种治疗效果更好，更容易制备的嵌合抗原受体。

发明内容

本发明的一个方面，是针对现有实体瘤治疗中容易产生耐药、复发和转移的问题，提供了一种细胞免疫治疗中靶向VEGFR-2和/或VEGFR-3嵌合抗原受体。

本发明提供的技术方案为：

编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其编码的所述胞外区包含结合VEGFR-2和/或VEGFR-3的结合结构域，所述结合VEGFR-2和/或VEGFR-3的结合结构域为VEGFR-2和/或VEGFR-3的配体或与所述VEGFR-2和/或VEGFR-3的配体具有90-99％同一性的氨基酸序列。

考虑到血管/淋巴管新生在肿瘤发生发展中的重要作用，我们选择能与VEGFR-2和VEGFR-3共结合的VEGF-C作为配体，设计了VEGF-C CAR，并且采用抗原结合区作为CAR-T的胞外识别区，相比抗体scFv以及完整配体来说片段更小，可操作性更好，极大地缩短了CAR的制备周期，而且可以同时针对VEGFR-2和VEGFR-3两种受体，抑制血管/淋巴管新生，通过阻断肿瘤生长所需的血液和营养物质供给以及直接攻击肿瘤细胞这两种机制，扩大了CAR的应用空间，可以与传统的药物联合更为有效地治疗肿瘤。

作为优选，在本发明中，使用可与VEGFR-2和VEGFR-3结合的VEGF-C结构域作为抗原识别区，CD3ζ串联CD28胞内区作为胞内信号激活区，制备识别VEGFR-2和VEGFR-3的二代CAR-T(VEGFR-2/3CAR-T)，在遇到VEGFR-2/3阳性的肿瘤细胞时既可以产生CAR-T细胞引发的杀伤作用，又可以抑制肿瘤及其新血管的生成，从而发挥杀瘤和抑瘤效应。在本发明中，可以对所述VEGFR-2和/或VEGFR-3的配体，优选为VEGF-C的氨基酸序列以合适的方式进行随机或者工程化的点突变，其目的可以为，例如，获得更好的亲和力和/或解离性质，而这些突变后的氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，本发明核酸分子编码的所述胞外区包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。该氨基酸序列为VEGF-C fragment，命名为VEGF-Cf的氨基酸序列。本发明人经过创造性劳动发现，VEGF-Cf是VEGFR-2和VEGFR-3的结合结构域，可以特异性杀伤VEGFR-2和VEGFR-3阳性细胞，对VEGFR-2和VEGFR-3阴性的细胞没有杀伤作用。

在本发明中，所述核酸分子可编码信号肽。信号肽可引导抗原识别区及铰链区转移到胞外。任意合适的信号肽或信号肽的组合均可实现本发明的目的。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，本发明核酸分子编码的所述胞外区还包含构建在所述的嵌合抗原受体氨基末端的信号肽或与所述信号肽具有90-99％同一性的氨基酸序列，所述信号肽为CD8α中的信号肽序列或GM-CSF。

更优选地，所述信号肽为如SEQ ID NO.4所示的信号肽。

在本发明的一个实施方式中，本发明核酸分子编码的所述结合VEGFR-2和/或VEGFR-3的结合结构域通过铰链区与跨膜区连接。任意合适的铰链区序列均可实现本发明的目的。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述铰链区来自CD8α。

在本发明中，所述核酸分子还编码跨膜结构域。任意合适的跨膜结构域均能实现本发明的目的。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。

在本发明中，所述核酸分子编码的所述胞内信号转导区还包含共刺激因子。

作为优选，所述共刺激因子为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD226、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD229、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76。

更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述共刺激因子为CD28或4-1BB或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。

同时，本发明核酸分子还编码任意合适的胞内信号结构域。可以为CD3ζ胞内信号结构或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。

