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ES2968880T3 - Receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une a BCMA, y usos del mismo - Google Patents

Receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une a BCMA, y usos del mismo Download PDF

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ES2968880T3
ES2968880T3 ES19747792T ES19747792T ES2968880T3 ES 2968880 T3 ES2968880 T3 ES 2968880T3 ES 19747792 T ES19747792 T ES 19747792T ES 19747792 T ES19747792 T ES 19747792T ES 2968880 T3 ES2968880 T3 ES 2968880T3
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car
seq
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cell
amino acid
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ES19747792T
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Jianfeng Zhou
Junjian Liu
Guang Hu
Yongkun Yang
Guangrong Meng
Wenjing Gao
Yuyu Wang
Panpan Niu
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Nanjing Iaso Biotechnology Co Ltd
Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Original Assignee
Nanjing Iaso Biotechnology Co Ltd
Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
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Abstract

La invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) que puede unirse específicamente a una proteína BCMA que comprende un dominio estructural de unión a BCMA, un dominio transmembrana, un dominio coestimulador y un dominio de señalización intracelular. La invención también proporciona usos del CAR en el tratamiento de enfermedades o afecciones relacionadas con la expresión de BCMA. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une a BCMA, y usos del mismo
Campo técnico
La presente solicitud se refiere al campo de la biomedicina, y en particular a un receptor de antígeno quimérico que puede unirse específicamente a la proteína de BCMA.
Antecedentes
El antígeno de maduración de células B (BCMA), también conocido como CD269 o TNFRSF17, es un miembro de la familia de receptores de factor de necrosis tumoral. Estudios han mostrado que BCMA puede unirse con un receptor de factor de activación de células B (BAFF) y un ligando de inducción de la proliferación de células B (APRIL) para fomentar la supervivencia de células B en diferentes fases de desarrollo. Una transducción de señales anómala puede dar como resultado la proliferación anómala de células B, conduciendo a enfermedades autoinmunitarias y tumorigénesis (véase Rickert,et al.,Immunological Reviews, 2011, vol. 244: 115-133).
El receptor de antígeno quimérico (CAR) es un receptor de antígeno que está diseñado para identificar un antígeno de superficie celular de una manera independiente de antígenos de leucocitos humanos. Se han realizado algunos avances en los intentos por tratar a tales pacientes con células T que expresan CAR (CAR-T) (Molecular Therapy, 2010, 18:4, 666-668; Blood, 2008, 112: 2261-2271).
Dada la eficacia del BCMA que está usándose como diana terapéutica en tumores malignos de células B, y particularmente en mielomas múltiples, existe una urgente necesidad en la técnica de desarrollar una nueva terapia celular para lograr el objetivo de tratamiento actuando sobre le BCMA.
Sumario
La presente solicitud proporciona un receptor de antígeno quimérico que puede unirse específicamente al BCMA y una aplicación del mismo. El receptor de antígeno quimérico de BCMA proporcionado por la presente solicitud tiene una o más de las siguientes propiedades: 1) una afinidad superior por la proteína de BCMA; 2) el CAR puede expresarse de manera estable en células CAR-T que se preparan con el CAR; 3) una tasa positiva para CAR superior en las células CAR-T que se preparan con el CAR; 4) fomentar la liberación de citocinas mediante el CAR; 5) poder usarse para tratar enfermedades o estados asociados con la expresión de BCMA.
La presente invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR), en el que el CAR contiene un dominio de unión a BCMA, un dominio transmembrana, un dominio coestimulante y un dominio de transducción de señales intracelular, el dominio de unión a BCMA comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo que puede unirse de específicamente a un BCMA, y el anticuerpo contiene una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HCDR1), una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HCDR2) y una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3), en el que la HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, la HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y la HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y
el anticuerpo contiene una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LCDR1), una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LCDR2) y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LCDR3), y en el que la LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, la LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, y la LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, el anticuerpo contiene una región variable de cadena pesada, y la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, el anticuerpo contiene una región variable de cadena ligera, y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43.
En algunas realizaciones, el dominio transmembrana del CAR incluye dominios transmembrana derivados de proteínas seleccionadas de un grupo que consiste en cadena a, p o C del receptor de células T, CD28, CD3e, CD45, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
En algunas realizaciones, el dominio coestimulante del CAR incluye dominios coestimulantes derivados de proteínas seleccionadas de un grupo que consiste en CD28, 4-1BB, OX-40 e ICOS. En algunas realizaciones, el dominio coestimulante contiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 31.
En algunas realizaciones, el dominio de transducción de señales intracelular del CAR incluye un dominio de transducción de señales derivado de CD3^. En algunas realizaciones, el dominio de transducción de señales intracelular contiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
En algunas realizaciones, el CAR también contiene una región de bisagra que une el dominio de unión a BCMA al dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la región de bisagra contiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
En algunas realizaciones, el CAR también está unido a un péptido señal. En algunas realizaciones, el péptido señal contiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
En algunas realizaciones, el CAR también está unido a un péptido de escisión. En algunas realizaciones, el péptido de escisión contiene una secuencia de aminoácidos derivada de un péptido T2A. En algunas realizaciones, el péptido de escisión contiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
En algunas realizaciones, el CAR contiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 51. En otro aspecto, la presente solicitud comprende además una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para el CAR descrito en la presente solicitud.
En otro aspecto, la presente solicitud también incluye una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para el CAR, que contiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 52.
En otro aspecto, la presente solicitud también incluye un vector, que contiene la molécula de ácido nucleico de la presente solicitud. En algunas realizaciones, el vector se selecciona de un plásmido, un vector retroviral y un vector lentiviral.
En otro aspecto, la presente solicitud también comprende una célula efectora inmunitaria, que contiene el CAR de la presente solicitud, la molécula de ácido nucleico de la presente solicitud o el vector de la presente solicitud. En algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria se selecciona de un linfocito T y un linfocito citolítico natural (NK).
En otro aspecto, la presente solicitud también comprende un método de preparación de una célula efectora inmunitaria, que incluye introducir el vector de la presente solicitud en la célula efectora inmunitaria.
En otro aspecto, la presente solicitud incluye además una composición, que contiene la célula efectora inmunitaria de la presente solicitud.
En otro aspecto, la presente solicitud comprende además un uso del CAR, la molécula de ácido nucleico, el vector o la célula efectora inmunitaria en la preparación de fármacos usados para tratar enfermedades o estados asociados con la expresión de BCMA. En algunas realizaciones, las enfermedades o estados asociados con la expresión de BCMA son cánceres o tumores malignos.
Otros aspectos y ventajas de la presente solicitud resultarán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción detallada. Únicamente se muestran las realizaciones a modo de ejemplo de la presente solicitud y se describen en la siguiente descripción detallada. El contenido de la presente solicitud permite a los expertos en la técnica modificar las realizaciones específicas dadas a conocer sin alejarse del espíritu y alcance de la invención implicada en la presente solicitud, tal como constatarán los expertos en la técnica. Por consiguiente, se pretende que los dibujos de la presente solicitud y la descripción en la memoria descriptiva simplemente sean ilustrativos y no limitativos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A muestra la estructura del CAR de la presente solicitud.
La figura 1B muestra el nivel de expresión del CAR de la presente solicitud mediante la evaluación de señal de GFP. La figura 2A muestra un diagrama esquemático del procedimiento de transfectar de manera transitoria células T con los plásmidos de CAR de la presente solicitud; la figura 2B muestra la expresión de moléculas de CAR en las células T transfectadas de manera transitoria con los plásmidos de CAR de la presente solicitud.
La figura 3 muestra la expresión de moléculas de CAR en las células T transfectadas de manera transitoria con los plásmidos de CAR de la presente solicitud.
La figura 4 muestra resultados de un ensayo de determinación de título biológico para los plásmidos de CAR de la presente solicitud empaquetados con lentivirus.
La figura 5 muestra el crecimiento de las células CAR-T de la presente solicitud.
La figura 6 muestra resultados de la capacidad de las moléculas de CAR de las células CAR-T de la presente solicitud para unirse con la proteína de BCMA.
La figura 7 muestra resultados de análisis de FACS de pruebas de desgranulación de CD107a para las células CAR-T de la presente solicitud.
La figura 8 muestra resultados de una prueba de desgranulación de CD107a obtenidos tras la incubación de células CAR-T de la presente solicitud con diferentes células diana.
La figura 9 muestra resultados de una prueba de desgranulación de CD107a obtenidos tras la incubación de células CAR-T de la presente solicitud con diferentes células diana en una condición de competición de proteína de BCMA.
La figura 10 muestra resultados de ensayo de liberación de citocinas obtenidos tras la incubación conjunta de células CAR-T de la presente solicitud con células diana.
La figura 11 muestra resultados de un ensayo de función de células CAR-T a partir de diferentes donantes de la presente solicitud.
La figura 12 muestra efectos de destrucciónin vitrode células CAR-T de la presente solicitud frente a células diana.
La figura 13 muestra resultados de un experimento de modelo de ratón portador de tumor para determinar los efectos de destrucción de tumor de células CAR-T de la presente solicitud.
La figura 14 y la figura 15 muestran cambios de citocinas en modelos de ratón portador de tumor a los que se les administraron las células CAR-T de la presente solicitud.
La figura 16 muestra cambios de los números de copias de CAR en la sangre periférica de ratones portadores de tumor a los que se les administraron las células CAR-T de la presente solicitud.
La figura 17 muestra la evaluación para determinar los efectos terapéuticos de las células CAR-T de la presente solicitud en cuerpos de los sujetos que lo necesitan.
La figura 18 muestra cambios de los números de copias de CAR en la sangre periféricain vivode los sujetos de la presente solicitud.
Descripción detallada
A continuación en el presente documento se describirán las realizaciones de la invención de la presente solicitud mediante ejemplos específicos. Los expertos en la técnica pueden apreciar fácilmente otras ventajas y efectos de la invención de la presente solicitud a partir de la divulgación de la memoria descriptiva. El CAR de la presente solicitud puede unirse específicamente al BCMA, las células CAR-T que se preparan con el CAR pueden expresar de manera estable el CAR, y las células CAR-T que se preparan con el CAR tienen una tasa positiva para CAR superior. Además, el CAR puede fomentar la liberación de citocinas y puede usarse para tratar enfermedades o estados asociados con la expresión de BCMA.
Se adoptan los métodos de química convencional, bioquímica, química orgánica, biología molecular, microbiología, técnica de ADN recombinante, genética, inmunología y citobiología dentro de las habilidades de la técnica para implementar la presente solicitud a menos que se indique explícitamente lo contrario. La descripción de estos métodos pueden encontrarse, por ejemplo, en Sambrook,et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición, 2001); Sambrook,et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, 1989); Maniatis,et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel,et al.,Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, actualizado en julio de 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, Nueva York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow y Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; y revistas y monografías tales como Advances in Immunology.
A menos que se defina lo contrario, los significados de todos los términos tecnológicos y científicos usados en la presente solicitud son los mismos que los entendidos generalmente por los expertos habituales en la técnica. Para los fines de la presente solicitud, se definen los siguientes términos.
En la presente solicitud, el término “receptor de antígeno quimérico (CAR)” se refiere de manera general a una proteína de fusión que contiene un dominio extracelular que puede unirse con un antígeno y al menos un dominio intracelular. El CAR es una parte central de una célula T con receptor de antígeno quimérico (CAR-T) y puede contener un dominio de unión a antígeno (tal como un antígeno asociado a tumor (t Aa )), un dominio transmembrana, un dominio coestimulante y un dominio de señal intracelular. En la presente solicitud, el CAR puede combinarse con un dominio intracelular de activación de receptor de células T basado específicamente en el antígeno (tal como el BCMA) de un anticuerpo. Las células T que expresan CAR genéticamente modificadas pueden identificar y eliminar específicamente células malignas que expresan antígeno diana. La descripción del CAR y las células CAR-T puede encontrarse, por ejemplo, en Sadelain M, Brentjens R, Rivi'ere I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 2013; 3(4): 388-398; Turtle CJ, Hudecek M, Jensen MC, Riddell SR. Engineered T cells for anticancer therapy. Curr Opin Immunol. 2012; 24(5): 633-639; Dotti G, Gottschalk S, Savoldo B, Brenner MK. Design and development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing T cells. Immunol Rev. 2014; 257(1): 107-126; documentos WO2013154760 y WO2016014789.
En la presente solicitud, los términos “BCMA” y “antígeno de maduración de células B” pueden usarse de manera intercambiable y se refieren de manera general a una proteína codificada por el gen TNFRSF17. La proteína de BCMA es un miembro de la familia de receptores de factor de necrosis tumoral receptor. En la presente solicitud, el BCMA puede ser un BCMA humano, con el número de registro de GenBank de BAB60895.1. El BCMA es una proteína transmembrana de tipo III y presenta un dominio rico en cisteína (CRD) que caracteriza a los miembros de la familia de TNFR en el dominio extracelular (ECD), que forma un motivo de unión a ligando. Como biomarcador de células B, el BCMA se expresa en una célula tumoral (tal como una célula de mieloma múltiple) o ubicado en la superficie de una célula tumoral (por ejemplo, un plasmocito maligno de mieloma múltiple). La proteína de BCMA también puede comprender un fragmento del BCMA, tal como un dominio extracelular y un fragmento del mismo, tal como un dominio de unión, un dominio transmembrana, un dominio coestimulante y un dominio de transducción de señales intracelular y un fragmento que puede unirse con cualquier anticuerpo de la presente solicitud.
