KR101521981B1

KR101521981B1 - 혈액암 줄기세포 증식 또는 생착 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101521981B1
Application number: KR1020130091203A
Authority: KR
Inventors: 김희제; 이지윤
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2033-07-31
Also published as: KR20150015302A

Abstract

본 발명은 VEGFR(Vascular endothelial growth factor receptor)-3 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착을 억제하기 위한 조성물 및 상기 조성물을 생체 외에서 또는 혈액암 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착 억제 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 헐액암 줄기세포의 증식 또는 생착을 억제하여 혈액암을 치료하는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

혈액암 줄기세포 증식 또는 생착 억제용 조성물 {Composition for inhibiting proliferation or engraftment of hematologic cancer stem cell}

본 발명은 VEGFR(Vascular endothelial growth factor receptor)-3 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착을 억제하기 위한 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착 억제 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 헐액암 줄기세포의 증식 또는 생착을 억제하여 혈액암을 치료하는 약학 조성물에 관한 것이다.

혈액암은 혈액을 구성하는 성분에 생긴 암으로 포괄적으로 혈액, 골수, 조혈기간, 림프절, 림프기관, 림프계에 발생한 악성 종양을 말한다. 최근에 들어 혈액암 중 백혈병뿐만 아니라 다발골수종, 림프종, 골수형성이상증후군, 골수증식종양 등의 빈도가 급격히 증가하고 있다. 2010년 국가암등록통계(보건복지부 중앙암등록본부)에 따르면 혈액암 환자는 7937명으로 전체 암의 약 4.6%를 차지한다. 최근 10년간 주요 혈액암 종별 신규 환자 수 증가추이를 보면 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)이 89%, 다발골수종(multiple myeloma)이 122% 증가로, 같은 기간 전체 암 환자 수 증가율인 51%를 훨씬 상회하고 있다. 또한, 백혈병은 어린아이보다 성인에서 10배 정도 높게 발생된 것으로 보이고, 특히 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML) 은 성인의 급성 백혈병 중 가장 흔한 형태로서 급성 백혈병의 65%를 차지한다. 이와 같이 혈액암은 성인에서 발병률이 더 높아 고령화가 진행됨에 따라 혈액암의 유병률과 사망률이 지속적으로 높아지는데, 우리나라도 고령화가 진행됨에 따라 혈액암 발생 빈도가 증가해 향후 10% 수준까지 올라갈 것으로 전망된다.

지금까지 암의 발생원인은 정상세포가 어떤 외부적인 원인에 의해 돌연변이를 일으켜 발생한다고 보고되어 왔다. 따라서, 현재까지 암의 치료를 위해 정상 세포와는 다른 암세포에서 특이적으로 발현되거나 과발현되는 유전자를 찾아 그 유전자를 목표로 하는 항암제 개발 및 치료가 이루어져 왔으나, 전이가 된 암 환자나 암이 재발된 환자에게서는 이상의 치료법만으로는 암세포를 완전히 제거하지 못했다. 이런 환자들을 연구하던 중 최근에는 암세포 중에 암을 근본적으로 일으키는 세포가 따로 존재하고, 이 세포들은 정상 줄기세포의 특성을 갖고 있으며, 이와 같은 세포들이 암을 발생시킨다고 보고되어 왔으며, 이러한 세포들은 줄기세포의 특성을 갖고 있다고 하여 "암 줄기세포"라 명명되었다.

암 줄기세포의 패러다임은 종양이란 다양한 잠재적 증식능력(pluri-potency)과 자가재생능력(self renewal)을 보이는 특정한 세포군에 의하여 기인한다는 것이다(B.M. Boman, M.S. Wicha, Cancer stem cells: a step toward the cure, J. Clin. Oncol. 26(2008) 2795-2799). 암 줄기세포의 존재는 급성 골수성 백혈병에서 처음 증명되었으며 최근에는 유방암을 포함한 일반 고형암에서도 암 줄기세포의 존재를 증명함으로써, 고형암종에서도 줄기세포가 존재함을 확인하게 되었다(D. Bonnet, J.E. Dick, Human acute myeloid leukemia is organized as hierachy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med 3(1997)730- 737; M. Al-Hajj, M.F. Clarke, Self-renewal and tumor stem cells. Oncogene 23(2003)7274-7284). 이러한 암 줄기세포들은 별개의 집단으로서 급성 골수성 백혈병과 같은 혈액암들에도 존재한다.

기존의 항암 요법인 화학요법(chemotherapy)은 독자적으로 또는 다른 치료법(방사능요법 등)과 조합하여 현재 암을 치료하기 위한 가장 일반적이며 효율적인 치료 도구로 사용되고 있는 것 중의 하나이다. 화학요법에서 암을 치료하기 위하여 사용되는 약물의 효능은 암 세포를 죽일 수 있는 능력에 따른다. 그러나, 이러한 약물은 세포 독성으로 인하여 암세포뿐만 아니라 암세포가 아닌 일반적인 세포에도 역으로 작용할 수 있다는 사실에서 오는 큰 제한이 있다. 또한, 약물에 대한 내성을 가진 암세포가 생기고, 이런 내성을 가진 암 세포들이 암 치료 후에도 생존하여 결국 암 재발을 일으킬 수 있다. 나아가, 화학요법에 의해 구역, 구토, 체액정체, 설사, 근육경련과 같은 경미한 부작용과 폐렴, 우울증, 경련, 심부전, 혈전증, 색전, 출혈, 빈혈, 혈소판 감소증을 동반한 골수억제의 심각한 부작용을 유발한다.