作为优选，本发明核酸分子所编码的嵌合抗原受体是以VEGFR-2/3配体VEGF-C为抗原识别区、CD8α为铰链区以及CD28为跨膜区胞内区和CD3ζ为胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其序列如SEQ ID NO.2所示或与其具有90-99％同一性。

另外，在上述抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区之间合适的位置可插入任意肽链作为间隔区，所述肽链可以为寡肽或多肽。

对于上述核酸分子的制备方法，可基于上述抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区等结构域的碱基序列，通过化学合成或PCR扩增等已知技术制备。通常，可以对编码上述结构域的氨基酸的密码子进行优化，以优化其在宿主细胞中的表达。上述碱基序列的信息可通过检索已知文献或NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库来获得。

在本发明的一个实施方式中，采用PCR扩增的方法获得VEGFR-2/3配体VEGF-C抗原识别区的碱基序列。具体为，提取急性髓系白血病(AML)患者骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)的总RNA，逆转录合成cDNA。PCR扩增引物为：

P1：5’CGGGATCCACAGAAGAGACTATAAAATTTGC3’

P2：5’CCGGAATTCCAGTTTAGACATGCATCGGCAGGAAGTGT3’

本发明的另一个方面，是提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由上述核酸分子编码。

上述嵌合抗原受体的胞外区包含结合VEGFR-2和/或VEGFR-3的结合结构域，所述结合VEGFR-2和/或VEGFR-3的结合结构域为VEGFR-2和/或VEGFR-3的配体或与所述VEGFR-2和/或VEGFR-3的配体具有90-99％同一性的氨基酸序列。

优选地，所述所述VEGFR-2和/或VEGFR-3的配体为VEGF-C。

作为优选，所述结合VEGFR-2和/或VEGFR-3的结合结构域为SEQ ID No.3所示的VEGF-Cf或与所述VEGF-Cf具有90-99％同一性的氨基酸序列。

作为优选，本发明嵌合抗原受体是以VEGFR-2/3配体VEGF-C抗原识别区、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、以及CD3ζ胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，VEGF-C的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。

本发明的另一个方面，是提供了一种载体，所述载体包含上述核酸分子。

在本发明中，上述载体可以为直链载体，也可以为环状载体。可以为质粒等非病毒载体，也可以为病毒载体，还可以为利用转座子的载体。所述载体中可含有启动子、终止子等调控序列，以及耐药基因、报告基因等标记序列。另外，上述载体也可包含编码自杀基因的序列，可根据治疗过程，通过给予激活自杀基因的物质，从而控制体内CAR-T细胞的数目。

作为上述病毒载体，可以为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。在本发明的一个实施方式中，使用的是慢病毒表达载体。包装载体包括但不限于psPAX2和pMD2.G。

本发明的另一个方面，是提供了一种细胞，所述细胞包含上述核酸分子、上述嵌合抗原受体或上述载体。

在本发明的一个实施方式中，上述细胞为人的T细胞。所述T细胞可以来自血液、骨髓等体液，也可以来自脾脏、胸腺、淋巴等组织，或者原发肿瘤、转移性肿瘤、癌性腹水等癌症组织，经分离、纯化后得到。同时，所述T细胞可以为CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、αβT细胞、γδT细胞、NK细胞等。

本发明的另一个方面，是提供了一种上述核酸分子在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的另一个方面，是提供了一种上述嵌合抗原受体在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的另一个方面，是提供了一种上述载体在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的另一个方面，是提供了一种上述细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

作为优选，上述应用为在制备抗血管生成的抗肿瘤药物中的应用。

只要其在病理过程中表达VEGFR-2/3，上述肿瘤包括但不限于乳腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌等。除肿瘤外其它一些涉及异常血管新生的一些疾病中，如视网膜病变、风湿性关节炎、子宫内膜异位症等，能同样产生疗效。但作为优选，上述肿瘤为VEGFR-2或/和VEGFR-3高表达的肿瘤。

本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述核酸分子、上述嵌合抗原受体、上述载体或上述细胞。

本发明药物组合物除包含上述成分以外，还可包含任意药学上允许的添加剂，例如，生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。