En la presente solicitud, el término “dominio de unión a BCMA” se refiere de manera general a un dominio que puede unirse específicamente a la proteína de BCMA. Por ejemplo, el dominio de unión a BCMA puede comprender un receptor de antígeno quimérico o un fragmento del mismo que puede unirse específicamente a un polipéptido de BCMA humano expresado en una célula B así como un anticuerpo anti-BCMA o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los términos “dominio de unión”, “dominio extracelular”, “dominio de unión extracelular”, “dominio de unión específico de antígeno” y “dominio de unión específico de antígeno extracelular” usados en la presente solicitud pueden usarse de manera intercambiable y proporcionan dominios de CAR o fragmentos que tienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno diana (tal como BCMA). El dominio de unión a BCMA puede derivarse de una fuente natural, una fuente sintética, una fuente semisintética o una fuente recombinante.
En la presente solicitud, el término “anticuerpo” se refiere de manera general a una molécula de polipéptido que puede identificar y/o neutralizar específicamente un antígeno específico. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender una inmunoglobulina que consiste en al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) que están conectadas entre sí mediante enlaces disulfuro, y comprender cualquier molécula que contiene una parte de unión a antígeno de la misma. El término “anticuerpo” comprende anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpo o derivados de anticuerpo, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de un único dominio (tales como dAb), anticuerpos de cadena sencilla (tales como scFv) y fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno (tales como fragmentos Fab, Fab' y (Fab)2). El término “anticuerpo” comprende además todas las formas recombinantes del anticuerpo, tales como un anticuerpo expresado en células procariotas, un anticuerpo no glicosilado, así como cualquier fragmento de anticuerpo de unión a antígeno y derivados de los mismos. Cada cadena pesada puede estar compuesta por una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera puede estar compuesta por una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera. La VH y la VL pueden dividirse adicionalmente en regiones hipervariables conocidas como regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que están dispersadas en regiones más conservadas conocidas como regiones de entramado (FR). Cada una de la VH y la VL puede estar compuesta por tres CDR y cuatro FR, que pueden estar dispuestas desde el extremo amino-terminal hasta el carboxi-terminal según el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las regiones variables de cadenas pesadas y cadenas ligeras comprenden un dominio de unión que interacciona con antígenos. Las regiones constantes del anticuerpo pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a un factor o tejido huésped que comprende una variedad de células (tales como células efectoras) del sistema inmunitario y un primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.
En la presente solicitud, el término “molécula de unión a antígeno” se refiere de manera general a una molécula que contiene una región de unión a antígeno o parte de unión a antígeno que puede unirse a un antígeno diana. Por ejemplo, la molécula de unión a antígeno puede ser una proteína o un polipéptido. En la presente solicitud, cuando el antígeno diana es un antígeno de maduración de células B (BCMA), la molécula de unión a antígeno que se une a BCMA también se denomina molécula de unión a BCMA. Las moléculas de unión a antígeno incluyen, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, anticuerpos de scFV de cadena sencilla, así como diversas funciones y conjugados construidos basándose en scFv (tales como anticuerpos de scFv-Fc, inmunoconjugados, conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC), anticuerpos multiespecíficos/biespecíficos y receptores de antígeno quiméricos (CAR)). Tal como conocen los expertos en la técnica, la parte de unión a antígeno del anticuerpo comprende generalmente un residuo de aminoácido derivado de las “regiones determinantes de la complementariedad” o “CDR”. En algunos casos, “molécula de unión a BCMA” y “anticuerpo de la presente solicitud” o “anticuerpo anti-BCMA” pueden usarse de manera intercambiable según el contexto.
En la presente solicitud, el término “fragmento de anticuerpo de cadena sencilla” puede ser un anticuerpo que está formado por las regiones variables de cadena pesada y las regiones variables de cadena ligera conectadas mediante un péptido de conexión.
En la presente solicitud, el término “dominio transmembrana” se refiere de manera general a un dominio en el CAR que pasa a través de la membrana celular y está unido al dominio de transducción de señales intracelular, que desempeña una función de señalización.
En la presente solicitud, el término “dominio coestimulante” se refiere de manera general a un dominio intracelular que puede proporcionar una molécula inmunocoestimulante, y la molécula inmunocoestimulante es una molécula de superficie celular requerida en la respuesta eficaz de linfocitos frente a un antígeno. El dominio coestimulante mencionado puede incluir un dominio coestimulante de CD28, y también puede incluir dominios coestimulantes de la familia de receptores de TNF, tales como dominios coestimulantes de OX40 y 4-1BB.
En la presente solicitud, el término “región de bisagra” se refiere de manera general a una región de conexión entre una región de unión a antígeno y una región de unión a receptor de Fc de inmunocitos (FcR).
En la presente solicitud, el término “etiqueta de HA” se refiere de manera general a una etiqueta de proteína basada en un antígeno de hemaglutinina de influenza humana, y su naturaleza química es una secuencia de aminoácidos corta derivada de los aminoácidos de hemaglutinina de influenza humana 98-106. Tras adoptarse un método de biología molecular para realizar el corte y empalme de la secuencia de etiqueta de HA a un extremo terminal de una proteína diana, puede usarse un anticuerpo específico anti-etiqueta de HA para unirse con la proteína recombinante, lo cual resulta favorable para la realización de experimentos tales como inmunohistoquímica (IHC), inmunotransferencia de tipo Western, etc. (véase Schembri, Laura,et al.,The HA tag is cleaved and loses immunoreactivity during apoptosis. Nature Methods, febrero de 2007, 4 (2): 107-108).
En la presente solicitud, el término “dominio de transducción de señales intracelular” se refiere de manera general a un dominio que está ubicado dentro de una célula y puede transducir señales. En la presente solicitud, el dominio de transducción de señales intracelular puede transducir señales al interior de la célula. Por ejemplo, el dominio de transducción de señales intracelular es un dominio de transducción de señales intracelular del receptor de antígeno quimérico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el dominio de transducción de señales intracelular puede seleccionarse de un grupo que consiste en un dominio intracelular de CD3^, un dominio intracelular de CD28, un dominio intracelular de CD28, un dominio intracelular de 4-1BB y un dominio intracelular de OX40.
En la presente solicitud, el término “péptido señal” se refiere de manera general a una cadena peptídica para guiar la transferencia de proteína. En algunas realizaciones, el péptido señal puede ser una cadena peptídica corta, que puede tener una longitud de 5 a 30 aminoácidos.
En la presente solicitud, el término “péptido de escisión” se refiere a un tipo de polipéptidos que puede implementar una función de escisión de proteínas. Por ejemplo, el péptido de escisión puede lograr la escisión de proteínas mediante salto de ribosoma en vez de hidrólisis de proteasa. Por ejemplo, el péptido de escisión mencionado puede ser péptidos de escisión 2A que pueden incluir T2A, F2A, P2A, etc.
En la presente solicitud, el término “señal de detección de marcador” se refiere de manera general a un gen, una proteína u otras moléculas con funciones y secuencias conocidas que pueden desempeñar la función de un marcador específico y emitir señales detectables. La señal de detección de marcador puede ser proteínas fluorescentes, tales como GFP, RFP, YFP, etc. La señal de detección de marcador mencionada puede ser EGFRt.
En la presente solicitud, el término “EGFRt” se refiere de manera general a un gen que codifica para un polipéptido de receptor de factor de crecimiento epidérmico humano truncado. El EGFRt carece de un dominio de unión a e Gf distal de membrana y una cola de transducción de señales citoplasmática, pero mantiene un epítopo extracelular identificado mediante un anticuerpo anti-EGFR. El EGFRt puede usarse como herramienta de selección no inmunogénica con una función de modificar genéticamente células y un marcador de seguimiento. En la presente solicitud, el EGFRt puede servir como molécula de marcador para una célula CAR-T. El EGFRt mencionado puede eliminar la ruta de ADCC mediada por cetuximab para las células CAR-T en el organismo si es necesario (véase el documento US8802374B2).
En la presente solicitud, el término “secuencia de Kozak” se refiere de manera general a una secuencia de (gcc)gccRccAUGG que es común en los ARNm de eucariotas. La secuencia de Kozak desempeña una función importante en el inicio del proceso de traducción y se identifica como sitio de iniciación de la traducción por los ribosomas (véase De Angioletti M,et al.,a novel silent beta-thalassaemia mutation, the first in the Kozak sequence. Br J Haematol. 2004, 124 (2): 224-31).
En la presente solicitud, el término “aislado” significa de manera general un anticuerpo que se ha separado a partir de sus componentes en el entorno natural. En algunas realizaciones, el anticuerpo se purifica para tener una pureza superior al 95% o al 99%, lo cual se determina, por ejemplo, mediante electroforesis (tal como SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF) o electroforesis capilar) o cromatografía (tal como HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). El resumen del método para evaluar la pureza de anticuerpo puede encontrarse en Flatman, S.et al,J. Chrom. B 848 (2007) 79-87.
En la presente solicitud, el término “molécula de ácido nucleico” se refiere de manera general a un nucleótido, desoxirribonucleótido o ribonucleótido aislado o un análogo de los mismos de cualquier longitud. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico de la presente solicitud puede aislarse a partir del entorno natural. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico de la presente solicitud puede producirse o sintetizarse mediante los siguientes métodos: (i) amplificaciónin vitro,tal como amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR); (ii) clonación y recombinación; (iii) purificación, tal como digestión y fraccionamiento por electroforesis en gel; (4) síntesis, tal como síntesis química. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado es una molécula nucleica preparada mediante tecnología de ADN recombinante. En la presente solicitud, el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede prepararse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, adoptar operación por fragmentos de restricción o PCR de extensión por solapamiento de oligonucleótido sintetizado. La operación específica puede encontrarse en Sambrook,et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; y Ausube,et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York N.Y., 1993.
En la presente solicitud, el “vector” se refiere de manera general a una molécula de ácido nucleico que puede autorreplicarse en un huésped adecuado, y se usa para transferir las moléculas de ácido nucleico insertadas en células huésped y/o la sustancia intercelular entre células huésped. El vector puede comprender un vector usado principalmente para insertar ADN o ARN en células, un vector usado principalmente para replicar ADN o ARN, y un vector usado principalmente para la expresión de transcripción y/o traducción de ADN o ARN. El vector incluye además un vector con una variedad de las funciones anteriormente mencionadas. El vector puede ser un polinucleótido que puede transcribirse y traducirse para dar un polipéptido cuando se introduce en una célula huésped adecuada. Generalmente, el vector puede producir un producto de expresión deseable cultivando la célula huésped adecuada que contiene el vector. En la presente solicitud, el vector puede contener uno o más tipos de las moléculas de ácido nucleico. Además, el vector puede contener además otros genes, por ejemplo, un gen de marcador que permite seleccionar el vector en una célula huésped adecuada y una condición apropiada. Además, el vector también puede contener un elemento de control de la expresión que permiten expresar correctamente la región codificante en un huésped adecuado. Un elemento de control de este tipo lo conocen bien los expertos en la técnica y, por ejemplo, puede incluir un promotor, un sitio de unión al ribosoma, un potenciador y otros elementos de control para regular la transcripción génica o traducción de ARNm. En algunas realizaciones, la secuencia de control de la expresión es un elemento regulable. La estructura específica de la secuencia de control de la expresión puede variar según las funciones de especies o tipos de células, pero generalmente contiene una secuencia no transcrita en 5' y secuencias no traducidas en 5' y 3' que participan en la iniciación de la transcripción y la iniciación de la traducción respectivamente, tales como una caja de TATA, una secuencia con los centros reactivos ocupados, una secuencia de CAAT, etc. Por ejemplo, la secuencia de control de la expresión no transcrita en 5' puede contener una región de promotor, que puede comprender una secuencia de promotor para transcribir y controlar ácidos nucleicos funcionalmente unidos. El vector de la presente solicitud puede seleccionarse de un plásmido, un vector retroviral y un vector lentiviral. El plásmido, vector retroviral y vector lentiviral de la presente solicitud pueden contener el CAR.
En la presente solicitud, el término “plásmido” se refiere de manera general a una molécula de ADN distinta de cromosomas o nucleoides en organismos tales como bacterias, sacaromicetos, etc. Los plásmidos, que pueden existir en el citoplasma, tienen la capacidad de autorreplicarse, de modo que puede mantenerse un número constante de copias de los mismos en células descendientes y puede expresarse la información genética portada. Los plásmidos pueden usarse como vectores para genes en investigaciones de ingeniería genética.
En la presente solicitud, el término “vector retroviral” se refiere de manera general a un virión que puede clonar y expresar genes exógenos, pero no puede autoempaquetarse para tener la capacidad de proliferación. La mayoría de tales virus tienen transcriptasa inversa. Un retrovirus comprende al menos tres tipos de genes:gag,que comprende un gen para proteínas que forman el núcleo viral y la estructura;pol,que comprende un gen para transcriptasa inversa yenv,que comprende n gen que forma la cubierta del virus. El genoma del propio vector retroviral y un gen exógeno portado por el mismo pueden integrarse de manera aleatoria y estable en el genoma de una célula huésped mediante la transfección de retrovirus, por ejemplo, la molécula de CAR puede integrarse en la célula huésped.
