CN109661239A - 通过抑制fsh/fshr减少肥胖的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于减少肥胖的组合物和方法，其通过抑制有此需要的受试者中的FSH/FHSR进行。

Description

通过抑制FSH/FSHR减少肥胖的组合物和方法

I.对相关申请的交叉引用

本申请要求2016年7月29日提交的美国临时专利申请序列号62/368,651(其公开通过引用整体并入本文)和2017年5月23日提交的美国临时专利申请序列号62/510,087(其公开通过引用整体并入本文)的优先权。

II.关于联邦基金的声明

本发明是在国立卫生研究院(NIH)的拨款号R01DK80459、R01DK113627、R01AG40132、R01AG23176、R01AR06592和R01AR06066的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。

III.发明领域

本发明的领域是用于减少有此需要的受试者中的肥胖的组合物和方法。

IV.发明背景

女性围绝经期转变(perimenopausal transition)与总体脂(body fat)增加以及能量消耗和身体活动(physical activity)递减有关，所有这些都影响生活质量。特别地，晚期围绝经期(perimenopause)的特征在于内脏肥胖(visceral adiposity)的急剧增加，这与破坏的能量平衡和降低的身体活动的出现相一致。围绝经期的特征还在于相对稳定的雌激素和升高的促卵泡激素(FSH)水平，其随着生殖能力停止而增加。FSH是由垂体合成和分泌的糖蛋白激素。它通过与其在卵巢滤泡细胞上的受体FSH受体相互作用而引起雌激素的合成和分泌。雌激素水平继而通过公知的反馈机制控制从垂体的FSH释放。因此，当雌激素升高时，FSH下降。然而，FSH从未直接涉及引起肥胖的增加。因此，需要鉴定促成内脏肥胖增加的其他因素以及迫切需要减少内脏肥胖的治疗。

V.发明概述

本公开涉及令人惊讶的发现，即抑制促卵泡激素(FSH)与其受体(FSHR)结合通过减少白色脂肪组织(WAT)和增加产热的“褐色”脂肪组织来减少有此需要的受试者的肥胖，以及特异性结合并抑制FSH的单克隆抗体及其抗原结合部分。

在一些实施方案中，本公开包含抗FSH抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗FSH抗体是单克隆抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分包含Hf2或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分特异性结合SEQ ID NO:1内的表位。在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分特异性结合SEQ ID NO:2内的表位。

在一些实施方案中，抗FSH抗体具有可变重链区。在一些实施方案中，可变重链区包含SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，抗FSH抗体具有可变重链区，其与SEQ ID NO:7具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO:7具有至少一个保守取代。在一些实施方案中，抗FSH抗体具有可变轻链区。在一些实施方案中，可变轻链区包含SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，抗FSH抗体具有可变轻链区，其与SEQ ID NO:8具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO:8具有至少一个保守取代。

在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分具有可变重链区的一个或多个互补决定区(CDR)，其包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11中的一个或多个。在一些实施方案中，可变重链区的一个或多个CDR与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11中的一个或多个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11中的一个或多个具有至少一个保守取代。

在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分具有可变轻链区的一个或多个互补决定区(CDR)，其包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中的一个或多个。在一些实施方案中，可变轻链区的一个或多个CDR与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14中的一个或多个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中的一个或多个具有至少一个保守取代。

在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分具有包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:11、或基本上由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:11组成但是在SEQ ID NO:9、SEQID NO:19、和SEQ ID NO:11中的一个或多个中具有至少一个保守取代的序列的相应序列。在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分具有包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、和SEQ ID NO:14、或基本上由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、和SEQ ID NO:14组成但是在SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、和SEQ ID NO:14中的一个或多个中具有至少一个保守取代的序列的相应序列。

在一些实施方案中，本公开包含核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列编码抗FSH抗体或其抗原结合部分的重链和/或轻链。在一些实施方案中，核酸具有一个或多个保守取代。在一些实施方案中，核酸是密码子优化的。在一些实施方案中，核酸序列包含SEQID NO:3。在一些实施方案中，核酸与SEQ ID NO:3具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3具有至少一个保守取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3是密码子优化的。在一些实施方案中，核酸序列包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，核酸与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，SEQ IDNO:4具有至少一个保守取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4是密码子优化的。

在一些实施方案中，本公开包含载体或载体的系统，其含有编码本公开的抗FSH抗体或其抗原结合部分的重链和/或轻链的一种或多种核酸序列。在一些实施方案中，载体或载体系统包含编码本公开的抗FSH抗体或其抗原结合部分的可变重链区的核酸序列。在一些实施方案中，载体或载体系统包含编码本公开的抗FSH抗体或其抗原结合部分的可变轻链区的核酸序列。在一些实施方案中，编码重链的核酸序列与编码轻链的核酸序列在同一载体上。在一些实施方案中，编码可变重链区的核酸序列与编码可变轻链区的核酸序列位于不同的载体上。在一些实施方案中，载体或载体系统是一种或多种质粒。在一些实施方案中，载体或载体系统是一种或多种噬菌体载体。在一些实施方案中，噬菌体载体是γ噬菌体。在一些实施方案中，一种或多种载体包含一种或多种粘粒。在一些实施方案中，载体或载体系统是一种或多种重组染色体。在一些实施方案中，载体系统是不同载体的组合。在一些实施方案中，不同核酸序列的表达可以是伴随的。在其他实施方案中，不同核酸序列的表达可以是分开可诱导的。在另一个实施方案中，本公开涉及载体或载体系统，其含有编码本公开的抗FSH抗体或其抗原结合部分的一条或多条重链和/或轻链的一个或多个互补决定区(CDR)的一种或多种核酸序列。在一些实施方案中，本公开涉及用本公开的载体或载体系统转化的细胞。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞、酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是下列之一：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DUXB11、DG44和CHOK1谱系，NS0鼠骨髓瘤细胞，PER.C6细胞和人胚肾(HEK)细胞，包括HEK293谱系。

在一些实施方案中，本公开包括制备重组抗FSH抗体或其抗原结合部分的方法。在一些实施方案中，重组抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，重组抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，方法包括以下步骤：(i)用至少一种载体转化宿主细胞，所述载体含有编码下列至少一项的至少一种核酸序列：1)本公开的抗FSH抗体或其抗原结合部分的重链和轻链或2)本公开的抗FSH抗体或其抗原结合部分的一条或多条重链和/或轻链的至少一个或多个互补决定区(CDR)，(ii)表达至少一种核酸序列以创建重组抗FSH抗体或其抗原结合部分，和iii.回收重组抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，本公开涉及包含一种或多种本公开的抗FSH抗体或其抗原结合部分的试剂盒。

在一些实施方案中，本公开包括减少有此需要的受试者的肥胖的方法。在一些实施方案中，减少肥胖的方法包括减少有此需要的受试者中白色脂肪组织(WAT)的方法。在一些实施方案中，减少肥胖的方法包括诱导有此需要的受试者中产热脂肪组织的方法。在一些实施方案中，本公开包括减少内脏肥胖的方法。在一些实施方案中，本公开包括治疗肥胖的方法。在一些实施方案中，本公开包括治疗肥胖相关病症的方法。在一些实施方案中，肥胖相关病症是多囊卵巢综合征(PCOS)。

在一些实施方案中，方法包括对所述受试者施用治疗有效量的包含FSH灭活剂(inactivating agent)的组合物。在一些实施方案中，方法包括对所述受试者施用治疗有效量的包含FSHR灭活剂的组合物。在一些实施方案中，FSH灭活剂是肽。在一些实施方案中，FSH灭活剂是核酸。在一些实施方案中，FSH灭活剂是siRNA。在一些实施方案中，FSH灭活剂是分子。在一些实施方案中，FSHR灭活剂是肽。在一些实施方案中，FSHR灭活剂是核酸。在一些实施方案中，FSHR灭活剂是siRNA。在一些实施方案中，FSHR灭活剂是分子。在一些实施方案中，FSHR灭活剂是抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体或稀释剂。

在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分是多克隆抗体。在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分是重组抗体。在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分包含Hf2或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分是本公开的抗FSH抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分是人源化抗体。在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分是人抗体。在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分是单链可变片段(scFv)。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分特异性结合FSH。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分特异性结合FSHR。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分特异性结合FSH的β亚基内的一个或多个表位。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分特异性结合SEQ ID NO:1内的一个或多个表位。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分特异性结合SEQ ID NO:2内的一个或多个表位。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1具有保守取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:2具有保守取代。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含本发明的任何抗FSH抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分包含Hf2或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，受试者是人受试者。在一些实施方案中，受试者是人女性。在一些实施方案中，受试者是人男性。在一些实施方案中，受试者是绝经期人女性。在一些实施方案中，受试者是绝经前的人女性。在一些实施方案中，受试者是围绝经期的人女性。

在一些实施方案中，本公开包括用于制备用于减少人受试者中肥胖的药物的组合物。在一些实施方案中，药物用于减少白色脂肪组织。在一些实施方案中，药物用于诱导人受试者中的产热脂肪组织(thermogenic adipose tissue)。在一些实施方案中，组合物包含根据本公开的任何方面的FSH灭活剂。在一些实施方案中，组合物包含根据本公开的任何方面的FSHR灭活剂。

VI.附图简述

图1A，1B，1C，1D和1E表示单克隆抗FSH抗体Hf2(其针对人FSHβ表位，SEQ ID NO:1产生)明显降低体重和WAT，并诱导喂养高脂肪饮食的小鼠中的褐化(beiging)。单克隆抗体Hf2针对具有13个氨基酸长的人FSHβ序列LVYKDPARPKIQK(SEQ ID NO:1)的基序产生，所述人FSHβ序列对应于小鼠FSHβ序列LVYKDPARPNTQK(SEQ ID NO:2)，针对所述小鼠FSHβ序列产生实施例2中使用的多克隆抗体。Hf2在ELISA中特异性结合人FSHβ。实施例1中显示了Hf2的序列数据。图1A，1B，1C和1D显示了约9周暴露于对配对喂养(pair-fed)高脂肪饮食的6个月龄雄性C57BL/6J小鼠每天注射的Hf2或小鼠IgG(每天每只小鼠200μg，腹膜内)的效果。(见方法)。图1A显示食物摄入；图1B显示体重；图1C显示脂肪量、FM/TM和LM/TM(定量NMR)；图1D显示TFV、SFV和VFV(微-CT、冠状和横切切片；(图1A，1B，1C和1D中每组n＝5)。图1E显示荧光和亮视野显微照片，其显示在vWAT的冻结切片中的Ucp1免疫染色。DAPI：核染色。阴性对照：无关IgG替换经Hf2处理的小鼠中的第一抗体。在vWAT中在Hf2处理的情况下Ucp1免疫染色显著增加，伴随细胞凝结(cell condensation)，暗示褐化。双因素Student’s t检验(Two-tailed Student’s t-test)，**P≤0.01；均值±s.e.m。对于体重变化，见源数据。

图2A，2B，2C，2D和2E表示抗FSH抗体阻断血浆中生理FSH浓度的FSH-FSHR相互作用。图2A表示重组小鼠FSH(FSHα-FSHβ嵌合体，2μg)通过具有固定化多克隆抗FSH抗体或山羊IgG的树脂。收集洗脱(洗脱液)、流过液(流动)和连续清洗级分(清洗)，并如所示用单克隆抗FSH抗体Hf2免疫印迹。图2B表示FSHα-FSHβ嵌合体的线性序列(SEQ ID NO:17)。通过质谱法匹配的来自经胰蛋白酶处理的洗脱液的肽以红色标记，其中接头肽显示为红色实心圆圈。针对LVYKDPARPNTQK(SEQ ID NO:2)产生多克隆抗FSH抗体。图2C表示人FSH-FSHR复合物的晶体结构(PDB代码4AY9；为了清楚未显示FSHα)表示来自FSHβ亚基的环(其含有序列LVYKDPARPKIQK(SEQ ID NO:1))进入由FSHR产生的小沟(i)。具有肽序列LVYKDPARPNTQK(SEQ ID NO:2)的FSH的计算建模显示相同的结合模式(ii)。肽表面的带正电荷的残基互补FSHR结合位点的带负电荷的残基，以在结合表面产生强静电相互作用(箭头)(iii)。鉴于沟的小尺寸(iv)，抗体与肽序列的结合将完全屏蔽FSHβ进入FSHR结合袋。图2D表示使用Thermo细胞，抗FSH抗体阻断FSH作用的实验证实，所述Thermo细胞具有插入Ucp1基因10的起始密码子的Luc2-T2A-tdTomato转基因。Thermo细胞保留BAT容量并使用Luc2作为报告物报告Ucp1活化。在不含胎牛血清(无内源性FSH)的情况下用Arb3激动剂CL-316,243(10^-7M)测试Fsh(30ng ml^-1)和抗FSH抗体(如记录的浓度)对Ucp1表达的影响。值得注意的是，1μgml^-1抗-FSH抗体消除了近循环水平的FSH对Ucp1表达的抑制作用。平均值≠s.d.；*P≤0.05，**P≤0.01；一式三份。图2E表示在单次注射抗体(100μg，腹膜内)后，在小鼠血清中测量为山羊IgG(ELISA)的抗FSH抗体产生血清山羊IgG(抗体)浓度，其比体外抑制FSH作用所需要的浓度高10-20倍(t1/2＝25.6h)n＝3每组(双因素学生t检验，平均值±s.e.m.)。

图3A，3B，3C，3D，3E，3F，3G，3H，3I，3J，3K和3L表示抗FSH抗体对喂养高脂肪饮食的小鼠的体脂和能量稳态的影响。图3A表示双能X射线吸光测定法(dual energy X-rayabsorptiometry)(DXA)(每组n＝12或11)。图3B和3C表示iWAT、性腺WAT(gWAT)和BAT的组织重量测量(每组n＝9或10)。图3D表示抗FSH抗体在热中性(30℃)条件下对体脂的影响。将3月龄雄性小鼠饲养在30℃，以高脂肪饮食喂养，并注射抗体或IgG(每只小鼠每天200μg，腹膜内)3周，以测量体重、脂肪和瘦体重(lean mass)(通过qNMR))(每组n＝3或4)。图3E表示在用抗体或山羊IgG(每只小鼠每天200μg，腹膜内)处理7周的3个月龄的雌性小鼠组的样品中测量的血浆去甲肾上腺素水平(HPLC)，其后杀死各组内的一半动物，并且另一半用酪氨酸羟化酶抑制剂α-甲基-对酪氨酸(AMPT，250mg kg^-1，用125mg kg^-1在2小时后重复注射，腹膜内)(每组n＝7或8)处理。在最后一次AMPT注射后2小时抽血。图3F表示用抗体或山羊IgG(每只小鼠每天200μg，腹膜内，对于IgG和抗FSH抗体，每组分别5和7个)处理3个月龄的小鼠后测量的血浆鸢尾素(irisin)水平(ELISA试剂盒，Phoenix EK-067-29)。还测量血清镍纹蛋白样物(meteorinlike)(metrnl)(ELISA试剂盒，R&D，DY7867)；所有样品均低于测定法检测。图3G表示GTT的测量。图3H表示ITT的测量。图3I代表激素测量。图3J表示脂质测量。图3K表示E2测量。双因素学生t检验；*P≤0.05，**P≤0.01，^P＝0.0588，^^P＝0.065，或如所示；平均值±s.e.m.。图3L表示用p-样条回归分解TEE。对于典型的量热法和活动数据集，显示了RMR和AEE(PA)(显示为AEE)的连续时间估计。p-样条回归模型通过最小化实际和预测能量消耗(AEE+RMR)之间的差异，从活动和能量消耗数据之间的时间相关性来估计RMR。通过在回归模型中使用样条(spline)函数替换常数截距，可以确定在RMR中发生的自然时间变化，并获得平均RMR和AEE的准确估计。