同样，本发明药物组合物也可以和其他合适的抗癌剂联合应用。例如，5-氟尿嘧啶类化学药物、卡铂、紫杉醇、多西他赛等。

本发明的另一个方面，是提供了一种上述核酸分子在治疗肿瘤中的应用。

本发明的另一个方面，是提供了一种上述嵌合抗原受体在治疗肿瘤中的应用。

本发明的另一个方面，是提供了一种上述载体在治疗肿瘤中的应用。

本发明的另一个方面，是提供了一种上述细胞在治疗肿瘤中的应用。

本发明的另一个方面，是提供了一种上述药物组合物在治疗肿瘤中的应用。

作为优选，上述肿瘤为VEGFR-2/3阳性的肿瘤。

本发明的有益效果为：

本发明从AML患者骨髓MSC细胞中提取RNA，逆转成cDNA，经PCR扩增及酶切、连接等技术将VEGF-Cf克隆到含有信号肽和CD8α-CD28-CD3ζ的慢病毒表达载体中，包装成携带VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζ编码基因的慢病毒载体。利用慢病毒感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。通过流式细胞术、CCK-8试剂盒检测、以及ELISA检测T细胞分泌的细胞因子，证明该嵌合抗原受体修饰的T细胞对表达VEGFR-2/3的肿瘤细胞以及HUVEC有很强的杀伤作用；通过HUVEC在matrigel中成管实验，证实该嵌合抗原受体修饰的T细胞能够破坏HUVEC的成管功能。本发明嵌合抗原受体VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζ可用于肿瘤，尤其是VEGFR-2/3高表达肿瘤的治疗。

附图说明

图1为本发明实施例中VEGFR-2/3配体VEGF-C结合结构域的PCR扩增电泳图，其中，1为2kb核酸分子量标准泳道，2为PCR扩增的VEGF-Cf片段(356bp，带酶切位点和保护碱基)泳道；

图2为本发明实施例中慢病毒表达载体pCDH-VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζ限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，1为2kb核酸分子量标准泳道；2为用核酸内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切慢病毒表达质粒pCDH-VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζ所得到的编码VEGF-Cf的DNA片段(345bp，带酶切位点)和带有CD8α-CD28-CD3ζ的载体片段(7991bp)泳道；

图3为本发明实施例中慢病毒表达载体示意图；

图4为用流式细胞术检测本发明实施例中构建的VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζ修饰T细胞中CAR分子的表达结果图，其中，图4A为转染空载体的T细胞和转染CAR的T细胞的GFP感染效率，图4B为GFP阳性细胞VEGF-Cf的表达；

图5A为四代HUVEC形态和CD31表达情况，图5B为利用流式细胞术检测本发明实施例中乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468、MCF-7和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中VEGF-Cf靶抗原分子的表达情况结果图；

图6为本发明实施例中VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζ修饰T细胞与MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468、HUVEC和MCF-7细胞按效靶比0:1、1:4、1:1、4:1、8:1共培养24小时后残留细胞存活率结果图，其中，CAR-T为VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζ修饰T细胞的实验组；VEC-T为转染空载体T细胞的对照组；

图7为本发明实施例中VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζ修饰T细胞与MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468、MCF-7和人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞系按效靶比1:1共培养24小时后，T细胞释放的细胞因子IFN-γ(左图)、TNF-α(右图)水平结果图，其中，CAR-T为VEGF-Cf-CD8α-CD28CD3ζ修饰T细胞的实验组；VEC-T为转染空载体T细胞的对照组；