En la presente solicitud, el término “vector lentiviral” se refiere de manera general a un vector viral de ARN diploide que pertenece a los retrovirus. El vector lentiviral es un vector que se prepara retirando múltiples estructuras de secuencia asociadas con actividad de virus en el genoma de n lentivirus para proporcionar al genoma seguridad biológica y después introduciendo la estructura de secuencia y expresión de un gen diana necesario por un experimento en este entramado de genoma. El genoma del propio vector retroviral y un gen exógeno portado por el mismo pueden integrarse de manera aleatoria y estable en el genoma de una célula huésped mediante la transfección de vector lentiviral, por ejemplo, la molécula de CAR puede integrarse en la célula huésped.
En la presente solicitud, el término “transposón” se refiere de manera general a un fragmento de ADN discreto que contiene un gen de transposasa. Las secuencias flanqueantes son repeticiones invertidas terminales (TIR) que contienen sitios de unión a transposasa. La transposasa puede unirse con una TIR y transferir el transposón a un nuevo sitio. El transposón de la presente solicitud es un sistema de dobles componentes compuesto por un plásmido que porta CAR (transposón) y un plásmido que porta transposasa. El transposón puede introducirse en una célula diana mediante transducción eléctrica u otros métodos. Por ejemplo, en primer lugar se someten los dos componentes a electroporación al interior de una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC) y la transposasa expresada actúa sobre las repeticiones invertidas terminales (TIR) a ambos lados del CAR, de modo que se corta el CAR (transposón) y después se integra sobre la secuencia de dinucleótido de TA en el genoma de la célula diana (tal como una célula T). Tras completarse la transposición y la integración estable en el genoma, puede expresarse una proteína CAR sobre la superficie de la célula diana (véase Cheng Zhang, Jun Liu, Jiang F Zhong,et al.Engineering CAR-T cells. Biomarker Research. 2017, 5: 22).
En la presente solicitud, el término “edición génica” se refiere de manera general a una técnica par la modificación dirigida al sitio de un genoma seleccionado como diana. La edición génica puede incluirtécnicas basadas en nucleasas de dedos de cinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas/Cas9 asociada a CRISPR, (CRISPR/Cas9), etc. La edición génica puede lograr la modificación dirigida altamente eficiente en un genoma añadiendo, retirando o cambiando el material genético en una posición específica de un genoma. La edición génica de la presente solicitud puede comprender introducir la molécula de CAR en el genoma de una célula receptora mediante una técnica de edición génica (tal como CRISPR-Cas9).
En la presente solicitud, el término “célula efectora inmunitaria” se refiere de manera general a un inmunocito que participa en retirar antígenos foráneos y realizar una función efectora en la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula efectora inmunitaria puede ser un plasmocito, una célula T citotóxica, una célula NK, una célula pluripotente APSC, un mastocito, etc.
En la presente solicitud, el término “adyuvante farmacéuticamente aceptable” se refiere de manera general a un vector de preparación, disolución o aditivo farmacéuticamente aceptable para potenciar las propiedades de preparación. Tales aditivos los conocen bien los expertos en la técnica.
En la presente solicitud, el término “cáncer” se refiere de manera general a una enfermedad provocada por la anomalía del mecanismo para controlar la proliferación celular. En la presente solicitud, las enfermedades hiperproliferativas conocidas como cánceres incluyen, pero no se limitan a, tumores sólidos, tales como cánceres que se producen en las mamas, vías respiratorias, cerebros, órganos reproductores, canales alimentarios, uretras, ojos, hígados, pieles, cabezas y cuellos, glándulas tiroideas y glándulas paratiroideas, así como metástasis distantes de los mimos. Tales enfermedades también incluyen linfomas, sarcomas y leucemias. Los ejemplos de cánceres de mama incluyen, pero no se limitan a, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo, carcinoma ductalin situy carcinoma lobularin situ.Los ejemplos de cánceres de las vías respiratorias incluyen, pero no se limitan a, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenoma bronquial y blastoma pleuropulmonar. Los ejemplos de cánceres de cerebro incluyen, pero no se limitan a, gliomas de tronco encefálico y del hipotálamo, astrocitomas cerebelar y cerebral, meduloblastoma, ependimoma y tumores neuroectodérmicos y pineales. Las neoplasias genitales masculinas incluyen, pero no se limitan a, cánceres de próstata y cánceres de testículos. Las neoplasias genitales femeninas incluyen, pero no se limitan a, cáncer endometrial, cáncer del cuello uterino, cáncer de ovarios, cáncer vaginal, cáncer vulvar e histeroma. Los tumores gastrointestinales incluyen, pero no se limitan a, cáncer anal, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer rectal, cáncer del intestino delgado y cáncer de la glándula salivar. Los tumores uretrales incluyen, pero no se limitan a, cáncer de vejiga, cáncer de pene, carcinoma renal, carcinoma pélvico renal, cáncer ureteral y cáncer uretral. Los cánceres oculares incluyen, pero no se limitan a, melanoma intraocular y retinoblastoma. Los ejemplos de cánceres de hígado incluyen, pero no se limitan a, carcinoma hepatocelular (carcinoma hepatocelular con o sin variación fibrolamelar), colangiocarcinoma (colangiocarcinoma intrahepático) y colangiocarcinoma hepatocelular combinado. Los cánceres de la piel incluyen, pero no se limitan a, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, carcinoma de células de Merkel y cánceres de la piel distintos de melanoma. Los cánceres de cabeza y cuello incluyen, pero no se limitan a, carcinomas de laringe/hipofaringe/nasofaringe/orofaringe, así como cánceres de labios y orales. Los linfomas incluyen, pero no se limitan a, linfoma asociado con SIDA, linfoma no Hodgkin, linfoma cutáneo de células T, enfermedad de Hodgkin y linfoma del sistema nervioso central. Los sarcomas incluyen, pero no se limitan a, sarcoma de tejidos blandos, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, linfosarcoma y rabdomiosarcoma. Las leucemias incluyen, pero no se limitan a, leucemia mieloide agua, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocítica crónica y leucemia de células pilosas.
El término “y/o” debe entenderse como una cualquiera de las opciones o ambas de las opciones.
Tal como se usa en la presente solicitud, se pretende que el término “comprender” o “incluir” abarque los elementos, números enteros o etapas descritos, pero no excluye cualquier otro elementos, números enteros o etapas. En la presente solicitud, cuando se usa el término “comprender” o “incluir”, abarca un caso compuesto por los elementos, números enteros o etapas a menos que se especifique lo contrario. Por ejemplo, cuando se refiere a “que comprende” la región variable de anticuerpo de una determinada secuencia específica, también se pretende cubrir una región variable de anticuerpo compuesta por la secuencia específica.
En la presente solicitud, el término “aproximadamente” se refiere de manera general a una variación dentro de un intervalo del 0,5%-10% por encima o por debajo de un valor especificado, por ejemplo, una variación dentro de un intervalo del 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5% o 10% por encima o por debajo de un valor especificado.
Receptor de antígeno quimérico
En la presente solicitud, el CAR puede comprender un dominio extracelular que puede unirse específicamente a un BCMA, un dominio transmembrana, un dominio de transducción de señales coestimulante intracelular, y un dominio de transducción de señales intracelular. En la presente solicitud, el dominio extracelular del CAR puede comprender el fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) de la presente solicitud. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo de cadena sencilla puede estar unido al dominio transmembrana a través de una región de bisagra (tal como una bisagra de CD8). En la presente solicitud, el CAR puede usarse para transducir una célula efectora inmunitaria (tal como una célula T) y expresarse sobre la superficie celular. Por tanto, la presente solicitud también puede proporcionar una célula T que expresa el receptor de antígeno quimérico, así como un uso de la célula T y/o el CAR en la preparación de fármacos para tratar enfermedades asociadas con células B.
En la presente solicitud, el receptor de antígeno quimérico (CAR) comprende un dominio de unión a BCMA, un dominio transmembrana, un dominio coestimulante y un dominio de transducción de señales intracelular.
En la presente solicitud, el dominio de unión a BCMA comprende un fragmento de anticuerpo que puede unirse específicamente a un BCMA, y el anticuerpo comprende una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HCDR1), una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HCDR2) y una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3), en el que las HCDR 1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9-11 en secuencia; el anticuerpo también comprende una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LCDR1), una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LCDR2) y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LCDR3), y las LCDR 1-3 pueden comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17-19 en secuencia. En la presente solicitud, el anticuerpo puede comprender una región variable de cadena pesada que puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. En la presente solicitud, el anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera que puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
En la presente solicitud, el anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo de cadena sencilla puede incluir scFv0026 con una secuencia de SEQ ID NO: 43.
Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo de cadena sencilla de la presente solicitud puede ser scFv0026 con una secuencia de SEQ ID NO: 43. Las LCDR 1-3 de el fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv0026) comprenden<una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y>S<e>Q<ID NO: 19 respectivamente; la VL comprende>una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; las HCDR 1-3 comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ<ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 respectivamente; y la v>H<comprende una secuencia de aminoácidos de>SEQ ID NO: 7.
El CAR de la presente solicitud puede comprender un dominio transmembrana, y el dominio transmembrana puede comprender un dominio transmembrana derivado de proteínas seleccionadas de un grupo que consiste en la cadena a, p o C del receptor de células T, CD28, CD3e, CD45, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En la presente solicitud, el dominio transmembrana puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. Por ejemplo, el dominio transmembrana de la presente solicitud puede comprender un dominio transmembrana de CD8a, con una secuencia de SEQ ID NO: 27.
En la presente solicitud, el dominio coestimulante puede comprender un dominio coestimulante derivado de proteínas<seleccionadas de un grupo que consiste en c>D28,<4-1BB, OX40 e ICOS. En la presente solicitud, el dominio>coestimulante puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 31.
El CAR de la presente solicitud puede contener un dominio de transducción de señales intracelular, y el dominio de transducción de señales intracelular puede incluir un dominio de transducción de señales derivado de CD3C. En la presente solicitud, el dominio de transducción de señales intracelular puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
El CAR de la presente solicitud puede contener una región de bisagra que une el anticuerpo y el dominio transmembrana. En la presente solicitud, la región de bisagra puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
El CAR de la presente solicitud también puede comprender una etiqueta de HA que puede estar ubicada en el extremo N-terminal del CAR. En la presente solicitud, la etiqueta de HA puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En la presente solicitud, puede usarse un anticuerpo anti-HA para unirse específicamente con el CAR para someter a ensayo la expresión del CAR de la presente solicitud y enriquecer la célula CAR-T para un estudio de funcionalidad.
El CAR de la presente solicitud puede estar unido a un péptido señal que puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, el péptido señal puede ser un péptido señal de CD8a con una secuencia de SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, CAR0037, CAR0085 y CAR0087 pueden estar unidos al péptido señal de CD8a.
En la presente solicitud, el CAR también pueden estar unido a un péptido de escisión. En la presente solicitud, el péptido de escisión puede comprender una secuencia de aminoácidos derivada de un péptido T2A. En la presente solicitud, el péptido de escisión puede comprender una secuencia de aminoácidos que puede comprender SEQ ID NO: 35. Por ejemplo, el péptido de escisión puede ser un T2A con una secuencia de SEQ ID NO: 35. Por ejemplo, CAR0037 y CAR0087 pueden estar unidos al péptido de escisión T2A.
En la presente solicitud, el CAR también puede estar unido a una señal de detección de marcador que puede estar ubicada en el extremo C-terminal del CAR. En la presente solicitud, la señal de detección de marcador puede ser una proteína fluorescente, que puede seleccionarse de un grupo que consiste en GFP, RFP e YFP. En la presente solicitud, la expresión de moléculas de CAR puede evaluarse indirectamente detectando la señal de GFP. Por ejemplo, el CAR puede comprender CAR0037 con una secuencia de señal de detección de marcador de SEQ ID NO: 37. En la presente solicitud, la señal de detección de marcador puede ser EGFRt. Por ejemplo, CAR0087 puede estar unido a una señal de detección de marcador con una secuencia de SEQ ID NO: 39.
En la presente solicitud, el CAR puede estar unido a una secuencia de Kozak con una secuencia de SEQ ID NO: 1. En la presente solicitud, el CAR puede estar unido a una secuencia de Kozak que puede estar ubicada en el extremo N-terminal del CAR. Por ejemplo, CAR0037, CAR0085 o CAR0087 pueden estar unidos a una secuencia de Kozak con una secuencia de SEQ ID NO: 1.
En la presente solicitud, el CAR puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 51. Por ejemplo, el CAR puede seleccionarse de CAR0037 con una secuencia de SEQ ID NO: 49. Como otro ejemplo, el CAR puede seleccionarse de CAR0085 con una secuencia de SEQ ID NO: 51; y el CAR puede seleccionarse de CAR0087 con una secuencia de SEQ ID NO: 51.
