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CN103080133A - 抗vegfr-3抗体组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗VEGFR-3单克隆抗体、含有所述抗体的药物组合物和所述抗体在治疗疾病中的用途。

Description

抗VEGFR-3抗体组合物
本发明涉及与血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)特异性结合的抗体，特别地本文中提供了抗VEGFR-3抗体的氨基酸序列和核酸序列、药物组合物和所述抗体在治疗VEGFR-3介导的医学疾病的方法中的用途。
认为内皮细胞特异性生长因子和受体主要负责刺激内皮细胞生长、分化以及某些细胞功能。一个广泛研究的生长因子家族包括血管内皮生长因子(VEGF)。
VEGFR-3是在正常成年组织中的表达主要限于淋巴内皮的唯一受体酪氨酸激酶(RTK)。新生儿VEGF-C和VEGF-D与VEGFR-3特异性结合。这些蛋白质的N端和C端区域的蛋白酶剪切释放了成熟的VEGF-CΔNΔC和VEGF-DΔNΔC，它们获得增加的VEGFR-3亲和力。这些配体激活VEGFR-3信号传导并且引发淋巴管生成(即新淋巴管从先前存在的淋巴管中形成)。
VEGFR-3配体的表达模式显示，它们不仅参与正常血管系统的发育和维持，还参与肿瘤血管生成和淋巴管生成。另外，已经在肿瘤内部的毛细血管上检测到VEGFR-3表达。因此，抑制VEGF-C和/或VEGF-D与VEGFR-3结合的单克隆抗体(mAb)具有抑制肿瘤血管生成的潜力。
此外，阻断VEGFR-3活性已经显示抑制VEGF-C增强的肿瘤淋巴管生成。在许多类型的癌症中，第一转移位点是淋巴结并且因此阻断VEGFR-3具有抑制肿瘤转移的潜力。
Persaud等人，J.Cell Science 117：2745-56(2004)描述人抗VEGFR-3单克隆抗体的某些特性，但是没有公开任何这类抗体的序列，也没有公开这类抗体可以结合的表位。因此仍需要结合VEGFR-3内部的新表位并且能够阻断配体结合和受体活化的高亲和力抗VEGFR-3抗体。还需要能够针对多种肿瘤类型显示抗肿瘤功效而没有明显不利副作用的抗VEGFR-3抗体。
本发明提供了与人VEGFR-3结合的抗体或其抗原结合部分，其中：
a)所述抗体与人VEGFR-3的结合因人VEGFR-3的Pro-219单突变成Leu减少至少90％；和
b)所述抗体与人VEGFR-3的结合因人VEGFR-3的Val-175单突变成Ala减少至少50％。
优选地，通过以下方式测定该抗体或其抗原结合片段和人或突变VEGFR-3之间的结合水平：将人或突变VEGFR-3的可溶性胞外结构域表达为具有碱性磷酸酶的融合蛋白并且随后使用碱性磷酸酶化学发光测定法确定能够与抗体结合的每种融合蛋白的量。
本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合部分和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
此外，本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合部分和可药用载体、稀释剂或赋形剂并且任选地含有至少一种其他治疗成分。
本发明也提供本发明的抗体或其抗原结合部分作为药物使用。
本发明额外地提供本发明的抗体或其抗原结合部分用于治疗或预防卵巢癌、人红白血病、头颈癌、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和淋巴结转移。
本发明还提供了治疗哺乳动物中卵巢癌、人红白血病、头颈癌、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和淋巴结转移的方法，所述方法包括向需要这类治疗的哺乳动物施用有效量的本发明抗体或其抗原结合部分。
本发明额外地提供本发明抗体或其抗原结合部分用于制造药物的用途，其中所述药物用于治疗选自卵巢癌、人红白血病、头颈癌、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和淋巴结转移的癌症。
本发明也提供本发明的抗体或其抗原结合部分与选自顺铂、5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂和多西紫杉醇的其他抗癌药组合，用于在治疗中同时、分别或依次使用。
本发明额外地提供了治疗哺乳动物中选自卵巢癌、人红白血病、头颈癌、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和淋巴结转移的方法，所述方法包括向有需要的患者施用本发明抗体或其抗原结合部分和选自顺铂、5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂和多西紫杉醇的其他抗癌药的治疗有效组合。
本发明的抗体结合哺乳动物VEGFR-3的第二免疫球蛋白(Ig)样结构域。人VEGFR-3的第二Ig样结构域对应于全长受体的残基138至226。见Pajusola等人，Cancer Res.52：5738-5743(1992)。
术语“哺乳动物/人/小鼠VEGFR-3的第二Ig样结构域”(及其变种)意在包括天然存在形式的结构域(例如，从正常条件下表达该结构域的细胞纯化)以及重组形式，例如，由天然存在或合成性点突变体或其截短形式编码的重组形式。
本发明的抗体结合人VEGFR-3的第二Ig样结构域中的表位，其中P219是该表位的主要组分，V175是该表位的从属组分并且L221是该表位的次要组分。(这些残基的编号与全长人VEGFR-3一致，如上文Pajusola等人和EMBL数据库(登录号X68203)中所报道)。这个研究结果部分地基于以下观察：在人VEGFR-3中包含突变V175A或P219L或L221V(即置换直向同源的鼠VEGFR-3残基)消除或显著地减少本发明抗体与突变体人VEGFR-3的结合。
另外，结合人VEGFR-3中表位(其中P219是该表位的主要组分，V175是该表位的从属组分并且L221是该表位的次要组分)的本发明抗体能够阻断配体VEGF-C与VEGFR-3的结合并且因此抵消该受体的活性。因而，本发明提供了在人VEGFR-3上的新颖中和表位，其允许产生针对人VEGFR-3的新的中性抗体，所述中性抗体能够阻断人VEGF-C与该受体的结合。本发明因此提供人VEGFR-3的表位，其中P219是该表位的主要组分，V175是该表位的从属组分并且L221是该表位的次要组分。
本发明也提供了抗体或其抗原结合部分，其结合包含氨基酸残基P219和V175的人VEGFR-3表位。优选地，本发明也提供了抗体或其抗原结合部分，其结合包含氨基酸残基P219、V175和L221的人VEGFR-3表位。这种表位由本发明的抗体(例如抗体1)结合，并且因此，本发明也提供与人VEGFR-3的相同表位反应的抗体或其抗原结合部分，如具有下述轻链和重链的抗体，其中所述轻链包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列，所述重链包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。与人VEGFR-3的相同表位反应的抗体如本发明的某些抗体(例如抗体1)将竞争与人VEGFR-3结合，并且因此，本发明也提供与具有下述轻链和重链的抗体竞争结合至人VEGFR-3的抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列，所述重链包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
优选地，本发明的抗体也与具有SEQ ID NO：20中所示序列的突变小鼠VEGFR-3(其包含突变L219P)和具有SEQ ID NO：21中所示序列的突变小鼠VEGFR-3(其包含突变A175V)结合，其中与野生型小鼠VEGFR-3(SEQ ID NO：19)的结合相比较时，与具有SEQ ID NO：20中所示序列的突变小鼠VEGFR-3的结合增加多于50倍，并且与野生型小鼠VEGFR-3的结合相比较时，与具有SEQ ID NO：21中所示序列的突变小鼠VEGFR-3的结合增加多于10倍。
优选地，通过以下方式测定该抗体或其抗原结合片段和野生型小鼠或突变小鼠VEGFR-3之间的结合水平：将野生型小鼠或突变小鼠VEGFR-3的可溶性胞外结构域表达为具有碱性磷酸酶的融合蛋白并且随后使用碱性磷酸酶化学发光测定法确定能够与抗体结合的每种融合蛋白的量。