图8为本发明实施例中VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζ修饰T细胞对HUVEC在matrigel中成管功能的影响。HUVEC接种14小时后按照效靶比1:3、1:1、3:1、6:1分别加入VEC-T或CAR-T细胞共培养6小时后，用Calcein-AM(钙黄绿素乙酰甲酯3',6'-Di(O-acetyl)-4',5'-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein，tetraacetoxymethyl ester)标记，荧光显微镜观察，其中图8A显示HUVEC细胞可以在matrigel基质胶中形成管状结构；图8B显示加入不同比例的VEC-T或CAR-T细胞后HUVEC成管受到的影响；

图9为本发明实施例中VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζ修饰T细胞在小鼠体内作用效果的评价结果图，选用5-6周的雌性裸鼠注射8×10⁵的稳定转染了荧光素酶的MDA-MB-231-luc细胞，9天以后小鼠注射部位出现肉眼可见的肿瘤，将小鼠随机分成两组，从第10天开始经尾静脉注射6×10⁶的VEC-T细胞或CAR-T细胞(如图9A所示)，以后每周注射一次，并监测小鼠肿瘤和体重变化，38天后给小鼠注射荧光素酶底物，小动物成像仪照相，然后处死小鼠，取其肿瘤称重，其中，CAR-T为VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζ修饰T细胞的实验组，VEC-T为转染空载体T细胞组，图9B显示肿瘤发出的荧光，图9C显示肿瘤的大小和重量，图9D显示肿瘤生长曲线，图9E显示小鼠体重的变化。

序列说明

SEQ ID NO.1为本发明嵌合抗原受体的氨基酸序列；

SEQ ID NO.2为本发明嵌合抗原受体的核酸序列；

SEQ ID NO.3为本发明嵌合抗原受体中抗原识别区的氨基酸序列；

SEQ ID NO.4为本发明嵌合抗原受体中信号肽的氨基酸序列；

SEQ ID NO.5为本发明嵌合抗原受体中CD8α-CD28-CD3ζ的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明公开了一种靶向VEGFR-2和/或VEGFR-3嵌合抗原受体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：嵌合抗原受体中抗原识别区VEGF-Cf的克隆

1.收集培养的AML患者的MSC，提取细胞的总RNA：在5×10⁶细胞中加入RNA isoPlus(Takara)1ml，吹打混匀。加入200μl三氯甲烷，上下颠倒、涡旋振荡混匀。4℃，12000rpm，离心5分钟。吸取上清至1.5ml EP管，加入同体积异丙醇，轻轻上下颠倒混匀。4℃，12000rpm，离心15分钟。4℃预冷75％乙醇沉淀RNA，50μl DEPC水溶解总RNA。

2.逆转录合成cDNA第一链：配制PCR反应体系(20μl)如下：Oligo d(T)15Primers:2μl；M-MLV(200u/μl)：1μl；dNTP(each 2.5mM)：1μl；DTT(0.1M)：2μl；First strand buffer(5×)：4μl；MSC-RNA:2μg；DEPC水:补足至20μl。反应条件：37℃，60分钟，70℃10分钟。

3.PCR扩增VEGF-Cf的基因片段：

P1：5’CGGGATCCACAGAAGAGACTATAAAATTTGC3’

P2：5’CCGGAATTCCAGTTTAGACATGCATCGGCAGGAAGTGT3’

配制PCR反应体系(20μl)如下：2×Taq PCR Master Mix(TianGen公司)：10μl；10μM P1+P2：1μl；10μM cDNA：1μl；ddH₂O：补足至20μl。反应条件：94℃预变性5分钟；重复如下循环33次：94℃30秒，56℃30秒，72℃40秒；最后，72℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳分离并回收VEGF-Cf片段。结果如图1所示。

实施例2：嵌合抗原受体载体的构建

1.采用BamH I、EcoR I核酸内切酶酶切前期构建的含有CD8α-CD28-CD3ζ片段的质粒(如“Construction of a new anti-CD19chimeric antigen receptor and the anti-leukemia function study of the transduced T cells”中记载)，获得CD8α-CD28-CD3ζ片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.将实施例1中得到的VEGF-Cf片段与目的载体进行连接，构建成pCDH-VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζCAR目的载体。用BamHⅠ和EcoRⅠ进行酶切鉴定。结果如图2所示，酶切结果表明阳性克隆含有目的条带且测序鉴定正确。载体示意图如图3所示。