En determinadas realizaciones, el CAR de la presente solicitud puede comprender, desde su extremo N-terminal, un dominio de unión a BCMA, un dominio transmembrana, un dominio coestimulante y un dominio de transducción de señales intracelular en secuencia. El CAR puede comprender un dominio de unión a BCMA, y el dominio de unión a BCMA comprende una secuencia de SEQ ID NO: 43. El dominio de unión a BCMA comprende las HCDR 1-3 con las secuencias de SEQ ID NO: 9-11 en secuencia, y el dominio de unión a BCMA comprende las LCDR 1-3 con las secuencias de SEQ ID NO: 17-19 en secuencia. Por ejemplo, el CAR puede comprender CAR0037 o el CAR de la presente solicitud que tiene las mismas LCDR 1-3 y HCDR 1-3 que CAR0037. El dominio de unión a BCMA puede comprender una región variable de cadena pesada con una secuencia de SEQ ID NO: 7; y el dominio de unión a BCMA también puede comprender una región variable de cadena ligera con una secuencia de SEQ ID NO: 15. Por ejemplo, el CAR puede comprender CAR0037 o el CAR de la presente solicitud que tiene la misma región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada que CAR0037. Un péptido de conexión también puede estar comprendido entre la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada, que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 23. Por ejemplo, el CAR puede comprender CAR0037 o el CAR de la presente solicitud que tiene el mismo péptido de conexión que CAR0037. El dominio transmembrana puede comprender un dominio transmembrana derivado de CD8a, con una secuencia de SEQ ID NO: 27. Por ejemplo, el CAR puede comprender CAR0037 o un CAR de la presente solicitud que tiene el mismo dominio transmembrana que CAR0037. El dominio coestimulante puede comprender un dominio coestimulante derivado de CD28, con una secuencia de SEQ ID NO: 29. Por ejemplo, el CAR puede comprender CAR0037 o el CAR de la presente solicitud que tiene el mismo dominio coestimulante que CAR0037. El dominio de transducción de señales intracelular puede comprender un dominio de transducción de señales derivado de CD3^, con una secuencia de SEQ ID NO: 33. Por ejemplo, el CAR puede comprender CAR0037 o un CAR de la presente solicitud que tiene el mismo dominio de transducción de señales intracelular que CAR0037.
El CAR también puede comprender una región de bisagra que puede estar ubicada en el extremo C-terminal del dominio de unión a BCMA y el extremo N-terminal del dominio transmembrana, y la región de bisagra tiene una secuencia de SEQ ID NO: 25. Por ejemplo, el CAR puede comprender CAR0037 o un CAR de la presente solicitud que tiene la misma región de bisagra que CAR0037.
El CAR también puede estar unido a una etiqueta de HA que puede estar ubicada en el extremo N-terminal del dominio de unión a BCMA, y la etiqueta de HA tiene una secuencia de SEQ ID NO: 5. Por ejemplo, el CAR puede comprender CAR0037 o un CAR de la presente solicitud que tiene la misma etiqueta de HA que CAR0037.
El CAR también puede estar unido a un péptido señal que puede estar ubicado en el extremo N-terminal del CAR, y el péptido señal tiene una secuencia de SEQ ID NO: 3.
El CAR también puede estar unido a un péptido de escisión tal como T2A. El péptido de escisión puede estar ubicado en el extremo C-terminal del dominio de transducción de señales intracelular, y el péptido de escisión tiene una secuencia de SEQ ID NO: 35. El CAR también puede estar unido a una señal de detección de marcador que puede estar ubicada en el extremo C-terminal del CAR (o el péptido de escisión). La señal de detección de marcador puede seleccionarse de un grupo que consiste en GFP, RFP e YFP, y la señal de detección de marcador comprende una secuencia de SEQ ID NO: 37.
Por ejemplo, el CAR de la presente solicitud puede ser CAR0037, y las LCDR 1-3 comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19 respectivamente; la VL comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; las HCDR 1-3 comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 respectivamente; la VH comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; el péptido de conexión entre la VH y la VL comprende una secuencia de SEQ ID NO: 23; su región de bisagra comprende una secuencia de SEQ ID NO: 25; su dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; su dominio coestimulante es un dominio coestimulante de CD28, con una secuencia de SEQ ID NO: 29; su dominio de transducción de señales intracelular de CD3^ comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; el CAR0043 también puede comprender un péptido de escisión de SEQ ID NO: 35 y una señal de detección de marcador de GFP de SEQ ID NO: 37; y el CAR0037 también puede comprender una secuencia de KOZAK de SEQ<ID NO: 1, un péptido señal de CD8a de SEQ ID NO: 3, y una etiqueta de>H<a de SEQ ID NO: 5.>
Por ejemplo, el CAR de la presente solicitud puede ser CAR0085, y las LCDR 1-3 comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19 respectivamente; la VL comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; las HCDR 1-3 comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 respectivamente; la VH comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; el péptido de conexión entre la VH y la VL comprende una secuencia de SEQ ID NO: 23; su región de bisagra comprende una secuencia de SEQ ID NO: 25; su dominio transmembrana comprende una secuencia de SEQ ID NO: 27; su<dominio coestimulante es un dominio coestimulante de 4-1BB de s>E<q ID NO: 31; su dominio de transducción de>señales intracelular de CD3^ comprende una secuencia de SEQ ID NO: 33; el CAR0085 también puede comprender una secuencia de KOZAK de SEQ ID NO: 1 y un péptido señal de CD8a de SEQ ID NO: 3.
Por ejemplo, el CAR de la presente solicitud puede ser CAR0087, y las LCDR 1-3 comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19 respectivamente; la VL comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; las HCDR 1-3 comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 respectivamente; la VH comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; el péptido de conexión entre la VH y la VL comprende una secuencia de SEQ ID NO: 23; su región de bisagra comprende una secuencia de SEQ ID NO: 25; su dominio transmembrana comprende una secuencia de SEQ ID NO: 27; su<dominio coestimulante es un dominio coestimulante de 4-1BB de s>E<q ID NO: 31; su dominio de transducción de>señales intracelular CD3^ comprende una secuencia de SEQ ID NO: 33; el CAR0085 también puede comprender un péptido de escisión de SEQ ID NO: 35 y una señal de detección de marcador de EGFRt de SEQ ID NO: 39; y el CAR0087 también puede comprender una secuencia de KOZAK de SEQ ID NO: 1 y un péptido señal de CD8a de SEQ ID NO: 3.
También debe entenderse que las proteínas, los polipéptidos y/o las secuencias de aminoácidos implicados en la presente solicitud incluyen al menos variantes funcionales u homólogos que tienen funciones iguales o similares a las proteínas o los polipéptidos.
En la presente solicitud, las variantes funcionales pueden ser proteínas o polipéptidos que se obtienen sustituyendo, delecionando o añadiendo uno o más aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de las proteínas y/o polipéptidos anteriores (tales como anticuerpos que pueden unirse específicamente con el BCMA o fragmentos de los mismos). Por ejemplo, las variantes funcionales pueden incluir proteínas o polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos diferentes debido a sustitución, deleción y/o inserción de al menos un aminoácido, tal como de 1 a 30, de 1 a 20 o de 1 a 10, o tal como 1, 2, 3, 4 o 5. Las variantes funcionales pueden conservar sustancialmente las características biológicas de las proteínas o los polipéptidos que no están modificados (sustitución, deleción o adición). Por ejemplo, las variantes funcionales pueden conservar al menos el 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de la actividad biológica (tal como capacidad de unión a antígeno) de las proteínas o polipéptidos originales. Por ejemplo, la sustitución puede ser una conservativa.
En la presente solicitud, los homólogos pueden ser proteínas o polipéptidos que tienen al menos aproximadamente el 85% (tal como al menos aproximadamente el 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más) de homología de secuencia de aminoácidos con las proteínas y/o polipéptidos anteriores (tales como anticuerpos que pueden unirse específicamente con el BCMA o fragmentos de los mismos).
En la presente solicitud, la homología se refiere de manera general a la igualdad, similitud o correlación entre dos o más secuencias. El “porcentaje de homología de secuencia” puede calcularse mediante el siguiente método: dos secuencias que van a compararse se comparan en un intervalo de comparación para determinar el número de posiciones que tienen la misma base de ácido nucleico (tal como A, T, C, G e I) o los mismos residuos de aminoácido (tales como Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) en las dos secuencias de modo que se obtiene el número de posiciones coincidentes; después se divide el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en el intervalo de comparación (es decir, el tamaño de intervalo); y se multiplica el resultado por 100 para obtener el porcentaje de homología de secuencia. La comparación para determinar el porcentaje de homología de secuencia puede llevarse a cabo mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando un software informático disponible para el público tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para la comparación de secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para implementar una comparación máxima dentro de intervalos de secuencia de longitud completa comparados o regiones de secuencia diana. La homología también puede determinarse mediante los siguientes métodos: FASTA y BLAST. La descripción del algoritmo de FASTA puede encontrarse en “ Improved Tools for Biological Sequence Comparison” de W. R. Pearson y D. J. Lipman, Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America (Proc. Natl. Acad. Sci.) , 85: 2444-2448, 1988; y “Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches” de D. J. Lipman yW. R. Pearson, Science, 227: 1435-1441, 1989. La descripción del algoritmo de BLAST puede encontrarse en “A Basic Local Alignment Search Tool” de S. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers y D. Lipman, Journal of Molecular Biology, 215: 403-410, 1990.
Ácido nucleico, vector, célula, método de preparación y composición
En otro aspecto, la presente solicitud proporciona una molécula de ácido nucleico aislada, que codifica para el CAR de la presente solicitud. La molécula de ácido nucleico aislada que codifica para el CAR de la presente solicitud puede comprender una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 52 o variantes funcionales de las mismas. La molécula de ácido nucleico de la presente solicitud puede aislarse. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede producirse o sintetizarse mediante los siguientes métodos: (i) amplificaciónin vitro,tal como amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR); (ii) clonación y recombinación; (iii) purificación, tal como digestión y separación por electroforesis en gel; o (iv) síntesis, tal como síntesis química. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada se prepara mediante la tecnología de ADN recombinante.
En otro aspecto, la presente solicitud proporciona un vector, que contiene la molécula de ácido nucleico. En la presente solicitud, el vector puede seleccionarse de uno o más de un plásmido, un vector retroviral y un vector lentiviral. El vector lentiviral de la presente solicitud puede comprender el CAR. Por ejemplo, el vector lentiviral de la presente solicitud puede comprender una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 50 y/o SEQ ID NO: 52 o variantes funcionales de las mismas. Además, el vector también puede contener otros genes, por ejemplo, un gen de marcador que permite seleccionar el vector en una célula huésped adecuada y en una condición apropiada. Además, el vector también puede contener un elemento de control de la expresión que permite expresar correctamente la región codificante en un huésped adecuado. Un elemento de control de este tipo lo conocen bien los expertos en la técnica y, por ejemplo, puede incluir un promotor, un sitio de unión al ribosoma, un potenciador y otros elementos de control para regular la transcripción génica o traducción de ARNm. En algunas realizaciones, la secuencia de control de la expresión es un elemento regulable. La estructura específica de la secuencia de control de la expresión puede variar según las funciones de especies o tipos de células, pero generalmente contiene una secuencia no transcrita en 5' y secuencias no traducidas en 5' y 3' que participan en la iniciación de la transcripción y la iniciación de la traducción respectivamente, tales como una caja de TATA, una secuencia con los centros reactivos ocupados, una secuencia de CAAT, etc. Por ejemplo, la secuencia de control de la expresión no transcrita en 5' puede contener una región de promotor, que puede comprender una secuencia de promotor para transcribir y controlar ácidos nucleicos funcionalmente unidos. La una o más moléculas de ácido nucleico de la presente solicitud pueden estar operativamente unidas al elemento de control de la expresión. El vector puede incluir, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos u otros vectores habitualmente usados, por ejemplo, en ingeniería genética. Por ejemplo, el vector es un vector de expresión, que incluye un plásmido de scFv de vector y/o un plásmido de CAR.
En algunas realizaciones, el vector implicado con virus puede ser un vector lentiviral que puede comprender plásmidos de scFv de vector y/o plásmidos de c Ar . Por ejemplo, el virus puede ser un lentivirus LV0002, que puede comprender un plásmido de scFv de vector PXL0008 que puede comprender una molécula de ácido nucleico scFv0008, y/o un plásmido de CAR PXL0009 que puede comprender una molécula de ácido nucleico CAR0009. Por ejemplo, el virus puede ser un lentivirus LV0011, que puede comprender un plásmido de scFv de vector PXL0008 que puede comprender una molécula de ácido nucleico scFv0008, y/o un plásmido de CAR PXL0041 que puede comprender una molécula ácido nucleico CAR0041. Por ejemplo, el virus puede ser un lentivirus LV0007, que puede ser un plásmido de scFv de vector PXL0026 que puede comprender un ácido nucleico scFv0026, y/o un plásmido de CAR PXL0037 que puede comprender un ácido nucleico CAR0037. Por ejemplo, el virus puede ser un lentivirus LV0020, que puede ser un plásmido de scFv de vector PXL0026 que puede comprender un ácido nucleico scFv0026, y/o un plásmido de CAR PXL0085 que puede comprender un ácido nucleico CAR0085. Por ejemplo, el virus puede ser un lentivirus LV0021, que puede un plásmido de scFv de vector PXL0026 que puede incluir un ácido nucleico scFv0026, y/o un plásmido de CAR PXL0087 que puede incluir un ácido nucleico CAR0087. En algunas realizaciones, el vector implicado con virus puede comprender vectores retrovirales, que pueden los plásmidos de scFv y/o los plásmidos de CAR.