图4A，4B和4C表示抗FSH抗体在高脂肪饮食的小鼠中减少肥胖。将多克隆抗FSH抗体(Ab)或山羊IgG(每只小鼠每天200μg)腹膜内注射至配对喂养高脂肪饮食的3个月龄雌性(F)和雄性(M)C57BL/6J小鼠中达8周。图4A表示食物摄取和体重相关性。图4B表示通过定量NMR测量的脂肪量、FM/TM和LM/TM(每组n＝4或5只小鼠)。图4C表示通过微-CT测量的TFV、SFV和VFV(来自相同实验的代表性冠状和横切切片；内脏，红色；皮下，黄色)(每组n＝5只小鼠)。双因素学生t检验；*P≤0.05，**P≤0.01；平均值±s.e.m.。

图5A，5B和5C表示抗FSH抗体在高脂肪饮食的小鼠中减少肥胖，测量每日注射到配对喂养高脂肪饮食的8个月龄C57BL/6雄性小鼠(每组n＝2或3只小鼠)中的抗FSH抗体或山羊IgG(每只小鼠每天200μg，腹膜内)的效果。图5A表示食物摄取和体重。图5B表示脂肪量、FM/TM和LM/TM。图5C表示冠状和横切切片；内脏，皮下。双因素学生t检验；*P≤0.05，**P≤0.01；平均值±s.e.m.。

图6A，6B和6C表示Fshr-单倍体不足(haploinsufficient)的雄性小鼠表型模拟(phenocopy)抗FSH抗体的抗肥胖作用并且不能响应抗体，证实了体内抗体特异性。图6A表示总质量(TM)、脂肪量(FM)和FM/TM(定量NMR)。图6B表示TFV、SFV和VFV(微-CT、冠状和横切切片)。图6C表示sWAT切片的Ucp1免疫染色显示Fshr+/-小鼠和抗体处理的野生型小鼠中较小且密集染色的褐色样细胞。双因素学生t检验；*P≤0.05，**P≤0.01；平均值±s.e.m.。

图7A，7B和7C表示抗FSH抗体在卵巢切除小鼠中的作用。对喂养正常食物的卵巢切除或假手术小鼠注射抗FSH抗体或山羊IgG(分别对假手术和切除卵巢的小鼠，每天每只小鼠200和400μg)。图7A表示食物摄取和体重(每组n＝5)。图7B表示血浆FSH和雌激素(E2)水平(卵巢切除术后几乎检测不到血浆E2)(每组n＝4或5)。图7C表示抗FSH抗体或IgG不改变血浆葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯或游离脂肪酸(每组n＝4或5只小鼠)。双因素学生t检验；**P≤0.01，或如所示。

图8A，8B和8C表示抗FSH抗体减少卵巢切除小鼠的肥胖。对喂养正常食物的卵巢切除(OVX)或假手术小鼠注射抗FSH抗体或山羊IgG(每天200-400μg)达8周。图8A表示如通过定量NMR测量的脂肪量、FM/TM和LM/TM(每组n＝5或9只小鼠，合并)。图8B表示通过微-CT测量的随意进食的小鼠中的TFV、VFV和SFV(横切切片；粉红色，内脏；白色，皮下)(每组n＝4只小鼠)。图8C表示通过锇微-CT测量的两个感兴趣体素(voxel)(VOI1和VOI2)(每组n＝3只小鼠)上的以MAT/总体积(TV)定量的骨髓脂肪组织(MAT；白色)。图8B和图8C中的图像是来自各自实验的代表性图像。双因素学生t检验；^P＝0.067，*P≤0.05，**P≤0.01；平均值±s.e.m.。

图9A，9B，9C，9D，9E和9F表示抗FSH抗体降低以正常食物喂养的小鼠的体脂。对3个月龄的C56BL/6J雌性小鼠配对喂养(图9A，9B和9C)或随意喂养(图9D，9E和9F)正常食物，并分别注射抗FSH抗体或IgG(每只小鼠每天100μg)7周和5周。对于配对喂养，将由IgG组随意食用的食物量给予抗体处理组。对于随意喂养，允许抗体处理组随意获取食物，并且对IgG组给予相同量的食物，测量剩余食物以确定IgG组的食物摄入。在随意喂养方案中注意到由经抗体处理的小鼠的食物摄入的显著增加。尽管如此，与喂养高脂肪饮食的小鼠一样，在任一种喂养方案中，在配对喂养的小鼠中的定量NMR上，抗体处理导致总质量(TM)、脂肪量(FM)和FM/TM的显著降低以及LM/TM的增加。也降低体重。然而，虽然抗体处理的小鼠比注射IgG的小鼠食用实质性更多的食物，但它们显示FM和FM/TM的减少，但没有显示TM或体重的减少。微-CT显示胸腹脂肪的大大减少，在代表性的冠状和横切切片中，并且在这两组中TFV、SFV和VFV定量后可见。

图10A和10B表示Sanger测序证实脂肪细胞上FSHR的表达。图10A表示从源自间充质干细胞的脂肪细胞(MSC-ad)中提取总RNA，所述脂肪细胞从小鼠耳垂或3T3.L1细胞中分离并在分化培养基(MDI，含有IBMX、地塞米松和胰岛素)中培养。将总RNA逆转录，并且使用重叠引物组(粗线)进行PCR以扩增三个大的cDNA片段。箭头显示了用于Sanger测序的引物覆盖的重叠区域。MSC-ad细胞中Fshr的序列与小鼠卵巢Fshr(GenBank ID：NM_013523.3)相同。3T3.L1细胞Fshr缺乏外显子2(红色框)并显示三种氨基酸变异(H158Y、F190L和K243E)，但就其响应FSH减少cAMP水平和Ucp1表达的能力而言是完全功能性的。图10B表示FSH还触发脂肪生成基因Fas和Lpl的上调，Pparg略微增加(倍数变化；qPCR，三个生物重复，一式三份)。在脂肪细胞中信号传导有效的FSHR的存在与GTex和GeneCard数据库中人脂肪组织中的FSHR基因表达一致。同样发现WAT中的Fshr表达低于卵巢中：1.00±0.47对13.8±1.31(倍数变化，qPCR，P≤0.01，每组n＝3或4只小鼠，一式三份测量)。双因素学生t检验，平均值±s.e.m.。

图11A，11B，11C，11D和11E表示用抗FSH抗体处理阻断FSH-FSHR相互作用以激活Ucp1。图11A表示用iWAT、vWAT和BAT切片的抗Fshr抗体进行免疫染色(每组4只小鼠的代表)。图11B表示分化的3T3.L1细胞中的环AMP水平(3个生物样品，一式两份)。PTX，百日咳毒素。图11C表示在10％(v/v)FBS(含有Fsh)中培养的Thermo细胞中的Luc2活性(三个生物学重复)。图11D表示在将1.5x10⁶个Thermo细胞植入两个体侧(两只小鼠也移植到上躯干)(每组3或4只小鼠)后，注射抗FSH抗体或IgG(每天200μg，腹膜内，8周)的nu/nu小鼠(以正常食物喂养)中的Luc2辐射。对照：注射d-萤光素的两个非转基因小鼠。图11E表示来自图11D中的实验的细胞植入区域的冷冻切片中的tdTomato荧光。双因素学生t检验，*P≤0.05，**P≤0.01，^P＝0.0756；平均值±s.e.m.。

图12A，12B，12C和12D表示抗FSH抗体诱导褐色样脂肪组织。在注射抗FSH抗体或山羊IgG(每只小鼠每天200μg，腹膜内，8周)到配对喂养高脂肪饮食的3个月龄雌性C57BL/6J小鼠(每组n＝4或5只小鼠)后，iWAT的苏木精和曙红染色切片中的细胞大小和周长(图12A)和iWAT(图12B)和BAT(图12C)的Ucp1免疫染色。图12D表示在1和3个月(1M和3M)的抗体或IgG处理(相对于持家基因和相对于IgG标准化)后BAT和WAT中基因的相对表达(3或6个生物重复，通过qPCR，一式三份)。双因素学生t检验；平均值±s.e.m.；*P≤0.05，**P≤0.01。

图13A和13B表示抗FSH抗体改变WAT和BAT中的基因表达。对配对喂养高脂肪饮食的3个月龄雌性C57BL/6J小鼠每天注射抗FSH抗体或山羊IgG(每天每只小鼠200μg，腹膜内)8周。图13A显示BAT对WAT(相对于持家基因和iWAT标准化)的基因(注明的名称)的相对表达。图13B显示与脂肪细胞褐化一致的是在1或3个月时iWAT和BAT中增强的棕色(brown)基因表达(qPCR)(相对于持家基因和相对于IgG标准化)。双因素学生t检验；平均值±s.e.m.；*P≤0.05(qPCR，n＝3或6个生物学重复，一式三份测量)。

图14A，14B和14C表示抗FSH抗体触发Ucp1活化并增强线粒体生源。3个月龄的雄性Thermo小鼠配对喂养高脂肪饮食并在室温用抗FSH抗体或山羊IgG(每天每只小鼠200μg)处理8周(n如显示)(图14A)或在热中性(30℃)条件下处理2.5周(每组n＝3或4只小鼠)(图14B)。ROI，感兴趣区域。对照，注射d-萤光素的非转基因小鼠。双因素学生t检验；*P≤0.05，^P＝0.060，^^P＝0.051；平均值±s.e.m.。图14C显示用于产生PhAM^切除小鼠的构建体(mito：Cox8线粒体定位信号)。在抗体或IgG处理2周后，在sWAT、vWAT和BAT中捕获荧光。来自每组使用三只小鼠的实验的代表性图像。

图15表示FSHR基因缺失对总体肪的影响，其通过对不同年龄的小鼠中总体肪的双能X射线吸光测定法测量，如所示。

发明详述

如本文所用，术语“抗体”(Ab)以最广义使用，并且具体地可以包括任何免疫球蛋白，无论是天然的还是部分或完全合成产生的，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体和多反应性抗体)和抗体片段。因此，如本说明书中任何上下文中使用，术语“抗体”意在包括但不限于任何特异性结合成员、免疫球蛋白类和/或同种型(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE)及其生物相关片段或特异性结合成员，包括但不限于Fab、F(ab')₂、scFv(单链或相关实体)和(scFv)₂。

如本文所用，术语“抗体片段”可以包括使用本领域普通技术人员容易已知和可获得的技术获得的那些抗体片段，如本文所述。因此，除了上文所述的“抗体”的定义之外，术语“抗体”还可以包括任何包含完整抗体的一部分的多肽或蛋白质，例如完整抗体的抗原结合区或可变区。这些可以源自天然来源，或者它们可以部分或完全合成产生。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体和线性抗体。

术语“特异性结合”和“选择性结合”可以指抗体结合预定抗原上的表位但不结合其他抗原。通常，抗体以约小于10^-6M，例如约小于10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或甚至更低的平衡解离常数(K_D)结合，当通过例如平衡透析或2000表面等离振子共振仪中的表面等离振子共振(SPR)技术，使用预定抗原(例如FSH和/或FSHR上的表位)作为分析物和抗体作为配体，或对抗体对抗原阳性细胞的结合的Scatchard分析测定时，以及(ii)以亲和力结合预定抗原，所述亲和力比其对预定抗原或密切相关抗原外的非特异性抗原(例如BSA，酪蛋白)结合的亲和力大至少两倍。

如本文所用，术语“表位”可以指与抗体或T细胞结合的抗原区域，例如FSH的beta(β)亚基内的区域，包括但不限于SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2内的表位。“抗原”是指引发免疫反应或结合所述反应的产物的物质。

如本文所用，术语“促卵泡激素”和/或“FSH”可以指促性腺激素，一类糖蛋白多肽激素。FSH由前叶垂体的促性腺细胞合成和分泌，并参与调节身体的发育、生长、成熟和生殖过程。FSH是35.5kDa糖蛋白异二聚体，具有两个多肽单元，alpha(α)和beta(β)亚基。FSH在结构上类似于促黄体激素(LH)、促甲状腺激素(TSH)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)，共享相同的alpha(α)亚基，但是具有beta(β)亚基中的变异。这使得beta(β)亚基成为FSH抑制剂的有吸引力的治疗靶标，因为靶向beta(β)亚基(例如位于beta(β)亚基内的一个或多个表位)的抑制剂可以特异于抑制FSH。编码人FSH的beta(β)亚基的示例性基因可以在例如登录号NM_000510获得。编码鼠FSH的beta(β)亚基的示例性基因可以在例如NM_008045获得。本领域普通技术人员将能够从提供的核苷酸序列达到预测的氨基酸序列。

如本文所用，术语“促卵泡激素受体”和/或“FSHR”可以指与FSH相互作用的跨膜受体。FSHR是G蛋白偶联受体(GPCR)。FSHR的激活对于FSH的激素功能发挥是必需的。FSH的beta(β)亚基对于结合FSHR是必需的，因此beta(β)亚基对FSH赋予其特异性生物作用。因此，由于FSH的生物活性依赖于对FSHR的结合，可以通过直接灭活FSH，例如通过结合FSH的beta(β)亚基，或通过直接灭活FSHR来实现抑制FSH的生物活性。这是因为灭活FSHR将与灭活FSH类似导致生物活性的丧失，因为生物活性依赖于FSH和FSHR之间的结合。编码人FSHR的示例性基因可以例如登录号XM_011532734(转录物变体X2)或XM_011532733(转录物变体X1)获得。编码FSHR的示例性基因可以在例如登录号NM_013523.3获得。本领域普通技术人员将能够从提供的核苷酸序列达到预测的氨基酸序列。