优选地，本发明的抗体或其抗原结合部分具有针对人VEGFR-3的高亲和力。例如，对人VEGFR-3具有1×10-9M和5.6×10-11M之间的Kd的抗体或其抗原结合部分，如在2000生物传感器上在20℃通过表面等离子体共振法测量。更优选地，这种抗体或其抗原结合部分对人VEGFR-3具有1×10-10M和5.6×10-11M之间的Kd，如在2000生物传感器上在20℃通过表面等离子体共振测量。
优选地，本发明提供了抗VEGFR-3抗体或其抗原结合部分，其以2nM和1.3nM之间的IC50抑制人VEGF-CΔNΔC与人VEGFR-3结合。
优选地，本发明提供了抗VEGFR-3抗体或其抗原结合部分，其以10nM和5nM之间的IC50抑制VEGF-CΔNΔC刺激的促有丝分裂反应。更优选地，这种抗VEGFR-3抗体或其抗原结合部分在如实施例5中所述的测定法中以8nM和5nM之间、最优选地以6nM和5nM之间的IC50抑制VEGF-CΔNΔC刺激的促有丝分裂反应。
优选地，本发明提供结合人VEGFR-3并且包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)的抗体或其抗原结合部分，其中所述LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3并且HCVR包含CDRHCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：1的氨基序列，LCDR2包含SEQ ID NO：2的多肽，LCDR3包含SEQ ID NO：3的多肽，HCDR1包含SEQ ID NO：6的氨基序列，HCDR2包含SEQ ID NO：7的多肽，并且HCDR3包含SEQ ID NO：8的多肽。
更优选地，本发明提供了抗体或其抗原结合部分，其结合人VEGFR-3并且包含SEQ ID NO：5的LCVR多肽和SEQ ID NO：10的HCVR。
更优选地，本发明提供了结合人VEGFR-3并且包含以下轻链和重链的抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链包含SEQ ID NO：15的多肽，所述重链包含SEQ ID NO：16的多肽。
仍更优选地，本发明提供了结合人VEGFR-3并且包含以下两条轻链和两条重链的抗体或其抗原结合部分，其中所述两条轻链包含SEQ ID NO：15的多肽，所述两条重链包含SEQ ID NO：16的多肽。
优选地，本发明提供了与本发明抗体竞争结合人VEGFR-3的抗体或其抗原结合部分。
优选地，本发明提供了抗体或其抗原结合部分，其为人抗体。
优选地，本发明提供了抗体或其抗原结合部分，其为人工程化抗体。
定义
如本文所用的术语“抗体”意指可以是完全人抗体或人工程化抗体的单克隆抗体，以及其消化片段、指定部分和变体，包括抗体模拟物、模以抗体的结构和/或功能的抗体部分或其指定片段或部分，包括保留与人VEGFR-3的第二Ig样结构域结合的能力的单链抗体及其片段。例如，由本发明包括的能够特异性结合人VEGFR-3第二Ig样结构域的抗体片段包括Fab片段(例如，通过木瓜蛋白酶消化)、Facb片段(例如，通过纤溶酶消化)、F(ab′)2片段(例如通过胃蛋白酶消化)和通过分子生物学技术产生的二硫键稳定的可变片段(dsFv)或单链可变片段(scFv)。抗体片段也意在包括，例如，保留与人VEGFR-3第二Ig样结构域结合的能力的结构域缺失抗体、双体抗体(diabodies)和三体抗体(triabodies)。
抗体包括了包含4条多肽链(由二硫键相互连接的两条重链(H)和两条轻链(L))的免疫球蛋白分子。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为HCVR)和重链恒定区。重链恒定区含有3个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为LCVR)和轻链恒定区。来自任何脊椎动物物种的抗体轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列划分成两个明显独特的类型(称作κ和λ)之一。如本文中所用，表述LCVR意在包括来自κ型轻链的可变区(Vκ)和来自λ型轻链的可变区(Vλ)。轻链恒定区包含一个结构域CL。HCVR和LCVR区包括序列高变区，命名为互补决定区(CDR)，其间插有更保守的区域，命名为构架区(FR)。每个HCVR和LCVR由从氨基端至羧基端按以下顺序：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4排列的3个CDR和4个FR组成。出于本发明的目的，LCVR CDR缩写为LCDR1，LCDR2和LCDR3，且HCVR CDR缩写为HCDR1、HCDR2和HCDR3。
取决于抗体重链恒定域的氨基酸序列，抗体可以划分成不同的“类别”。存在5个主要类别的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类别中的几种可以进一步划分成“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。与不同抗体类别相对应的重链恒定域分别称作α、Δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。本发明包括落入前述类别或亚类(同种型)中任意者范围内的抗体。
如本文所用，“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，例如，构成这个群体的各个抗体是基本上相同的，除了可能存在的可能天然存在的突变或少数翻译后变化之外。单克隆抗体是高度特异的，针对单个抗原位点(也称作决定簇或表位)，如本文中教导，所述抗原位点包含于哺乳动物VEGFR-3的第二Ig样结构域中。另外，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为通过任何特定方法产生该抗体。
如本文中所用，“人抗体”指这样的抗体，它们具有与人种系免疫球蛋白序列相对应的可变区和恒定区(如Kabat等人，(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242中所述)。如本文所用，术语“人抗体”不意在包括其中从另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系衍生的CDR序列已经移植到人构架序列上的抗体。
本发明的范围内包括对如本文中公开的抗体1的氨基酸序列的修饰，特别地与改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性相联系的情况下。在本上下文中，如本文所用，术语“人工程化抗体”指额外的抗体，所述抗体具有与抗体1相似的功能特性(例如在包含P219和V175的表位结合人VEGFR-3的能力)并且具有基本上是人的或完全是人的衍生自抗体1的在CDR周围的构架区。在本发明的情境下，基本上人的构架是与抗体1的构架区具有至少80％序列同一性的那些。优选地，这类基本上的人构架与抗体1的构架区具有至少约85％、约90％、约95％或约99％序列同一性。WO 2007/044411中描述了人种系序列。例如，种系轻链构架可以选自：A11、A17、A18、A19、A20、A27、A30、L1、L11、L12、L2、L5、L15、L6、L8、O12、O2和O8并且种系重链构架区可以选自：VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VH1-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VH1-18、VH1-69、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59和VH5-51。
衍生自抗体1的人工程化抗体可以包括从抗体1的序列内部缺失残基和/或将残基插入该序列和/或置换该序列中的残基。然而，最终构建体必须保留抗体1的所需功能特征(例如，在包含P219和V175的表位结合人VEGFR-3的能力)。
可以使用几种不同的方法产生与抗体1具有相似功能特性的人工程化抗体，其中每种方法始于抗体1(即，具有分别如SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：10中所示LCVR和HCVR序列的抗体)作为模板或亲本抗体以产生额外的抗体。在第一方法中，将抗体1的CDR移植入与抗体1构架区具有高度序列同一性的不同人构架。新构架的序列同一性通常将与抗体1中的相应构架至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一。这种移植可以导致与抗体1相比结合亲和力降低。如果情况是这样，可以基于由Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，2869(1991)发表的特定标准，将这个构架在某些位置回复突变成抗体1的构架。可以如下实施考虑用于回复突变的残基的鉴定：当氨基酸落入以下标准的任一项时，正在使用的人种系序列的构架氨基酸(接纳体构架)由来自抗体1构架(供体构架)的构架氨基酸替换：