实施例3：嵌合抗原受体VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζ慢病毒修饰T细胞的制备

1.采用EndoFree Plasmid Maxi质粒抽提试剂盒(QIAGEN公司)提取pCDH-VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζ表达质粒和包装质粒psPAX2、pMD2.G。三种质粒按4：3：1比例用Turbofect转染试剂(Thermo公司)进行转染(具体方法见Turbofect转染试剂说明书)。转染后48小时、72小时分别收取病毒上清，于4℃，3000rpm，离心10分钟，经0.45μm滤器过滤后，采用50000g，4℃，2小时超速离心后浓缩10倍，后转入-80℃保存。

2.T细胞的制备：取新鲜健康人外周血10ml，采用RosetteSep T cell enrichmentCocktail(Stemcell公司)和Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare公司)提取T细胞(具体步骤按照RosetteSep T cell enrichment Cocktail说明书)。按细胞：磁珠＝1：1比例加入抗CD3/CD28磁珠(Gibco公司)，培养24小时即为感染前的T细胞。

3.慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的培养：从-80℃中取出病毒上清，室温下融化，按每1×10⁶T细胞加入100μl病毒上清，加入polybrene至终浓度为8μg/ml。32℃，1800rpm，离心1.5小时，转入5％CO₂，37℃孵箱培养。

4.流式细胞术检测CAR修饰T细胞的阳性率：收集细胞，一部分使用FITC通道分析GFP的表达，结果如图4A所示。另一部分用兔抗人VEGF-C一抗(抗体结合区包含VEGF-Cf片段)(abcam公司)标记，再用PE标记的抗兔的二抗标记GFP阳性细胞VEGF-Cf的表达，以isotype为对照组(图4B)。

实验例1：嵌合抗原受体VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζ慢病毒修饰T细胞对乳腺癌细胞及HUVEC的杀伤作用

1.乳腺癌细胞系及HUVEC中VEGFR-2/3的表达水平：

乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468及MCF-7细胞系均购自美国ATCC。HUVEC来自足月健康胎儿脐带，胰酶消化脐静脉，收集细胞培养，将贴壁细胞传代至第四代，用APC标记的抗人CD31抗体(Biolegend公司)鉴定为CD31阳性，形态也符合内皮细胞特征(图5A)。将以上细胞分别培养后，各吸取5×10⁵细胞悬液，PBS洗2次后，标记PerCP/Cy5.5抗人VEGFR-2或APC抗人VEGFR-3单抗(Biolegend公司)，以标记的isotype为对照组，冰上孵育30分钟。运用流式细胞术检测各种细胞VEGFR-2和VEGFR-3的表达水平，结果如图5B所示。结果表明，本实验例中所使用的乳腺癌细胞系除MCF-7以外，均表达VEGFR-2或/和VEGFR-3。