En otro aspecto, la presente solicitud proporciona una célula efectora inmunitaria que puede comprender el CAR, la molécula de ácido nucleico o el vector de la presente solicitud. En la presente solicitud, la célula efectora inmunitaria puede ser una célula de mamífero. En la presente solicitud, la célula efectora inmunitaria puede seleccionarse de un linfocito T y un linfocito citolítico natural (NK).
En la presente solicitud, el linfocito T puede comprender un timocito, linfocito T natural, linfocito T inmaduro, linfocito T maduro, linfocito T en reposo o linfocito T activado. La célula T puede ser una célula T cooperadora (Th), tal como una célula T cooperadora 1 (Th1) o una célula T cooperadora 2 (Th2). El linfocito T puede ser una célula T cooperadora CD4+ (HTL; célula T CD4+), una célula T citotóxica (CTL; célula T CD8+), una célula T citotóxica de infiltración tumoral (TIL; célula T CD8+), una célula T CD4+/CD8+, una célula T CD4-/CD8- o cualquier otro subtipo de linfocito T. En algunas realizaciones, el linfocito T puede ser una célula T virgen (célula T<n>). En algunas realizaciones, el linfocito T puede ser una célula T de memoria central (célula T<cm>). En algunas realizaciones, el linfocito T puede ser una célula T efectora (célula T<em>). En algunas realizaciones, el linfocito T puede ser una célula T NK. En la presente solicitud, el linfocito T puede derivarse de células de sangre periférica, células de sangre del cordón umbilical y/o leucocitos.
En la presente solicitud, el linfocito T puede ser una célula T<cm>, que puede tener las características de CD45RO+/CD62L+. El linfocito T puede ser una célula T<em>, que puede tener las características de CD45RO+/CD62L-. El linfocito T puede ser una célula T<n>, que puede tener las características de CD45RO-/CD62L+. El linfocito T puede ser una célula T NK, que puede subdividirse como NK1.1+, NK1.1-, CD4+, CD4-, CD8+ y CD8-. Después de activarse, la célula T NK puede producir un gran número de interferón y, IL-4 (interleucina 4) y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos. Además, la célula T NK también puede producir algunas citocinas y factores quimiotácticos (tales como IL-2, IL-13, IL-17, IL-21 y factor de necrosis tumoral a).
En otro aspecto, la presente solicitud proporciona un método para preparar la célula efectora inmunitaria, que puede comprender introducir el vector de la presente solicitud en la célula efectora inmunitaria. Por ejemplo, el vector de la presente solicitud puede introducirse en la célula efectora inmunitaria, tal como el linfocito T o el linfocito citolítico natural (NK). En algunas realizaciones, cada tipo de o cada célula puede comprender uno o un tipo de vector de la presente solicitud. En algunas realizaciones, cada tipo de o cada célula puede comprender múltiples (tal como dos o más) o múltiples tipos (tal como dos o más tipos) de vectores de la presente solicitud. En la presente solicitud, el vector de la presente solicitud puede introducirse en la célula efectora inmunitaria mediante un método conocido en la técnica cuando se necesite. Por ejemplo, la célula efectora inmunitaria puede transfectarse mediante el vector retroviral para integrar un genoma viral que porta la molécula de CAR al interior de un genoma de huésped, garantizando la expresión estable a largo plazo de un gen diana. Para otro ejemplo, el transposón puede usarse para introducir un plásmido que porta CAR (transposón) y un plásmido que porta transposasa al interior de una célula diana. Para otro ejemplo, la molécula de CAR puede añadirse al interior del genoma mediante un método de edición génica (tal como CRISPR/Cas9). En la presente solicitud, el vector que porta molécula de CAR de la presente solicitud puede introducirse en la célula mediante un método conocido en la técnica, tal como electroporación, Lipofectamine (Lipofectamine 2000, Invitrogen), etc.
En otro aspecto, la presente solicitud proporciona una composición, que puede comprender la célula efectora inmunitaria y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Los adyuvantes farmacéuticamente aceptables pueden comprender tampón, antioxidante, conservante, polipéptido de bajo peso molecular, proteína, polímero hidrófilo, aminoácido, azúcar, agente quelante, contraión, complejo de metal y/o tensioactivo no iónico.
En la presente solicitud, la composición puede prepararse para administración oral, administración intravenosa (tal como inyección intravenosa, i.v.), administración intramuscular (tal como inyección intramuscular, i.m.), administraciónin situen un sitio de tumor, inhalación, administración rectal, administración vaginal, administración transdérmica o administración de depósito subcutáneo.
La composición de la presente solicitud puede contener una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. La cantidad terapéuticamente eficaz es una dosis requerida para prevenir y/o tratar (al menos tratar parcialmente) una enfermedad (tal como cáncer) y/o cualquier complicación de la misma en un sujeto que tiene esa enfermedad o un riesgo de desarrollo de la misma.
Uso farmacéutico
En otro aspecto, la presente solicitud proporciona un uso del CAR, la molécula de ácido nucleico, el vector o la célula efectora inmunitaria en la preparación de fármacos, en el que los fármacos se usan para tratar enfermedades o estados asociados con la expresión de BCMA.
En la presente solicitud, las enfermedades o estados asociados con la expresión de BCMA pueden ser cánceres o tumores malignos. En algunas realizaciones, los cánceres o tumores malignos pueden seleccionarse de enfermedades malignas de plasmocitos, tales como mieloma múltiple, y también pueden seleccionarse de enfermedades malignas de células B, tales como linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin.
En otro aspecto, la presente solicitud proporciona el CAR, la molécula de ácido nucleico, el vector o la célula efectora inmunitaria, que tratan enfermedades o estados asociados con la expresión de BCMA.
En otro aspecto, la presente solicitud proporciona un método para tratar enfermedades o estados asociados con la expresión de BCMA, que comprende administrar el CAR, la molécula de ácido nucleico, el vector o la célula efectora inmunitaria a un paciente.
Sin pretender limitarse por ninguna teoría, se pretende que los siguientes ejemplos simplemente ilustren los modos de funcionamiento del receptor de antígeno quimérico, vector, célula y composición de la presente solicitud, en vez de limitar el alcance de la invención de la presente solicitud.
Ejemplos
Ejemplo 1: construcción de vectores lentivirales recombinantes
En primer lugar se sintetizaron artificialmente las siguientes secuencias de nucleótidos: KOZAK (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2), péptido señal de CD8a (la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4), etiqueta de HA (la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6), scFv0026 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 44), región de bisagra (la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 26), dominio transmembrana (la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 28), factor coestimulante de CD28 (la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 30), dominio coestimulante de 4-1BB (la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 32), dominio de transducción de señales intracelular CD3^ (la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 34), péptido T2A de escisión (la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 36), GFP (la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 38) y EGFRt (la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 40).
Mientras tanto, se construyó una molécula de scFv0008 como control y la molécula de scFv0008 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 (véase el documento US9034324, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4).
La etiqueta de HA estaba ubicada en el extremo N-terminal de la molécula de CAR y directamente unida al péptido señal de CD8a. Cuando se expresó la molécula de CAR sobre la superficie celular, la etiqueta de HA puede servir como etiqueta para detectar la molécula de CAR o el enriquecimiento de la célula CAR-T. Además, la GFP estaba ubicada en el extremo más C-terminal de la molécula de CAR y directamente unida al péptido T2A de escisión. La molécula de CAR y la proteína GFP en cantidades iguales pueden formarse después de la escisión de T2A (véase Szymczak,et al.,Correction of multi-gene deficiencyin vivousing a single self-cleaving 2A peptide-based retroviral vector. Nature biotechnology, 2004. 22: pág. 589). Por tanto, el proceso de expresión (tal como se muestra en la figura 1B) de las moléculas de CAR puede evaluarse indirectamente detectando la señal de GFP. La figura 1B muestra específicamente el procedimiento de detección: (1) se introduce una partícula lentiviral en una célula mediante la fusión de membrana celular (2); se retira el empaquetamiento (3); después se realiza la transcripción inversa (4); después se realizan la integración (5), transcripción (6) y traducción (7); y se realiza la escisión (8) mediante el péptido T2A de escisión. La eficiencia de la transducción puede evaluarse mediante la expresión de la GFP (9), la eficiencia de unión de scFv y la proteína de BCMA puede estudiarse mediante BCMA-Fc (10), y el anticuerpo anti-HA puede usarse para detectar la expresión del CAR y enriquecer la célula CAR-T para el análisis de funcionalidad (11).
Además de detectar la proteína GFP, la expresión de la molécula de CAR también puede determinarse mediante otros métodos. Por ejemplo, puede usarse una cantidad apropiada de BCMA biotinilado y PE-estreptavidina para marcar la molécula de c A r de modo que la expresión de la molécula de CAR puede reflejarse mediante señales de PE. Para otro ejemplo, puede usarse una cantidad apropiada de anticuerpo monoclonal anti-HA biotinilado (AcM anti-HA biotinilado) y PE-estreptavidina para marcar las moléculas de CAR para la detección.
Los plásmidos contenidos en molécula de scFv, los plásmidos contenidos en molécula de CAR y los lentivirus correspondientes a los mismos usados en la presente solicitud se muestran en la tabla 1.
Tabla 1: tipos de vectores lentivirales
Se prepararon los siguientes plásmidos de CAR (véase la figura 1A).
Se sometió un vector lentiviral PLVX-EF1alpha-IRES-Puro a doble digestión con NotI y MluI, y se recuperó el fragmento de vector. Se amplificó el plásmido de scFv candidato PXL0026 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 44) mediante PCR y, en el extremo 5'-terminal en la secuencia, se añadió un sitio de corte de enzima de restricción NotI (que contenía una base protectora), un péptido señal de CD8a, una etiqueta de HA mediante PCR de extensión; se llevó a cabo la síntesis génica de una región de bisagra, un dominio transmembrana, un factor coestimulante de CD28 y un dominio de transducción de señales intracelular CD3^ y después la amplificación mediante PCR; se obtuvieron un péptido T2A de escisión y una eGFP a partir de un plásmido pMy-BirA-T2A-eGFP mediante amplificación mediante PCR, con un sitio de corte de enzima de restricción MluI y una base protectora en el extremo 3'-terminal; y después se obtuvo un fragmento de PCR, con un sitio de corte de enzima de restricción NotI en el extremo 5'-terminal y un sitio de corte de enzima de restricción MluI en el extremo 3'-terminal, mediante PCR por solapamiento, se sometió el fragmento obtenido a doble digestión con NotI y MluI, y se recuperó. El plásmido de CAR con número PXL0037 se construyó mediante ligación de T4 (la secuencia de nucleótidos de CAR0037 se muestra como SEQ ID NO: 50).
El plásmido de CAR con número PXL0085 se obtuvo mediante un método similar. Se sometió un vector lentiviral PLVX-EF1alpha-IRES-Puro a doble digestión con NotI y MluI y se recuperó el fragmento de vector. Se amplificó el plásmido de scFv candidato PXL0026 mediante PCR y, en el extremo 5'-terminal en la secuencia, se añadió un sitio de corte de enzima de restricción NotI (que contenía una base protectora), un péptido señal de CD8a mediante PCR de extensión; se realizó la síntesis génica de una región de bisagra, un dominio transmembrana, un factor coestimulante de 4-1BB (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 32) y un dominio de transducción de señales intracelular CD3^ y la amplificación mediante PCR; después, se obtuvo un fragmento de PCR, con un sitio de corte de enzima de restricción NotI en el extremo 5'-terminal y un sitio de corte de enzima de restricción MluI en el extremo 3'-terminal mediante PCR por solapamiento, se sometió el fragmento obtenido a doble digestión con NotI y MluI, y se recuperó el fragmento. El plásmido de CAR con número PXL0085 se construyó mediante ligación de T4 (la secuencia de nucleótidos de la porción de molécula de CAR de CAR0085 se muestra como SEQ ID NO: 52).
El plásmido de CAR con número PXL0087 se obtuvo mediante un método similar. Se sometió un vector lentiviral PLVX-EF 1alpha-IRES-Puro a doble digestión con NotI y MluI y se recuperó el fragmento de vector. Se amplificó el plásmido de scFv candidato PXL0026 mediante PCR y, en el extremo 5'-terminal en la secuencia, se añadió un sitio de corte de enzima de restricción NotI (que contenía una base protectora), un péptido señal de CD8a mediante PCR de extensión; se realizó la síntesis génica de una región de bisagra, un dominio transmembrana, un factor coestimulante de 4-1BB (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 32), un dominio de transducción de señales intracelular CD3^, un péptido T2A de escisión y EGFRt (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 40) y la amplificación mediante PCR; después, se obtuvo un fragmento de PCR, con un sitio de corte de enzima de restricción NotI en el extremo 5'-terminal y un sitio de corte de enzima de restricción MluI en el extremo 3'-terminal mediante PCR por solapamiento, se sometió el fragmento obtenido a doble digestión con NotI y MluI, y se recuperó el fragmento. El plásmido de CAR con número PXL0087 se construyó mediante ligación de T4 (la secuencia de nucleótidos de la porción de molécula de CAR de CAR0087 se muestra como SEQ ID NO: 52).