(a)对于人构架在这个位置，接纳体构架的人构架区中的氨基酸是不常见的，而对于人构架在这个位置，抗体1中的相应氨基酸是常见的。
(b)该氨基酸的位置紧邻于CDR之一；或
(c)构架氨基酸的任一侧链原子处于三维免疫球蛋白模型中CDR氨基酸的任一原子的约5-6埃(中心至中心)范围内。
当接纳体构架的人构架区中的每一氨基酸和抗体1构架中的相应氨基酸对于人构架在那个位置处均是不常见时，这个氨基酸可以由对于人构架在那个位置常见的氨基酸替换。这些回复突变标准能够恢复抗体1的活性。
在第二方法中，可以通过突变抗体1的CDR(随机方式或以偏倚方式以避开氨基酸代码简并性)，同时保留抗体1的构架区而产生衍生自抗体1的保留抗体1的功能特性(例如在包含P219和V175的表位结合人VEGFR-3的能力)的人工程化抗体。优选地，与抗体1的CDR序列相比较时，在衍生自抗体1的人工程化抗体CDR的氨基酸序列中的突变(缺失、插入和/或置换)限于人工程化抗体的CDR序列中最多3个突变、更优选地2个突变或最优选地单个突变。在多于一个突变存在的情况下，突变可以按多种不同方式在CDR序列分布。例如，全部突变可以在单个CDR序列(例如LCDR1)中出现，每个突变可以处于不同的CDR序列中或两个突变可以存在于一个CDR序列中并且第三突变存在于另一个CDR序列中。这导致产生人工程化抗体的组合文库，其中CDR序列在如上文所述的一个或多个位置突变，同时保留抗体1的构架区。可以对该文库筛选与抗体1相比具有相似或改进功能特性的额外变体。
又一种产生衍生自抗体1(并且保留抗体1的功能特性，例如，在包含P219和V175的表位结合人VEGFR-3的能力)的人工程化抗体的方法是组合上文描述的两种方法并且在构架和CDR二者中产生变化。换而言之，将抗体1的CDR移植入不同构架后，除了在CDR中产生变化之外，还可以将特定构架残基回复突变。在Wu等人.(1999)，J.Mol.Biol.294：151-162中描述这种方法学的一般原理。
氨基酸变化也可以改变人工程化抗体的翻译后过程，如改变糖基化位点的数目或位置。
可以通过置换抗体1的一个或多个高变区残基产生置换变体。这样一种用于产生此类置换性变体的方法已知为使用噬菌体展示的亲和力成熟法。将几个高变区位点(例如6-7个位点)突变以便在每个位点产生全部可能的氨基酸置换。将如此产生的抗体变体以单价形式从丝状噬菌体粒子中展示为与每个粒子内部包装的M13的基因III产物的融合物。随后如本文中所公开那样，对噬菌体展示的变体筛选它们的生物学活性(例如结合亲和力)。
本文中公开的测定法可以用来筛选衍生自抗体1的人工程化抗体以鉴定那些具有如本文中公开的具有体外和体内功能的抗体。
本发明的抗体可以是分离的抗体。分离的抗体基本上不含其他细胞物质和/或化学品。
如本文所用，术语“表位”指抗原表面上的特定分子区域，所述分子区域能够引发免疫反应并且与这种反应产生的特异性抗体结合。表位可以是线性表位(即由均含于单一短序列段内部的连续氨基酸残基组成)或它可以是构象表位(即由这样的氨基酸残基组成，所述氨基酸残基处于抗原的线性序列的不同部分中，但是一旦抗原采取其适宜的二级和三级结构时被聚拢以形成抗体结合位点)。通常，表位由少数(例如2至5个)关键氨基酸残基构成，并且这些残基的破坏(例如通过突变成不同的氨基酸残基)导致抗原和该表位之间的结合明显减少或甚至完全消除。
与本文中公开的分子“竞争”的抗体或其抗原结合片段是在与本发明分子结合的位点相同或重叠的位点结合人VEGFR-3的那些抗体或其抗原结合片段。可以例如通过抗体竞争测定法鉴定竞争性人工程化抗体或其抗原结合片段。例如，纯化或部分纯化的人VEGFR-3的样品与固相支持物结合。随后添加本发明的抗体和测试单克隆抗体或抗原结合片段，其中测试抗体或本发明的抗体是经标记的。如果标记的抗体和未标记的抗体与VEGFR-3上独立和分开的位点结合，则标记的抗体将以相同的水平结合，不论疑似的竞争抗体是否存在。然而，如果相互作用位点是相同或重叠的，则未标记的抗体将竞争并且与抗原结合的标记抗体的量将减少。如果未标记的抗体过量存在，则标记的抗体将不结合。出于本发明的目的，竞争性人工程化抗体或其抗原结合片段是减少本发明抗体的结合约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的那些。用于实施这类竞争测定法的方法的细节是本领域熟知的并且可以在例如Harlow和Lane(1988)Antibodies：ALaboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，第567-569页，ISBN 0-87969-314-2中找到。此类测定法可以通过使用纯化的抗体定量地进行。通过针对自身滴定一种抗体建立标准曲线，即，将相同的抗体用作标记物和竞争物。滴定未标记的竞争性单克隆抗体或其抗原结合片段抑制标记分子与平板结合的能力。将结果作图并且比较为实现所需结合抑制程度而必需的浓度。
人VEGFR-3以两种形式存在，这由长度不同的mRNA转录物产生。与较短转录物编码的蛋白质相比较时，较长的转录物编码在C末端含有65个额外氨基酸残基的蛋白质，而较长的蛋白质是组织中检测到的主要形式。这两种变体在它们的N端胞外结构域是相同的。除非另外声明，否则术语“人VEGFR-3”指衍生自备选mRNA转录物的野生型人VEGFR-3的两种变体(即SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18)。
抗体1的LCVR区的核酸和相应的氨基酸序列分别命名为SEQ IDNOS：4和5。
抗体1的HCVR区的核酸和相应的氨基酸序列在本文中分别命名为SEQ ID NOS：9和10。
抗体1的轻链的核酸和相应的氨基酸序列在本文中分别命名为SEQID NOS：11和12。SEQ ID NO：12的氨基酸残基1-19构成从多种哺乳动物宿主细胞系中表达和提取轻链是有用的，但在成熟抗体中不存在的分泌序列。抗体1的成熟轻链的氨基酸序列在本文中命名为SEQ ID NO：15。
抗体1的重链的核酸和相应的氨基酸序列分别命名为SEQ ID NOS：13和14。如轻链的序列那样，SEQ ID NO：14的氨基酸残基1-19构成从多种哺乳动物宿主细胞系中表达和提取重链是有用的，但在成熟抗体中不存在的分泌序列。抗体1的成熟重链的氨基酸序列在本文中命名为SEQ IDNO：16。
可以基于亲和力和/或亲合力确定抗体的特异性。亲和力，由抗原与抗体的解离平衡常数(Kd)代表，度量抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合强度。亲合力是抗体与其抗原之间结合作用强度的度量。亲合力与表位和抗体上其抗原结合位点之间的亲和力及抗体的价态有关，其中所述的价态指特定表位的抗原结合位点数目。Kd的值越小，抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合强度越强。
本发明也提供了编码本发明抗体的重链的多核苷酸(例如抗体1-SEQID NO：13)或包含本发明抗体(例如抗体1)的任一个VH区或其部分或任一个VH CDR(包括其任何变体)的多核苷酸。本发明也提供了编码本发明抗体的轻链的多核苷酸(例如抗体1-SEQ ID NO：11)或包含本发明抗体(例如抗体1)的任一个VL区或其部分或任一个VH CDR(包括其任何变体)的多核苷酸。
本发明也包括表达载体，其包含本文所述的任一多核苷酸。示例性载体包括质粒、噬菌粒、粘粒、病毒和噬菌体核酸或能够在原核或真核宿主如细胞(例如，哺乳动物细胞)中复制的其他核酸分子。常见的表达载体含有用于调节本发明核酸分子的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。载体可以也含有遗传表达盒，所述遗传表达盒含有独立的终止子序列、允许载体在真核生物和原核生物二者中的复制的序列(即，穿梭载体)和用于原核和真核系统的选择标记。载体一般含有标记物以提供用于选择转化宿主的表型性状，如赋予抗生素(如氨苄青霉素或新霉素)耐药性。
合适的启动子包括组成型启动子和诱导型启动子。代表性表达控制序列/启动子包括lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、酵母糖酵解启动子，例如，3-磷酸甘油酸激酶启动子、酵母酸性磷酸酶启动子(例如，Pho5)、酵母α交配因子的启动子、源自人巨细胞病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺瘤病毒启动子、罗斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子和源自多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒和猿猴病毒的启动子(例如，SV40早期和晚期启动子)。