如本文所用，术语“FSH灭活剂”定义为降低FSH的生物活性或生物利用度的试剂。FSH灭活剂可以通过直接或间接结合FSH来实现减少，例如在抗FSH抗体或类似的肽或分子的情况下，或者试剂可以阻止FSH从前叶垂体中释放。在siRNA的情况下，FSH灭活剂可以阻止编码FSH的mRNA的翻译。如本文所用，术语“FSHR灭活剂”定义为减少或阻止FSHR下游信号传导的试剂。FSHR灭活剂可以通过阻断受体并阻止FSH与FSHR结合来实现减少或预防，例如，通过直接或间接结合FSHR，例如在抗FSHR抗体或类似肽或分子的情况下，或试剂可以允许FSH结合FSHR，但是在其它情况下阻断下游信号传导。在siRNA的情况下，FSHR灭活剂可以阻止编码FSHR的mRNA的翻译。

如本文所用，术语“载体”可以包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其在采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒。药学上可接受的载体通常是含水pH缓冲溶液。生理学上可接受的载体的实例包括但不限于缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括但不限于抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如但不限于血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如但不限于聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如但不限于甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括但不限于葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如但不限于EDTA；糖醇，例如但不限于甘露醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如但不限于钠；和/或非离子表面活性剂，例如但不限于TWEEN；聚乙二醇(PEG)和PLURONICS。此类组分的任何组合(包括可能包含抑菌剂)可用于填充本公开的配制剂。

如本文所用，术语“治疗”或“处理”疾病可以指进行方案，其可以包括向患者(人或其他)施用一种或多种药物，以努力减轻疾病的体征或症状。因此，在治疗肥胖，包括内脏和/或中央肥胖(central adiposity)的情况下，“治疗”或“处理”可以出现在推进治疗过程以减少患者的肥胖的情况下，如通过例如总或全体白色脂肪组织的减少和/或产热褐色脂肪组织增加测量。缓解可以在疾病的体征或症状出现之前以及其出现之后发生。因此，“治疗”或“处理”包括“预防”疾病。术语“预防”指预防和/或防范措施，其中目的是预防或减缓目标病理状况或病症。例如，在阻止肥胖，包括内脏和/或中央肥胖的情况下，“预防”可以出现在推进治疗过程的情况中，以便防止或阻止肥胖的增加，如通过例如白色脂肪组织累积的减少或减缓测量。另外，“治疗”或“处理”不需要完全缓解体征或症状，不需要治愈，并且具体包括可以对患者仅具有边际效应的方案。

如本文所用，术语“同源性”可以指两种组合物之间共有结构的存在。在蛋白质背景中的术语“同源性”可以指两个或更多个氨基酸和/或肽序列之间重叠的量(例如以百分比表示)。在核酸的背景中，术语可以指两个或更多个核酸序列之间重叠的量(例如以百分比表示)。如本文所用，两个序列之间的百分比(％)同源性等同于两个序列之间的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数(即％同源性＝相同位置的数目/位置总数x 100)，考虑缺口的数目和每个缺口的长度，其为了两个序列的最佳比对而需要引入。可以使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定。通过局部比对工具和/或算法在本领域中充分表示此类同源性，并且可以包括成对比对、多序列比对方法、结构比对方法和/或系统发育分析方法。在序列在保守取代中不同的情况下，序列同一性百分比可以(但不一定)向上调整以校正取代的保守性质。进行此种调整的手段是本领域技术人员公知的。通常但不一定，这涉及将保守取代评分为部分错配而非完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，在对相同氨基酸给予得分1并且对非保守取代给予得分0的情况下，对保守取代给予0和1之间的得分。

如本文所用，术语“共施用”和“与......组合”可以指对受试者施用至少两种试剂或疗法。在一些实施方案中，两种或更多种试剂/疗法的共施用是同时的。在其他实施方案中，在第二试剂/疗法之前施用第一试剂/疗法。本领域技术人员理解，所使用的各种试剂/疗法的配制剂和/或施用途径可以变化。

如本文所用，术语“保守序列修饰”或“保守取代”可以指对本公开的靶表位或抗体和其抗原结合部分的氨基酸修饰，其不显著影响或改变抗FSH抗体的结合特征，例如但不一定是Hf2及其抗原结合部分，或针对表位的抗FSHR抗体，包括但不限于SEQ ID NO:1和SEQID NO:2。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术将修饰引入本发明的抗体中，例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、beta-支链侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本公开的抗FSH或抗FSHR抗体特异性结合的靶表位(例如，对于一些抗FSH抗体，FSH的beta(β)亚基上的表位)内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且本公开的抗体可以针对可测试的靶表位进行测试，例如使用本文所述或本领域以其它方式已知的功能测定法进行。同样地，本发明抗体(例如Hf2)的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的抗体的保留功能。

如本文所用，术语“患者”可以指可以施用治疗的生物系统。生物系统可以包括例如个别细胞、细胞组(例如细胞培养物)、器官、组织或多细胞生物体。“患者”可以指人患者或非人患者。在一些实施方案中，术语“患者”意指女性患者。在一些实施方案中，术语“患者”意指男性患者。在一些实施方案中，术语“患者”意指绝经期女性患者。在一些实施方案中，术语“患者”意指绝经前的女性患者。在一些实施方案中，术语“患者”意指围绝经期的女性患者。

如本文所用，术语“纯化的”或“分离的”抗体、肽、多肽或蛋白质可以指已经与其天然相关的其他蛋白质、脂质和核酸分离的肽、多肽或蛋白质。多肽/蛋白质可以按干重计占至少10％(即，10％至100％之间的任何百分比，例如20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,85％,90％,95％和99％)的纯化的制备物。纯度可以通过任何合适的标准方法测量，例如，通过柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。本公开中描述的分离的多肽/蛋白质(例如，抗FSH或抗FSHR抗体)可以通过重组DNA技术产生。

本公开提供了能够结合和/或灭活或抑制促卵泡激素(FSH)和/或促卵泡激素受体(FSHR)的试剂。在一些实施方案中，本公开提供减少有此需要的受试者的肥胖的方法，包括施用治疗有效量的FSH抑制剂和/或FSHR抑制剂。在一些实施方案中，通过内脏体肪的减少发生肥胖的减少。在一些实施方案中，通过白色脂肪组织(WAT)的减少发生肥胖的减少。在一些实施方案中，通过产热脂肪组织的增加发生肥胖的减少。

一种示例性类型的抑制剂是在本文中更详细地讨论的抗FSH和抗FSHR抗体，例如Hf2及其抗原结合部分。然而，本公开明确不限于此。FSH/FSHR抑制剂可以包括小分子、蛋白质、肽、核酸、抗体等。编码FSH和FSH受体的核酸是已知的。因此，针对任一种或两种的反义分子可用于本公开。类似地，针对FSHR的siRNA在本公开中可用于降低脂肪细胞上FSH受体的水平，从而减少肥胖。此外，Arey等人已经描述了一种能够抑制FSH作用的新型合成分子。此化合物(7-[4-[双-(2-氨基甲酰基-乙基)-氨基]-6-氯-(1,3,5)-三嗪-2-基氨基)-4-羟基-3-(4-甲氧基-苯偶氮基)-萘]-2-磺酸，钠盐)是FSHR的选择性非竞争性抑制剂，并且更详细地记载于Arey et al(Endocrinology,2002October；143(10):3822-9。此外，美国专利No.6,426,357描述了一类小分子噻唑啉酮(thiazolidinone)FSH受体拮抗剂。此外，此类试剂可以通过与二膦酸盐(bisphosphonate)或类似化合物(以将其靶向到骨)或TAT(一种用于细胞内递送的短肽)的融合构建体递送(2001July；24(3):247-56；MethodsEnzymol.2001；332:36-49)。另外，美国专利No.6,583,179描述了一系列作为FSH拮抗剂的新的取代的氨基烷基酰胺衍生物。

在示例性实施方案中，本公开提供了抗FSH和抗FHSR抗体及其抗原结合片段。如本文所公开的，抗FSH或抗FSHR抗体可以采用本领域中的多种形式之一。抗体部分地由与它们结合的抗原限定，因此，“抗FSH抗体”是特异性结合FSH上发现的至少一个表位的任何此类抗体，并且“抗FSHR抗体”是特异性结合FSHR上发现的至少一个表位的任何此类抗体。在一些实施方案中，表位位于FSH的beta(β)亚基中。在一些实施方案中，表位位于LVYKDPARPKIQK(SEQ ID NO:1)内。在一些实施方案中，表位位于LVYKDPARPNTQK(SEQ IDNO:2)内。在本领域中应理解，抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH1、CH2和CH3)。轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。重链和轻链两者的可变区包含框架区(FWR)和互补决定区(CDR)。四个FWR区域是相对保守的，而CDR区域(CDR1、CDR2和CDR3)代表高变区并且如下从NH₂端到COOH端排列：FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域，而取决于同种型，恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合。本领域已知可以操作单克隆抗体和其他抗体，并使用重组DNA技术的技术来产生保留原始抗体特异性的其他抗体或嵌合分子。此类技术可以演化将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。

本公开的示例性抗FSH抗体或其抗原结合部分包含下文实施例1中表征的Hf2或其抗原结合部分。Hf2具有包含SEQ ID NO:7的可变重链区和包含SEQ ID NO:8的可变轻链区。Hf2具有包含SEQ ID NO:9的CDRH1、包含SEQ ID NO:10的CDRH2、包含SEQ ID NO:11的CDRH3、包含SEQ ID NO:12的CDRL1、包含SEQ ID NO:13的CDRL2和包含SEQ ID NO:14的CDRL3。然而，本公开的抗FSH抗体或其抗原结合部分不限于此。例如，在一些实施方案中，抗FSH抗体具有可变重链区，其与SEQ ID NO:7具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％的同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO:7具有至少一个保守取代。在一些实施方案中，抗FSH抗体具有可变轻链区，其与SEQ ID NO:8具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO:8具有至少一个保守取代。在一些实施方案中，可变重链区的一个或多个CDR与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11中的一个或多个具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％同一性。在一些实施方案中，SEQID NO:9，SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11中的一个或多个具有至少一个保守取代。在一些实施方案中，可变轻链区的一个或多个CDR与SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中的一个或多个具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中的一个或多个具有至少一个保守取代。

本公开的抗体可以包含多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是熟练技术人员已知的。可以在哺乳动物中产生多克隆抗体，例如，通过一次或多次注射免疫剂，并且若期望的化，注射佐剂进行。通常，通过多次皮下或腹膜内注射将免疫剂和/或佐剂注射到哺乳动物中。免疫剂可以包括FSH或FSHR多肽或其融合蛋白。将免疫剂与已知在被免疫的哺乳动物中具有免疫原性的蛋白质缀合可能是有用的。此类免疫原性蛋白质的实例包括但不限于钥孔虫戚血兰蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以使用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A，合成海藻糖二分枝菌酸(dicorynomycolate))。本领域技术人员无需过度实验可以选择免疫方案。

或者，抗体可以是单克隆抗体。可以使用杂交瘤方法制备单克隆抗体，例如Kohlerand Milstein,Nature,256:495(1975)所述的方法。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物以引发产生或能够产生特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。

免疫剂通常包括FSH或FSHR多肽或其融合蛋白。免疫剂可以包含FSH的beta(β)亚基的抗原性片段。免疫剂可以是包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的肽序列或基本上由SEQID NO:1或SEQ ID NO:2组成但具有保守取代的肽序列。通常，若期望人来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者若期望非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后，使用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞[Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986)第59-103页]。永生化细胞系通常是经转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在合适的培养基中培养，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，若亲本细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。

优选的永生化细胞系是有效融合，支持由选择的抗体生成细胞的抗体的稳定高水平表达，并且对诸如HAT培养基的培养基敏感的细胞系。更优选的永生化细胞系是鼠骨髓瘤系，其可以例如获自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.和美国典型培养物保藏中心,Manassas,Va。还已经描述了人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体[Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York,(1987)第51-63页]。然后，可以对培养杂交瘤细胞的培养基测定针对FSH或FSHR的单克隆抗体的存在。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定法测定，例如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。此类技术和测定法在本领域中是已知的。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson and Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来确定。

在鉴定出期望的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释程序亚克隆克隆并通过标准方法培养。用于此目的的合适培养基包括例如Dulbecco改良Eagle培养基和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可以在体内以哺乳动物中的腹水培养。

可以通过常规免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基或腹水中分离或纯化由亚克隆分泌的单克隆抗体。

也可以通过重组DNA方法，例如美国专利No.4,816,567中描述的方法制备单克隆抗体。可以使用常规程序容易地分离和测序编码本公开的单克隆抗体的DNA(例如，通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。本公开的杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。一旦分离，可以将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞中，例如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或在其它情况下不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以获得重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。也可以例如通过用人重链和轻链恒定域的编码序列代替同源鼠序列，如美国专利No.4,816,567中，或通过与免疫球蛋白编码序列共价连接非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列修饰DNA。可以用此类非免疫球蛋白多肽替换本公开的抗体的恒定域，或者可以替换本公开的抗体的一个抗原结合位点的可变域以创建嵌合二价抗体。

抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法是本领域公知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和修饰的重链的重组表达。通常在Fc区中的任何点处截短重链以阻止重链交联。或者，相关的半胱氨酸残基用另一个氨基酸残基取代或被删除以阻止交联。

体外方法也适用于制备单价抗体。消化抗体以产生其片段，特别是Fab片段可以使用本领域已知的常规技术完成。

本公开的抗体还可以包含人源化抗体或人抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的互补决定区(CDR)的残基被具有期望特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)例如小鼠，大鼠或兔的CDR的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基取代。人源化抗体还可以包含既不在接受体抗体中也不在输入的CDR或框架序列中找到的残基。通常，人源化抗体将包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。最佳地，人源化抗体还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的[Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。

用于人源化非人抗体的方法是本领域公知的。通常，人源化抗体具有从非人的来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常从“输入”可变域取得。人源化可以基本上按照Winter和同事的方法[Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyenet al.,Science,239:1534-1536(1988)]进行，通过用啮齿类CDR或CDR序列替换人抗体的相应序列进行。用于鼠抗体人源化的技术是本领域普通技术人员已知的，并且通常在Safdari et al.,(2013)Biotechnol.Genet.Eng.Rev.,29:175-86(其在此通过引用完整并入)中综述。抗体的人源化通常包括将CDR(例如但不一定，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14中的一个或多个，或其一个或多个保守取代变体)植入合适的人可变区框架中进行，如Jones et al.(1986)Nature 321,522-525(其在此通过引用完整并入)中公开。使用的常用方法包括但不限于基于框架同源性的人源化、种系人源化、基于互补决定区(CDR)同源性的人源化和特异性决定残基(SDR)植入。人源化抗体中适当的CDR取向通常是必需的，并且可以通过例如评估人源化抗体的晶体结构来确定。与鼠单克隆抗体，特别是鼠抗体的恒定域(Fc区)相比时，人源化抗体的主要优点来自显著降低的免疫原性，尽管人源化可变域也导致免疫原性降低。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能地一些FR残基被来自啮齿类抗体中类似位点的残基取代。