Mientras tanto, se construyó un plásmido de CAR que contenía el plásmido de scFv PXL0008 como control.
El plásmido de CAR con número PXL0041 se obtuvo mediante el mismo método (la secuencia de nucleótidos de la porción de molécula de CAR de CAR0041 se muestra como SEQ ID NO: 48). Se sometió un vector lentiviral PLVX-EF1alpha-IRES-Puro a doble digestión con NotI y MluI y se recuperó el fragmento de vector. Se amplificó el plásmido de scFv candidato PXL0008 (la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 42) mediante PCR y, en el extremo 5'-terminal en la secuencia, se añadió un sitio de corte de enzima de restricción NotI (que contenía una base protectora), un péptido señal de CD8a, una etiqueta de HA mediante PCR de extensión; se realizó la síntesis génica de una región de bisagra, un dominio transmembrana, un factor coestimulante de CD28 y un dominio de transducción de señales intracelular CD3^ y después la amplificación mediante PCR; se obtuvieron un péptido T2A de escisión y una GFP a partir de un plásmido pMy-BirA-T2A-eGFP mediante amplificación mediante PCR, con un sitio de corte de enzima de restricción MluI y una base protectora en el extremo 3'-terminal; y después se obtuvo un fragmento de PCR, con un sitio de corte de enzima de restricción NotI en el extremo 5'-terminal y un sitio de corte de enzima de restricción MluI en el extremo 3'-terminal, mediante PCR por solapamiento, se sometió el fragmento obtenido a doble digestión con NotI y MluI, y se recuperó el fragmento. El plásmido de CAR con número PXL0041 se construyó mediante ligación de T4 (la secuencia de nucleótidos de la porción de molécula de CAR de CAR0041 se muestra como SEQ ID NO: 48).
El plásmido de CAR con número PXL0009 se obtuvo mediante un método similar. Se sometió un vector lentiviral PLVX-EF1alpha-IRES-Puro a doble digestión con NotI y MluI y se recuperó el fragmento de vector. Se amplificó el plásmido de scFv candidato PXL0008 mediante PCR y, en el extremo 5'-terminal en la secuencia, se añadió un sitio de corte de enzima de restricción NotI (que contenía una base protectora), un péptido señal de CD8a; se realizó la síntesis génica de una región de bisagra, un dominio transmembrana, un factor coestimulante de CD28 y un dominio de transducción de señales intracelular CD3^ y la amplificación mediante PCR; después, se obtuvo un fragmento de PCR, con un sitio de corte de enzima de restricción NotI en el extremo 5'-terminal y un sitio de corte de enzima de restricción MluI en el extremo 3'-terminal mediante PCR por solapamiento, se sometió el fragmento obtenido a doble digestión con NotI y MluI, y se recuperó el fragmento. El plásmido de CAR con número PXL0009 se construyó mediante ligación de T4 (la secuencia de nucleótidos de la porción de molécula de CAR de CAR0009 se muestra como SEQ ID NO: 46).
Ejemplo 2: expresiones de moléculas de CAR en muestras de células 293T transfectadas de manera transitoria
Tal como se muestra en la figura 2A, los plásmidos de CAR PXL0009, PXL0041 y PXL0037 preparados en el ejemplo 1 se transfectaron de manera transitoria en células 293T usando PEI como reactivo de transfección, de modo que se obtuvieron respectivamente una célula PXL0009-293T, una célula PXL0041-293T y una célula PXL0037-293T. A las 72 horas tras la transfección transitoria, se usaron la célula PXL0009-293T, la célula PXL0041-293T y la célula PXL0037-293T para evaluar las capacidades de expresión de las moléculas de CAR candidatas. En la figura 2A, 1 representa un plásmido y un reactivo de transfección, 2 representa la transfección transitoria y 3 representa la expresión y escisión de péptido T2A de escisión.
Se evaluaron las expresiones de las moléculas de CAR usando los métodos en el ejemplo 1. Específicamente, se cambió la dosis del BCMA biotinilado mediante dilución en gradiente en presencia de PE-estreptavidina en exceso con una concentración fija, de modo que se obtuvo el cambio de señales de PE (mostrado en la figura 2B). El eje de las X representa señales de proteína GFP expresadas en las células, y el eje de las Y representa señales de PE obtenidas mediante las moléculas de CAR marcadas usando el BCMA biotinilado diluido en gradiente y la cantidad fija de PE-estreptavidina.
Se usó la proteína de BCMA de biotinilada diluida en gradiente (de 295,86 nM a 3,79 pM) para someter a ensayo las células 293T transfectadas de manera transitoria con los plásmidos de CAR candidatos, de modo que se obtuvo una curva de cambio de señal de PE (mostrada en la figura 3). Los valores de CE<50>para la unión a proteínas de BCMA de moléculas de CAR en la superficie celular calculados mediante ajuste de curva se muestran en la tabla 2.
Tabla 2: resultados de expresiones de moléculas de CAR mediante detección de proteínas GFP
De manera similar, las muestras de células 293T a las 72 horas tras la transfección transitoria, se marcaron las moléculas de CAR usando el anticuerpo monoclonal anti-HA biotinilado (AcM anti-HA) y PE-estreptavidina, y después se obtuvieron las tasas positivas para GFP (% de GFP), tasas positivas para CAR (% de CAR) y razones de las mismas mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en la tabla 3.
Tabla 3: resultados de citometría flujo para expresiones de moléculas de CAR
PXL0009 era un plásmido de referencia bien conocido que puede expresar normalmente la molécula de CAR, que no contenía genes que codifican para la proteína GFP y la etiqueta de HA, y su secuencia se muestra como SEQ ID NO: 45. No pudo detectarse la señal de GFP en la muestra de células, ni la señal de PE para la unión de un CAR con un anticuerpo monoclonal anti-HA biotinilado (AcM anti-HA biotinilado). Por tanto, pudo usarse una muestra de células PXL0009-293T como muestra de control para la citometría de flujo. A diferencia de PXL0009, PXL0041 y PXL0037 como plásmidos de referencia pueden codificar para la proteína GFP y la etiqueta de HA, de modo que pueden detectarse señales de GFP en una muestra de células PXL0041-293T, y también puede detectarse la unión (señal de PE) del CAR con la proteína de BCMA biotinilada o el anticuerpo monoclonal anti-HA biotinilado respectivamente, por tanto, pueden servir como controles positivos.
El resultado mostró que tanto la señal de GFP como la unión (señal de PE) del CAR con la proteína de BCMA biotinilada o el anticuerpo monoclonal anti-HA biotinilado (AcM anti-HA biotinilada) pueden detectarse en una muestra de células PXL0037-293T, demostrando que la molécula de CAR codificada por el plásmido PXL0037 puede expresarse en células y puede unirse normalmente con la proteína de BCMA.
Ejemplo 3: expresiones de moléculas de CAR en muestras de células 293T transducidas con lentivirus
3.1. Empaquetamiento de lentivirus
Los plásmidos de CAR con número PXL0009, PXL0041 y PXL0037 que se prepararon en el ejemplo 1 con un plásmido lanzadera y otros plásmidos de empaquetamiento se transfectaron conjuntamente de manera simultánea en células 293T, de modo que los lentivirus se empaquetaron en las células. Las etapas específicas fueron las siguientes.
Tomando como ejemplo el empaquetamiento de lentivirus en placas de cultivo de 10 cm, se inocularon las células 293T en medio DMEM que contenía el 10% de FBS a una densidad de 6*104 células/cm2, y se cultivaron en un entorno de 37°C, al 5% de CO2 y humedad saturada durante 3 días, y después se llevó a cabo la transfección. Antes de la transfección, se prepararon dos tubos de EP con 500 pl de opti-MEM en cada tubo de EP, en los que se añadieron 3 pg de vector cooperador lentiviral PSPAX2, 2 de vector cooperador lentiviral pMD2.G y 5 pg del vector preparado en el ejemplo 1 (plásmido de CAR con número PXL0009, PXL0041 o PXL0037) a un tubo y se mezcló exhaustivamente la disolución de mezcla, de modo que se obtuvo un tubo que contenía plásmido; y se añadieron 30 pl de PEI con una concentración de 1 mg/ml al otro tubo y se mezcló exhaustivamente la disolución de mezcla. Después se añadió la disolución que contenía PEI en el otro tubo gota a gota al tubo que contenía el plásmido mientras se mezclaba la disolución obtenida, y 30 minutos después de reposar a temperatura ambiente, se añadió de manera uniforme la disolución resultante a las células 293T anteriormente mencionadas gota a gota. 24 horas tras la transfección, se cambió el medio a 6 ml de medio DMEM que contenía el 10% de FBS.
72 horas después, se recogió el sobrenadante y se añadió a un tubo de centrífuga y después se centrifugó a 3000 g a 4°C durante 10 minutos y el sobrenadante estaba listo para la purificación después de filtrarse mediante un filtro de 0,45 pm.
Se centrifugó el sobrenadante mediante una ultracentrífuga a 27000 g a 4°C durante 4 horas. Se retiró el sobrenadante, volvió a suspenderse el precipitado con 100 pl de PBS previamente enfriado y después se mezcló la disolución de mezcla hasta que no quedaba ninguna partícula. Se puso la disolución obtenida durante la noche a 4°C. Después se extrajo la suspensión de virus y se dispensó. Se obtuvieron respectivamente los lentivirus LV0002 (correspondiente al plásmido de Ca r PXL0009), LV0011 (correspondiente al plásmido de CAR PXL0041) y LV0007 (correspondiente al plásmido de CAR PXL0037).
3.2. Evaluación de eficiencias de empaquetamiento de lentivirus
Detectando títulos virales (títulos biológicos) con actividades de transducción en el sobrenadante obtenido en el procedimiento de empaquetamiento lentiviral, se evaluaron las eficiencias de empaquetamiento de lentivirus. Las etapas de ensayo específicas fueron las siguientes.
Se inocularon células 293T en una placa de seis pocillos en una cantidad de 1*105 células/pocillo y se cultivaron con 500 pl de medio DMEM que contenía el 10% de FBS en un entorno de 37°C, al 5% de CO2 y humedad saturada. Tras cultivarse las células durante 24 horas, se extrajeron 100 pl, 50 pl, 25 pl y 12,5 pl del sobrenadante anteriormente mencionado y se añadieron a placas de seis pocillos (dos pocillos para cada volumen de muestra) para la transducción lentiviral. Tras la transducción lentiviral, entonces se siguieron cultivando las células en el entorno de 37°C, al 5% de CO2 y humedad saturada. 72 horas tras la transducción lentiviral, se sometieron las células 293T a digestión y volvieron a suspenderse para citometría de flujo. Dado que tanto el gen que codifica para molécula CAR como el gen que codifica para proteína GFP se portaban en LV0007, pudieron expresarse tanto la molécula de CAR como la proteína GFP en células 293T transducidas con LV0007. Detectando las señales de fluorescencia de GFP en las células 293T mediante la citometría de flujo, pudo calcularse el título biológico lentiviral (denominado título de GFP) en el sobrenadante:
título biológico (UT/ml) = (tasa positiva para GFP * número de células 293T) / volumen de muestra de virus
O, las células 293T transducidas con LV0007se marcaron con el BCMA biotinilado y la PE-estreptavidina, y la tasa positiva para CAR (denominada título de CAR) se detectó mediante la citometría de flujo:
título biológico (UT/ml) = (tasa positiva para CAR * número de células 293T) / volumen de muestra de virus
Los resultados de ensayo de determinación de título biológico para sobrenadantes obtenidos en el procedimiento de empaquetamiento anteriormente mencionado se muestran en la figura 4 y la tabla 4.
La tabla 4 muestra los datos de título biológico de sobrenadantes para empaquetamiento lentiviral. “Título de GFP” se refiere de manera general a un título que se calculó detectando la tasa positiva para GFP en células 293T transducidas con virus que van a detectarse mediante señales de GFP; y “título de CAR” se refiere de manera general a un título que se calculó detectando la tasa positiva para CAR en células 293T transducidas con virus que van a detectarse con el BCMA biotinilado y la PE-estreptavidina.
Tabla 4: resultados de ensayo de determinación de título biológico para empaquetamiento lentiviral
Ejemplo 4: preparación de células CAR-T
En el día 1, se extrajeron aproximadamente 65 ml de sangre periférica de un donante sano, se usó Ficoll para la separación para obtener PBMC y después se usaron adicionalmente microperlas CD3 para clasificar células T. Se activaron adicionalmente las células T obtenidas usando perlas Dynabeads CD3/CD28. Aproximadamente 24 horas tras la activación (en el día 2), se añadieron los lentivirus LV0007 y LV0011 preparados en el ejemplo 3 respectivamente para la transducción (MOI = 4), con una densidad de células T de aproximadamente 1,5*10® células/ml durante la transducción. En el día 3, se renovaron las células T transducidas con medio nuevo una vez. Después de eso, se realizó el recuento cada día, se mantuvo la densidad celular entre 0,6*10® células/ml y 2 ,0* 10® células/ml, y se trazó gráficamente la curva de crecimiento de las células.