방사선요법은 적당한 양의 방사선을 환부에 조사(照射)함으로써 인체에 발생하는 각종 암을 치료하는 항암요법인데, 이러한 방사선요법은 인체의 조혈기능을 저하시키고 면역계를 억제시켜 암 치료의 효율성을 낮추는 문제점이 있다. 나아가 반복적인 방사선 조사로 인해 암세포가 저항성을 획득하게 되므로, 이러한 방서선 요법 또한 항암 치료에 있어 한계가 존재한다.

또한 혈액암의 치료에 있어서 특정 면역요법을 포함하는 치료법이 상당히 잠재력이 있는 것 같아 보이지만, 그러한 치료법은 소수의 공지된 암-관련 항원(malignancy-associated antigens)으로 제한된다. 따라서, B세포 백혈병, 림프종 및 다발골수종과 같은 혈액암의 치료를 위한 향상된 방법이 요구되고 있다.

암세포 중 80~90%는 실제로 재발능력이 없지만, 나머지 10~20% 암 줄기세포는 항암제를 투여했을 때 죽지 않고 남아서 재발한다. 따라서, 암세포 재발과 전이를 피하고 암을 완전히 제거하기 위해서는 단순히 암 세포를 억제하고 제거하는 것이 아니라, 기존의 항암요법의 문제점인 정상 줄기세포에는 손상을 주지 않으면서 암 줄기세포를 표적으로 하여 암 줄기세포를 선택적으로 제거하는 항암제의 개발이 필요하다.

그러나, 지금까지 암 줄기세포에 대한 연구에는 제한성도 많고, 종양의 형성이나 유지에서의 역할에 대해서는 아직까지 확실하게 밝혀진 것은 없다. 현재까지 암 줄기세포를 직접적으로 표적으로(targeting)하는 항암제나 천연물 유래 추출물의 연구는 거의 없는 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 VEGFR-3의 발현 또는 활성을 억제하면 정상 줄기세포에 영향을 주지 않으면서 특이적으로 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착을 억제할 수 있고, 이를 이용하면, 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착을 억제함으로써 혈액암을 효과적으로 치료하는 것이 가능하다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 VEGFR(Vascular endothelial growth factor receptor)-3 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 VEGFR(Vascular endothelial growth factor receptor)-3 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 혈액암 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착 억제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 VEGFR(Vascular endothelial growth factor receptor)-3 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 혈액암 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 VEGFR(Vascular endothelial growth factor receptor)-3 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착 억제용 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 VEGFR(Vascular endothelial growth factor receptor)-3 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 혈액암 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착 억제 방법에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 혈액암 줄기세포는 백혈병 줄기세포(leukemic stem cell, LSC)일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 VEGFR-3의 발현을 억제하는 물질은 VEGFR-3 에 특이적으로 결합하는 siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 VEGFR-3의 활성을 억제하는 물질은 VEGFR-3 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머, 또는 화학식 1의 화합물 또는 이의 염일 수 있다.

[화학식 1]

또 하나의 양태로서, 본 발명은 VEGFR(Vascular endothelial growth factor receptor)-3 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 혈액암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 VEGFR-3의 발현을 억제하는 물질은 VEGFR-3 에 특이적으로 결합하는 siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산일 수 있다.

[화학식 1]

또한 바람직하게, 상기 혈액암은 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 다발성 골수종(multiple myeloma,MM) 또는 골수이형성증후군(myelodysplastic syndrome, MDS)일 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 VEGFR-3의 발현 또는 활성을 억제하는 경우 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착을 억제할 수 있다는 것을 기초로, 마우스에서 VEGFR-3의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 처리한 암 줄기세포(CD34⁺CD38^-VEGFR-3 세포)를 주입하여 암 줄기세포의 증식 또는 생착 결과를 확인함으로써, VEGFR-3 가 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착을 억제하기 위한 신규 타겟이 될 수 있음을 확인하였다. 또한, VEGFR-3 가 암 줄기세포의 증식 또는 생착 억제를 통해 종국적으로는 혈액암을 치료하기 위한 신규 타겟이 될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 급성 골수성 백혈병(AML) 환자의 암 줄기세포에서 VEGFR-3이 과발현되는지 확인하고, 이에 VEGFR-3의 안타고니스트를 처리하였을 때 암 줄기세포의 빈도 및 VEGFR-3의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, 급성 골수성 백혈병(AML) 환자의 암 줄기세포에서 VEGFR-3이 과발현되었고(도 1), VEGFR-3의 안타고니스트를 처리하였을 때 암 줄기세포의 빈도 및 VEGFR-3의 발현이 감소하였다(도 2).

본 발명의 다른 실시예에서는, VEGFR-3의 발현 또는 활성을 억제하는 경우 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착을 억제할 수 있는지 알아보기 위해, VEGFR-3의 안타고니스트를 처리한 암 줄기세포를 마우스에 주입하였다. 암 줄기세포 주입 18시간 후, 골수, 말초혈액 및 비장에서의 주입한 암 줄기세포의 빈도를 확인하였다. 또한 암 줄기세포 주입 6주 후, 생착 결과를 측정하였다. 그 결과, VEGFR-3의 안타고니스트를 처리한 암 줄기세포를 주입한 마우스에서 암 줄기세포의 빈도 및 VEGFR-3의 발현이 감소하였고, 주입한 암 줄기세포의 귀소성이 현저히 감소하였다(도 3). 또한, 생착에 있어서도 전반적인 암 줄기세포의 유의한 감소를 나타내었으나, 정상 줄기세포에 대해서는 유의한 차이를 보이지 않았다(도 4). 따라서, VEGFR-3를 억제하는 경우 정상 줄기세포에 대해서는 영향을 주지 않고 암 줄기세포에 대해서 선택적으로 증식 또는 생착을 억제할 수 있음을 확인하였다.

