CN116003573A - 一种卵泡刺激素β亚基活性肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种卵泡刺激素β亚基活性肽及其应用。该活性肽具有以下序列：X_m‑Y_n‑Z_c；X包括T、R、D和L中的至少3种氨基酸；Y为肽段LVYKDPARP；Z包括K、I、T、Q和N中的至少1种氨基酸，以及位于活性肽3’端的K；其中，0≤m≤4，n＝0或1，0≤c≤4，且m和n不同时为0。本发明提供的活性肽可作为一种安全有效、质量稳定、价格低廉、纯度高且生产简便的新FSH制剂。使用人工合成的FSHβ活性肽，可避免通过经绝经妇女的尿液中提取或基因重组技术生产FSH的弊端。

Description

一种卵泡刺激素β亚基活性肽及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种卵泡刺激素β亚基活性肽及其应用。

背景技术

卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone，FSH)是由垂体合成和分泌的一种由α与β两条多肽组成的异源二聚体糖蛋白，对雌性动物卵泡发育和雄性动物精子发生起关键调控作用。除调控生殖功能外，近年研究证实高水平的FSH是导致妇女绝经后肥胖、高血糖、高血脂、骨质疏松等代谢疾病发生的关键原因。

在临床上，FSH主要用于治疗不孕不育症，以及在辅助生殖技术中作为超数排卵的关键药物。目前，临床所用的FSH主要从绝经妇女的尿液中提取或通过基因重组技术生产。通过尿液提取FSH，首先绝经妇女尿液来源有限且FSH含量低，提取量有限，产品价格昂贵。此外，尿液源FSH有时含病原体或尿蛋白污染物，进入人体后存在引起疾病的风险。而通过基因重组技术生产FSH时，需考虑FSHα和β亚基翻译后复杂的糖基化修饰。糖基化修饰对FSH活性及半衰期具有重要影响。其次，在临床使中，通过尿液提取或基因重组技术生产的FSH，进入机体后均可能发生α与β亚基解离，从而失去生物活性。第三，通过尿液提取或基因重组技术生产的FSH均都具有较高的分子量和较强的免疫原性，通常进入机体后会引起不良的免疫反应。因此，一种安全有效、质量稳定、价格低廉、纯度高且生产简便的新FSH制剂成为临床应用的迫切需求。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种卵泡刺激素β亚基活性肽及其应用，本发明提供了一种卵泡刺激素β亚基活性肽，可显著激活FSHR下游信号，从而发挥FSH类似物的作用。本发明提供的活性肽可作为一种安全有效、质量稳定、价格低廉、纯度高且生产简便的新FSH制剂。使用人工合成的FSHβ活性肽，可避免通过经绝经妇女的尿液中提取或基因重组技术生产FSH的弊端。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种卵泡刺激素β亚基活性肽，该活性肽具有以下序列：X_m-Y_n-Z_c；X包括T、R、D和L中的至少3种氨基酸；