En el día ® del cultivo celular, se detectaron la tasa positiva para CAR (% de CAR), la tasa positiva para GFP (% de GFP) y la razón de CD4/CD8 mediante la citometría de flujo. En el día 10, se evaluaronin vitrolas funciones de células CAR-T.
Según el procedimiento anteriormente mencionado, se obtuvieron células LV0007-CAR-T y LV0011-CAR-T, y se adoptaron las células T del donante como control. La tabla 5 resume el procedimiento de preparación anteriormente mencionado para células CAR-T.
Tabla 5: procedimiento de preparación de células CAR-T
Las curvas de crecimiento para el grupo de células LV0007-CAR-T, el grupo de células LV0011-CAR-T y el grupo de control de células T son tal como se muestra en la figura 5. Los datos tales como las tasas positivas para CAR que se obtuvieron mediante la citometría de flujo en el día ® del cultivo celular se muestran en la tabla ®.
Tabla ®: resultados de ensayo de tasa positiva para CAR mediante citometría de flujo
Ejemplo 5: datos para la unión de moléculas de CAR con la proteína de BCMA
Además, se detectaron las capacidades de moléculas de CAR expresadas en las células CAR-T preparadas en el ejemplo 4 para unirse con la proteína de BCMA usando proteína de BCMA biotinilada diluida en gradiente para marcar moléculas de CAR (idéntico al método en el ejemplo 2) en presencia de PE-estreptavidina en exceso con una concentración fija. Los resultados se muestran en la figura 6 y tabla 7.
Tabla 7: resultados para la unión de moléculas de CAR con la proteína de BCMA
Según los datos anteriormente mencionados, las moléculas de CAR candidatas expresadas en las células T pueden unirse normalmente a la proteína de BCMA. Sin embargo, hubo una diferencia significativa entre los valores de CE50 determinados para muestras de células preparadas en diferentes lotes. Una diferencia de este tipo puede estar provocada por las diferentes densidades de las moléculas de CAR expresadas en las superficies de las células debido a los diferentes tipos de células, métodos de preparación de muestras y lotes.
Ejemplo 6: prueba de desgranulación de CD107a
6.1. Prueba de desgranulación de CD107a
Se evaluó la potencia biológica de las células CAR-Tin vitromediante la prueba de desgranulación de CD107a. CD107a es un marcador de una microvesícula intracelular. Cuando la microvesícula cargada con granzima se fusiona con una membrana celular, se aumenta la cantidad de CD107a sobre la membrana celular. Por tanto, cuando se bloquea la recuperación de CD107a usando monesina (obtenida de BioLegend), puede reflejarse de manera cuantitativa la intensidad de liberación de microvesícula. Después de estimularse el CAR-T mediante un antígeno diana en una célula diana, se libera la granzima. La activación de células T puede determinarse detectando el aumento de CD107a mediante la citometría de flujo.
En primer lugar, se incubaron las células CAR-T (células LV0007-CAR-T o células LV0011-CAR-T) obtenidas en el ejemplo 4, junto con células diana U266, monesina y un anticuerpo frente a CD107a durante de 3 a 6 horas, en el que las células CAR-T y las células diana tenían la misma densidad celular de 5*105 células/ml. Después, tras marcar la muestra con anticuerpos frente a CD8 y PD1, se realizó la citometría de flujo. Las células positivas para CAR entre las células CAR-T se detectaron detectando GFP expresada conjuntamente, mientras que las células positivas para CAR entre las células LV0011-CAR-T como control se marcaron mediante BCMA-Fc biotinilado y PE-estreptavidina. En la prueba, se incubaron células K562 conjuntamente con células CAR-T como control negativo, y el control positivo consistió en usar un cóctel en lugar de células diana para activar las células CAR-T.
Tomando las células LV0007-CAR-T como ejemplo, el resultado de citometría de flujo se muestra en la figura 7.
Para la muestra de células en la que se incubaron conjuntamente células LV0007-CAR-T y U266, se seleccionó una compuerta de P1 en el diagrama de dispersión de FSC:SSC, y se retiró el residuo celular en la esquina inferior<izquierda; para células en la compuerta p>1,<pudo analizarse adicionalmente CD8:PD1 para obtener una población de>células CD8+/PD1- (Q3); y en la población de células CD8+/PD1-, pudo analizarse de nuevo GFP:CD107a para obtener la proporción de la expresión de CD107a en la población de células CD8+/PD1-/CAR+ (la célula positiva para CAR estaba marcada mediante una señal de GFP expresada conjuntamente) y la población de células CD8+/PD1-/CAR- respectivamente.
Para la muestra de células en la que se incubaron conjuntamente células LV0007-CAR-T y K562, se dividieron las células en población P1 y población P2 en el diagrama de dispersión de FSC:SSC, en el que casi no se expresó nada de CD8 en las células en la población P2, que por tanto pueden ser células K562; para células en la compuerta P1, pudo analizarse adicionalmente CD8:PD1; en la población de células CD8+/PD1- (Q3), pudo analizarse de nuevo GFP:CD107a para obtener la proporción de la expresión de CD107a en también cada una de CD8+/PD1-/CAR+ y CD8+/PD1-/CAR-.
6.2. Datos de prueba de desgranulación de CD107a
Según el funcionamiento de la prueba en la sección 6.1 del ejemplo 6, se incubaron las muestras de células CAR-T (células LV0007-CAR-T o LV0011-CAR-T) conjuntamente con células diana U266 (positivas para BCMA) o K562 (negativas para BCMA) respectivamente durante 3 horas, y después se realizó la citometría de flujo. Los resultados de datos de la prueba de desgranulación de CD107a para muestras de células se muestran en la tabla 8 y la figura 8, y tanto la tabla 8 como la figura 8 muestran las razones de las células positivas que expresan CD107a en la subpoblación de células CD8+/PD1-/CAR+ y la subpoblación de células CD8+/PD1-/CAR-.
Tabla 8: razones de células positivas que expresan CD107a en diferentes subpoblaciones celulares
Muestra Subpoblación CD8+/PD1-/CAR+ Subpoblación CD8+/PD1-/CAR
Tal como se muestra en la tabla 8 y la figura 8, en la muestra de CAR-T incubada conjuntamente con U266, el valor de CD107a en la subpoblación de células CD8+/PD1-/CAR+ puede reflejar la situación en la que las células CAR-T se activaron de manera específica; mientras que, en la muestra de CAR-T incubada conjuntamente con K562, el valor de CD107a en la subpoblación de células CD8+/PD1-/CAR+ puede reflejar la situación en la que las células CAR-T se activaron de manera no específica. Comparando los valores de CD107a en las subpoblaciones de células CD8+/PD1-/CAR+ a partir de muestras de CAR-T incubadas conjuntamente con U266, puede concluirse que la subpoblación CD8+/PD1-/CAR+ de células LV0007-CAR-T puede activarse de manera específica mediante las células positivas para BCMA (U266), y la activación para células LV0007-CAR-T fue más intensa que para células LV0011-CAR-T como control.
6.3. Datos de prueba de desgranulación de CD107a en una condición de competencia de proteína de BCMA
Además, dado que la parte extracelular de la proteína de BCMA expresada sobre la superficie de una célula de mieloma múltiple (MM) puede cortarse mediante y-secretasa, puede formarse un BCMA soluble (sBCMA). Pudo aumentarse el contenido de BCMA soluble en el suero de un paciente con MM, y se correlacionó su concentración de manera positiva con el grado de malignidad de un tumor. Por tanto, cuando se incubaron las células CAR-T conjuntamente con células diana, se añadió 1 pg/ml de proteína de BCMA al medio para evaluar el efecto del BCMA soluble sobre la activación de células CAR-T.
Los resultados de prueba de desgranulación de CD107a para las muestras de células CAR-T en una condición de competencia de proteína de BCMA se muestran en la tabla 9 y la figura 9. Tal como se muestra en la figura 9, la activación de las células CAR-T mediante las células U266 no se suprimió mediante competencia por la proteína de BCMA en la muestra de células transducidas con LV0007; mientras que la activación de la muestra de células LV0011-CAR-T como control se suprimió significativamente.
Tabla 9: datos de prueba de desgranulación de CD107a en una condición de competencia de proteína de BCMA
Ejemplo 7: determinación de liberación de citocinas
En un experimento de determinación de la liberación de citocinas, tras incubar conjuntamente las células CAR-T que van a determinarse (5 * 105 células, 100 pl) y células diana (5*105 células, 100 pl) en medio RPMI-1640 durante 24 horas, se recogió el sobrenadante de cultivo celular y se determinaron las secreciones de IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF -a, IFN-y y otros factores mediante el método de CBA.
Los resultados de ensayo de liberación de citocinas, obtenidos tras cultivar las muestras de células CAR-T conjuntamente con las células diana respectivamente, tal como se muestra en la tabla 10 y la figura 10. La cantidad de liberación de una citocina mostrada en la figura 10 fue un porcentaje relativo con respecto al valor máximo detectado en una muestra. Tal como se muestra en la tabla 10 y la figura 10, las cantidades de TNF-a, IFN-y e IL-2 secretadas por las células LV0007-CAR-T estimuladas mediante las células diana U266 positivas para BCMA (+U226) se aumentaron en gran medida. Las cantidades de TNF-a, IFN-y e IL-2 secretadas por células LV0007-CAR-T estimuladas mediante las células K562 negativas para BCMA (+K562) no se aumentaron.
Tabla 10: resultados de determinación de liberación de citocinas
Ejemplo 8: funciones de células CAR-T de diferentes donantes
Se prepararon células LV0002-CAR-T y células LV0021-CAR-T transduciendo los lentivirus LV0002 y LV0021 preparados en el ejemplo 3 al interior de células CAR-T con un método experimental similar al ejemplo 4, en el que se usaron virus LV0021 (correspondientes a la molécula de CAR codificada por el plásmido PXL0087, con un factor coestimulante de 4-1BB) y virus LV0002 (correspondientes a la molécula de CAR codificada por el plásmido PXL0009, con un factor coestimulante de CD28) para transducir células T de diferentes donantes, para preparar células CAR-T. Las células T del donante 1 transducidas con virus LV0002 se denominaron células LV0002-D01-CAR-T, las células T del donante 1 transducidas con virus LV0002 se denominaron células LV0002-D02-CAR-T, y las células T del donante 3 transducidas con virus LV0002 se denominaron células LV0002-D03-CAR-T; las células T del donante 1 transducidas con virus LV0021 se denominaron células LV0021-D01-CAR-T, las células T del donante 2 transducidas con virus LV0021 se denominaron células LV0021-D01-CAR-T, y las células T del donante 3 transducidas con virus LV0021 se denominaron células LV0021-D03-CAR-T. Mientras tanto, se adoptaron células T del propio donante como controles, en las que las células T procedentes del donante 1 se denominaron células T-D01, las células T procedentes del donante 2 se denominaron células T-D02, y las células T procedentes del donante 3 se denominaron células T-D03. También se sometieron a ensayo las funciones de estas células CAR-T usando la prueba de desgranulación de CD107a en el ejemplo 6. Los resultados se muestran en la tabla 11 y la figura 11.
Los datos mostraron que los resultados para las células LV0021-CAR-T de dos donantes diferentes fueron similares, es decir, las células LV0021-CAR-T de ambos donantes podían estimularse de manera específica mediante las células U266 positivas para BCMA para producir CD107a, mientras que los valores de CD107a generados en la estimulación de las células K562 negativas para BCMA fueron similar a los valores generados sin estimulación (blanco). Las células LV0002-CAR-T como control pudieron producir más CD107a en la estimulación de las células U266, lo cual puede resultar de diferentes scFv y factores coestimulantes para las mismas. Además, las células LV0002-CAR-T podían tener valores de CD107a superiores tanto en la condición sin estimulación (blanco) como en la condición de estimulación con células K562. Además, el efecto de una proteína de BCMA libre sobre la capacidad de LV0021-CAR-T para producir CD107a fue menor, mientras que el efecto de una proteína de BCMA libre sobre la capacidad de LV0002-CAR-T para producir CD107a fue grande.