人抗体也可以使用本领域已知的各种技术产生，包括噬菌体展示文库[Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)]。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole etal.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)和Boerneret al.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)]。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如，内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠)中来制备人抗体。攻击后，观察到人抗体产生，其在所有方面非常类似于人中所见，包括基因重排、装配和抗体全集。此种方法记载于例如美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016,和以下科学出版物：Marks et al.,Bio/Technology 10,779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature 368 856-859(1994)；Morrison,Nature 368,812-13(1994)；Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14,845-51(1996)；Neuberger,NatureBiotechnology 14,826(1996)；Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)。

本发明的一些实施方案涉及载体和载体系统，以及用此类载体和/或载体系统转化的细胞，所述载体和载体系统含有编码本公开的抗FSH抗体或其抗原结合部分，例如Hf2或其抗原结合部分的可变区的核苷酸序列。载体可以是例如但不一定是质粒；其他明确非限制性的重组载体是本领域已知的并且可以包括例如噬菌体载体如λ噬菌体载体，其他病毒载体如非复制型腺病毒载体、慢病毒载体、pSV、pCMV系列质粒载体、痘苗和逆转录病毒载体、杆状病毒载体、粘粒、人工染色体。载体可以是哺乳动物表达载体；例如，可以将载体转染到哺乳动物细胞中，并且可以在稳定转染的情况下通过同源重组将DNA整合到基因组中，或者备选地可以瞬时转染细胞。大多数工程化载体的共同点是复制起点、多克隆位点和选择标志物，只要载体(包括载体系统，例如多个质粒)含有此类系统，就认为它们是本发明范围所涵盖的。哺乳动物表达载体的常见启动子包括CMV和SV40启动子；非病毒启动子如EF-1启动子也是已知的。

编码Hf2的一个或两个可变区的载体或载体系统可以含有SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4中的一个或两个，或者与SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4共享一定程度同一性的核苷酸序列，例如与SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4之任一或两者的至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或超过95％的同一性。不依赖于此类同一性，SEQ IDNO:3和/或SEQ ID NO:4可以具有保守取代和/或可以进行密码子优化，并且这认为是在本发明的范围内。如本文所讨论的，编码可变区的核苷酸序列可以在同一载体上或可以不在同一载体上，并且其表达可以是可分开诱导的或可以不是可分开诱导的。

本公开的一些实施方案涉及制备重组抗FSH抗体，例如嵌合抗FSH抗体或人源化抗FSH抗体或其抗原结合部分的方法。在嵌合抗体的情况下，宿主细胞(例如酵母细胞或大肠杆菌细胞)(例如通过噬菌体)通过载体，包括上文讨论的载体转染，所述载体含有编码一种或多种抗HCMV抗体的可变重/轻区的基因，例如，在Hf2或其抗原结合部分的情况下，SEQ IDNO:3和/或SEQ ID NO:4。在人源化抗体的情况下，宿主细胞可以通过载体或载体系统转染，所述载体或载体系统含有Hf2的可变重/轻区的CDR的核苷酸，例如编码SEQ ID NO:9，SEQID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14中的一个或多个的核苷酸序列。编码CDR的核苷酸可以具有保守取代，并且不依赖于此类保守取代，可以与编码SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和/或SEQID NO:14中的一个或多个的核苷酸序列共享一定程度的同一性(即至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或超过95％的同一性)。另外，这些核苷酸序列中的一个或多个可以是密码子优化的或者可以不是密码子优化的。使用嵌合或人源化抗体，Fc区将保持为人的。然后，诱导经转化的宿主细胞以产生重组抗体，其可以在宿主细胞中从重链/轻链装配抗体，然后将抗体转运出细胞，或者抗体可以在宿主细胞外自装配并且以重/轻链输出。常见宿主细胞可以包括酵母细胞，例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)，细菌，例如大肠杆菌和哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DUXB11、DG44和CHOK1谱系、NS0鼠骨髓瘤细胞、PER.C6人细胞和人胚肾(HEK)细胞，例如HEK293。其他不太常见但仍然包括在本发明的范围内的宿主细胞包括植物细胞，例如基于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒的植物细胞。也存在无细胞表达系统，例如基于大肠杆菌细胞裂解物，其含有转录/翻译所必需的细胞组分。真核和哺乳动物无细胞系统也是本领域已知的，例如小麦胚无细胞表达系统，以及Brodel et al.(2015),Methods Mol Bio.1261:129-40(其在此通过引用完整并入)描述的那些。一些重组抗体生产系统在收获前在宿主细胞表面上表达重组抗体，其他系统简单地将抗体释放到培养基中以进行收集。此类变化意图落入本公开的范围内。

本公开的组合物(单独的或组合的)可以根据具体应用在体外、离体和体内使用。因此，本公开提供了施用药物组合物，其包含药学上可接受的载体和药理学有效量的一种或多种主题肽或其合适的盐。药物组合物可以配制成粉末、颗粒、溶液、悬浮液、气溶胶、固体、丸剂、片剂、胶囊剂、凝胶、局部乳膏、栓剂、透皮贴剂等。

药学上可接受的盐意图包括任何本领域公认的药学上可接受的盐，包括有机和无机酸和/或碱。盐的实例包括钠、钾、锂、铵、钙、以及伯、仲和叔胺、低级烃的酯，例如甲基、乙基和丙基。其他盐可以包括有机酸，如乙酸、丙酸、丙酮酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、水杨酸等。

药学上可接受的组合物可以是液体形式或固体形式。固体配制剂通常但一定是冻干的，并且在施用前带入溶液中以进行单次或多次给药。配制剂不应暴露于极端温度或pH值以避免热变性。因此，在生物学相关的pH范围内配制本公开的组合物可能是重要的。经缓冲以在储存期间保持适当pH范围的溶液通常是必需的，尤其是对于在配制和施用之间储存较长时间段的液体配制剂。通常，液体和固体配制剂两者都需要在较低温度的储存(通常但不一定在2-8℃之间)，以保持较长时间段的稳定性。配制的组合物，尤其是液体配制剂可以含有抑菌剂以阻止或最小化储存期间的蛋白水解，包括但不限于有效浓度(通常<1％w/v)的苄醇、酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。对于一些患者，抑菌剂可能是禁忌的。因此，冻干配制剂可以在含有或不含此类成分的溶液中重建。

可以将另外的组分添加到缓冲液体或固体配制剂中，包括但不限于作为冷冻保护剂的糖(包括但不必限于多羟基烃，例如山梨糖醇、甘露醇、甘油和卫矛醇和/或二糖，例如蔗糖、乳糖、麦芽糖或海藻糖)，和在某些情况下，相关的盐(包括但不限于NaCl、KCl或LiCl)。此类配制剂，尤其是定为长期储存的液体配制剂将依赖于有用的总渗量范围，以促进在例如2-8℃或更高温度下的长期稳定性，同时还使配制剂可用于胃肠外注射。例如但不一定，总渗量的有效范围(溶液中的分子总数)可以为约200mOs/L至约800mOs/L。显而易见的是，诸如蔗糖或山梨糖醇的细胞保护剂的量可以取决于配制剂中的盐量，以使溶液的总渗量保持在合适的范围内。因此，无盐配制剂可以但一定含有约5％至约25％的蔗糖。

或者，基于山梨糖醇的无盐配制剂可以但不一定含有约3％至约12％范围内的山梨糖醇。无盐配制剂可以保证相应冷冻保护剂的增加的范围，以保持有效的渗量水平。这些配制剂还可以含有二价阳离子(包括但不一定限于MgCl₂、CaCl₂和MnCl₂)；非-32离子表面活性剂(包括但不一定限于Polysorbate-80(Tween)、Polysorbate-60(Tween)、Polysorbate-40(Tween)和Polysorbate-20(Tween)、聚氧乙烯烷基醚(polyoxyethylene alkyl ether)，包括但不限于以及其他物质，如Triton X- Span 85和Pluronic系列非离子表面活性剂(如，Pluronic121))。此类组分的任何组合(包括可能包含抑菌剂)可用于填充本公开的含有抗体的配制剂。本公开的组合物也可以是“化学衍生物”，其描述了含有通常不是初始化合物的部分的另外的化学部分的组合物(例如聚乙二醇化)。此类部分可以改善基础FSH/FSHR灭活剂的溶解度、半衰期、吸收等。或者，部分可以减弱基础分子的不想要的副作用或降低基础FSH/FSHR灭活剂的毒性。

合适的配制剂可以特别参见Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Co.,Philadelphia,Pa.,1985和Handbook of PharmaceuticalExcipients,第3版,Kibbe,A.H.编,Washington D.C.,American PharmaceuticalAssociation,2000；其在此通过引用整体并入本文。本文所述的药物组合物可以以本领域技术人员公知的方式制备(例如，通过本领域常规的手段，包括混合、溶解、制粒、研磨、乳化、包囊、包埋或冻干方法)。

另外，还可以将FSH/FSHR灭活剂引入或包囊到脂质体腔中，用于递送以及用于延长肽配制剂离体或体内的寿命。如本领域中已知的，脂质体可以分为各种类型：多层(MLV)、稳定多层(SPLV)、小单层(SUV)或大单层(LUV)囊泡。脂质体可以从各种脂质化合物制备，所述脂质化合物可以是合成的或天然存在的，包括磷脂酰醚和酯，如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二肉豆蔻磷脂酰胆碱；类固醇，诸如胆固醇；脑苷脂；鞘磷脂；甘油脂；和其他脂质(参见例如美国专利No.5,833,948)。

阳离子脂质也适用于形成脂质体。通常，阳离子脂质具有净正电荷并具有亲脂部分，例如固醇或酰基或二酰基侧链。优选地，首基是带正电的。典型的阳离子脂质包括1,2-二油酰基氧基-3-(三甲基氨基)丙烷(1,2-dioleyloxy-3-(trimethylamino)propane)；N-[1-(2,3,-二十四烷环氧基)丙基]-N,N-二甲基-N-N-羟基乙基溴化铵(N-[1-(2,3,-ditetradecycloxy)propyl]-N,N-dimethyl-N-N-hydroxyethylammoniu m bromide)；N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵(N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N-dimethyl-N-hydroxy ethylammonium bromide)；N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchloride)；3-[N-(N'，N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(3-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)carbamoyl]cholesterol)；和二甲基二十八烷基铵(dimethyldioctadecylammonium)。特别感兴趣的是促融合脂质体，其特征在于它们在生理条件的适当变化时与细胞膜融合的能力或特征在于促融合成分，特别是促融合肽或蛋白质的存在。在一个方面，促融合脂质体对pH和温度敏感，因为与细胞膜的融合受温度和/或pH变化的影响(参见例如美国专利No.4,789,633和4,873,089)。通常，pH敏感性脂质体是酸敏感的。因此，在pH为弱酸性的生理环境，例如溶酶体、内体和炎性组织的环境中增强融合。该性质允许在脂质体的内吞后将脂质体内容物直接释放到细胞内环境中(参见Mizoue,T.Int.J.Pharm.237:129-137(2002))。

另一种形式的促融合脂质体包含含有融合增强剂的脂质体。也就是说，当掺入脂质体或附着于脂质时，试剂增强脂质体与其它细胞膜的融合，从而导致脂质体内容物递送到细胞中。试剂可以是融合增强肽或蛋白质，包括流感病毒的血凝素HA2(Schoen,P.GeneTher.6:823-832(1999))；仙台病毒包膜糖蛋白(Mizuguchi,H.Biochem.Biophys.Res.Commun.218:402-407(1996))；水泡性口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)糖蛋白(Abe,A.et al.JVirol 72:6159-63(1998))；融合增强蛋白的肽段或模拟物；和合成的融合增强肽(Kono,K.et al.Biochim.Biophys.Acta.1164:81-90(1993)；Pecheur,E.I.Biochemistry 37:2361-71(1998)；美国专利No.6,372,720)。

脂质体还包括用亲水性聚合物衍生化的囊泡，如美国专利No.5,013,556和5,395,619(其在此通过引用并入)中所提供(还见Kono,K.et al.J.Controlled Release 68:225-35(2000)；Zalipsky,S.et al.Bioconjug.Chem.6:705-708(1995))，以延长体内循环寿命。用于包被或衍生化脂质体的亲水性聚合物包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚天冬酰胺、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素等。另外，如上所述，附着结合内吞的细胞表面蛋白的蛋白质，例如对特定细胞类型向性的壳体蛋白或其片段以及经历内化的细胞表面蛋白的抗体，可以用于靶向和/或促进脂质体摄取到特定细胞或组织。

通过本领域公知的方式制备脂质体(参见例如Szoka,F.etal.Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467-508(1980))。一种典型的方法是脂质膜水合技术，其中在有机溶剂中混合脂质组分，然后蒸发溶剂以产生脂质膜。在优选含有主题肽或核酸的水性缓冲溶液中膜的水合得到乳液，将所述乳剂超声处理或挤出以减小尺寸和多分散性。其他方法包括反相蒸发(参见Pidgeon,C.et al.Biochemistry 26:17-29(1987)；Duzgunes,N.et al.Biochem.Biophys.Acta.732:289-99(1983))、磷脂混合物的冷冻和融化和醚输注。

在另一个优选的实施方案中，载体为微粒、微胶囊、微球和纳米颗粒的形式，其可以是可生物降解的或不可生物降解的(参见例如Microencapsulates:Methods andIndustrial Applications,Drugs and Pharmaceutical Sciences,第73卷,Benita,S.编,Marcel Dekker Inc.,New York,1996)。物质可以在颗粒的核心内或附着到颗粒的聚合物网络。通常，微粒(或微胶囊或微球)与纳米颗粒之间的差异可以是尺寸之一。

多种材料可用于制备微粒。不可生物降解的微胶囊和微粒包括但不限于由聚砜、聚(丙烯腈-共-氯乙烯)、乙烯-乙酸乙烯酯和甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物制成的那些。这些可用于植入目的，其中包囊的FSH/FSHR灭活剂从胶囊中扩散出来。另一方面，微胶囊和微粒基于可生物降解的聚合物，优选那些显示低毒性且被免疫系统良好耐受的聚合物。这些包括基于蛋白质的微胶囊和微粒，其从纤维蛋白、酪蛋白、血清白蛋白、胶原、明胶、卵磷脂、壳聚糖、藻酸盐或聚氨基酸如聚赖氨酸制成。用于包囊的可生物降解的合成聚合物可以包括聚合物，例如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(己内酯)、聚二恶烷酮碳酸三亚甲酯(polydioxanone trimethylenecarbonate)、聚羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkonates)(例如聚(β-羟基丁酸酯))、聚(β-乙基谷氨酸)、聚(DTH亚氨基碳基(iminocarbony)(双酚A亚氨基碳酸酯(bisphenol Aiminocarbonate))、聚(原酸酯)和聚氰基丙烯酸酯。用于制备含有主题组合物的微粒的各种方法是本领域公知的，包括溶剂除去方法(参见例如美国专利No.4,389,330)；乳化和蒸发(Maysinger,D.et al.Exp.Neuro.141:47-56(1996)；Jeffrey,H.et al.Pharm.Res.10:362-68(1993))、喷雾干燥和挤出方法。