本发明也包括含有本发明多核苷酸或载体的非人宿主如细胞。“宿主”意指非人类多细胞生物或“宿主细胞”，其指向其中导入本发明多核苷酸或载体的细胞或细胞群体。本发明的宿主细胞可以是真核细胞或细胞系，如植物、动物、脊椎动物、哺乳动物、啮齿类、小鼠、灵长类或人细胞或细胞系。合适的真核细胞包括酵母和其他真菌、昆虫细胞、植物细胞、人细胞和动物细胞，包括哺乳动物细胞，如杂交瘤系、COS细胞、NS0细胞和CHO细胞。“宿主细胞群”意指可以将本发明多核苷酸或载体向其中导入并表达的培养的细胞群落。构想了将支持从本发明多核苷酸或载体中表达的任何宿主细胞。
本发明的宿主也可以是原核的。合适的原核宿主包括例如大肠杆菌(E.coli)，如大肠杆菌SG-936、大肠杆菌HB101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌X2282、大肠杆菌DHI和大肠杆菌MRC1、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)，如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和链霉菌属(Streptomyces)。
本发明也包括产生本发明抗体的方法，所述方法需要培养宿主细胞，所述宿主细胞表达编码本发明抗体的一个或多个多核苷酸，并且从培养基中回收抗体。
可以使用本发明的抗体作为人类医学中的药物，通过多种途径施用。最优选地，包含本发明抗体的药物组合物用于肠胃外施用。这类药物组合物可以通过本领域熟知的方法制备(见，例如，Remington：The Science andPractice of Pharmacy，第19版(1995)，A.Gennaro等人，Mack PublishingCo.)并且包含如本文中公开的抗体和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
如本文所用，就本发明抗体的生物活性而言，术语“抑制”或“中和”意指基本上拮抗、禁止、防止、阻止、减慢、破坏、消除、停止、减少或逆转人VEGFR-3的生物活性(包括但不限于如本文实施例4或5中所度量的人VEGFR-3生物活性)的能力。
如本文所用，术语“治疗”或“疗法”指治疗性治疗，其中目的是防止或减缓(减轻)与疾病或病症相关的不想要的生理学变化。有益或所需的临床结果包括症状减轻、疾病或病症的程度减弱、疾病或病症的稳定(即，其中疾病或病症没有加重)、延迟或减缓疾病或病症的进展、疾病或病症的改善或缓和、疾病或病症的消退(无论是局部或总体消退)，无论是可检测的或不可检测的。“治疗”也可以意指与如果没有接受治疗的预期存活相比，延长存活。那些需要治疗的患者包括已经患有这种疾病或病症的那些以及易于患有这种疾病或病症的那些患者。
本发明的组合物可以包含“治疗有效量”的本发明抗体。“治疗有效量”指以需要的剂量和时间段有效实现所需治疗结果的量。抗体的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中引发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体部分的任何有毒或有害作用被治疗有益作用超过。
疗法可以是“一线的”，即，作为未曾接受过先前抗癌治疗的患者中的初始治疗，其单独或与其他治疗组合；或“二线的”，作为已经接受过先前抗癌治疗方案的患者中的治疗，其单独或与其他治疗组合；或作为“三线”、“四线”治疗等，其单独或与其他治疗组合。
疗法可以给予已经接受过先前治疗的患者，所述治疗已经部分获得成功，但是对于这个特定治疗是不耐受的。疗法可以也作为辅助治疗给予，即，以防止癌症在当前未检测到疾病或在手术摘除肿瘤后的患者中复发。
由本发明治疗的癌包括原发肿瘤和已经通过淋巴系统转移的继发性或转移性肿瘤(包括从肺、乳腺或前列腺转移的那些)。
可以治疗的癌包括未血管化或基本上未血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌可以包含非实体瘤(如白血病和淋巴瘤)或可以是实体瘤。
待用本发明抗体治疗的癌症的类型包括卵巢癌、人红白血病、头颈癌、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌和结肠癌。另外，鉴于VEGF-C/VEGFR-3途径在促进淋巴管生成中的作用并且鉴于对大部分类型的癌症而言，第一转移部位是淋巴结，故阻断VEGF-C/VEGFR-3途径预期将抑制淋巴结转移，例如从乳腺癌、胰腺癌、胃癌或结直肠癌转移(Roberts等人，Cancer Res.，66(5)，2650-2657(2006))。
抗体可以单独施用(单药疗法)或与一种或多种治疗有效的药物或疗法组合(联合疗法)。其他治疗有效的药物可以与抗体缀合、并入与抗体相同的组合物或可以作为分别的组合物施用。其他治疗有效的药物或疗法可以在施用抗体之前、在其期间和/或在其后施用。可以施用其他治疗有效的药物以增进抗体的治疗作用或以减弱抗体的不利副作用。
本文中所述的治疗方法可以用来治疗任一合适的哺乳动物，包括灵长类如猴和人、马、奶牛、猫、犬、兔和啮齿类如大鼠和小鼠。在一个实施方案中，待治疗的哺乳动物是人。
通过参考以下实施例将看到，抗体1结合人VEGFR-3上的表位，所述表位包含P219作为表位的主要组分，包含V175作为表位的从属组分并且包含L221作为表位的次要组分。另外，可以见到，抗体2(针对鼠VEGFR-3产生的参比大鼠单克隆抗体)结合鼠VEGFR-3上包含残基L219和V221的表位。此外，这些实施例也显示抗体1对人VEGFR-3具有高亲和力(56pM)，能够阻断配体VEGF-C与VEGFR-3结合，能够阻断VEGF-C刺激的促有丝分裂反应并且在卵巢癌和HEL的体内异种移植模型中有效。最后，也可以见到，抗体2在头颈癌、乳腺癌、肺癌、RCC、胰腺癌和结肠癌的异种移植模型中有效。
实施例1
可以使用本领域熟知的多种合适的方法产生并纯化本发明的抗体。例如，将适宜的宿主细胞(如HEK 293EBNA或CHO)用分泌抗体的使用最佳的预定轻链对重链载体比率的表达系统或编码轻链(例如对于抗体1，SEQ ID NO：12)和重链(对于抗体1，SEQ ID NO：14)的单一载体系统瞬时或稳定转染。使用许多常见技术中的任一技术纯化其中已经分泌有抗体的澄清培养基。例如，可以将培养基便利地施加至蛋白A或G琼脂糖凝胶FF柱，所述柱已经用相容性缓冲液(如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4))平衡。洗涤所述柱以除去非特异性结合组分。洗脱结合的抗体，例如，借助pH梯度(如0.1M磷酸钠缓冲液pH6.8至0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 2.5)进行。检测抗体级分，如通过SDS-PAGE，并且随后合并抗体级分。取决于预期用途，进一步纯化是任选的。可以使用常见技术，将抗体浓缩和/或无菌过滤。可以通过常见技术，包括大小排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石层析有效地移除可溶性聚集物和多聚体。经这些层析步骤后，抗体的纯度大于99％。可以将产物立即在-70℃冷冻或可以冻干。下文提供抗体1的CDR和可变区氨基酸序列(使用Kabat方法测定)。
表1.轻链CDR氨基酸序列
Figure BDA00002892714400161
表2.重链CDR氨基酸序列
Figure BDA00002892714400162
表3.LCVR、HCVR、轻链及重链氨基酸序列
Figure BDA00002892714400163
实施例2
在以下实施例中，描述了导致阐明VEGFR-3受体上抗体1和抗体2与之结合的表位的实验。
VEGF-CΔNΔC和小鼠和人sR3-AP的产生：如Pytowski等人(2005)J.Natl.Cancer Inst.97(1)：14-21中所述那样产生重组的成熟人VEGF-CΔNΔC。人和小鼠VEGFR-3(sR3)的全长(即Ig结构域1-7)可溶性胞外区与编码人碱性磷酸酶的cDNA(AP)融合以产生融合蛋白sR3-AP(Persaud等人，(2004)J.Cell Science 117：2745-56；Pytowski等人(2005)J.Natl.Cancer Inst.97(1)：14-21)。