위의 실험들은, 확립된 인간화 마우스 모델에 대하여 수행되었다 (도 5).

종합하면, 본 발명은 혈액암 환자의 암 줄기세포에서 VEGFR-3 가 과발현된다는 것을 처음 확인하였으며, 상기 VEGFR-3 가 암 줄기세포의 증식 및 생착에 영향을 준다는 것을 확인하였다. 또한, VEGFR-3 의 안타고니스트를 처리하는 경우 암 줄기세포의 증식 및 생착이 억제된다는 것을 확인함으로써, VEGFR-3 가 혈액암 치료의 새로운 치료 타겟이 될 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 VEGFR-3 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착 억제용 조성물, 상기 조성물의 이용방법 및 혈액암을 치료하는 약학 조성물을 제공한다.

본원에서 용어, "혈액암"이란, 혈액을 구성하는 성분에 생긴 암으로 포괄적으로 혈액, 골수, 조혈기간, 림프절, 림프기관, 림프계에 발생한 악성 종양을 의미한다. 구체적으로, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병 만성 림프구성 백혈병, 골수섬유증, 다발성 골수증, 림프종, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 골수형성이상증후군, 골수증식종양, 고립성 골수종, 재생불량성 빈혈을 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니며, 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착에 기인한 각종 혈액암들이 본 발명의 범위에 포함된다.

본원에서 용어, "암 줄기세포"란, 정상 줄기세포의 특성을 갖고 다양한 표현형을 가진 암세포를 끊임없이 만들어내는 있는 암 세포를 의미한다. 이 중,"백혈병 줄기세포"는 암 줄기세포 중 하나로 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병 만성 림프구성 백혈병 등의 모든 백혈병을 유발하는 원인이 되는 줄기세포를 의미한다. 암 줄기세포는 암의 재발의 원인이 되는 것으로 일반적인 암 세포와는 구별되며, 암의 완치를 위해서는 암 줄기세포가 필수적으로 제거되어야 한다. 암 줄기세포의 제거를 위해서는 직접적인 절단, 화학 또는 방사능 요법을 통한 파괴뿐만 아니라, 암 줄기세포의 증식을 억제하고 생체 내 생착을 억제하는 방법으로 암 줄기세포를 생체 내에서 제거할 수 있다.

용어 "증식 억제"는, 세포가 분열하여 세포 수가 늘어나는 상태인 증식을 막는 것을 의미한다. 바람직하게, 본원에서는 VEGFR-3의 발현 또는 활성을 억제하여 암 줄기세포의 증식을 억제할 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 VEGFR-3의 발현 또는 활성을 억제하여 혈액암 줄기세포의 증식을 억제할 수 있다는 것을 입증하였다.

용어 "생착"은, 세포를 생체 내로 투여하였을 경우, 투여한 세포가 생체 내의 조직에 부착하는 것을 의미한다. 바람직하게, 본원에서는 암 줄기세포가 생체 내에 정착하여 암 세포를 생산할 수 있는 것을 의미하며, 더 바람직하게, 혈액암 줄기세포가 골수에 정착하여 혈액암 세포를 생산할 수 있는 것을 의미한다. 이에 대해 본원에서의 용어 "생착 억제"는 암 줄기세포가 생체 내에 정착하는 것을 막고, 바람직하게, 혈액암 줄기세포가 골수에 정착하는 것을 방지하는 것을 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 VEGFR-3의 발현 또는 활성을 억제하는 경우 혈액암 줄기세포의 생착을 억제할 수 있다는 것을 입증하였다.

본원에서 용어, "VEGFR-3"란, 혈관 내피세포 성장 인자(vascular endothelial growth factor)의 수용체 중 하나로, 막 결합성(membrane-bound) 수용체(mbVEGFR) 또는 수용성(soluble) 수용체(sVEGFR) 일 수 있다. VEGFR-3는 림프관신생(lymphangiogenesis)의 기능을 수행하며, 세포 외 부분인 7개의 면역 글로블린 도메인(immunoglobulin-like domain), 하나의 막 관통 영역(transmembrane spanning region) 및 세포 내 부분인 티로신 인산화 효소 도메인(tyrosine-kinase domain)으로 구성되어 있다. VEGFR-3 유전자 및 이의 단백질 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 확인할 수 있다. 보다 상세하게, VEGFR-3 유전자의 염기 서열은 NM_002020, 단백질의 아미노산 서열은 NP_002011로 등록되어 있다. VEGFR-3는 혈관 내피세포 성장 인자의 수용체 중 하나로 알려져 있을 뿐, 혈액암 줄기세포와의 구체적인 관련성은 전혀 알려진 바가 없다.

VEGFR-3의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은, VEGFR-3의 합성경로, 반응경로 등을 차단하는 물질을 의미한다. 예를 들어, VEGFR-3 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합(hybridization)할 수 있는 siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산(antisense oligonucleotide) 등이 될 수 있다. 상기 siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산은 VEGFR-3 유전자의 mRNA 염기 서열에 특이적으로 결합하고 다른 핵산물질의 염기 서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것이 바람직하나, VEGFR-3의 합성경로, 반응경로 등을 차단하는 물질에 해당하면 이에 제한되지 않는다.