另一种类型的载体是纳米颗粒，其通常适用于静脉内施用。亚微米和纳米颗粒通常由如本领域已知的两亲性二嵌段、三嵌段或多嵌段共聚物制成。可用于形成纳米颗粒的聚合物包括但不限于聚(乳酸)(PLA；参见Zambaux et al.,J.Control Release 60:179-188(1999))，聚(丙交酯-共-乙交酯)，聚(丙交酯-共-乙交酯)和聚己内酯(polycarprolactone)、二嵌段聚合物聚(1-亮氨酸-嵌段-1-谷氨酸)、二嵌段和三嵌段聚(乳酸)(PLA)和聚(环氧乙烷)(PEO)的混合物(参见De Jaeghere,F.et al.,Pharm.Dev.Technol.；5:473-83(2000))，丙烯酸酯，芳酰胺(arylamides)，聚苯乙烯等。如针对微粒所述，纳米颗粒可以是不可生物降解的或可生物降解的。纳米颗粒也可以由聚(氰基丙烯酸烷基酯)(poly(alkylcyanoacrylate))，例如聚(氰基丙烯酸丁酯)制成，其中将FSH/FSHR灭活剂吸收到纳米颗粒上并用表面活性剂(例如聚山梨酯80)包被。制备纳米颗粒的方法类似于制备微粒的方法，并且可以特别包括连续水相中的乳剂聚合、乳化-蒸发、溶剂置换和乳化-扩散技术(参见Kreuter,J.“Nano-particle Preparation andApplications,In Microcapsules and nanoparticles in medicine and pharmacy,”(M.Donbrow编),第125-148页,CRC Press,Boca Rotan,Fla.,1991)。

水凝胶也可用于将FSH/FSHR灭活剂递送到宿主中。通常，水凝胶是对极其多种药物化合物(包括肽)可渗透的交联亲水性聚合物网络。水凝胶具有选择性引发聚合物溶胀的优点，其导致包埋的药物化合物的受控释放。取决于聚合物网络的组成，溶胀和随后的释放可以由各种刺激触发，包括pH、离子强度、热、电、超声和酶活性。可用于水凝胶组合物的聚合物的非限制性实例特别包括由以下形成的聚合物：聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)的聚合物；聚(甲基丙烯酸-g-聚乙二醇)；聚丙烯酸和聚(氧丙烯-共-氧乙烯)乙二醇；和天然化合物，例如硫酸软骨素(chrondroitan sulfate)、壳聚糖、明胶、或合成和天然聚合物的混合物，例如壳聚糖-聚(环氧乙烷)。

凝胶聚合物可以是丙烯酸聚合物，优选卡波姆(例如羧基聚亚甲基)，例如Carbopol(例如.Carbopol 420-430,475,488,493,910,934P,974P,and the like；Brocket al.,Pharmacotherapy 14:430-437(1994))，它是与聚链烯基聚醚(polyalkenylpolyether)交联的丙烯酸的非线性聚合物。其他类型的卡波姆包括与多官能化合物，例如聚烯丙基蔗糖(polyallysucrose)交联的丙烯酸。除了对捕获主题化合物并限制其释放的凝胶的水合和溶胀的优点外，卡波姆凝胶是粘膜粘附的。

出于本公开的目的，根据所治疗的状况、主题组合物的形式和药物组合物来选择施用方法。FSH/FSHR灭活剂的施用可以以多种方式进行，包括但不限于皮肤、皮下、静脉内、口服、局部、透皮、腹膜内、肌肉内、鼻和直肠(例如，结肠施用)。例如，微粒、微球和微包囊配制剂可用于口服、肌肉内或皮下施用。另外，脂质体和纳米颗粒适用于静脉内施用。药物组合物的施用可以通过单一途径或通过几种途径同时进行。例如，口服施用可以伴随直肠或局部施用至受影响的区域。或者，口服施用与静脉内或胃肠外注射联合使用。

递送系统还包括持续释放或长期递送方法，这些是本领域技术人员公知的。如本文所用，“持续释放”或“长期释放”是指递送系统施用药学治疗量的主题化合物超过一天，优选超过一周，最优选至少约30天至60天或更长。长期释放系统可以包含含有主题肽的可植入固体或凝胶，例如上述可生物降解的聚合物；泵，包括蠕动泵和碳氟化合物推进剂泵；渗透泵和微渗透泵；等等。蠕动泵在每次启动泵的情况下递送设定量的药物，并且可以再填充储器，优选通过端口经皮再填充。控制器设定剂量并且还可以提供关于递送的剂量、剩余剂量和递送频率的读数。碳氟化合物推进剂泵利用碳氟化合物液体来操作泵。碳氟化合物液体施加高于大气压的蒸气压并压缩含有药物的腔室以释放药物。渗透泵(和微型渗透泵)利用渗透压以恒定速率释放药物。药物包含在不渗透的隔膜中，所述隔膜被渗透剂包围。半透膜含有渗透剂，并且整个泵容纳在壳体中。水扩散过半透膜挤压保持药物的隔膜，迫使药物进入血液、器官或组织中。这些和其他此类植入物特别可用于治疗疾病状况，特别是那些表现出反复发作或具有进行性性质的疾病，通过以持续的长期方式经由全身(例如，静脉内或皮下)或局部剂量(例如脑室内)递送本公开的FSH/FSHR灭活剂进行。

在一个优选的实施方案中，施用方法是通过口服递送，以粉末、片剂、丸剂或胶囊的形式。用于口服施用的药物配制剂可以通过将一种或多种肽与合适的赋形剂，例如糖(例如乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇)、纤维素(例如淀粉、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素等)、明胶、甘氨酸、糖精、碳酸镁、碳酸钙、聚合物诸如聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮等组合制备。丸剂、片剂或胶囊可以具有肠溶衣，其在胃中保持完整但在肠中溶解。各种肠溶衣是本领域已知的，其中许多是商品化的，包括但不限于甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、聚合物纤维素醚、苯二甲酸醋纤维素、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，等等。或者，组合物的口服配制剂在合适的稀释剂中制备。合适的稀释剂包括水性稀释剂中的各种液体形式(例如糖浆、浆液、悬浮液等)，所述水性稀释剂例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、含水乙醇、糖(例如蔗糖、甘露醇或山梨糖醇)溶液、甘油、明胶水溶液、甲基纤维素、羟甲基纤维素、环糊精，等等。如本文所用，稀释剂或水溶液还包括婴儿配方食品。在一些实施方案中，使用亲脂性溶剂，包括油，例如植物油、花生油、芝麻油、橄榄油、玉米油、红花油，大豆油等)；脂肪酸酯，如油酸酯，甘油三酯等；胆固醇衍生物，包括油酸胆固醇、亚油酸胆固醇、肉豆蔻酸胆固醇(cholesterol myristilate)等；脂质体；等等。

在一个实施方案中，以直肠完成施用。这可以使用适合于以油膏剂、酊剂、乳剂形式局部应用，或通过使用栓剂、灌肠剂、泡沫等形式的组合物应用到肠腔中的配制剂。栓剂可以含有常规的栓剂基质，例如可可脂、碳蜡、聚乙二醇或甘油酯，其在室温为固体或半固体，但在体温为液体。

在另一个优选的实施方案中，皮肤、皮下、腹膜内、肌肉内或静脉内进行施用。如上所讨论，这些是溶解或悬浮在合适的水性介质中的肽的形式，如上所讨论。另外，注射用药物组合物可以在亲脂性溶剂中制备，所述亲脂性溶剂包括但不限于油，例如植物油、橄榄油、花生油、棕榈油、大豆油、红花油等；合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯；胆固醇衍生物，包括油酸胆固醇、亚油酸胆固醇，肉豆蔻酸胆固醇等；或脂质体，如上所述。该组合物可以直接在亲脂性溶剂中制备，或优选作为油/水乳液制备(参见例如Liu,F.etal.Pharm.Res.12:1060-1064(1995)；Prankerd,R.J.J.Parent.Sci.Tech.44:139-49(1990)；美国专利No.5,651,991)。

剂量和剂量方案取决于内科医生容易确定的多种因素，例如感染的性质，例如其治疗指数、患者和患者的病史。通常，将治疗有效量的组合物施用于患者。在一些实施方案中，施用的组合物的量在约0.001mg/kg至约1000mg/kg患者体重的范围内，以及其间的任何范围。根据状况的严重程度，约0.1mg/kg至约50mg/kg体重(例如，约0.1-15mg/kg/剂，更通常约1-25mg/kg体重)的组合物是用于对患者施用的初始候选剂量，无论例如通过一次或多次分开施用还是通过连续输注。组合物可以以相对低的体积速率递送，例如但不一定是约0.001ml/天至10ml/天，以使释放配制剂的部位附近的组织干扰或创伤最小化。取决于具体的生物剂，配制剂可以以低剂量释放，例如，约0.01μg/hr或0.1μg/hr、0.25μg/hr、1μg/hr，通常高达约200μg/hr的速率释放，或以低体积速率递送配制剂，例如约0.001ml/天至约1ml/天，例如0.01微克/天直至约20毫克/天的体积速率。剂量取决于许多因素，例如效力、生物利用度和活性成分的毒性以及受试者的要求。通过常规方法和测定法并且基于内科医师或本领域其他技术人员已知的标准，容易地监测该疗法的进展。用于评估成功治疗和疾病改善的上述参数可通过内科医生熟悉的常规程序容易地测量。

递送系统还包括持续释放或长期递送方法，这些是本领域技术人员公知的。如本文所用，“持续释放”或“长期释放”是指递送系统施用药学治疗量的主题化合物超过一天，优选超过一周，最优选至少约30天至60天，或更长。长期释放系统可以包含含有主题肽的可植入固体或凝胶，例如上述可生物降解的聚合物；泵，包括蠕动泵和碳氟化合物推进剂泵；渗透泵和微渗透泵；等等。蠕动泵在每次启动泵的情况下递送设定量的药物，并且可以再填充储器，优选通过端口经皮再填充。控制器设定剂量并且还可以提供关于递送的剂量、剩余剂量和递送频率的读数。碳氟化合物推进剂泵利用碳氟化合物液体来操作泵。碳氟化合物液体施加高于大气压的蒸气压并压缩含有药物的腔室以释放药物。渗透泵(和微型渗透泵)利用渗透压以恒定速率释放药物。药物包含在不渗透的隔膜中，所述隔膜被渗透剂包围。半透膜含有渗透剂，并且整个泵容纳在壳体中。水扩散过半透膜挤压保持药物的隔膜，迫使药物进入血液、器官或组织中。这些和其他此类植入物特别可用于治疗炎性疾病状况，特别是那些表现出反复发作或具有进行性性质的疾病，通过以持续的长期方式经由全身(例如，静脉内或皮下)或局部剂量递送本公开的FSH/FSHR灭活剂进行。

本公开还涵盖试剂盒或包装配制剂形式的本文公开的治疗组合。如本文所用的试剂盒或包装配制剂包括容纳剂量的容器中一剂或多剂主题肽及其盐以及对患者同时或序贯施用的用法说明。例如，包装可以含有肽以及以粉末形式组合的药物载体，用于在水溶液中混合，所述水溶液可以由患病的受试者摄取。包装或试剂盒包括适当的指令，其包括图表、记录(例如，音频、视频、光盘)和提供使用组合疗法的指示的计算机程序。已经出于说明和描述的目的呈现了本公开的具体实施方案的前述描述。它们并非旨在穷举或将本公开限制于所公开的精确形式，并且显然根据上述教导可以进行许多修改和变化。

在提供范围数值的情况下，应当理解的是，除非上下文另有明确规定，本公开内涵盖在该范围的上限和下限与所述范围中的任何其他叙述或中间值之间的每个中间值(至下限单位的十分之一)。在本公开内也涵盖可以独立地包括在较小范围内的这些较小范围的上限和下限，服从所述范围中的任何明确排除的限制。在叙述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的限制之一或两者的范围也包括在本公开中。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可用于本公开的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用整体并入本文。

如本文和所附权利要求书中所使用，单数形式“一”、“和”和“该/所述”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。

术语“约”是指本领域普通技术人员认为不与基线值实质不同的数值范围。例如，术语“约”可以指在叙述数值的20％,15％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％或0.01％内的数值，以及此类叙述数值居间的数值(对此，上下文将定义)。

本文公开的出版物仅是为了在本公开的提交日之前的公开而提供的。本文中的任何内容均不应解释为承认本公开无权先于此类出版物。此外，提供的出版物日期可能与可能需要独立确认的实际出版日期不同。

本文中引用的每个申请和专利，以及每个申请和专利中引用的每个文件或参考文献、专利或非专利文献(包括在每个已公告的专利的起诉期间；“申请引用文件”)以及与这些申请和专利中的任何一个相对应和/或要求优先权的每个PCT和外国申请或专利，以及在每个申请引用的文献中引用或提到的每个文献在此通过引用明确地完整并入本文。更一般地，在本文中在权利要求书前的参考文献列表中；或者在文本本身中引用文献或参考文献；并且，这些文献或参考文献中的每一个(“本文引用的参考文献”)，以及在本文引用的每篇参考文献(包括任何制造商的规则，用法说明等)中引用的每篇文献或参考文献在此通过引用明确地并入本文。

以下非限制性实施例用来进一步说明本公开。

VII.实施例

1.单克隆抗FSH抗体Hf2及其抗原结合部分的表征

按照试剂(Ambion，产品目录号：15596-026)的技术手册从杂交瘤细胞中分离总RNA。然后，按照PrimeScriptTM 1stStrand cDNA合成试剂盒(Takara，产品目录号：6110A)的技术手册，使用同种型特异性反义引物或通用引物将总RNA逆转录成cDNA。根据GenScript的cDNA末端快速扩增(RACE)的标准操作程序(SOP)扩增V_H和V_L的抗体片段。将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中。进行菌落PCR以筛选具有正确大小的插入物的克隆。对于每个片段，对不小于五个具有正确大小的插入物的菌落进行测序。比对不同克隆的这些序列，并提供这些克隆的共有序列。结果显示在下面的表1、2、3和4中。

表1.编码Hf2的可变重/轻链的核苷酸序列。加下划线的部分代表前导物序列。

表2.Hf2的可变重/轻链的氨基酸序列。加下划线的部分代表前导物序列。的部分代表互补决定区(CDR)。

氨基酸序列	抗体区
		SDYAWN(SEQ ID NO:9)	Hf2重链CDR1(CDRH1)
SIFSSGSINYNPSLKS(SEQ ID NO:10)	Hf2重链CDR2(CDRH2)
		GGTGTDY(SEQ ID NO:11)	Hf2重链CDR3(CDRH3)
RASQDISNYLS(SEQ ID NO:12)	Hf2轻链CDR1(CDRL1)
		YTSRLHS(SEQ ID NO:13)	Hf2轻链CDR2(CDRL2)
QQGHTLPPT(SEQ ID NO:14)	Hf2轻链CDR3(CDRL3)