Y为肽段LVYKDPARP；

Z包括K、I、T、Q和N中的至少1种氨基酸，以及位于活性肽3’端的K；

其中，0≤m≤4，n＝0或1，0≤c≤4，且m和n不同时为0。

进一步地，n和c为0，m取值为4，其活性肽序列为TRDL(SEQ ID NO.9)。

进一步地，m为0，n＝1，c为4，其活性肽序列为LVYKDPARPZ_c。

进一步地，活性肽序列如SEQ ID NO.5～8所示。

进一步地，m取值为3，n＝1，c取值为4，其活性肽序列为X₃-LVYKDPARP-Z₄。

进一步地，活性肽序列如SEQ ID NO.1～4所示。

上述活性肽在制备调控生殖功能的药物中的应用。

进一步地，药物可促进卵泡发育或精子生成。

上述活性肽在制备FSH拮抗剂或FSH激活剂中的应用。

上述活性肽在制备治疗FSH异常分泌导致的疾病的药物中的应用。

进一步，该活性肽可缓解或治疗由高浓度FSH引起的肥胖、高血脂、高血糖、骨质疏松等疾病。

本发明的有益效果：

FSH的生理功能通过其受体(FSH receptor,FSR)介导实现。其中，FSHβ亚基在介导FSH与FSHR结合并激活下游信号中发挥核心作用。本发明筛查到了FSHβ与FSHR结合的关键氨基酸位点序列---FSHβ活性肽。经人工合成的FSHβ活性肽，可显著激活FSHR下游信号，从而发挥FSH类似物的作用。FSHβ活性肽可作为一种安全有效、质量稳定、价格低廉、纯度高且生产简便的新FSH制剂。使用人工合成的FSHβ活性肽，可避免通过经绝经妇女的尿液中提取或基因重组技术生产FSH的弊端。

附图说明

图1为FSHβ活性多肽对小鼠颗粒细胞增殖的影响；

图2为FSHβ活性多肽对小鼠颗粒细胞雌二醇合成的影响；

图3为FSHβ活性多肽对雄性幼鼠青春期启动和精子发生的影响；

图4为FSHβ活性多肽对雌性幼鼠青春期启动和卵巢卵泡发育的影响；

图5为FSHβ活性多肽对成年雌性小鼠生殖功能的影响。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1合成FSHβ活性肽序列

以CTC Resin树脂为原料，采用基于Fmoc的固相多肽合成法合成FSHβ活性肽序列，多肽由上海强耀生物科技有限公司合成，具体序列见表1。

表1 FSHβ活性肽序列

实施例2 FSHβ活性肽功能验证

1、离体细胞培养确证FSHβ活性肽可与FSHR结合并激活其下游信号

选取25日龄雌性C57BL/6小鼠，断颈处死后迅速分离小鼠卵巢并置于4℃4℃预冷的PBS溶液(含有2％青链霉素混合液)中。在显微镜下用针头剔除卵巢周围脂肪，用PBS溶液冲洗卵巢2-3次后将其移至DMEM/F12培养基(添加3％FBS和1％青链霉素混合液)。用针头刺破卵巢以充分释放卵泡中的颗粒细胞。将含有颗粒细胞的DMEM/F12培养基用40μm细胞筛网过滤并收集至15mL离心管。1000r/min离心5min，弃去上清，重复2-3次，以彻底清洗杂质。将清洗的细胞重悬于含有10％FBS的DMEM/F12培养基。将分离得到的卵巢颗粒细胞以5×10³/孔的浓度接种至96孔细胞培养板，于含5％CO2的培养箱37℃过夜培养。待细胞贴壁后，移去培养基，然后分别添加含100ng/mL不同FSHβ活性肽(表1)的DMEM/F12培养基，并以不含多肽的DMEM/F12培养基(Vehicle)为对照。向每个孔添加10μL CCK-8分析溶液(购自于Boster公司，货号为AR1160)，并在处理0、6、12、18、24、30和36h后用酶标仪测定每孔的吸光值，测定波长为450nm。

结果显示，添加9种不同FSHβ活性肽(表1)均能显著促进小鼠卵巢颗粒细胞增殖(图1A)；进一步研究机制发现FSHβ活性肽通过上调卵巢颗粒细胞增殖关键调控基因Ccnd2表达(图1B)，进而促进其增殖。Ccnd2为细胞周期调控蛋白，是FSH-FSHR信号下游重要靶基因，表明本发明所公开的9种不同FSHβ活性肽均能于FSHR结合并激活FSHR信号通路，可作为FSH激活剂或类似物进行进行商业化应用。注：*表示差异显著(P<0.05)；Ccnd2，细胞周期蛋白D2；^a-c不同字母表示组间差异显著(P<0.05)。