이때, 상보적으로 결합한다는 것은, 소정의 혼성화 또는 어닐링(annealing) 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 핵산이 VEGFR-3 유전자의 mRNA 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포함하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

일예로, 본원의 VEGFR-3 유전자의 mRNA 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것은 siRNA일 수 있다. 용어, "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knockdown) 방법으로서 또는 유전자 치료의 방법으로 제공될 수 있다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70염기이다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 또한 siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA 분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단 구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중 사슬 RNA 일반의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스텝 루프형 구조일 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 siRNA는 그 자체로 폴리뉴클레오타이드 페어링을 갖는 완전한 형태, 즉 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 두 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 생체 내에 투여된 후 이러한 형태를 갖도록 하나의 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 단편과 이의 역방향(reverse) 상보물이 스페이서에 의해 분리된 단일쇄 폴리뉴클레오타이드로부터 유도될 수 있는 형태, 예를 들어 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유도된 siRNA 발현 카세트를 형질전환 또는 감염(infection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태일 수 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.

다른 일예로, 본원의 VEGFR-3 유전자의 mRNA 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것은 shRNA일 수 있다. 용어 "shRNA"는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase Ⅲ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도함이 널리 알려져 있다.

또 다른 일예로, 본원의 VEGFR-3 유전자의 mRNA 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것은 안티센스 핵산일 수 있다. 용어 "안티센스 핵산"이란 특정 mRNA 의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 서열은 VEGFR-3 유전자의 mRNA에 상보적이고 VEGFR-3 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, VEGFR-3 유전자의 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.

안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나, 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제Ⅰ를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 VEGFR-3의 siRNA, shRNA 또는 VEGFR-3 안티센스 핵산의 1종 이상을 포함하는 외에, 환자의 암 줄기세포의 증식을 억제시키는 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 또는 siRNA 또는 안티센스 핵산 분자의 유입을 촉진시키는 제제, 예를 들어 리포좀(미국 특허 제4,897,355호, 제4,394,448호, 제4,23,871호, 제4,231,877호, 제4,224,179호, 제4,753,788호, 제4,673,567호, 제4,247,411호, 제4,814,270호)을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한 안티센스 핵산은 세포에 의해 흡수되는 펩티드에 접합시킬 수도 있다. 유용한 펩타이드의 예로는 펩타이드 호르몬, 항원 또는 항체 및 펩타이드 독소 등이 있다.

본 발명의 조성물은 단독으로 사용할 수 있지만, 치료 효율을 증가시키기 위해 방사선 요법 또는 화학 요법, 세포 성장 정지 또는 세포 독성 물질, 항생 물질형 물질, 알킬화제, 항대사성 물질, 호르몬제, 면역제, 인터페론형 물질, 사이클로옥시게나제 억제제, 메탈로매트릭스프로테아제 억제제, 텔로머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항성장인자 수용체 물질, 항-HER 물질, 항-EGFR 물질, 항-혈관생성 물질, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, ras-raf 시그날 전도 경로 억제제, 세포 주기 억제제, 기타 cdk 억제제, 튜불린 결합체, 토포이소머라제Ⅰ 억제제, 토포이소머라제 Ⅱ 억제제 등)과 같은 다른 항암 치료법과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있고, 경구 투여시에는 결합체, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물의 유효 투여량의 범위는 성별, 체표면적, 질환의 종류 및 중증도, 연령, 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 배출비율, 투여시간, 치료기간, 표적세포, 발현 수준 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일예로, 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착 억제용 조성물은 VEGFR-3 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 압타머 또는 화학식 1의 화합물 또는 이의 염 등을 포함할 수 있다.

[화학식 1]

용어 "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 VEGFR-3 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, VEGFR-3 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝(cloning)하여 상기 VEGFR-3 유전자에 의해 코딩되는 VEGFR-3 단백질을 얻고, 얻어진 VEGFR-3 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 VEGFR-3 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명의 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착 억제용 조성물에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

용어 "압타머"는, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 압타머는, 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 압타머는, RNA, DNA, 수식 핵산 또는 이들의 혼합물 등의 직쇄상 또는 환상의 형태의 핵산일 수 있다. 압타머는, 파지 디스플레이(phage display) 또는 단일 클론 항체(monoclonal antibodies, "MAbs")에 의해 생성되는 펩티드와 같은 것으로서, 선택된 표적에 특이적으로 결합할 수 있고 표적의 활성을 조절할 수 있으며, 예컨대, 결합을 통해 압타머가 기능에 대한 표적의 능력을 차단할 수 있다. 불규칙 서열 올리고뉴클레오티드의 풀(pool)로부터 시험관내 선택 프로세스에 의해 생성된 것으로서, 압타머는 성장 인자, 전사 인자, 효소, 면역글로불린, 및 수용체를 포함하는 100 이상의 단백질에 걸쳐 생성된 것이다. 전형적인 압타머는 크기가 10-15 kDa(30-45개의 뉴클레오티드)이며, 나노몰 이하(sub-nanomolar)의 친화성으로 그 표적에 결합하며, 그리고 밀접하게 관련된 표적들로부터 구분된다(예컨대, 압타머는 동일한 유전자 패밀리로부터의 다른 단백질과는 전형적으로 결합하지 않는다). 압타머가 갖는 친화성을 유도하는 동일한 유형의 결합 상호작용(예컨대, 수소 결합, 정전기적 상보성, 소수성 접촉, 입체적 배제(steric exclusion))과 항체-항원 복합체에서의 특이성을 통하여 선택된 표적에 특이적으로 결합할 수 있고 표적의 활성을 조절할 수 있으며 표적의 능력을 차단할 수 있다.