小鼠-人嵌合sR3-AP和sR3-AP的位点定向突变体的产生：使用重叠PCR技术(Ho等人(1989)，Gene77：51-59)制备sR3-AP的3个N端免疫球蛋白样(Ig)结构域的嵌合小鼠-人和人-小鼠构建体，并且将它们克隆至AP表达载体中(Persaud等人，上文；Pytowski等人，上文)。使用QuickChange II XL位点定向诱变试剂盒按制造商的说明书(Stratagene)进行sR3-AP构建体的位点定向诱变。使用ABI Prism 3100 Genetic分析仪(Applied Biosystems)和BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒(AppliedBiosystems)，通过对cDNA的两条链跨突变区域的测序验证所需置换的存在。
可溶性VEGFR-3蛋白的表达：将编码野生型和突变的sR3-AP的胞外区的cDNA转染至FreeStyleTM293细胞(Invitrogen，#R79007)中，所述细胞在化学上定义的、无蛋白质的FreeStyleTM293表达培养基(Invitrogen，#12338026)中悬浮培养。在一些情况下，使用如先前所述的抗AP抗体亲和层析(Zhu等人，(1998)Cancer Res.58：3209-14)或通过采用固定的本文所述mAb抗体1和抗体2的亲和层析纯化所选择的sR3-AP。
条件培养基(CM)中sR3蛋白的归一化：使用Great EscAPe TMSEAP化学发光试剂盒2.0(Clontech，Mountain View，CA)，使用TropixTR7171光度计(Applied Biosystems，Foster City，CA)，测定CM的AP活性。将CM与其AP活性成比例地在含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释(PBS-BSA)并且进行再测试，以通过AP活性测量和通过蛋白质印迹法再测试来验证归一化。
sR3-AP结合测定法：将一百(100)μl归一化的CM转移至用VEGF-CΔNΔC或测试抗体(200ng/孔)包被的96孔微量滴定板。在2小时孵育后，将板洗涤5次，并且通过化学发光检测结合的sR3-AP。
使用固定的小鼠和人VEGFR-3胞外部分(Ig结构域1-7)，通过ELISA测试抗体1和针对小鼠VEGFR-3的参比大鼠单克隆抗体(命名为‘抗体2’)的结合特异性。抗体1和抗体2强烈地和以剂量依赖性方式分别与人和小鼠VEGFR-3结合。作为人抗体的抗体1在超过10nM的浓度显示与小鼠VEGFR-3的轻微但可重复的交叉反应性。相反，抗体2未能展示出任何与人VEGFR-3的可检测结合。
抗体1的和抗体2的表位完全包含于VEGFR-3的第二免疫球蛋白样(Ig)结构域内部：VEGF受体家族的全部3个成员的配体结合位点均包含于胞外结构域的3个N端Ig结构域内部。使用抗体1的和抗体2的物种特异性来确定前3个Ig结构域的哪一个含有这些抗体的表位。编码小鼠和人Ig结构域1-3的DNA序列以多种组合交换以形成以下的VEGFR-3胞外结构域构建体：i)野生型人；ii)野生型小鼠；iii)嵌合体1(人Ig1-人Ig2-小鼠Ig3)；嵌合体2(人Ig1-小鼠Ig2-小鼠Ig3)；(iv)嵌合体3(小鼠Ig1-人Ig2-小鼠Ig3)和(v)嵌合体4(人Ig1-小鼠Ig2-人Ig3)。将构建体表达为带有碱性磷酸酶(AP)的融合蛋白，参见Persaud等人，上文。编码的蛋白质从瞬时转染细胞的条件培养基(CM)分离并且归一化成相等的蛋白质浓度和AP活性。小鼠和人sR3-AP以相似的亲和力结合人VEGF-CΔNΔC。因此，测试多种sR3-AP嵌合体结合人VEGF-CΔNΔC的能力作为确定在嵌合受体中保持正确蛋白质折叠的手段。抗体1和抗体2与嵌合蛋白1至4结合的能力显示，抗体1和抗体2的表位完全分别包含于人和小鼠VEGFR-3的第二Ig结构域(Ig2)内部。例如，抗体1将不与在Ig结构域2处含有小鼠VEGFR3序列的嵌合体2或嵌合体4结合。
鉴定构成抗体1和抗体2的表位的VEGFR-3的氨基酸：在VEGFR-3的第二Ig结构域的氨基酸序列内部鉴定到人蛋白和小鼠蛋白之间不同的十二(12)个位置。表4中显示这些位置以及在人蛋白和小鼠蛋白中的残基。
表4
位置 153 167 175 177 184 192 194 199 214 219 221
人 A V V W V L S H D P L
小鼠 S I A H L R P R N L V
位点定向诱变用来将人序列和小鼠序列中的每个物种特异性氨基酸分别变成对立物种的相应直向同源物；每种突变的蛋白质随后在编码第一、第二和第三Ig结构域的sR3-AP蛋白的背景下表达。通过两种互补方法完成表位绘制。在第一方法中，测量人特异性抗体1和小鼠特异性抗体2与其相应的人和小鼠sR3-AP的结合作用的丧失，所述丧失因各个氨基酸置换成小鼠或人直向同源物所致。在第二方法中，测量抗体1的和抗体2与对立物种的sR3-AP的结合作用的增益，所述增益由各个氨基酸置换成小鼠或人直向同源物而介导。如果上文描述的突变导致采用第一方法时结合的丧失并且采用第二方法时结合的增益，则将一个残基视为构成抗体表位的部分的有力候选物。对于全部突变体蛋白，与检查蛋白结构总变化(grosschange)平行地测量与VEGF-CΔNΔC的结合。
一式三份实施结合实验，并且将结果计算为3个独立实验的均数和标准差。在人sR3-AP的Ig2结构域中所检查的12个置换当中，仅一个(V184L)导致与VEGF-CΔNΔC和抗体1的结合完全丧失。因此认为这种变化扰动人sR3-AP的总体结构。置换V175A导致与VEGF-C和与抗体1的结合丧失大约50％。置换P219L导致与VEGF-C的结合丧失大约75％并且与抗体1的结合几乎完全丧失(约95％)。L221变成V不影响人sR3-AP与VEGF-C结合，但是减少与抗体1的结合约55％。剩余的置换不导致与VEGF-C或抗体1的结合大幅度丧失。
对小鼠sR3-AP中各个小鼠至人突变检查增加的与人特异性抗体1结合时，对置换A175V(约12倍)和L219P(约60倍)观察到高于与野生型小鼠sR3-AP结合作用的显著增加。其他置换均不导致高于背景的显著结合作用增加。
因此设定用于将某个氨基酸视为构成抗体1表位的标准，其中，人sR3-AP中人至小鼠的直向同源置换将显著地减少与抗体1的结合，同时减少(但不消除)与VEGF-CΔNΔC结合或使其不受影响。此外，对于构成抗体1表位的氨基酸，小鼠sR3-AP中小鼠至人的直向同源置换将导致明显与抗体1结合。对于抗体1，这些标准由人sR3-AP的V175和P219满足。排除V184，原因在于人sR3-AP中变成小鼠直向同源物的置换消除与VEGF-CΔNΔC和与抗体1的结合，同时在这个位置处在小鼠sR3-AP中变成人直向同源物的相应置换不导致与抗体1的结合。将人sR3-AP中的亮氨酸221变成相应的鼠缬氨酸减少了与抗体1的结合55％。然而，在这个位置在小鼠sR3-AP中变成人直向同源物的相应置换不导致与抗体1的结合。因此L221可能对抗体1的表位做出少量贡献，但是不符合上文建立的所有标准。
为进一步研究在位置221的残基的作用，将人sR3-AP中的P219L和L221V突变组合入单一构建体。与保留5％与人sR3-AP结合的单个P219L突变体相比，这种双突变体与抗体1的结合基本上被消除。
总之，这些结果确定P219作为人VEGFR-3上的抗体1表位的主要组分并且确定V175作为从属组分并且提出L221也是该表位次要组分的可能性。
随后就小鼠VEGFR-3的Ig结构域2的哪些残基构成抗体2的表位，使用相似方法进行检验。再次，一式三份实施结合实验，并且将结果计算为3个独立实验的均数和标准差。在小鼠氨基酸变成相应的人氨基酸的12个独立置换中，4个置换(H177W、P194S、R199H和N214D)显著地减少小鼠sR3-AP与VEGF-C和抗体2的结合。有趣地，在位置219和221(L219P和V221L)处的突变减少与抗体2的结合，但是不减少与VEGF-C的结合。在人VEGFR-3中在位置219和221处相应的人至小鼠突变(P219L和L221V)允许抗体2与人sR3-AP的结合水平分别大于抗体2与野生型人序列的结合大约55倍和10倍。也表明了在位置219和221处含有人直向同源氨基酸的小鼠突变体蛋白与VEGF-CΔNΔC的结合略微增加或不受影响，而这些突变体蛋白与抗体2的结合消除(219)或减少约85％(221)。
为将某个氨基酸视为构成抗体2表位所设定的标准是，小鼠sR3-AP中人直向同源置换将显著地减少与抗体2的结合，同时减少(但不消除)与VEGF-CΔNΔC结合或使其不受影响。此外，对于构成抗体2表位的氨基酸，人sR3-AP中的人至小鼠直向同源置换将导致明显与抗体2结合。对于抗体2，这些标准由小鼠sR3-AP的P219和L221满足。