2、离体细胞培养确证FSHβ多肽可激活FSHR进而促进卵巢颗粒细胞合成雌二醇

按上述同样方法分离25日龄雌性C57BL/6小鼠卵巢颗粒细胞。将分离得到的颗粒细胞以3×10⁴/孔的浓度接种至48孔细胞培养板，于含5％CO₂的培养箱37℃过夜培养。待细胞贴壁后，移去培养基并用含100ng/mL的不同FSHβ活性多肽(表1)培养基处理24h，以不含活性肽的DMEM/F12培养基为对照(Vehicle)。待处理完成后，收集培养液上清，以美国R&D公司生产的小鼠雌二醇ELISA试剂盒(KGE014)测定细胞培养液上清雌二醇(17β-estradiol)含量。结果显示，添加9种不同FSHβ活性多肽(表1)均能可显著促进颗粒细胞17β-estradiol的合成(图2A)；进一步研究机制发现FSHβ活性肽通过上调卵巢颗粒细胞雌二醇合成关键基因芳香化酶(Cyp19a1)的表达，进而促进颗粒细胞雌二醇合成(图2B)。实验结果再次证实，本专利所公开的9种不同FSHβ活性肽(表1)均能与FSHR结合并显著激活FSHR下游信号，可作为FSH激活剂或类似物进行商业化应用。注：^a-b不同字母表示组间差异显著(P<0.05)。

离体细胞培养实验结果显示，4种不同FSHβ13AA肽(即FSHβ13AA1、FSHβ13AA2、FSHβ13AA3及FSHβ13AA4)活性相当，4种不同FSHβ16AA肽(即FSHβ16AA1、FSHβ16AA2、FSHβ16AA3及FSHβ16AA4)活性也相当；同时4种不同FSHβ13AA和FSHβ16AA活性均高于FSHβ4AA。据此，在后续试验中，仅选取FSHβ13AA1、FSHβ16AA1和FSHβ4AA三种多肽进行体内活性评价。

3、FSHβ活性肽注射显著促进雄性幼鼠青春期启动和睾丸精子发生

分别给25日龄C57BL/6J雄性幼鼠腹腔单剂量注射200μg/g体重的不同FSHβ活性肽，以注射生理盐水的小鼠为对照(Vehicle)。注射第二天起，每天观察小鼠阴茎包皮分离情况，并记录小鼠阴茎包皮分离的日龄。阴茎包皮分离为小鼠青春期启动的标志。结果显示，单剂量注射200μg/g体重的不同FSHβ活性多肽(FSHβ13AA1、FSHβ16AA1及FSHβ4AA)均能显著促进雄性小鼠青春期启动(图3A)。

从25日龄起，分别给C57BL/6J雄性幼鼠每天腹腔注射200μg/g体重的不同FSHβ活性多肽(表1)，连续注射4天。30日龄时处死小鼠，收集血液分离血清，使用美国R&D公司睾酮ELISA试剂盒(KGE010)测定血清睾酮(Testosterone)浓度；分离睾丸通过石蜡包埋、切片、H&E染色检测小鼠睾丸精子发生情况。结果显示，FSHβ13A/1、FSHβ16AA1及FSHβ4AA三种不同FSHβ活性肽注射均能显著促进小鼠睾丸睾酮合成(图3B)；尤为明显的是，不注射注FSHβ活性肽的小鼠睾丸30日龄时完全无精子生成(图3C)，而注射FSHβ活性肽的小鼠30日龄时睾丸精子生成清晰可见(图3C，方框所示)，表明FSHβ活性肽可显著促进小鼠睾丸精子生成。注：BSP为：阴茎包皮分离，是雄鼠青春期启动的标志；*P<0.05；**P<0.01；^a-b不同字母表示组间差异显著(P<0.05)；图C中：短箭头表示精原细胞，长箭头表示次级精母细胞，方框表示成熟精子。

4、FSHβ活性肽注射显著促进雌性幼鼠青春期启动和卵巢卵泡发育

分别给25日龄C57BL/6J雌性幼鼠单剂量腹腔注射200μg/g体重的不同FSHβ活性肽，以注射生理盐水的小鼠为对照(Vehicle)。注射第二天起，每天通过阴道涂片跟踪检测小鼠初次发情(First estrous)日龄，初次发情为小鼠青春期发育结束的标志。结果显示，单剂量注射三种不同FSHβ活性肽(FSHβ13AA1、FSHβ16AA1及FSHβ4AA)均能显著促进雌性小鼠青春期启动(图4A)。