본 발명의 "압타머"는 VEGFR-3에 대하여 결합 활성을 갖는 압타머이다. 바람직하게, 본 발명의 압타머는 VEGFR-3에 결합하여, VEGF와 VEGFR-3와의 결합을 저해함으로써, VEGFR-3의 활성을 저해할 수 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 VEGFR-3 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착 억제용 조성물을 생체 외에서 또는 인간을 제외한 동물에서 혈액암 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착 억제 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, VEGFR-3 의 발현 또는 활성을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 억제할 수 있는 물질을 포함하는 조성물을 생체 외에서 혈액암 줄기세포나 혈액암 줄기세포를 포함하는 조직 등에 처리하거나, 혈액암이 발병한 동물에 처리하고, 혈액암 줄기세포의 증식 및 생착 정도를 검사하여 수행할 수 있다.

본원에서 "혈액암 치료"라 함은 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착을 억제함으로써 체내에서 혈액암 줄기세포가 감소하거나 생착된 혈액암 줄기세포의 감소를 통하여 혈액암을 치료하는 것을 의미한다. 바람직하게, VEGFR-3 의 발현 또는 활성을 억제함으로써 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착을 억제하여 혈액암을 치료하는 것을 의미한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 VEGFR-3 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 처리한 혈액암 줄기세포를 마우스에 주입한 경우 암 줄기세포가 감소하고, 암 줄기세포의 생착 또한 감소한 것을 확인하여, 이를 통하여 혈액암을 치료할 수 있다는 것을 입증하였다.

본 발명은 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착을 억제하기 위하여 VEGFR(Vascular endothelial growth factor receptor)-3 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착 억제용 조성물을 제공하며, 이를 이용하면, 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착을 억제함으로써 혈액암을 치료하는 것이 가능하다.

도 1a는 정상인 대조군과 백혈병 환자의 단핵구 세포와 암 줄기세포에서의 VEGFR-3 발현에 대한 FACS(fluorescense activated cell sorter) 분석 결과를 나타낸 것이다. "AML"은 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), "Normal"은 정상인 대조군, "R1"은 단핵구 세포, "In R1"은 단핵구 세포에서의 암 줄기세포의 빈도, "In CD3+CD38- cells"는 암 줄기세포에서의 VEGFR-3 발현을 나타낸다.
도 1b는 정상인 대조군과 백혈병 환자의 암 줄기세포에서의 VEGFR-3 발현에 대한 FACS(fluorescense activated cell sorter) 분석 결과를 통계처리하여 나타낸 것이다. "In MNCs"는 단핵구 세포, "In CD3+CD38-"는 암 줄기세포를 나타낸다.
도 1c는 혈액 내 존재하는 비정상적인 암세포를 H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색을 통하여 확인한 결과를 나타낸다. "Normal PB"는 정상인 대조군에서의 말초혈액(peripheral blood), "AML PB"는 급성 골수성 백혈병 환자의 말초혈액, "M4/M5"는 백혈병 유형(type)을 나타낸다.
도 1d는 CD34+CD38-VEGFR-3+ 세포를 주사한 마우스와 CD34+CD38-VEGFR-3- 세포를 주사한 마우스의 골수(위)와 비장(아래)에서 적혈구 생성(erythropoiesis) 정도를 나타낸 것이다. "CD34+CD38- cells"는 암 줄기세포, "VEGFR-3+"는 VEGFR-3가 있는 암 줄기세포, "VEGFR-3-"는 VEGFR-3가 없는 암 줄기세포를 나타낸다.
도 1e는 암 줄기세포에서와 VEGFR-3의 공발현을 형광면역염색하여 공초점 현미경(confocal microscope)으로 확인한 결과이다. "DAPI"는 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 염색한 결과, 흰색 화살표는 공발현을 나타낸다.
도 2는 VEGFR-3 길항제인 MAZ51를 백혈병 환자의 단핵구 세포와 암 줄기세포에 처리하거나 처리하지 않았을 때, 단핵구 세포와 암 줄기세포의 빈도 및 암 줄기세포에서의 VEGFR-3의 발현 변화를 나타낸 것이다. "Leukemic cells"는 MAZ51 를 처리하지 않은 백혈구 환자 유래 CD34+CD38-VEGFR-3 세포군에서의 결과를, "MAZ51 treated"는 MAZ51 를 처리한 백혈구 환자 유래 CD34+CD38-VEGFR-3 세포군에서의 결과를 나타낸다.
도 3은 MAZ51를 처리하거나 처리하지 않은 인간 CD34+CD38-VEGFR-3 세포군을 마우스의 꼬리정맥에 주사하고 18시간 후, 골수, 말초혈액 및 비장에서의 인간의 CD34+세포의 빈도를 확인하여 귀소성(homing efficiency)으로 나타낸 결과이다. "In BM"은 골수(bone marrow), "Leukemic cells"는 MAZ51 를 처리하지 않은 인간 CD34+CD38-VEGFR-3 세포군을 주입한 마우스에서의 결과를, "MAZ51 treated"는 MAZ51 를 처리한 인간 CD34+CD38-VEGFR-3 세포군을 주입한 마우스에서의 결과를 나타낸다.
도 4는 MAZ51를 처리하거나 처리하지 않은 인간 CD34+CD38-VEGFR-3 세포군을 마우스의 꼬리정맥에 주사하고 6주 후, CD34+CD38-VEGFR-3 세포군의 생착 결과를 나타낸다. "MAZ treated"는 MAZ51 를 처리한 인간 CD34+CD38-VEGFR-3 세포군을 주입한 마우스에서의 결과를, "Leukemic cells"는 MAZ51 를 처리하지 않은 인간 CD34+CD38-VEGFR-3 세포군을 주입한 마우스에서의 결과를 나타낸다.
도 5a는 인간화 마우스 모델에서 CD34+CD38-VEGFR-3+ 세포를 주사하여 골수로 귀소(homing)하는 것과 생착능을 FACS와 면역염색법으로 확인한 결과이다. "CD34+CD38-VEGFR-3+"는 VEGFR-3가 있는 암 줄기세포를 나타낸다.
도 5b는 인간화 마우스모델에서 CD34+CD38-VEGFR-3+ 세포를 주사하여 골수에 생착된 인간의 세포가 환자로부터 온 것인지를 확인하는 DNA 지문(DNA finger print) 결과이다. "CD34+CD38-VEGFR-3+"는 VEGFR-3가 있는 암 줄기세포를 나타낸다.
도 5c는 인간화 마우스모델에서 골수 내(endosteal niche) 부분을 직접 잘라 Hematoxylin& Eosin 면역염색하여 마우스 세포와 인간 세포가 같이 있는 범위를 나타낸 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 급성 골수성백혈병 ( AML ) 환자의 단핵구 세포와 암 줄기세포에서의 VEGFR-3의 과발현 확인