表述数据的另一种方法是计算抗体2与通过在人sR3-AP序列内部每个独立的人至小鼠直向同源突变重构的野生型小鼠sR3-AP的最大结合百分比。这显示，单独置换人sR3-AP序列内部的P219L和L221V分别导致随所见到野生型小鼠sR3-AP的约5％和1％与抗体2最大结合的重构。因此得出结论，L219和V221是抗体2表位的组分。
可以见到，抗体1和抗体2分别结合人VEGFR-3和小鼠VEGFR-3中高度相似的表位，每种情况下在位置219处的残基是关键残基。以下实施例中的数据显示，抗体1和抗体2是能够阻断其相应抗原的活性以及在体内异种移植模型中抑制肿瘤生长的中和抗体。这些数据提供进一步证据表明，在本文中鉴定的VEGFR-3的Ig2结构域中的新表位提供作为中和表位的关键有利特征。抗体与所述表位的结合因此能够阻断配体结合、VEGFR-3信号传导和在体内抑制肿瘤生长。
实施例3：抗VEGFR-3抗体的亲和力(Kd)测量
在
Figure BDA00002892714400211
2000生物传感器(
Figure BDA00002892714400212
Piscataway，NY)上在20℃，通过表面等离子体共振法测量抗体1的结合动力学。将人VEGFR-3(sR3-AP)的可溶性胞外结构域固定在传感芯片上并将抗体1以0.8和6.25nM之间的浓度注射在传感器的表面上。使用BIA评价3.2程序评价Sensograms以测定结合速率(ka)和解离速率(kd)。使用以下等式从ka和kd速率计算解离常数(Kd)：Kd＝ka/kd。对于抗体1与固定的sR3-AP的结合，BIAcore动力学分析产生56pM的Kd。因此，抗体1对人VEGFR-3具有极高亲和力，其中所述亲和力几乎比sR3-AP对VEGF-CΔNΔC的亲和力大2个数量级。
实施例4：通过抗VEGFR-3抗体阻断VEGF-C与VEGFR-3结合
为测量VEGFR-3抗体阻断VEGF-C与人VEGFR-3结合的能力，使用竞争性VEGF-C阻断测定法。将抗体或可溶性噬菌体粒子以0.001μg/ml至5μg/ml的浓度与50ng的sR3-AP混合，在室温孵育1小时并转移至用VEGF-ΔNΔC(200ng/孔)包被的96孔微量滴定板。在额外的2小时后，将板洗涤5次并且添加磷酸对硝基苯基酯(Sigma)以便在OD405nm对结合的sR3-AP分子定量。计算IC50，即50％抑制sR3-AP与VEGF-CΔNΔC结合所需要的Fab或IgG浓度。Fab和IgG形式的抗体1分别以2nM和1.3nM的IC50强烈阻断sR3-AP与固定的VEGF-CΔNΔC结合。相反，靶向人IGF受体并从相同噬菌体文库获得的对照抗体是无活性的。
实施例5：通过抗体1抑制VEGF-CΔNΔC-刺激的促有丝分裂反应
为了测试抗体1抑制VEGFR-3介导的信号转导的能力，制备NIH-3T3细胞系，所述细胞系表达人VEGFR-3胞外结构域与人cFMS跨膜和胞质结构域融合的嵌合形式的VEGFR-3。检测到亲本细胞中无VEGFR-3内源表达，并且通过FACS分析显示嵌合受体在质膜上的定位。VEGFR-3-FMS细胞(5×103个细胞/孔)铺种到200ml无血清培养基中的96孔组织培养板上(Wallac，Gaithersburg，MD)并且在37℃孵72小时。添加直至20nM的抗体并且在37℃预孵育1小时，此后添加VEGF-CΔNΔC至终浓度20ng/mL。在18小时孵育后，将0.25mCi氚化胸苷([3H]-TdR)(Amersham)添加至每个孔并且孵育额外的4小时。将细胞置于冰上，用含有血清的培养基洗涤一次，在4℃与10％TCA一起孵育10分钟并且在25ml 2％ SDS中增溶。在闪烁计数器(Wallac，型号1450Microbeta闪烁计数器)上测定掺入的放射性活度。通过添加VEGF-CΔNCΔ，刺激表达VEGFR-3-cFMS的NIH-3T3细胞掺入至少3倍的[3H]-TdR。这种促有丝分裂反应以剂量依赖性方式由抗体1以5nM的IC50值特异性阻断。
实施例6：人卵巢癌瘤细胞系皮下异种移植模型中的抗VEGFR-3单克隆抗体
在这个实验中，对免疫缺陷性SCID小鼠中人卵巢癌瘤细胞系OVCAR-8(NCI-60，Developmental Therapeutics Program，NCI/NIH)的异种移植物使用单独的或组合的抗VEGFR3单克隆抗体抗体1和抗体2。OVCAR-8是表达人VEGFR-3的十分少的人癌瘤细胞系之一。这个实验中的期望是，抗体2将阻断正在生长的肿瘤的小鼠基质中的血管生成和淋巴管生成，同时不影响肿瘤。相反，抗体1预期仅作用于人癌瘤细胞。
将OVCAR-8细胞以1×107个细胞/小鼠按皮下方式注射至75只雌性无胸腺小鼠的左侧腹部。当肿瘤达到约180mm3时，在植入细胞后13日，将小鼠随机分组并分成5个处理组(n＝12只)：USP盐水对照，0.5ml/给药；大鼠IgG，40mg/kg；抗体1，40mg/kg；抗体2，40mg/kg；以及抗体1，40mg/kg+抗体2，40mg/kg。按周一-周三-周五(Mon-Wed-Fri)方案腹膜内给予抗VEGFR-3mAb和对照。每周二次记录肿瘤量值。将每个处理组的T/C％计算为每个处理组的相对肿瘤体积与盐水对照组的相对肿瘤体积的比率。经第41日的RM ANOVA用来比较处理组之间的肿瘤生长。
抗体2显著地抑制OVCAR-8肿瘤生长，T/C％为71％(p＝0.0299)。抗体1在这个模型中具有指向功效的趋势(T/C％是74％)，但是肿瘤抑制程度没有达到显著性(P＞0.05)。这种可以归因于这个组中在第41日肿瘤体积的宽范围(335-1504mm3)，这可能阻碍这个组达到统计显著性。
抗体1和抗体2的组合一起增强抗体2的肿瘤抑制作用(T/C％是47％并且与单独的任一种抗体相比，组合效果达到显著性(P≤0.0358))。
抗体2显著地抑制OVCAR-8肿瘤的生长，而抗体1似乎在这个模型中有效，没有达到统计显著性。但是，由于与抗体2单药疗法相比，两种单克隆抗体的组合显著地抑制OVCAR-8肿瘤生长，因此得出结论，抗体1在这个实验中展示出治疗功效。因而，本发明的抗体在卵巢癌体内模型中展示出抗肿瘤功效。
实施例7：人红白血病(HEL)细胞皮下异种移植模型中的抗VEGFR-3mAb抗体1
在以下实施例中，在人红白血病(HEL)细胞皮下异种移植模型中测量到抗体1的明显抗肿瘤作用。
对每笼饲养的5-6只nu/nu小鼠(雌性，7-8周)用5×106个HEL细胞/小鼠皮下注射。当肿瘤达到大约400mm3时，将小鼠按肿瘤体积随机分组成4个处理组中的一个组(n＝11只/组)：
1)USP盐水，10mL/kg，
2)抗体1，60mg/kg(在第1日150mg/kg的加载剂量)
3)抗体1，20mg/kg(在第1日50mg/kg的加载剂量)
4)抗体1，6mg/kg(在第1日15mg/kg的加载剂量)
在USP盐水中制备抗体1。治疗药以10ml给药溶液/kg体重腹膜内施用，1周2次。在第1日施用首次剂量，即加载剂量，随后对于整个研究持续期，施用维持剂量，1周2次。一周2次测量肿瘤体积。对于整个研究持续期，至少一周2次记录体重。在第18日将每个处理组的T/C％计算为每个处理组的相对肿瘤体积与盐水对照组的相对肿瘤体积的比率(表5)。通过重复量值ANOVA比较处理组中的肿瘤生长和体重变化。
用抗体1处理导致HEL肿瘤生长的剂量依赖性抑制，60mg/kg抗体1显著抑制肿瘤生长(p＝0.0031)。这项研究中抗体1处理不影响体重(表5)。因而，本发明的抗体在HEL的体内模型中展示出抗肿瘤功效，同时在这个模型中产生最小的不良副作用。
表5
实施例8：CAL27鳞状细胞癌异种移植模型中与顺铂组合的抗VEGFR-3mAb抗体2
为了测试抗VEGFR-3抗体在头颈癌中的活性，使用CAL27异种移植模型。将CAL27细胞悬液以1×107个细胞/小鼠按皮下方式注射至60只雌性无胸腺小鼠的左侧腹部。当肿瘤达到约180mm3时，在植入细胞后8日，将小鼠随机分组并分成4个处理组(n＝12只)：1.)USP盐水对照，0.5ml腹膜内，每周3日；2.)抗体2，40mg/kg，每周3日；3.)顺铂，7mg/kg，q7d；4.)抗体2，40mg/kg，每周3日+顺铂，7mg/kg，q7d。
每周二次记录肿瘤量值；经第61日的RM ANOVA用来比较处理组之间的肿瘤生长。卡方检验用来检验处理组之间肿瘤消退数目的统计显著性。
与USP盐水对照相比，使用抗体2或顺铂的单药疗法显著地抑制CAL27肿瘤生长(P≤0.0077)。抗体2和顺铂的T/C％值分别是55％和39％。与单药疗法相比较时，采用抗体2和顺铂的联合疗法导致显著抑制肿瘤生长(P≤0.0322)。联合疗法的效果大于如分数乘积法(Fractional ProductMethod)所测定的加合作用。因此，作为单药疗法或与顺铂组合时，抗VEGFR-3抗体与VEGFR-3的Ig2结构域中的表位结合在头颈癌的体内模型中显示抗肿瘤功效。