从25日龄起，分别给C57BL/6J雌性幼鼠每天腹腔注射200μg/g体重的不同FSHβ活性肽，连续注射4天。30日龄时处死小鼠，收集血液分离血清，使用美国R&D公司生产的雌二醇ELISA试剂盒(KGE014)测定血清雌二醇(17-βestradiol)浓度；分离卵巢，石蜡包埋切片后，通过H&E染色检测小鼠卵巢卵泡发育情况。结果显示，FSHβ13AA1、FSHβ16AA1及FSHβ4AA三种不同FSHβ活性肽注射均能显著促进小鼠卵巢雌二醇合成(图4B)和卵泡发育(图4C和D)。注：First estrous为：初次发情，是雌鼠青春期结束的标志；Antral follicle，有腔卵泡；*表示差异显著(P<0.05)；^a-b不同字母表示组间差异显著(P<0.05)；箭头表示有腔卵泡。

5、FSHβ活性肽拮抗成年雌鼠内源性FSH活性

通过阴道涂片检测雌性成年小鼠发情周期变化，在间情期时分别给小鼠腹腔单剂量注射200μg/g体重的不同FSHβ活性多肽，在紧随其后的发情前期处死小鼠。小鼠处死后，收集血液，分离卵巢并称重。血液离心分离血清后，使用美国R&D公司ELISA试剂盒(KGE014)测定小鼠血清雌二醇浓度。

结果发现，与空白注射对照(Vehicle)相比，FSHβ13AA1、FSHβ16AA1及FSHβ4AA三种不同FSHβ活性肽注射均能显著降低小鼠卵巢重量(图5A)以及血清雌二醇浓度(图5B)。由此可知，FSHβ活性肽生物性较内源性FSH活性低，当人或动物体内内源性FSH含量高时，注射FSHβ活性肽可通过与FSHR竞争性结合，进而阻碍内源性FSH与FSHR结合，从而降低内源性FSH的生理活性和作用。因此，在内源性FSH存在的情况下，FSHβ活性肽可作为FSH拮抗剂进行商业化应用。注：^a-b不同字母表示组间差异显著(P<0.05)。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种卵泡刺激素β亚基活性肽及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln Lys

1 5 10 15

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Thr Gln Lys

1 5 10 15

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln Lys

1 5 10 15

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Asn Gln Lys

1 5 10 15

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln Lys

1 5 10

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Thr Gln Lys

1 5 10

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln Lys

1 5 10

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Asn Gln Lys

1 5 10

<210> 9

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Thr Arg Asp Leu

1

Claims (10)

1.一种卵泡刺激素β亚基活性肽，其特征在于，所述活性肽具有以下序列：X_m-Y_n-Z_c；所述X包括T、R、D和L中的至少3种氨基酸；

所述Y为肽段LVYKDPARP；

所述Z包括K、I、T、Q和N中的至少1种氨基酸，以及位于活性肽3’端的K；

其中，0≤m≤4，n＝0或1，0≤c≤4，且m和n不同时为0。

2.根据权利要求1所述的卵泡刺激素β亚基活性肽，其特征在于，所述n和c为0，m取值为4，其活性肽序列为TRDL。

3.根据权利要求1所述的卵泡刺激素β亚基活性肽，其特征在于，所述m为0，n＝1，c为4，其活性肽序列为LVYKDPARPZ_c。

4.根据权利要求3所述的卵泡刺激素β亚基活性肽，其特征在于，所述活性肽序列如SEQID NO.5～8所示。

5.根据权利要求1所述的卵泡刺激素β亚基活性肽，其特征在于，所述m取值为3，n＝1，c取值为4，其活性肽序列为X₃-LVYKDPARP-Z₄。

6.根据权利要求5所述的卵泡刺激素β亚基活性肽，其特征在于，所述活性肽序列如SEQID NO.1～4所示。

7.权利要求1～6任一项所述的活性肽在制备调控生殖功能的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物可促进卵泡发育或精子生成。

9.权利要求1～6任一项所述的活性肽在制备FSH拮抗剂或FSH激活剂中的应用。

10.权利要求1～6任一项所述的活性肽在制备治疗FSH异常分泌导致的疾病的药物中的应用。

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