1-1. FACS 분석

42명의 AML 환자 및 11명의 건강한 지원자의 혈액에서 단핵구 세포 및 암 줄기세포(LSC)를 분리하여, 암 줄기세포에서 VEGFR-3의 발현 여부를 확인하였다. 구체적인 실험방법으로, 밀도 1.077을 가지고 있어 단핵구를 분리해 낼 수 있는 용액 15ml 위에 혈액을 DPBS(Dulbecco`s Phosphate Buffered Saline)와 섞어 위에 얹고 원심분리(2500rpm, 20분)하였다. 연막(buffy coat)층에 있는 단핵구 부위의 세포를 피펫(pipet)으로 따서 DPBS로 세척한 후 10만개정도의 세포를 200ul 안의 DPBS 에 넣고 골고루 섞었다. 이후, 각 항체, anti-CD34, anti-CD38, anti-VEGFR-3를 튜브(tube) 안에 넣고 냉장고에서 20분간 노출시켰다. 노출 후 수세하고 FACS caliber로 어느 정도의 발현 변화를 관찰하였다.

실험 결과, 정상인의 단핵구 세포 중 CD34+CD38- 암 줄기세포의 빈도는 0.7%에 그치는 반면, 급성 골수성백혈병 환자의 단핵구 세포 중 CD34+CD38- 암 줄기세포의 빈도는 10.9% 정도로 높은 것을 확인하였다. 또한, 정상인의 줄기세포인 CD34+CD38- 세포 경우 VEGFR-3의 발현이 1.7% 정도에 그치는 반면, 급성 골수성백혈병 환자의 암 줄기세포에서의 VEGFR-3의 발현은 26.1%정도로 높은 발현을 보였다(도 1a, 도 1b).

1-2. H&E( Hematoxylin & Eosin ) 염색

AML 환자 및 건강한 지원자의 말초혈액을 유리 슬라이드 위에 한 방울 떨어뜨려 도말한 후 건조시켜 H&E 염색약으로 염색하였다. 이상 지역(Ideal zone)에서 세포를 관찰하였다.

혈액 내 존재하는 비정상적인 암세포들을 H&E 염색을 통해 확인한 결과, AML 환자의 혈액에서 백혈병 타입 중 M4/5에 해당하는 비정상 암세포가 많이 확인되었다(도 1c).

1-3. 적혈구 생성( erythropoiesis ) 분석

인간 CD34+CD38-VEGFR-3+ 세포를 주사한 마우스와 인간 CD34+CD38-VEGFR-3- 세포를 주사한 마우스의 허벅지 뼈를 잘라 근육 등을 발라내고 뼈만 남겼다. 육안으로 관찰(gross examination)하여 적혈구 생성 정도를 확인하였다.

생착이 잘 될수록 주사한 인간의 세포(human cell)로 차기 때문에 마우스에서 적색부분보다는 하얀색 부분이 많이 보이게 되는데, CD34+CD38-VEGFR-3+ 세포를 주사한 마우스의 골수와 비장을 조사한 결과, CD34+CD38-VEGFR-3- 세포를 주사한 마우스의 골수보다 적혈구 생성(erythropoiesis)이 떨어지고 비장이 비대해진 것을 확인하였다(도 1d). 따라서, VEGFR-3 가 암 줄기세포의 생착을 유도하는 것을 확인할 수 있었다.

1-4. 공초점 현미경 분석

실시예 1-1의 FACS 분석에서 보인 AML 환자의 암 줄기세포에서 CD34+CD38- 와 VEGFR-3의 공발현을 확인하기 위해 Rat anti- human VEGFR-3 항체에 FITC conjugated anti rat IgG 2nd 항체를 붙인 것과 PE conjugated anti human CD34 항체를 동시에 형광면역염색을 하고 공초점 현미경(Confocal microscope)(laser scanning microscope: confocal scanning, Carl Zeiss microscopy)을 이용하여 확인하였다.

확인 결과, 암 줄기세포 CD34+CD38-에서 VEGFR-3가 공발현됨을 확인하여, AML 환자의 암 줄기세포에서 VEGFR-3가 발현됨을 다시 한 번 확인할 수 있었다(도 1e).