实施例9：MDA-MB-231乳腺癌异种移植模型中与5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸组合的抗VEGFR-3mAb抗体2
为了测试抗VEGFR-3抗体在乳腺癌中的活性，使用MDA-MB-231异种移植模型。NIH nu/nu无胸腺小鼠(雌性，8周)以0.4ml(1∶1w/基质胶(matrigel))中的6×106个MDA-MB-231细胞按皮下方式在乳腺脂肪垫中注射。当肿瘤达到大约300mm3时，将小鼠按肿瘤尺寸随机分组成以下处理组(n＝12只)：1)USP盐水，10μl/g，每周3次；2)40mg/kg抗体2，每周3次；3)125mg/kg5FU(5-氟尿嘧啶)+62mg/kg LV(甲酰四氢叶酸)，每周1次；4)抗体2，40mg/kg，每周3次+5FU/LV，125mg/kg和62mg/kg，每周分别一次。在处理当日制备全部药物并且腹膜内施用。在抗体处理开始之前1日启动细胞毒药物处理。
来自盐水对照组的肿瘤体积与处理小鼠的肿瘤体积的比较显示施用抗体2或抗体2+5FU/LV时显著的肿瘤生长抑制(见表6)。尽管抗体2+5-FU/LV组合的作用并不大于单药疗法，但是对于该组合，存在抗肿瘤作用增加的趋势。因此，作为单药疗法或与5FU/LV组合时，抗VEGFR-3抗体与VEGFR-3的Ig2结构域中的表位结合在乳腺癌的体内模型中(与盐水对照相比)显示抗肿瘤功效。
表6
Figure BDA00002892714400261
1经第34日的RM ANOVA
实施例10：NCI-H292肺癌异种移植模型中单独和与多西紫杉醇(Docetaxel)组合的抗VEGFR-3mAb抗体2
为了测试抗VEGFR-3抗体在肺癌中的活性，使用NCI-H292异种移植模型。nu/nu小鼠(雌性，7-8周龄)用2×106个NCI-H292细胞/小鼠皮下注射。当肿瘤达到大约300mm3时，将小鼠按肿瘤尺寸随机分组成以下处理组(n＝15只)：1)USP盐水，10μl/g，每周3次，腹膜内，始于第2日。2)抗体2，40mg/kg，每周3次，腹膜内，始于第2日。3)多西紫杉醇，12mg/kg，q7d，始于第1日。4)多西紫杉醇，12mg/kg，q7d，始于第1日+抗体2，40mg/kg，每周3次，始于第2日。
1周大约2次测量肿瘤体积，并且对于整个研究持续期，至少一周2次记录体重。在处死时，通过CO2窒息使小鼠安乐死。将每个处理组的T/C％计算为相对对照组而言，实验组中相对肿瘤体积的比率。通过经第26日的重复量值ANOVA将肿瘤生长和体重与对照组比较。
用抗体2和多西紫杉醇处理显著地抑制NCI-H292肿瘤生长，T/C％值分别是74％和49％。与T/C％为24％的单药疗法相比，抗体2和多西紫杉醇的联合疗法显著地增加抗肿瘤功效。因此，作为单药疗法(p＝＜0.0001)或与多西紫杉醇组合(p＝＜0.0001)时，抗VEGFR-3抗体与VEGFR-3的Ig2结构域中的表位结合在肺癌的又一个体内模型中显示抗肿瘤功效。
实施例11：皮下SK-RC-29人肾细胞癌(RCC)异种移植模型中的抗VEGFR-3mAb抗体2
为了测试抗VEGFR-3抗体在RCC中的活性，使用SK-RC-29人肾细胞癌异种移植模型。雌性无胸腺nu/nu小鼠(n＝12只/组)皮下植入2×106个SK-RC-29RCC细胞/小鼠。将这些细胞作为1∶1基质胶
Figure BDA00002892714400271
基膜(Vt＝0.4ml)中的混合物注射。当肿瘤达到200-250mm3时，将小鼠随机分组成组，并且启动腹膜内给药，对照组接受USP盐水(500□l/注射)和抗体2组在首次给药时接受60mg/kg并且在全部后续给药时40mg/kg。每周二次记录肿瘤体积持续43日。在第48日(研究结束)取得代表性肿瘤样品(每个处理组n＝4只)用于组织学分析。为确定处理组之间抗肿瘤作用的显著性，用重复测量(RM)ANOVA进行统计分析。没有在任何处理组中出现因抗体毒性所致的体重减轻，如第47日所测量的那样。实际上，用抗体处理的小鼠的体重在整个研究期间增加大约5.5％。
为评估抗肿瘤功效和计算T/C％值，全部处理组与对照小鼠比较直至第32日。抗体2产生62％的T/C％(p＝0.012)；这显示在皮下异种移植模型中抑制肾细胞癌的生长，且具最小不良副作用。
实施例12：BxPC-3胰腺癌异种移植物中的抗VEGFR-3mAb抗体2
为了测试抗VEGFR-3抗体在胰腺癌中的活性，使用BxPC-3胰腺癌异种移植模型。雌性无胸腺nu/nu小鼠(n＝36只)用1∶1基质胶中混合的2×106个BxPC-3人胰腺细胞/小鼠进行皮下注射。当肿瘤达到约350mm3时，将动物分成3个处理组(n＝10只)：1)USP盐水。2)mAb抗体2，10mg/kg。3)mAb抗体2，40mg/kg。每周3次以0.1ml/10g体重腹膜内施用进行全部处理。每周二次记录肿瘤体积持续6周。
抗体2治疗以剂量依赖性方式抑制BxPC-3肿瘤的生长。在第40日研究结束时，10mg/kg和40mg/kg剂量组的T/C值分是75％(p＝0.042)和56％(p＝0.002)。
实施例13：HT-29结肠异种移植物中与奥沙利铂组合的抗VEGFR-3mAb抗体2
为了测试抗VEGFR-3抗体在结肠癌中的活性，使用HT-29结肠异种移植模型。将HT-29细胞悬液以5×106个细胞/小鼠按皮下方式注射至60只雌性无胸腺小鼠的左侧腹部。当肿瘤达到约180mm3时，在植入细胞后8日，将小鼠随机分组并分成4个处理组(n＝12只)：1)USP盐水对照，0.5ml腹膜内，每周3次。2)抗体2，40mg/kg，每周3次。3)奥沙利铂，12mg/kg，q7d。4)抗体2，40mg/kg，每周3次+奥沙利铂，12mg/kg，q7d。
每周二次记录肿瘤量值；将RM ANOVA用来比较处理组之间的肿瘤生长。单独的抗体2没有显著地抑制HT-29肿瘤的生长；该抗体具有指向功效的趋势，T/C为80％。与对照或与任一单药疗法相比，采用抗体2和奥沙利铂的联合疗法显著抑制HT-29肿瘤的生长(P≤0.0280)，T/C％为47％。因此，与奥沙利铂组合使用时，抗VEGFR-3抗体与VEGFR-3的Ig2结构域中的表位结合在结肠癌的体内模型中显示抗肿瘤功效。
Figure IDA00002892715200011
Figure IDA00002892715200021
Figure IDA00002892715200031
Figure IDA00002892715200051
Figure IDA00002892715200061
Figure IDA00002892715200071
Figure IDA00002892715200081
Figure IDA00002892715200111
Figure IDA00002892715200121
Figure IDA00002892715200131
Figure IDA00002892715200141
Figure IDA00002892715200151
Figure IDA00002892715200181
Figure IDA00002892715200191
Figure IDA00002892715200201
Figure IDA00002892715200211
Figure IDA00002892715200221
Figure IDA00002892715200231
Figure IDA00002892715200241
Figure IDA00002892715200251
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Figure IDA00002892715200271
Figure IDA00002892715200281
Figure IDA00002892715200291
Figure IDA00002892715200301
Figure IDA00002892715200311
Figure IDA00002892715200331
Figure IDA00002892715200341
Figure IDA00002892715200351
Figure IDA00002892715200361
Figure IDA00002892715200371
Figure IDA00002892715200381
Figure IDA00002892715200391
Figure IDA00002892715200401
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Figure IDA00002892715200471
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Figure IDA00002892715200511