2.CAR-T细胞与乳腺癌细胞或HUVEC共培养后，残留靶细胞的检测：

CAR修饰的T细胞与MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468、HUVEC及MCF-7细胞系共培养后洗去T细胞，用CCK8方法检测残留细胞吸光度值。将上述细胞按2×10⁴细胞/孔接种96孔培养板，100μl体系分别加入5×10³、2×10⁴、8×10⁴、1.6×10⁵的CAR修饰的T细胞，并将转染空载体的T细胞(VEC-T)设为对照组，于孵箱中共培养，24小时后洗去T细胞，换新的培养液，每孔加入10ul CCK8，1小时后检测450nm吸光度，参比波长为600nm，结果如图6所示。结果表明：1)将CAR-T细胞与MDA-MB-231细胞以不同效靶比共培养24小时后，残留细胞分别为空白对照组(不加T细胞)的73％、55.7％、46.4％、37.2％，VEC-T组则分别为87.8％、95.2％、99.7％和97％；2)将CAR-T细胞与MDA-MB-453细胞以不同效靶比共培养24小时后，残留细胞的存活率分别为空白对照组的94.6％、94.6％、84.9％和73％，而VEC-T组则为108.1％、114.7％、117.9％和117.3％；3)将CAR-T细胞与MDA-MB-468细胞以不同效靶比共培养24小时后，残留细胞的存活率分别为空白对照组的83.3％、86.2％、63.36％和34.48％，而VEC-T组则为93.85％、105.21％、107.42％和111.13％；4)将CAR-T细胞与HUVEC细胞以不同效靶比共培养24小时后，残留细胞的存活率分别为空白对照组的为88.2％、79.6％、67.0％和59.9％，而VEC-T组则为91.5％、102.6％、88.2％、91.9％；5)对于VEGFR低表达的MCF-7细胞，与CAR-T和VEC-T细胞共培养后，存活细胞没有明显差异。由上述结果可以看出，CAR-T对表达VEGFR2或/和3的乳腺癌细胞有杀伤作用，而对于VEGFR-2阴性、VEGFR-3低表达的MCF-7乳腺癌细胞未显示出杀伤作用，提示VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζCAR-T对肿瘤细胞的杀伤作用具有一定的特异性。

3.ELISA检测上述细胞系与CAR-T细胞共培养上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α的水平：

分别将MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468及MCF-7细胞系和人脐静脉内皮细胞HUVEC按照1×10⁵细胞/孔接种24孔板。按1:1分别加入CAR-T、VEC-T细胞，补充培养液至1ml，于孵箱中共培养24小时后，采用人IFN-γ、TNF-αELISA检测试剂盒(R&D公司)，对共培养上清进行检测(具体步骤见ELISA检测试剂盒说明书)。结果如图7所示，表达VEGFR-2/3的细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468以及HUVEC，与CAR-T共培养上清中IFN-γ细胞因子水平均较VEC-T组有显著升高，其中MDA-MB-231的升高最为显著(P<0.001)，但在不表达或低表达VEGFR-2/3的MCF-7细胞的共培养上清中的IFN-γ细胞因子水平与VEC-T组没有统计学差异(P>0.05)。另外，MDA-MB-231和HUVEC与CAR-T细胞共培养上清中TNF-α水平比VEC-T组显著升高(P<0.05)，其余组没有统计学差异(P>0.05)。以上结果表明，CAR-T在表达VEGFR-2/3的细胞刺激下，能够分泌更多的Th1类细胞因子。

4.CAR修饰的T细胞对HUVEC血管形成的影响

先用matrigel预铺96孔板，每孔50μl，然后接种HUVEC，每孔50μl体系含有8×10⁴细胞，14小时后按照效靶比(E:T)1:3、1:1、3:1、6:1加入VEC-T或CAR-T细胞共培养6小时后，用Calcein-AM标记，荧光显微镜观察。结果如图8所示，HUVEC在matrigel中能够形成管状结构，CAR-T组的管状结构随着加入CAR-T细胞而受到破坏，E:T为6:1时，管状结构已经完全不存在，而VEC-T组基本不受影响，表明嵌合抗原受体VEGF-Cf-CD8α-CD28-CD3ζ修饰的T细胞能够破坏新生血管。其中图8A显示HUVEC细胞在matrigel中形成管状结构；图8B显示加入不同比例上述T细胞对HUVEC形成管状结构的影响。

5.CAR修饰的T细胞对乳腺癌小鼠模型的作用：

选用5-6周的雌性裸鼠注射8×10⁵的MDA-MB-231细胞，9天后小鼠注射部位出现肉眼可见的肿瘤。将小鼠随机分成两组，从第10天开始经尾静脉注射6×10⁶的VEC-T细胞或CAR-T细胞，以后每周注射一次(见图9A)。至小鼠接种肿瘤细胞38天时，CAR-T组小鼠肿瘤明显缩小，与对照组相比有显著性差异(p<0.0001)，表明CAR-T对小鼠肿瘤有非常明显的治疗效果(图9B-D)。两组小鼠的体重变化无明显差异，提示CAR-T治疗对小鼠无明显的毒副作用(图9E)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）