Tabla 11: comparación defunciones de células CAR-T de diferentes donantes
Ejemplo 9: ensayo de destrucción in vitro de CAR-T sobre células diana
Se usaron las células CAR-T LV0021-D02-CAR-T preparadas en el ejemplo 8 para el ensayo de función de destrucciónin vitroque se llevó a cabo específicamente mediante el método de fluorescencia de calceína-AM. Las etapas de este ensayo fueron las siguientes. Se tomaron respectivamente 5*105 células U266 positivas para BCMA y células K562 negativas para BCMA y volvieron a suspenderse en disolución de PBS 4% de FBS, de modo que se prepararon suspensiones celulares con una densidad de 1*106 células/ml. Se marcaron las células U266 y las células K562 respectivamente con 25 pM de calceína-AM. Se incocularon las células U266 y K562 marcadas respectivamente en placas de 96 pocillos de fondo en U según la cantidad de 5000 células por pocillo; después se añadieron respectivamente las células CAR-T que van a someterse a ensayo o células T como control a los pocillos correspondientes según las razones de células efectoras/células diana de 50:1,25:1 y 5:1 (valor de E:T) y el volumen de disolución en cada pocillo era de 200 pl. Además, se añadió una disolución de PBS, en lugar de las células efectoras, a las células U266 o K562, que servían como control negativo para el ensayo; y se añadió la disolución de lisis celular, en lugar de las células efectoras, a las células U266 o K562, que servían como control positivo para el ensayo. Después, se incubaron las placas de 96 pocillos de fondo en U en la oscuridad a 37°C durante 3 horas, y se extrajo la disolución de sobrenadante con pipeta (sin extraer con pipeta ninguna célula) a partir de cada pocillo para el ensayo de fluorescencia (longitud de onda de excitación: 485/20 nm; longitud de onda de emisión: 530/25 nm). La proporción relativa de las células diana (U266 o K562) que se destruyeron por las células efectoras y experimentaron lisis para liberar calceína-AM puede calcularse mediante la siguiente fórmula:
U_U
proporci<■>ó</>n d<i>e d<i>i<■>sol<i>uci<i>ó</>n (%<# ->)<v>= ------- -—<esp>-<o>—<nt.>
“ máx. “ espont.
en la que, Fprueba era un valor de fluorescencia promedio para los pocilios repetidos que contenían las células diana y las células T/CAR-T que van a someterse a ensayo, Fespont. era un valor de fluorescencia promedio para los pocillos repetidos que contenían las células diana y PBS, y Fmáx. era un valor de fluorescencia promedio para los pocillos repetidos que contenían las células diana y la disolución de lisis.
Tomando la muestra de LV0021-D02-CAR-T como ejemplo, el efecto de destrucciónin vitrode las células CAR-T frente a las células diana se muestra en la figura 12. Las células CAR-T tenían un fuerte efecto de destrucción frente a las células U266 positivas para BCMA, y el efecto de destrucción se aumentó a medida que aumenta el valor de E:T, mostrando que una proporción superior de células U266 experimentaron lisis para liberar calceína-AM. En cambio, las células CAR-T tenían un mal efecto de destrucción frente a las células K562 negativas para BCMA. Además, las células T tenían un cierto grado de efecto de destrucción no específico frente a las células U266, y el efecto de destrucción no específico no cambiará a medida que aumenta el valor de E:T. Por tanto, las células CAR-T tenían un efecto de destrucción específico de BCMA notable.
Ejemplo 10: ensayo de supresión tumoral en modelos animales que portan tumor
Se usaron las células CAR-T (LV0021-D02-CAR-T) procedentes del donante 2 que se prepararon en el ejemplo 8 para el experimento de modelo animal. Las células LV0021-CAR-T se denominaron XL103-07. Mientras tanto, se adoptaron células T procedentes del donante 2 (células T-D02) como células T de control. Se inyectaron células U266 en proliferación por vía subcutánea en ratones NSG inmunodeficientes en una cantidad de 2*10® células por ratón, creando un modelo que porta tumor subcutáneo U266. Cuando los tamaños tumorales alcanzaron 100-150 mm3, se dividieron los ratones que portaban tumor en cinco grupos según la tabla 12 y se inyectaron las células CAR-T (XL103-07), las células T de control (células T-D02), PBS o medio de crioconservación celular que contenía el 7,5% de DMSO, el 23% de albúmina sérica humana, el 32,5% de disolución de electrolito compuesta, el 35% de inyección de glucosa y el 2% de solución salina normal, en los ratones que portaban tumor, respectivamente. La agrupación y el régimen de administración se muestran en la tabla 12.
Tabla 12: solución de agrupación para el experimento de modelo animal
Se alimentó a los ratones de manera continua y se registraron los tamaños tumorales, los pesos de ratones y los estados de supervivencia de los ratones. Los resultados se muestran en la figura 13. Los resultados del experimento de modelo de ratón indican que tanto el grupo de dosificación alta como el grupo de dosificación baja mostraron un buen efecto de destrucción de tumor tras una única inyección de las células CAR-T, y que, 19 días después de la inyección, los tumores desaparecieron completamente. Por el contrario, los tumores en los ratones a los que se les inyectaron las células T de control, PBS o el medio de crioconservación celular, siguieron creciendo.
Ejemplo 11: ensayo para determinar citocinas en modelos animales que portan tumor
Se usaron las mismas células CAR-T XL103-07 que las del ejemplo 10 para detectar los cambios de citocinas (IFNy, IL2, IL10, IL7, IL6 y TNF-a) en el plasma de sangre periférica de ratones a los que se les administraron fármacos mediante el método de matriz de perlas citométricas (el método específico puede encontrarse en BD™ CBAFlex Set Reagents y BD FACS Array™ Bioanalyzer). Se dividieron los ratones que portaban tumor en tres grupos: un grupo de células T de control, un grupo de dosificación alta de XL103-07 y un grupo de dosificación baja de XL103-07, y había cinco ratones que portaban tumor en cada grupo. XL103-07-H representa el grupo de dosificación alta, y la dosificación fue de 10*10® células (células XL103-07)/animal; XL103-07-L representa el grupo de dosificación baja, y la dosificación fue de 2*10® células (células XL103-07)/animal.
Los resultados para IFNy e IL2 se muestran en la figura 14. Los resultados mostraron que los picos de IFN-y e IL2 en los ratones del grupo de dosificación baja aparecieron en el día 10 y el día 7 respectivamente; y que los picos de IFNy e IL2 en el grupo de dosificación alta aparecieron en el día 3-7 y el día 3 respectivamente, en el que los momentos de aparición de pico fueron más tempranos que los del grupo de dosificación baja. El nivel del grupo de células T de control fue bajo, sin una tendencia de cambio evidente.
Los resultados para IL10, IL7, IL6 y TNF-a se muestran en la figura 15. Los resultados en la figura 15 muestran que todos los niveles de citocina fueron bajos y no tenían ninguna tendencia de cambio evidente en comparación con la del grupo de células T de control.
Ejemplo 12: ensayo para detectar cambios de los números de copias de moléculas de CAR en modelos animales que portan tumor
Con el método de PCR cuantitativa, se detectaron los cambios de los números de copias de ADN de las moléculas de CAR de XL103-07 en el ADN genómico de las células de sangre periférica del modelo animal de ratones que portaban tumor en el ejemplo 10 y se analizaron las situaciones de proliferación de las células CAR-T en los ratones. Los resultados se muestran en la figura 16. De manera similar, se dividieron los ratones que portaban tumor en tres grupos: un grupo de células T de control, un grupo de dosificación alta de XL103-07 y un grupo de dosificación baja de XL103-07, y había cinco ratones que portaban tumor en cada grupo. XL103-07-H representa el grupo de dosificación alta, y la dosificación fue de 10*10® células (células XL103-07)/animal; XL103-07-L representa el grupo de dosificación baja, y la dosificación fue de 2*10® células (células XL103-07)/animal.
Los resultados mostraron que, en comparación con el del grupo de células T de control, el número de copias de CAR para el grupo de dosificación alta empezó a aumentar en el día 3, y el pico se alcanzó en el día 10 y se mantuvo hasta el día 15. Por el contrario, no hubo ninguna proliferación en los grupos de control de simulación-T y otros. Esto indica que las células CAR-T proliferaron en una gran cantidad en el proceso de destrucción de tumor.
Ejemplo 13: investigación clínica exploratoria
Tras el procedimiento de producción estable para el plásmido PXL0085, se obtuvieron el vector lentiviral LV0020 y las células CAR-T mediante una investigación farmacéutica, se llevó a cabo una investigación clínica exploratoria para investigar su seguridad, tolerancia y eficacia preliminar y para explorar las características de PK/PD. Se siguieron los principios de BPC en esta investigación en cuanto a la preparación de muestras experimentales, investigadores e instituciones de investigación, esquemas experimentales, procedimientos para revisión ética y consentimiento informado, selección de inclusión así como diagnóstico y tratamiento para sujetos, notificación y tratamiento de reacciones adversas, recogida y análisis estadístico de datos experimentales, etc.
Se incluyó un total de cinco sujetos (respectivamente con los números 001, 002, 004, 005 y 007) con mieloma múltiple recidivante/que no responde al tratamiento y se trataron en la investigación clínica. Se evaluó el efecto terapéutico según los criterios de respuesta para mieloma múltiple recomendados por el grupo internacional de trabajo del mieloma (IMWG) 201®. La mejor tasa de respuesta global para los cinco sujetos alcanzó el 100%. Tres de los sujetos presentaron respuesta completa (CR), un sujeto presentó respuesta parcial (PR), un sujeto presentó respuesta mínima (MR) y las respuestas de los sujetos con PR y MR se mejoraron de manera continua (figura 17).
Ejemplo 14: ensayo para determinar el número de copias de ADN de CAR en sujetos
Se detectaron los números de copias de ADN del CAR en la sangre periférica de los cinco sujetos en el ejemplo 13 usando el método de PCR digital en gotitas (véase la descripción de Bio-Rad QX200), para evaluar las características farmacocinéticas de las células CAR-T. El resultado se muestra en la figura 18. Tras administrarse, el producto proliferó rápidamentein vivo,y todavía podía detectarse 60 días tras la administración. El tiempo hasta el pico del CAR-T en la mayoría de los sujetos fue de aproximadamente 10 días, y el tiempo hasta el pico del CAR-T en el sujeto 001 fue de 17 días.
Ejemplo 15: análisis farmacocinético en sujetos
Con el paquete NonCompart del software R 3.5.0, se analizaron adicionalmente los cambios de los números de copias de ADN del CAR en el ejemplo 14 y se calcularon parámetros relacionados con la farmacocinética. Los resultados se muestran en la tabla 13. En la tabla 13, T0 representa un tiempo en el que se observó inicialmente la concentración distinta de cero, la concentración pico de fármaco (Cmáx) representa un pico máximo para la concentración de fármaco, tiempo hasta el pico (Tmáx) representa un tiempo necesario para alcanzar una concentración pico de fármaco, AUC (0-28) representa un área bajo la curva integral desde el día 0 hasta el día 28, y AUC (0-CLST) representa un área bajo la curva integral desde 0 hasta el tiempo de observación final.
Tabla 13: investigación farmacocinética y análisis
Los resultados mostraron que el primer grupo de dosificación tenía una Cmáx promedio de (98644 ± 5000) número de copias/pg de ADN y un AUC (0-28) promedio de (1306653,3 ± 100000); y el segundo grupo de dosificación tenía una Cmáx promedio de (32487,5 ± 2000) número de copias/pg de ADN y un AUC (0-28) promedio de (317816,95 ± 150000).

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Receptor de antígeno quimérico (CAR), en el que el CAR comprende un dominio de unión a BCMA, un dominio transmembrana, un dominio coestimulante y un dominio de transducción de señales intracelular, el dominio de unión a BCMA comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo que puede unirse específicamente a un BCMA, y el anticuerpo comprende una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HCDR1), una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HCDR2) y una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3), en el que la HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, la HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y la HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y el anticuerpo comprende una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LCDR1), una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LCDR2) y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LCDR3), y en el que la LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, la LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, y la LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
  2. 2. CAR según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada, y la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, opcionalmente, en el que el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera, y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
  3. 3. CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla, preferiblemente en el que el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 43.
  4. 4. CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana derivado de proteínas seleccionadas de un grupo que consiste en la cadena a, p o C del receptor de células T, CD28, CD3e, CD45, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154, preferiblemente en el que el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
  5. 5. CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el dominio coestimulante comprende un dominio coestimulante derivado de proteínas seleccionadas de un grupo que consiste en CD28, 4-1BB, OX-40 e ICOS, preferiblemente en el que el dominio coestimulante comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 31.
  6. 6. CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el dominio de transducción de señales intracelular comprende un dominio de transducción de señales derivado de CD3C, preferiblemente en el que el dominio de transducción de señales intracelular comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
  7. 7. CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el CAR comprende además una región de bisagra que une el dominio de unión a BCMA al dominio transmembrana, preferiblemente en el que la región de bisagra comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
  8. 8. CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el CAR está unido además a un péptido señal, preferiblemente en el que el péptido señal comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
  9. 9. CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el CAR está unido además a un péptido de escisión, preferiblemente en el que el péptido de escisión comprende una secuencia de aminoácidos derivada de un péptido T2A, preferiblemente en el que el péptido de escisión comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
  10. 10. CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 51.
  11. 11. Molécula de ácido nucleico aislada, que codifica para el CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 10, preferiblemente en el que la molécula de ácido nucleico aislada que codifica para CAR comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 52.
  12. 12. Vector, que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11, preferiblemente en el que el vector se selecciona de un plásmido, un vector retroviral y un vector lentiviral.
  13. 13. Célula efectora inmunitaria, que comprende el CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11 o el vector según la reivindicación 12, preferiblemente en el que la célula efectora inmunitaria se selecciona de un linfocito T y un linfocito citolítico natural (NK).
  14. 14. Método de preparación de una célula efectora inmunitaria, que comprende introducir el vector según la reivindicación 12 en la célula efectora inmunitaria.
  15. 15. Composición, que comprende la célula efectora inmunitaria según la reivindicación 13.
  16. 16. CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11, vector según la reivindicación 12 o célula efectora inmunitaria según la reivindicación 13, para su uso en el tratamiento de enfermedades o estados asociados con la expresión de BCMA, en el que las enfermedades o estados asociados con la expresión de BCMA son cánceres o tumores malignos.
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