실시예 2. VEGFR -3 안타고니스트 처리 시, 백혈병 환자의 단핵구 세포와 암 줄기세포에서의 VEGFR -3의 발현 변화 확인

조직 배양 플라스크(Tissue culture flask)에 MAZ51(VEGFR-3 길항제)(Calbiochem. Cat no 676492) 30uM/ul와 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 9ml을 주입하고 AML 환자의 단핵구 세포와 암 줄기세포 5 x 10⁵~ 1 x 10⁶ cells/3ul)를 37℃, 5% 이산화탄소 유지 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 배양한 후 현탁액(suspension) 상태의 세포를 모으고 DPBS로 2번 세척한 후 FACS 분석(실시예 1-1의 FACS 방법과 동일)을 통해 암 줄기세포의 마커인 CD34, CD38, VEGFR-3의 발현을 비교하였다

그 결과, 지금까지 상업화 되어있는 VEGFR-3 길항제 중 가장 보편적인 MAZ51를 처리한 경우 AML 환자의 단핵구 세포와 암 줄기세포의 빈도가 감소하거나 암 줄기세포에서의 VEGFR-3 발현이 감소하는 경향을 보였다 (도 2).

실시예 3. VEGFR -3 안타고니스트 처리 시, 마우스에서의 암 줄기세포의 귀소성( homing efficiency ) 빈도 확인

MAZ51 를 처리하지 않은 인간 CD34+CD38-VEGFR-3 세포군 또는 MAZ51 처리 후의 인간 CD34+CD38-VEGFR-3 세포군을 각각 하루 전에 전신 방사선 조사(350cGy) 한 7주령의 마우스(NOD scid gamma, NSG, NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ 면역결핍생쥐, JACKSON LABORATORY) (5마리가 1cage 안에서 관리)의 꼬리정맥에 주사하였다. 준비된 세포(약 50만개)를 200ul DPBS에 넣어 호일로 감싸고 운반하여 주사하였다. 주사 후 혈액이 지혈되는 것을 확인하고 알코올 솜으로 닦은 후 우리(cage)에 넣었다. 18시간째 마우스를 잡아 골수와 말초혈액, 비장에서의 인간의 CD34+세포의 빈도를 확인하였다.

그 결과, MAZ51 처리한 세포군의 골수로의 귀소성(homing efficiency)은 MAZ51를 처리하지 않은 군에 비해 현저히 떨어졌다. 이러한 결과를 통하여 VEGFR-3의 발현 또는 활성을 억제하는 경우 암 종양세포의 증식이나 재발에 영향을 줄 수 있는 암 줄기세포의 생착을 줄어들게 한다는 것을 입증하였다 (도 3).

실시예 4. VEGFR -3 안타고니스트 처리 시, 마우스에서의 암 줄기세포의 생착능 확인

MAZ51 를 처리하지 않은 인간 CD34+CD38-VEGFR-3 세포군 또는 MAZ51을 처리하여 배양된 인간 CD34+CD38-VEGFR-3 세포군에 CD34, CD38, VEGFR-3에 대한 각 항체를 붙여 FACS moflo 를 이용하여 분류(sorting)하였다. 분류된 세포를 잘 수세하여 100,000 내지 500,000 만개의 세포를 200 ul 의 DPBS 에 넣고 방사선 조사된 마우스에 주사하였다. 주사 후 알코올 솜으로 잘 닦고 반드시 지혈을 확인한 후 우리(CAGE) 에 넣었다. 생착은 환자 혈액의 상태에 따라 각기 다를 수 있고 같은 환자의 피라 하더라도 암 줄기세포의 빈도에 따라 생착능이 다르게 나타날 수 있기 때문에 주사 이후 마우스의 상태를 적어도 5주 이상을 추적 관찰(follow up)하며 인간혈액의 생착을 안정적으로 확인할 수 있었다. 이후 죽은 마우스의 양쪽 허벅지 뼈를 자르고 근육 등의 불필요한 조직은 버린 후 한쪽 뼈만 4% PFA(paraformaldehyde)용액에 넣었다. 2일 후 뼈는 포름 산(formic acid) 용액에 넣고 일주일간 노출하여 뼈가 말랑거릴 때까지 기다렸다. 그 후 수돗물에 하루 수세하고 파라핀 블록(paraffin block)에 넣고 절단하여 인간세포의 유무를 확인하거나(도 5c), 나머지 한쪽 허벅지 뼈는 근육 등을 발라내자 마자 그 안에 있는 세포들을 꺼내어 양쪽 뼈의 단면을 칼로 자르고 1ml 주사기에 DPBS를 넣고 주사기를 밀어내어 물이 뼈 안쪽을 관통하게 만들어 세포를 획득하였다. 이후 모아진 세포는 RBC(Red Blood Cell) lysis로 적혈구를 터트리고 FACS 를 위한 과정을 진행하였다.

그 결과, MAZ51을 처리한 경우 생착에 있어서도 주사 후 6주 후 결과에서 전반적인 암 줄기세포의 유의한 감소(통계값 0.09로 유의함)를 보였으며 (4.3% in MAZ51 treated & 11.0% in non MAZ51 treated leukemic group), 비정상 암세포로 알려져 있는 CD45 군(dim population)에서, CD34+CD38- 의 빈도가 MAZ51 처리하지 않은 군이 22.6%인데 반해 MAZ51처리군은 9.4%로 유의하게 감소함을 확인하였다. 반면 정상 줄기세포인 CD45 군(bright population)의 경우는 유의한 차이를 보이지 않았다(12.4% vs 15.9%). 이러한 결과를 통하여 VEGFR-3의 발현 또는 활성을 억제하는 경우 정상 줄기세포에는 영향을 주지 않고 암 줄기세포에만 작용할 가능성이 높음을 입증하였다(도 4).