Figure IDA00002892715200531
Figure IDA00002892715200541
Figure IDA00002892715200551
Figure IDA00002892715200561

Claims (15)

1.与人VEGFR-3特异性结合的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQID NO：2的LCDR1、SEQ ID NO：2的LCDR2、SEQ ID NO：3的LCDR3、SEQ ID NO：6的HCDR1，SEQ ID NO：7的HCDR2和SEQ IDNO：8的HCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ IDNO：5的轻链可变区和SEQ ID NO：10的重链可变区。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含SEQ ID NO：15的轻链和SEQ ID NO：16的重链。
4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含SEQ ID NO：15的两条轻链和SEQ ID NO：16的两条重链。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中
a)所述抗体与人VEGFR-3的结合因人VEGFR-3的Pro-219单突变成Leu减少至少90％；和
b)所述抗体与人VEGFR-3的结合因人VEGFR-3的Val-175单突变成Ala减少至少50％。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与人VEGFR-3的结合因人VEGFR-3的Leu-221单突变成Val减少至少50％。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其也与SEQ ID NO.20的突变小鼠VEGFR-3和SEQ ID NO.21的突变小鼠VEGFR-3结合，其中与野生型小鼠VEGFR-3(SEQ ID NO.19)的结合相比较时，与SEQ ID NO.20的突变小鼠VEGFR-3的结合增加多于50倍，并且与野生型小鼠VEGFR-3的结合相比较时，与SEQ ID NO.21的突变小鼠VEGFR-3的结合增加多于10倍。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体对人VEGFR-3具有1×10-9M至5.6×10-11M的Kd，如在
Figure FDA00002892714300021
2000生物传感器上于20℃通过表面等离子体共振法所测量的那样。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体以2nM至1.3nM的IC50抑制人VEGF-CΔNΔC(SEQ ID NO：22)与人VEGFR-3结合。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体以10nM至5nM的IC50抑制VEGF-CΔNΔC刺激的促有丝分裂反应。
11.药物组合物，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
12.权利要求11中所述的药物组合物，其中所述组合物任选地含有至少一种其他治疗成分。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，用作药物。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，用于治疗卵巢癌、人红白血病、头颈癌、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和淋巴结转移。
15.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其与选自顺铂、5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂和多西紫杉醇的其他抗癌药组合，用于在治疗中同时、分别或依次使用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110004167A (zh) * 2019-04-16 2019-07-12 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 靶向vegfr-2和/或vegfr-3嵌合抗原受体及其应用
CN111808191A (zh) * 2020-05-11 2020-10-23 廊坊天光生物技术有限公司 一种用于检测血清中vegf含量的抗体对及其用途

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150246118A1 (en) 2012-10-26 2015-09-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Lyve-1 antagonists for preventing or treating a pathological condition associated with lymphangiogenesis
KR101521981B1 (ko) * 2013-07-31 2015-05-20 가톨릭대학교 산학협력단 혈액암 줄기세포 증식 또는 생착 억제용 조성물
WO2016112466A1 (en) * 2015-01-15 2016-07-21 Oncoquest Inc. Methods of increasing delivery of anti-cancer agents to targets
AU2017366739B2 (en) 2016-12-02 2023-11-23 Angeles Therapeutics, Inc. Synthetic immune receptors and methods of use thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002060950A2 (en) * 1994-11-14 2002-08-08 Ludwig Institute For Cancer Research Flt4(vegfr-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006302494B2 (en) 2005-10-06 2011-01-06 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002060950A2 (en) * 1994-11-14 2002-08-08 Ludwig Institute For Cancer Research Flt4(vegfr-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRONISLAW PYTOWSKI ET AL.: "Complete and specific inhibition of adult lymphatic regeneration by a novel VEGFR-3 neutralizing antibody", 《JNCI J NATL CANCER INST》 *
KRIS PERSAUD ET AL.: "Involvement of the VEGF receptor 3 in tubular morphogenesis demonstrated with a human anti-human VEGFR-3 monoclonal antibody that antagonizes receptor activation by VEGF-C", 《JOURNAL OF CELL SCIENCE》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110004167A (zh) * 2019-04-16 2019-07-12 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 靶向vegfr-2和/或vegfr-3嵌合抗原受体及其应用
CN111808191A (zh) * 2020-05-11 2020-10-23 廊坊天光生物技术有限公司 一种用于检测血清中vegf含量的抗体对及其用途

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