表3. Hf2的互补决定区(CDR)。

表4. Hf2的V(D)J接合的IMGT分析。

鉴于下文实施例2中提出的证据表明多克隆抗FSH抗体诱导WET褐化(beiging)和减少肥胖，针对人FSHβ表位LVYKDPARPKIQK,(SEQ ID NO:1)制备单克隆抗体Hf2。SEQ IDNO:1与小鼠表位(SEQ ID NO:2)的不同之处在于两个氨基酸。发现Hf2结合人和小鼠FSHβ两者，并且将其注射到喂养高脂肪饮食的小鼠中表型模拟了实施例2中使用的多克隆抗FSH抗体不仅减少皮下和内脏脂肪，而且还诱导褐化的作用(图1)，类似于实施例2中使用的多克隆抗FSH抗体，因此表明Hf2/其抗原结合部分的治疗潜力。

2.用抗FSH抗体阻断FSH诱导产热脂肪组织并减少体脂

方法和材料

FSH肽：从R&D(8576-FS)获得重组小鼠FSH。在环AMP测定法中，使用完全糖基化的FSH24。由于低糖基化糖型(hypoglycosylated glycoform)的亚最佳作用，对于骨和脂肪测定法来说使用完全糖基化的FSH形式是重要的。

免疫沉淀：使重组小鼠促卵泡激素(FSH)(FSHα-FSHβ嵌合体，2μg)通过具有固定化的抗FSH抗体或山羊IgG的树脂(Pierce Co-Immunoprecipitation Kit,26149,ThermoScientific)。收集洗脱液、流过液和连续清洗级分，并用单克隆抗FSH抗体(Hf2)进行免疫印迹。

质谱术：将免疫沉淀的洗脱液还原(DTT，Sigma)，烷基化(碘乙酰胺(iodoaceteamide)，Sigma)并且胰蛋白酶处理(胰蛋白酶，Promega)。通过反相(12cm/75μm,3μm C₁₈珠,Nikkyo Technologies)LC-MS/MS(与Q-Exactive Plus质谱仪，ThermoScientific偶联的Ultimate 3000nano-HPLC系统)分析肽。使用从6％缓冲液B/94％缓冲液A增加至50％缓冲液B/50％缓冲液A的梯度在34分钟内分离肽(缓冲液A：0.1％甲酸；缓冲液B：80％乙腈中的0.1％甲酸)并在组合数据依赖(DDA)/平行反应监测(PRM)实验中进行分析。靶向六种FSH肽。以17,500的分辨率记录串联MS谱，m/z为100作为最低质量。标准化碰撞能量设定为27，自动增益控制(automatic gain control，AGC)靶标和最大注射时间分别为2x10⁵和60ms。提取串联MS数据，并使用Proteome Discoverer1.4(Thermo Scientific)和MASCOT 2.5.1(Matrix Science)对与大肠杆菌背景数据库连接的含有FSHα-FSHβ嵌合体序列的蛋白质数据库和已知常见污染物进行查询。选择乙酰基(蛋白质N-末端)和氧化(M)作为可变修饰，而所有半胱氨酸被认为是氨基甲酰基甲基化。10ppm和20mDa分别用作前体和碎片离子的质量准确度。使用由过滤器(Percolator)计算的1％假发现率过滤匹配的肽，此外，要求肽匹配为等级1并且前体质量准确度好于5ppm。每个蛋白质的三个最丰富的肽的面积用于大致估计匹配蛋白质的丰度。

计算模型：使用与人FSHR的整个胞外域复合的人FSH的晶体结构作为模板(PDB id4AY9)用于比较建模。小鼠FSHβ上的表位序列仅相差两个氨基酸 使用ICM软件构建修饰的FSHβ表位的几种模型。进行受限制的最小化以除去任何空间碰撞。在模板结构上叠加后，根据最低CαRMSD值选择最终模型。FSHR的结构类似于右手掌，并且主体为掌和突出的发夹环为拇指。FSHβ在掌和拇指之间产生的小沟中结合。产生的静电表面揭示FSHR和FSHβ之间的互补表面电荷。

小鼠：最初从Jackson Labs获得的野生型C57BL/6小鼠、Fshr-^/-小鼠、Thermo小鼠和PhAM^切除小鼠的集落在芒特西奈(Mount Sinai)的伊坎医学院(Icahn School ofMedicine)和/或缅因州医学中心研究所(Maine Medical Center Research Institute)内部维持。对小鼠进行标准的12小时光照/黑暗循环(上午6点至下午6点)并如下文喂养。对于热中性实验，将小鼠圈养在温控笼(30℃)中。所有方案均由各机构的机构动物护理和使用委员会批准。

药代动力学：对3个月龄的野生型C57BL/6小鼠(n＝15)i.p.注射单剂抗FSH抗体(100μg/小鼠)，在0、2、6、12或24小时时处死3只小鼠的组。收集的血浆进行内部ELISA，其中两个兔抗山羊IgG(其中一个用HRP标记(来自Jackson ImmunoResearch的HRP-IgG，产品目录编号305-035-046和来自Thermo Scientific的未标记的IgG，产品目录编号31133)用于夹心捕获山羊IgG。

配对喂养：对2至3个月龄的C57BL/6小鼠配对喂养高脂肪饮食(DIO配方D12492，60％脂肪；Research Diets,Inc.,New Brunswick,NJ.)，或配对喂养或反向配对喂养(reverse pair-fed)正常食物(实验室啮齿类饮食5001；LabDiet，St Louis，MO)长达8周，在此期间在一周两次测量体重外每天测量累积食物摄入。对于配对喂养，对抗FSH抗体处理组给予IgG组随意食用的食物量。对于反向配对喂养，允许抗FSH抗体处理组随意获取食物，并且对IgG组给予相同量的食物，计算剩余食物以确定IgG组的食物摄入。以100至400μg/小鼠的剂量注射抗FSH抗体。使用类似的方案在缅因州医疗中心(Maine Medical Center)进行实验，但允许两个小鼠组随意获取食物。图例中显示了每组小鼠的数目。

ITT和GTT：用抗体或IgG处理4周后测试小鼠的葡萄糖和胰岛素耐受性。对于GTT，将小鼠置于具有水的干净笼中，并且饥饿过夜(16小时)，然后腹膜内施用葡萄糖(1g/kg)，并使用OneTouch Ultra血糖测计仪(LifeScan，Inc.)根据制造商的说明测量注射后0、15、30、60、90和120分钟的血糖水平。对于ITT，抗体或IgG处理的小鼠随意喂养，并且腹膜内注射胰岛素(1U/kg)。在注射后0、15、30、45、60和120分钟测量葡萄糖水平。

体脂的测量：利用几种互补的方法，即定量核磁共振(qNMR)、微计算机断层摄影术(microcomputed tomography，μCT)、双能X射线吸光测定法(DXA)，用于骨髓脂肪定量的锇μCT和组织重量测量以检查不同脂肪组织隔室中的总体脂以及脂肪体积/重量。

定量核磁共振：对于qNMR，将活小鼠放入薄壁塑料圆筒中，自由转动。根据制造商的说明，使用Echo3-in-1NMR核磁共振分析仪(Echo Medical)测量脂肪、瘦和总质量。

微计算机断层摄影术：对于μCT，遵循Judex et al,Quantification ofadiposity in small rodents using micro-CT.Methods 50,14-19,doi:10.1016/j.ymeth.2009.05.017(2010)(其在此通过引用并入本文)的方案。使用具有1024x256像素的检测器尺寸的VivaCT-40(Scanco AG，Bassersdorf，Switzerland)对脂肪进行成像并测量胸腰区室中的脂肪体积。通过用5％异氟烷和O₂吹扫室5至10分钟(X.E.G.)或用Avertin(C.J.R.)麻醉小鼠，并使两腿伸展定位。以76μm(45kV，133μA)的各向同性体素尺寸和200ms积分时间扫描每只小鼠的躯干。将二维灰度图像切片重建为三维断层照片，应用高斯滤器(σ＝0.8，支持＝1)以降低噪声。在L1的近端和L5的远端之间重建扫描。头部和脚部由于这些区域中的肥胖的相对较低量并且为了允许减少扫描时间和对动物的辐射暴露而不扫描和/或评估。手动追踪脂肪区域并以5％最大灰度值阈值化(threshold)。该方法的高分辨率允许皮下脂肪组织(SAT)和内脏脂肪组织(VAT)两者的成像。使用自动化算法使用先前描述的方法(DeMambro,V.E.et al.Igfbp2Deletion in Ovariectomized Mice EnhancesEnergy Expenditure but Accelerates Bone Loss.Endocrinology 156,4129-4140,doi:10.1210/en.2014-1452(2015),Lublinsky,S.,Ozcivici,E.&Judex,S.An automatedalgorithm to detect the trabecular-cortical bone interface in micro-computedtomographic images.Calcif Tissue Int 81,285-293,doi:10.1007/s00223-007-9063-8(2007,这两篇参考文献在此通过引用完整并入)量化VAT和SAT的体积。

双能X射线吸光测定法：使用Lunar Piximus DXA以精确度<1.5％进行BMD和体脂测量。对麻醉的小鼠进行测量，排除颅骨。使用前每次通过采用仿真模型(phantom)按照制造商的推荐校准仪器。

骨髓脂肪的锇定量：使用先前发表的方法(Scheller,E.L.et al.Use of osmiumtetroxide staining with microcomputerized tomography to visualize andquantify bone marrow adipose tissue in vivo.Methods Enzymol 537,123-139,(2014)，其在此通过引用完整并入)，与缅因州医学中心研究所的小动物成像核心和生理学核心(Small Animal Imaging Core and the Physiology Core)合作，进行骨髓脂肪的锇染色。简言之，分离胫骨，用10％福尔马林固定24小时，清洗，然后在EDTA中脱钙14天。进一步清洗后，将骨在1％四氧化锇中染色48小时。在随后的清洗之后，使用VivaCT-40(ScancoAG)以55kVp的能量水平和145μA的强度在PBS中扫描骨。在高分辨率设置下在最大各向同性体素尺寸10.5μm，积分时间设定为500ms。选择两个感兴趣的体素(VOI)，如图8C所示。

间接量热法：使用位于缅因州医学中心研究所生理学核心(Physiology Core ofMaine Medical Center Research Institute)的Promethion代谢笼系统(Sable Systems)进行间接量热法。使用MetaScreen软件(v.2.2.18)进行数据采集和仪器控制，并且使用ExpeData(v.1.8.2)(Sable Systems)处理原始数据。使用详细说明数据转换的所有方面的分析脚本。研究由以下组成：12h驯化期，然后是72小时的采样持续时间。16笼系统中的每个代谢笼由笼组成，所述笼具有标准垫层、食物漏斗、水瓶和用于体重测量的“屋样富集管(house-like enrichment tube)”，连接到用于连续监测的测压仪(load cells)，以及连接到磁簧开关以记录转数的11.5cm的导轮。使用具有0.25cm的束间距的XYZ束阵列监测走动活动和位置。根据这些数据，计算了笼内的小鼠步行运动和速度。使用配备有拉模式负压系统(pull-mode,negative-pressure system)的GA-3气体分析仪(Sable Systems)测量呼吸气体。以设定流速2,000ml/min，通过FR-8(Sable Systems)测量和控制空气流量。以每分钟mL报告耗氧量(VO₂)和二氧化碳产生(VCO₂)(未示出)。连续测量水蒸气，并且在分析流中以数学方式补偿其对O₂和CO₂的稀释效应。使用以下公式计算能量消耗(EE)：kcal/h＝60*(0.003941*VO₂+0.001106*VCO₂)(Weir方程)并且呼吸商(RQ)计算为VCO₂/VO₂。与量热法数据的收集同时测定步行活动和轮运行。使用两种独立的方法从时间依赖性量热法和活动数据中获得静息能量消耗(REE)和活性能量消耗。首先，REE测定为无活动的30分钟间隔的平均EE，并且活性EE测定为最活性状态的15分钟的平均EE。其次，使用惩罚(penalized)样条回归来估计连续REE(或静息代谢率(RMR))和与身体活动相关的活性EE(AEE(PA))，在样条函数中使用每天四个等距结并就回归残差而言优化与活动相关的预处理参数。确定睡眠时间为持续超过40秒或更长的任何不活动。后一种分析为身体活动与EE之间缺乏关系提供了独立的验证；如图3L所示。。

体内萤光素酶成像：在ThermoMouse中，将萤光素酶报告物构建体Luc2-T2A-tdTomato插入Y染色体上的Ucp1基因座中(参见图2D)。Ucp1表达的激活导致Luc2的上调，其可以在注射D-萤光素(10μL/g)后使用IVIS Spectrum In Vivo Imaging System(PerkinElmer)通过辐射测量在体内定量。3个月龄的雄性Thermo小鼠用抗FSH抗体或山羊IgG(200μg/天/小鼠)处理2或8周，期间配对喂养高脂肪饮食，然后进行D-萤光素注射，并且从整个身体的背和/或腹表面，腹股沟白色脂肪组织和肩胛间棕色脂肪组织区域捕获辐射。在分开的实验中，将Thermo细胞(1.5x10⁶)植入nu/nu小鼠的两侧中，所述nu/nu小鼠以正常食物喂养并注射抗FSH抗体(200μg/小鼠/天)8周，之后使用IVIS在D-萤光素后定量Luc2辐射。由于Ucp1表达的基础水平可以在转基因小鼠中变化，因此可以混淆数据解释，常规进行d-萤光素后5分钟的辐射捕获的早期时间点。这允许评估“基础”Ucp1表达，并且排除测量的5分钟时间点的总通量和/或平均辐射与组的平均值大于1s.d的小鼠。为了独立确认，检查已经植入细胞的切除区域的冷冻切片的tdTomato荧光。

组织学、免疫检测和qPCR：对组织进行苏木精和曙红染色或免疫细胞化学。使用Keyence或Zeiss显微镜捕获图像。FSHR的免疫细胞化学使用标准方案和商品化的抗Fshr抗体(Lifespan，产品目录编号LS-A4004)。在冷冻的15-μm切片中检测tdTomato和mito-Dendra2荧光。使用Prism 7900-HT(Applied Biosystems Inc.)，使用适当的引物组进行定量PCR。对于cAMP测量，在有或没有用百日咳毒素(100ng mL^-1；European Pharmacopoeia)预温育16小时(在0.1mM IBMX存在下)的情况下，用Fsh和/或CL-316,243处理细胞20分钟。使用ELISA试剂盒(Cayman，581001)在细胞提取物中测量环AMP。对于鸢尾素和metrnl测量，使用商品化的ELISA(分别为Phoenix，EK-067-29和R&D，DY7867)。通过ELISA(分别为Biotang，M7581和M7619)测量血浆FSH和E2水平。