실시예 5. 인간화 백혈병 마우스 모델의 확립

인간화 마우스 모델은 인간의 혈액세포를 마우스 생체 내 존재하게 하는 것이다. 인간화 마우스 모델의 확립과 이에 대한 검증은 암 줄기세포의 생착과 주변세포와의 상호작용을 얼마나 하고 있는지에 대한 실험을 가능케 하는 것으로, 인간화 마우스모델의 확립은 암 줄기세포의 실험을 안정적으로 진행할수 있게 해주는 기본 시스템이다.

실시예 1-3, 실시예 3 및 4에서 사용한 마우스는 인간화 백혈병 마우스 모델로 아래와 같은 방법으로 제조 및 확립하였다.

인간화 백혈병 마우스 모델의 확립하기 위해, 방사선 조사로 남아있는 마우스의 세포까지 박멸된 면역결핍 NSG 마우스 꼬리정맥에 분리한 인간의 혈액세포를 주사하였다. 이미 방사선 처리가 된 마우스는 빠르게 인간의 혈액세포를 받아들이고 수주 후에는 온몸에 인간의 세포가 존재함을 확인하였다.

5-1. FACS 분석 및 면역 염색

CD34 줄기세포 마커의 발현과 CD45 혈액세포의 존재를 혈액 세포 내에서 FACS(실시예 1-1의 FACS 방법과 동일)와 면역염색법으로 확인하였다.

면역염색을 위해 FITC CONJUGATED ANTI HUMAN CD45의 항체 5ul를 세포가 200ul 모아진 튜브 안에 넣고 2시간 냉장배양한 후 DAPI와 함께 형광현미경을 찍었다. 다만 마우스의 세포는 APC conjugated mouse CD45, 인간(human)의 세포는 FITC conjugated anti human CD45를 주어 거리가 먼 파장으로 시행하여 형광간섭을 피해 위양성(FLASE positive)을 없앴다.

그 결과, 주사한 인간 CD34+CD38-VEGFR-3+ 세포가 골수로 귀소(homing)하는 것과 생착능을 확인하였다(도 5a).

5-2. DNA finger print 확인

골수 생착된 인간의 세포가 환자로부터 온 것인지 DNA 지문(finger print)을 통하여 확인하였다. 이를 위해, 환자의 세포를 모아 Genomic DNA를 kit를 이용해 추출하였다. 마우스에 주사되고 생착된 세포를 마우스의 허벅지 뼈 안에서 꺼내 kit를 이용하여 DNA를 추출하였다. DNA 지문(Finger print) 방법은 유래(origin)를 밝힐 때 주로 쓰이는 방법으로 일반 겔 로딩(gel loading)하여 밴드 유형(band type)으로 해석되는 일반 PCR의 방법을 사용하였다. DNA 양은 20ug 이고 로딩(loading)양은 2ul를 넘지 않게 하였다. 겔 농도(gel concentration) 은 2%이며, 150 volt 로 천천히 내려 band가 뭉치지 않고 내려와 차이를 확인할 수 있었다.

그 결과, 각각 환자의 프라이머리(primary) 세포와 골수 내 생착된 세포가 같은 환자의 DNA임을 확인하였다. 사용된 primer는 2번, 5번, 13번으로 universal UFP finger print genomic DNA kit(JK BioTech.Ltd. Cat No. JK090016)를 사용하였다.

그 결과, 환자 중 1명은 완전 일치, 1명은 부분 일치로 나왔다. 부분 일치로 나온 이유는 마우스의 세포와 혼합되어 있기 때문으로 생각된다. 하지만, 이는 생착빈도의 문제이지 인간의 세포가 생착되어 있음은 확실한 결과이다. 따라서, 각각 환자의 프라이머리 세포와 골수 내 생착된 세포가 같은 환자의 DNA임을 확인할 수 있었다 (도 5b).

5-3. 면역 염색 확인

골수 내 부분을 직접 잘라 H&E 면역염색하여 마우스 세포와 인간 세포가 같이 있는 범위를 조사하였다.

그 결과, CD34+CD38-VEGFR-3+ 의 경우 마우스의 세포는 적게 존재하는 반면, 인간의 세포는 퍼져있음을 확인하였고(도 5c의 노란 실선 안), CD34+CD38-VEGFR-3-세포를 주사한 마우스의 골수는 이에 반해 마우스의 세포가 많이 존재함을 확인하였다 (도 5c).

Claims

VEGFR(Vascular endothelial growth factor receptor)-3 의 발현을 억제하는 siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산; 또는
VEGFR-3의 활성을 억제하는 항체, 압타머 또는 화학식 1의 화합물을 포함하는,
혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착 억제용 조성물:
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 혈액암 줄기세포는 백혈병 줄기세포(leukemic stem cell)인 조성물.
삭제
삭제
VEGFR(Vascular endothelial growth factor receptor)-3 의 발현을 억제하는 siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산; 또는
VEGFR-3의 활성을 억제하는 항체, 압타머 또는 화학식 1의 화합물을
생체 외에서 또는 인간을 제외한 동물에서 혈액암 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는,
혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착 억제 방법.
[화학식 1]
제5항에 있어서, 상기 혈액암 줄기세포는 백혈병 줄기세포(leukemic stem cell)인, 혈액암 줄기세포의 증식 또는 생착 억제 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제