<120> 靶向VEGFR-2和/或VEGFR-3嵌合抗原受体及其应用

<130> 2019

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 419

<212> PRT

<213> Human

<400> 1

Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala

1 5 10 15

Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe

20 25 30

Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala

35 40 45

Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser

50 55 60

Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met

65 70 75 80

Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln

85 90 95

Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala

100 105 110

His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys

115 120 125

Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe

130 135 140

Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr

145 150 155 160

Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr

165 170 175

Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu

180 185 190

Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser

195 200 205

Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile

210 215 220

Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn

225 230 235 240

Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys

245 250 255

Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser

260 265 270

Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu

275 280 285

Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys

290 295 300

Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys

305 310 315 320

Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu

325 330 335

Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro

340 345 350

Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys

355 360 365

Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr

370 375 380

Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser

385 390 395 400

Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro

405 410 415

Gln Met Ser

<210> 2

<211> 1260

<212> DNA

<213> Human

<400> 2

atgcacttgc tgggcttctt ctctgtggcg tgttctctgc tcgccgctgc gctgctcccg 60

ggtcctcgcg aggcgcccgc cgccgccgcc gccttcgagt ccggactcga cctctcggac 120

gcggagcccg acgcgggcga ggccacggct tatgcaagca aagatctgga ggagcagtta 180

cggtctgtgt ccagtgtaga tgaactcatg actgtactct acccagaata ttggaaaatg 240

tacaagtgtc agctaaggaa aggaggctgg caacataaca gagaacaggc caacctcaac 300

tcaaggacag aagagactat aaaatttgct gcagcacatt ataatacaga gatcttgaaa 360

agtattgata atgagtggag aaagactcaa tgcatgccac gggaggtgtg tatagatgtg 420

gggaaggagt ttggagtcgc gacaaacacc ttctttaaac ctccatgtgt gtccgtctac 480

agatgtgggg gttgctgcaa tagtgagggg ctgcagtgca tgaacaccag cacgagctac 540

ctcagcaaga cgttatttga aattacagtg cctctctctc aaggccccaa accagtaaca 600

atcagttttg ccaatcacac ttcctgccga tgcatgtcta aactggatgt ttacagacaa 660

gttcattcca ttattagacg ttccctgcca gcaacactac cacagtgtca ggcagcgaac 720

aagacctgcc ccaccaatta catgtggaat aatcacatct gcagatgcct ggctcaggaa 780

gattttatgt tttcctcgga tgctggagat gactcaacag atggattcca tgacatctgt 840

ggaccaaaca aggagctgga tgaagagacc tgtcagtgtg tctgcagagc ggggcttcgg 900

cctgccagct gtggacccca caaagaacta gacagaaact catgccagtg tgtctgtaaa 960

aacaaactct tccccagcca atgtggggcc aaccgagaat ttgatgaaaa cacatgccag 1020

tgtgtatgta aaagaacctg ccccagaaat caacccctaa atcctggaaa atgtgcctgt 1080

gaatgtacag aaagtccaca gaaatgcttg ttaaaaggaa agaagttcca ccaccaaaca 1140

tgcagctgtt acagacggcc atgtacgaac cgccagaagg cttgtgagcc aggattttca 1200

tatagtgaag aagtgtgtcg ttgtgtccct tcatattgga aaagaccaca aatgagctaa 1260

<210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> Human

<400> 3

Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala His Tyr Asn Thr Glu Ile

1 5 10 15

Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln Cys Met Pro Arg

20 25 30

Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val Ala Thr Asn Thr

35 40 45

Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr Arg Cys Gly Gly Cys Cys

50 55 60

Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr Leu Ser

65 70 75 80

Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu Ser Gln Gly Pro Lys Pro

85 90 95

Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg Cys Met Ser Lys

100 105 110

Leu

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> Human

<400> 4

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 5

<211> 225

<212> PRT

<213> Human

<400> 5

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val

35 40 45

Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr

50 55 60

Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu

65 70 75 80

His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg

85 90 95

Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

100 105 110

Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

115 120 125

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

130 135 140

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

145 150 155 160

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

165 170 175

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

180 185 190

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

195 200 205

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

210 215 220

Arg

225

Claims

1.编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其特征在于，其编码的所述胞外区包含结合VEGFR-2和/或VEGFR-3的结合结构域，所述结合VEGFR-2和/或VEGFR-3的结合结构域为VEGFR-2和/或VEGFR-3的配体或与所述VEGFR-2和/或VEGFR-3的配体具有90-99％同一性的氨基酸序列；

优选地，所述VEGFR-2和/或VEGFR-3的配体为VEGF-C。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述胞外区包含如SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述胞外区还包含构建在所述的嵌合抗原受体氨基末端的信号肽或与所述信号肽具有90-99％同一性的氨基酸序列，所述信号肽为CD8α中的信号肽序列，优选为如SEQ ID NO.4所示的信号肽。

4.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述结合VEGFR-2和/或VEGFR-3的结合结构域通过铰链区与其编码的所述跨膜区连接，所述铰链区优选为CD8α中的铰链区序列；所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。

5.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述胞内信号转导区还包含共刺激因子。

6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD226、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD229、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76。

7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为CD28或4-1BB或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。

8.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列如SEQ IDNO.2所示或与其具有90-99％同一性。

9.嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由权利要求1～8中任意一项所述的核酸分子编码。

10.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的胞外区包含结合VEGFR-2和/或VEGFR-3的结合结构域，所述结合VEGFR-2和/或VEGFR-3的结合结构域为VEGFR-2和/或VEGFR-3的配体或与所述VEGFR-2和/或VEGFR-3的配体具有90-99％同一性的氨基酸序列；

优选地，所述VEGFR-2和/或VEGFR-3的配体为VEGF-C。

11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述结合VEGFR-2和/或VEGFR-3的结合结构域为SEQ ID No.3所示的VEGF-Cf或与所述VEGF-Cf具有90-99％同一性的氨基酸序列；

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。

12.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求1～8中任意一项所述的核酸分子。

13.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含如权利要求1～8中任意一项所述的核酸分子、如权利要求9～11中任意一项所述的嵌合抗原受体或如权利要求12所述的载体。

14.如权利要求1～8中任意一项所述的核酸分子、如权利要求9～11中任意一项所述的嵌合抗原受体、如权利要求12所述的载体或如权利要求13所述的细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为VEGFR-2和/或VEGFR-3阳性的肿瘤；

优选地，所述肿瘤为乳腺癌、结肠癌、肝癌或肺癌；更优选地，所述肿瘤为乳腺癌。

16.如权利要求1～8中任意一项所述的核酸分子、如权利要求9～11中任意一项所述的嵌合抗原受体、如权利要求12所述的载体或如权利要求13所述的细胞在制备除肿瘤外的抗异常血管新生药物中的应用，优选为在制备治疗视网膜病变、风湿性关节炎或子宫内膜异位症药物中的应用。

17.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1～8中任意一项所述的核酸分子、如权利要求9～11中任意一项所述的嵌合抗原受体、如权利要求12所述的载体或如权利要求13所述的细胞。

18.如权利要求1～8中任意一项所述的核酸分子、如权利要求9～11中任意一项所述的嵌合抗原受体、如权利要求12所述的载体、如权利要求13所述的细胞或如权利要求16所述的药物组合物在治疗肿瘤中的应用，所述肿瘤优选为VEGFR-2或VEGFR-3阳性的肿瘤；更优选为乳腺癌、结肠癌、肝癌或肺癌。