去甲肾上腺素水平：32只以高脂肪饮食喂养的小鼠用抗体或IgG(每只小鼠每天200μg)处理7周。在抽血后开始时杀死每组的一半，并且对另一半注射α-甲基-对酪氨酸(AMPT；250mg kg-¹)，2h后用补充剂量(125mg kg-¹)。再过2小时后，在抽血后杀死这两组。提取和HPLC在耶鲁医学院的Core CTSI实验室进行。

统计学：从初步的微-CT数据中，发现每组4或5只小鼠的脂肪体积的明显的高达3倍的差异。使用预先指定的效应(x1-x2)/s为3，α＝0.05(Zα)的标准化Z得分为1.96，并假设标准偏差(S)是置信区间宽度的一半(W)[N＝4Z² _αS²/W²]，计算出每组4只小鼠足以在0.8次幂下获得95％的统计学显著性(α＝0.05，β＝0.20)。在给定相等方差的情况下，使用双因素学生t检验检查任何两组之间的统计学显著差异。认为处于或低于0.05的P值是显著的。

随机化、盲法和排除：随机挑选小鼠用于注射IgG或抗体以确保各组的体重的相等分布。分别在哥伦比亚大学和芒特西奈产生和分析微-CT和qNMR数据的技术人员对小鼠组是盲的(图1、4、5、6、8和9)。另外，用Thermo小鼠(图14)和植入nu/nu小鼠中的Thermo细胞(图11D)生成数据的芒特西奈成像核心设施(Imaging Core Facility)的技术人员对小鼠组也是盲的。基本数据在缅因州医疗中心得到确认。对于使用Thermo小鼠的实验，在取样之前进行d-萤光素注射后的基础Luc2测量。预计5分钟时的Luc2辐射率较低。进行预先规定的确定，即若给定小鼠中的Luc2辐射超过平均值的1个标准偏差，则排除该小鼠。基于该标准排除一只小鼠。

结果和讨论

抗FSH抗体减少高脂肪饮食诱导的肥胖：

已经显示，针对FSH的β-亚基(FSHβ)的13个氨基酸的序列(LVYKDPARPNTQK,SEQ IDNO:2)产生的多克隆抗体抑制小鼠中的卵巢切除术诱导的骨丧失。为了确立抗体与FSHβ结合并中断该亚基与其受体的相互作用，使重组小鼠FSH通过具有固定化FSH抗体或山羊免疫球蛋白G(IgG)的树脂，并用针对相应的人LVYKDPARPKIQK(SEQ ID NO:1)基序产生的新型单克隆FSH抗体Hf2对级份免疫印迹。Hf2的表征参见上文实施例1。图2A显示在通过固定化的FSH抗体的洗脱和流过级份两者中的约50kDa条带，而用固定化的山羊IgG，所有蛋白质都出现在流过级份中。抗体免疫沉淀的洗脱液的液相层析及串联质谱术(LC-MS/MS)产生10种对应于鼠FSHα-FSHβ嵌合体的肽(SEQ ID NO:17)(图2B，下表5)，最终确立FSH是抗FSH抗体的结合靶标。

下文再现了全长鼠FSHα-FSHβ嵌合体。SEQ ID NO:2加下划线：

HSCELTNITISVEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPNTQKVC TFKELVYETVRLPGCARHSDSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCS FS.E.M.KEGGGSGGGSGGGSLPDGDFIIQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCM GCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKS(SEQ ID NO:17).

表5.匹配小鼠FSHα-FSHβ嵌合体的胰蛋白酶肽片段(氧化的甲硫氨酸和氨基甲酰甲基化的半胱氨酸是加下划线的)。

研究了针对LVYKDPARPNTQK(SEQ ID NO:2)产生的多克隆FSH抗体是否可以阻断FSH与小鼠FSH受体(FSHR)的相互作用(图2C)。具有基序LVYKDPARPKIQK(SEQ ID NO:1)的人FSH-FSHR复合物(蛋白质数据库(PDB)登录号4AY9)的晶体结构用于模拟小鼠FSH-FSHR相互作用(具有基序LVYKDPARPNTQK(SEQ ID NO:2)；图2C)。值得注意的是，含有此肽序列的来自FSHβ的环进入FSHR中的小沟中，因此抗体对此序列的结合将不可避免地阻断FSHβ进入其FSHR结合位点(图2C)。为了测试抗体是否逆转FSH诱导的对解偶联蛋白1(Ucp1)(脂肪细胞褐化和产热的主要调节物)的抑制，使用源自Thermo小鼠的永生化去分化棕色脂肪细胞(也称为Thermo细胞)，其中Ucp1启动子驱动Luc2-T2A-tdTomato报告物10(图2D)。外源性FSH(30ng ml^-1)抑制缺乏FSH的培养基中的Luc2活性，并且FSH抗体以浓度依赖性方式逆转此种抑制(以1μg ml^-1抗体完成)。为了确定至少1μg ml^-1的血清浓度是否源自100μg抗体的单次腹膜内注射，进行酶联免疫吸附测定法(ELISA)。注射抗体的小鼠在注射后2小时显示血浆抗体水平的急剧增加，以山羊IgG测量，并且水平保持在10μg ml^-1或更多，持续至少24小时(t1/2＝25.6小时)(图2E)。

在3个月龄的野生型雄性和雌性C57BL/6J小鼠中以每天200μg腹膜内注射，检测FSH抗体或山羊IgG对脂肪量的影响，所述小鼠配对喂养或允许随意获取高脂肪饮食。在雄性和雌性小鼠两者中在具有近相等食物摄取的8周内体重增加，抗体和山羊IgG处理的小鼠之间在任一性别上没有显著差异(图4A)。定量NMR(qNMR)显示用抗体处理的小鼠体脂的减少和瘦质量/总质量(LM/TM)比率增加(图4B)。7周时使用qNMR、双能X射线吸光测定法(DXA)和组织重量测量再现数据(图3A-C)。DXA还显示在4周和7周时骨矿物质密度的显著增加(图3B)。不同的胸腹部白色脂肪组织(WAT)区室的微计算机断层摄影术(微-CT)揭示了抗体处理的小鼠的内脏和皮下肥胖的显著减少(图4C)。具体地，总(TFV)、皮下(SFV)和内脏脂肪体积(VFV)在抗体处理的小鼠中比在IgG处理的小鼠中均显著降低(P≤0.05)(图4C)。在肩胛间棕色脂肪组织(BAT)中没有观察到重量差异(图3C)。使用8个月龄的小鼠(图5)和在30℃的热中性条件(图3D)下获得类似的结果。

测试下述假设，即Fshr缺陷小鼠将表型模拟抗体治疗的效果以及在具有遗传性Fshr缺陷的小鼠中多克隆FSH抗体的抗肥胖作用减弱。IgG处理的雄性Fshr+/-小鼠显示通过qNMR测量的总质量和脂肪量，以及通过微-CT测量的TFV、SFV和VHV的减少(图6A，B)。当用FSH抗体处理Fshr+/-小鼠时，在任何参数中没有进一步的减少(图6A，B)，证明抗体通过体内抑制FSH信号传导轴起作用。此外，单倍体不足(haploinsufficient)的Fshr+/-小鼠表型模拟FSH抗体的抗肥胖作用的事实阐明FSH是脂肪量的主要生理调节物。

在抗体治疗的小鼠中，使用代谢笼的间接量热法显示能量消耗和氧消耗(VO2)增加，其伴随着增加的身体活动参数，包括X射线断裂(X-beam break)和步行距离和速度。独立进行的惩罚样条(p-Spline)回归显示，主要由步行(未跑步)组成的身体活动未促成增加的能量消耗(下文表6、7、8)。具体地，由身体活动所致的能量消耗(A-EE(PA))在抗体和IgG处理组之间没有差异。相反，小鼠表现出升高的日间静息能量消耗(R-EE)，其与p-样条回归上的静息代谢率(RMR)的记录趋势(P＝0.08)相对应。后者的发现共同表明抗体诱导的褐化而非身体活动促成产热和瘦。这与BAT和WAT两者中抗体诱导的Ucp1RNA和蛋白质的增加完全一致。

表6.间接量热法(24小时)

表7.间接量热法(天)

表8.间接量热法(晚间)

探讨了身体活动与褐化或瘦的内分泌介质的已知联系，其也可以影响骨量。以高脂肪饮食喂养的小鼠组用多克隆抗FSH抗体或IgG(每天每只小鼠200μg)注射7周，之后每组中一半接受酪氨酸羟化酶抑制剂α-甲基对酪氨酸(AMPT)。在没有AMPT处理的情况下或在AMPT处理之后的IgG和抗体处理组之间，血浆去甲肾上腺素水平没有显著差异(图3E)。同样地，血浆鸢尾素水平在IgG和抗FSH抗体处理的小鼠之间不能区别(图3F)，并且在这两组的血浆中仍检测不到镍纹蛋白样物(Metrnl)。

葡萄糖耐受性测试(GTT)和胰岛素耐受性测定(ITT)两者均未显示抗体处理后的改善(图3G，H)。与此一致，血浆C肽、脂连蛋白和瘦蛋白水平未改变(图3I)。循环总胆固醇和游离脂肪酸也未改变，但经抗体处理的小鼠中血浆甘油三酯有边际(marginal)增加(图3J)。抗体治疗也不影响血清雌二醇(E2)水平(图3K)。

抗FSH抗体减少卵巢切除小鼠的肥胖：

在卵巢切除术后的啮齿类以及慢性低雌激素血症(hypooestrogenaemic)模型中，例如在雌性Esr1-/-(也称为Erα-/-)，Cyp19a1(也称为芳香酶-/-)和Fshr-/-小鼠中，已经记录了与围绝经期转变相关的临床表型，尽管在本实施例中，雌性Fshr-/-小鼠不肥胖。虽然遗传性Fshr缺陷似乎不能抵抗雌性小鼠中严重慢性低雌激素血症(hypo-oestrogenaemia)的促肥胖效应，但研究了抗FSH抗体对FSH的短期抑制是否可以通过平行机制不仅减弱骨丧失，而且还减少体脂并且改善能量稳态。临床上，这在围绝经期晚期期间尤其重要，此时中心性肥胖的发作伴随着相对稳定的雌激素和增加的FSH水平。

雌性小鼠配对喂养正常食物，因此在用卵巢切除术或假手术后腹膜内给予的抗FSH抗体或IgG处理8周内，其食物摄入几乎相同。与喂养高脂肪饮食的小鼠不一样(图4A)，喂养正常食物的这些小鼠未显示总体重随时间的增加(图7A)。然而，与注射IgG的小鼠相比，经抗体处理的假手术小鼠显示出体重减轻(参见图7A的源数据；与图9A比较)。定量NMR显示在假手术组和卵巢切除组两者中抗体处理后脂肪量减少和LM/TM增加(图8A)。抗体处理还降低这两组中的TFV、VFV和SFV(图8B)。此外，锇微-CT揭示抗体处理的小鼠中骨髓脂肪体积的减少(图8C)。卵巢切除术导致血浆FSH水平的预期增加(图7B)。尽管存在这些增加的水平，为了确保有效阻断FSH，与假手术组的每天每只小鼠100μg相反使用每天每只小鼠200或400μg抗体来治疗卵巢切除术组。值得注意的是，尽管FSH与抗体结合(图2A)，但抗体和IgG处理的小鼠之间的总血浆FSH水平(通过ELISA测量)没有显著差异(图7B)。另外，虽然抗体处理组中血清雌激素(oestrogen)水平趋于较低，但与IgG处理组没有显著差异(图3K和7B)。

令人惊讶的是，假手术小鼠和切除卵巢的小鼠对抗体治疗具有相等的响应性(图8)。因此，使用3个月龄的C57BL/6J小鼠重复研究，所述小鼠配对喂养或随意给予正常食物(参见图9)。用抗体处理的配对喂养食物的小鼠在各个时间点时显示减少的总体重(参见图7A，9A的源数据)。抗体处理还减少脂肪量和FM/TM，以及腹部TFV、SFV和VFV(图9B，9C)。相比之下，当允许随意获取食物时，尽管食物摄入增加，但注射抗体的小鼠并未显示总体重减少，但显示脂肪量和腹部TFV、SFV和VFV的类似减少(图9D，9E和9F和源数据)。

间接量热法显示抗FSH抗体增强假手术或卵巢切除小鼠中的活性能量消耗和降低的呼吸商(下文表9，10)。这些产热响应与身体活动参数的显著增加无关；相反，卵巢切除的抗体处理组的步行距离有不明原因的减少。同样地，在喂养正常食物的抗体处理的野生型小鼠中注意到活性能量消耗的边际增加，身体活动没有改变(下表11)。总体上，身体活动未促成喂养正常食物的卵巢切除的小鼠或野生型小鼠中的抗体诱导的产热或实际上瘦。在喂养正常食物的IgG和抗体处理组之间的葡萄糖、胆固醇、甘油三酯或游离脂肪酸的血浆水平没有差异(图7C)。

表9.间接量热法(假性)

表10.间接量热法(OVX)

表11.间接量热法(代谢笼)

阻断FSH对脂肪细胞FSHR的作用诱导Ucp1表达

先前已在脂肪组织和脂肪细胞中以及在破骨细胞和间充质干细胞上鉴定出FSHRcDNA和蛋白质。对全长FSHR cDNA(参见下文，SEQ ID NO:30)进行Sanger测序(参见下文，SEQ ID NO:31)，其来自源自耳垂的原代小鼠间充质干细胞(MSC-ad)和3T3.L1细胞(图10A)。通过腹股沟和内脏WAT和BAT的免疫染色证实的FSHR蛋白(图11A)是信号传导有效的并且在其抑制cAMP(图11B)和刺激脂肪生成基因Fas和Lpl(图10B)的能力中功能性的。然而，与其与卵巢滤泡细胞中的Gs蛋白偶联相反，脂肪细胞FSHR与Gi蛋白偶联。因此，在分化的3T3.L1脂肪细胞中，Fsh消除由Arb3激动剂CL-316,243触发的cAMP的增加，而此种抑制在Gi抑制剂百日咳毒素的存在下被逆转(图11B)。

由于由Arb3信号传导诱导的cAMP的增加刺激Ucp1，使用Thermo细胞研究了FSH是否抑制Ucp1的此种诱导(图2D)。在含有15-40ng ml^-1的FSH的血清存在下的实验表明，抗体(1μg ml^-1)在不添加FSH的情况下诱导Ucp1表达，无论是否存在CL-316,243(图11C)。通过进一步添加FSH(30ng ml^-1)来逆转此刺激，建立FSH特异性(图11C，与图2D比较)。将Thermo细胞植入3个月龄的nu/nu小鼠的两体侧中，并注射IgG或抗FSH抗体(每天每只小鼠200μg)，持续8周。注射d-萤光素后注意到Luc2辐射的显著增加(图11D)。为了确认，在腹股沟WAT(iWAT)的冷冻切片中检查tdTomato荧光(红色)。与Luc2辐射的增加一致，经抗体处理的小鼠显示出tdTomato表达的显著增加(图11E)。数据共同表明通过阻断FSH对FSHR的作用，抗FSH抗体激活Ucp1。

FSHR cDNA核苷酸序列：

TGAGCAGGCAGAAAGCAGGTGGATGGATAAAATAAGCATGGCCTTGCTCCTGGTCTCCTTGCTGGCATTCTTGGGCTCGGGATCTGGATGTCATCACTGGCTGTGTCATTGCTCTAACAGGGTCTTCCTCTGCCAAGATAGCAAGGTGACCGAGATTCCGCCCGACCTCCCCCGGAACGCCATTGAACTGAGATTTGTGCTCACCAAGCTTCGAGTCATT CCAAAAGGATCATTTTCTGGATTTGGGGACCTGGAGAAAATAGAGATCTCTCAGAATGATGTCTTGGAGGTAATAGAGGCAGATGTGTTCTCCAACCTACCCAACTTGCATGAAATTAGGATTGAAAAGGCTAACAATCTGCTGTACATCAACCCTGAGGCCTTCCAGAATCTTCCCAGTCTCCGATATCTGTTAATATCCAACACAGGCATTAAACACTTGCCAGCCTTTCACAAGATCCAGTCTCTCCAAAAGGTTTTATTAGACATTCAAGATAACATAAACATCCACATCATTGCCAGGAACTCCTTCATGGGACTGAGCTTTGAAAGTGTAATTCTATGGCTGAATAAGAATGGGATTCAAGAAATACACAACTGTGCATTCAACGGAACCCAGCTAGATGAACTGAATCTAAGCGATAACAATAATTTGGAAGAATTGCCTGATGATGTTTTCCAGGGAGCCTCTGGGCCAGTCGTTTTAGACATCTCAAGGACAAAGGTCTATTCCCTGCCCAACCATGGCTTAGAAAATCTGAAGAAGTTGAGGGCCAGGTCAACATACCGCTTGAAAAAGCTCCCTAGTCTAGACAAGTTTGTCATGCTCATTGAGGCCAGCCTTACCTACCCCAGTCACTGCTGTGCCTTTGCAAACTGGAGGCGGCAAACCTCTGAACTTCATCCAATTTGCAACAAGTCTATTTCAAGGCAAGATATTGATGATATGACTCAGCCTGGGGATCAGAGAGTCTCTCTCGTAGATGATGAACCCAGTTATGGAAAAGGATCTGACATGTTGTATAGTGAATTTGACTATGACTTATGCAATGAATTTGTTGATGTGACCTGCTCGCCAAAGCCAGATGCATTTAATCCATGTGAAGACATCATGGGGTACAACATCCTCAGAGTCTTGATATGGTTTATCAGCATCCTGGCCATCACTGGGAACACCACAGTGCTGGTGGTCCTGACCACAAGCCAATACAAACTCACTGTGCCCCGGTTCCTTATGTGTAACCTCGCCTTTGCTGATCTTTGCATTGGGATCTACTTGCTACTTATAGCCTCAGTTGATATCCATACTAAGAGCCAGTACCACAATTACGCCATTGACTGGCAAACAGGAGCAGGCTGCGATGCCGCTGGCTTTTTCACTGTCTTTGCCAGTGAACTGTCAGTCTACACATTGGCAGCCATAACCCTAGAAAGATGGCATACCATCACACATGCCATGCAACTGGAATGCAAGGTACAGCTCTGCCATGCTGCCAGCATCATGGTGCTGGGCTGGGCCTTTGCCTTTGCGGCTGCTCTCTTCCCCATCTTTGGCATCAGTAGCTACATGAAAGTGAGCATCTGCCTGCCCATGGATATCGACAGCCCTTTGTCGCAGCTGTATGTTATGGCCCTCCTCGTACTCAACGCCCTGGCCTTTGTGGTCATCTGTGGTTGCTACACCCACATCTACCTCACAGTGAGGAATCCTAACATTGTGTCCTCGTCAAGAGACACCAAGATTGCCAAGCGCATGGCCACACTCATCTTCACGGACTTTCTCTGCATGGCCCCAATTTTATTCTTTGCCATTTCCGCCTCCCTCAAGGTGCCCCTCATCACTGTGTCCAAGGCCAAGATCCTCCTAGTTCTGTTCTACCCCATCAATTCTTGTGCCAATCCTTTCCTCTATGCCATTTTCACCAAGAACTTCCGCAGGGACTTCTTCGTCCTGATGAGCAAGTTTGGCTGTTATGAGGTGCAAGCCCAGATTTACAAGACAGAAACCTCATCTATTACCCACAACTTCCACTCCAGAAAGAATCCCTGTTCCTCGGCTCCCAGAGTCACCAATAGTTACGTGCTTGTCCCTCTAAATCATTCAGTCCAGAACTAAAAATCAATGTGAAAATGGATCCTCACCTTGAAAGACAAGTGTGACTTCTTTCTGGAGAGAGGGCTATGGAAGAGCTGGCAGTGTTGC(SEQ ID NO:30)(3T3.L1细胞中的加下划线区缺少(外显子2))

FSHR肽序列：

MALLLVSLLAFLGSGSGCHHWLCHCSNRVFLCQDSKVTEIPPDLPRNAIELRFVLTKLRVIPKGSFSGFGDLEKIEISQNDVLEVIEADVFSNLPNLHEIRIEKANNLLYINPEAFQNLPSLRYLLISNTGIKHLPAFHKIQSLQKVLLDIQDNINIHIIARNSFMGLSFESVILWLNKNGIQEIHNCAFNGTQLDELNLSDNNNLEELPDDVFQGASGPVVLDISRTKVYSLPNHGLENLKKLRARSTYRLKKLPSLDKFVMLIEASLTYPSHCCAFANWRRQTSELHPICNKSISRQDIDDMTQPGDQRVSLVDDEPSYGKGSDMLYSEFDYDLCNEFVDVTCSPKPDAFNPCEDIMGYNILRVLIWFISILAITGNTTVLVVLTTSQYKLTVPRFLMCNLAFADLCIGIYLLLIASVDIHTKSQYHNYAIDWQTGAGCDAAGFFTVFASELSVYTLAAITLERWHTITHAMQLECKVQLCHAASIMVLGWAFAFAAALFPIFGISSYMKVSICLPMDIDSPLSQLYVMALLVLNALAFVVICGCYTHIYLTVRNPNIVSSSRDTKIAKRMATLIFTDFLCMAPILFFAISASLKVPLITVSKAKILLVLFYPINSCANPFLYAIFTKNFRRDFFVLMSKFGCYEVQAQIYKTETSSITHNFHSRKNPCSSAPRVTNSYVLVPLNHSVQN(SEQ ID NO:31)

抗FSH抗体触发白色脂肪细胞的褐化：

为了确定Fsh抗体是否在体内诱导富含Ucp1的褐色样脂肪组织，对配对喂养高脂肪饮食的野生型小鼠注射抗FSH抗体或IgG。抗FSH处理的小鼠显示腹股沟脂肪垫切片中的脂肪细胞面积和周长的显著减少，与脂肪细胞褐化一致(图12A)。此外，在iWAT和BAT两者中Ucp1免疫标记的显著增加(图12B，12C)。这在1或3个月时伴随iWAT中褐变基因表达的增加(图12D和图13)。在1个月时在BAT中Ucp1、Cidea、Cebpa和Vegfa的表达中也观察到增加，与产热基因程序的早期激活相当(图12D和图13)。

如实地表型模拟抗体处理的效果，来自用IgG处理的Fshr+/-小鼠的皮下WAT显示出具有更强烈的Ucp1免疫染色的更小的褐色样脂肪细胞的证据(图6C)。通过将抗FSH抗体注射到Fshr+/-小鼠中没有增强此种效果，再次证实了抗FSH抗体的特异性(图6C)。未知的是抗FSH抗体诱导的褐色脂肪细胞是源自定型的脂肪形成前体还是源自成熟白色脂肪细胞的转化，或代表这两种机制的组合。

作为用于褐化的互补体内测试，对SV129Thermo小鼠进行成像(图14)，其中转基因Ucp1启动子驱动Luc2-T2A-tdTomato报告物10(图2D)。Thermo小鼠配对喂养高脂肪饮食，并且注射抗体或IgG(每天每只小鼠200μg)。分别从腹和背表面两者测量Luc2辐射，用于对腹股沟(富含WAT的，加上睾丸)和肩胛间(富含BAT的)区域进行最佳显现。注射d-萤光素的对照非转基因小鼠未显示发射的辐射。在8周时，抗体处理触发Luc2辐射的显著增加，主要在腹股沟区域中(图14A)。这些增加在热中性(30℃)下用短的2.5周处理同样显著(图14B；还参见图3D)。

这些数据共同证实抗FSH抗体处理触发褐化，其不源自环境冷暴露。

褐化与线粒体密度的增加有关。使用PhAM^切除小鼠，其中来自octocoralDendronephthya的荧光蛋白，Dendra2与Cox8线粒体靶向信号融合，产生mito-Dendra2(图14C)。来自抗FSH抗体处理的PhAM切除小鼠(4周)的皮下WAT(sWAT)、内脏WAT(vWAT)和BAT的冷冻切片显示荧光的显著增加和WAT中较小较浓缩的脂肪细胞(图14C)。这些数据表明FSH阻断诱导线粒体生物发生(biogenesis)，这与Ucp1激活一致。

3.小鼠中FSHR基因的缺失减少总体脂

进行研究以确定在小鼠中删除FSHR基因对总体脂的影响。使用小鼠的三个实验组；FSHR+/+、FSHR+/-和FSHR-/-并且使用三个不同的龄期；6个月、7个月和8个月龄的小鼠。如图15所示，那些呈FSHR+/+的小鼠表现出最高的脂肪量(FM)与总质量(TM)比率，而那些呈FSHR-/-的小鼠表现出最低的FM/TM比率。

前述实施例和优选实施方案的描述应当视为说明，而不是限制如由权利要求书限定的本公开。如将容易理解的，在不脱离如权利要求书中所阐述的本公开的情况下，可以利用上述特征的许多变化和组合。这些变化不被视为脱离本公开的范围，并且所有这些变化旨在包括在所附权利要求书的范围内。本文引用的所有参考文献都通过引用整体并入。

Claims (23)

1.分离的抗FSH抗体或其抗原结合部分，其包含：

(i)重链CDR1(CDRH1)，其包含SEQ ID NO:9或基本上由SEQ ID NO:9组成但具有至少一个保守取代的序列；

(ii)重链CDR2(CDRH2)，其包含SEQ ID NO:10或基本上由SEQ ID NO:10组成但具有至少一个保守取代的序列；

(iii)重链CDR3(CDRH3)，其包含SEQ ID NO:11或基本上由SEQ ID NO:11组成但具有至少一个保守取代的序列；

(iv)轻链CDR1(CDRL1)，其包含SEQ ID NO:12或基本上由SEQ ID NO:12组成但具有至少一个保守取代的序列；

(v)轻链CDR2(CDRL2)，其包含SEQ ID NO:13或基本上由SEQ ID NO:13组成但具有至少一个保守取代的序列；和

(vi)轻链CDR3(CDRL3)，其包含SEQ ID NO:14或基本上由SEQ ID NO:14组成但具有至少一个保守取代的序列。

2.权利要求1的分离的抗FSH抗体或其抗原结合部分，其具有重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:7或基本上由SEQ ID NO:7组成但具有至少一个保守取代的序列，所述轻链包含SEQ ID NO:8或基本上由SEQ ID NO:8组成但具有至少一个保守取代的序列。

3.权利要求1-2中任一项的分离的抗FSH抗体或其抗原结合部分，其中所述抗FSH抗体或其抗原结合部分特异性结合FSH的β-亚基内的一个或多个表位。

4.权利要求1-3中任一项的分离的抗FSH抗体或其抗原结合部分，其中FSH的β-亚基内的所述一个或多个表位包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或肽序列，所述肽序列基本上由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2组成，但具有保守取代。

5.权利要求1-4中任一项的分离的抗FSH抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是单克隆抗体。

6.权利要求1-5中任一项的分离的抗FSH抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

7.权利要求1-6中任一项的分离的抗FSH抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是人源化抗体。

8.药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项的分离的抗FSH抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体或赋形剂。

9.编码权利要求1-7中任一项的分离的抗FSH抗体或其抗原结合部分的核酸序列。

10.权利要求9的核酸序列，其包含以下之一：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、基本上由SEQID NO:3或SEQ ID NO:4组成但具有保守取代的序列、或编码相同抗体或其抗原结合部分的经密码子优化的序列。

11.载体或载体系统，其包含权利要求9-10中任一项的至少一种核酸。

12.用权利要求11的载体或载体系统转化的细胞。

13.制备重组抗FSH抗体或其抗原结合部分的方法，其包括：

(i)提供权利要求12的细胞；

(ii)在所述细胞的载体或载体系统中表达至少一种核酸序列，以创建重链、轻链或其组合中的至少一种；

(iii)收集形成的抗FSH抗体或其抗原结合片段。

14.减少有此需要的人受试者中白色脂肪组织的方法，其包括对所述受试者施用治疗有效量的包含FSH灭活剂(inactivating agent)或FSHR灭活剂的组合物。

15.诱导有此需要的人受试者中产热脂肪组织(thermogenic adipose tissue)的方法，其包括对所述受试者施用治疗有效量的包含FSH灭活剂或FSHR灭活剂的组合物。

16.权利要求14-15中任一项的方法，其中所述组合物包含FSH灭活剂，并且其中所述FSH灭活剂包含权利要求1-7中任一项的分离的抗FSH抗体或其抗原结合部分。

17.权利要求14-15中任一项的方法，其中所述组合物包含抗FSH抗体或其抗原结合部分或者抗FSHR抗体或其抗原结合部分。

18.权利要求17的方法，其中所述抗FSH抗体或其抗原结合部分或者抗FSHR抗体或其抗原结合部分选自下组：多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人抗体、单链可变片段(scFv)及其组合。

19.权利要求14-18中任一项的方法，其中所述方法降低有此需要的受试者中的总体脂(body fat)。

20.权利要求14-19中任一项的方法，其中所述方法降低有此需要的受试者中的内脏体脂。

21.组合物，其包含权利要求1-7中任一项的分离的抗FSH抗体或其抗原结合部分，用于减少人受试者中的白色脂肪组织。

22.组合物，其包含权利要求1-7中任一项的分离的抗FSH抗体或其抗原结合部分，用于诱导人受试者中产热脂肪组织。

23.权利要求1-7中任一项的组合物在制备用于在人受试者中减少白色脂肪组织或诱导产热脂肪组织的药物中的用途。