CN110133170B - 复杂样本的蛋白检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种复杂样本的蛋白检测方法，该方法包括：对复杂样本进行色谱分离以及质谱扫描采集质谱数据，在质谱扫描采集质谱数据的过程中，采用DDA模式扫描采集的过程中穿插PRM模式的扫描采集；对质谱数据中的蛋白进行定性和定量分析，获得复杂样本的全谱蛋白的表达信息。通过对现有的两种质谱数据的采集模式进行调整，在DDA采集过程中穿插PRM采集模式对目标蛋白进行更准确地定量，在较短的时间范围内既获得了此类样本的全谱蛋白表达情况，也获得了目标蛋白的更准确的定量。该方法兼顾了DDA采集模式下蛋白全谱覆盖的高通量和PRM采集模式下靶向定量的高灵敏度和精确度的优点，且操作简单、耗时少、实验周期短。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白表达量检测领域，具体而言，涉及一种复杂样本的蛋白检测方法。
背景技术
数据依赖性采集(Data Dependent acquisition，DDA)是目前最常用的质谱数据采集模式，无需预先设定离子信息、或建立谱图数据集，应用过程方便快捷。根据检测样本的实时信号强度对不同的离子进行碎裂扫描，能够在一定程度上保证检测样本中离子种类的完整性。但根据实时信号强度进行离子采集，使得一些丰度较低的离子在定量过程中出现可信度偏低或丢失的现象。
平行反应监测(Parallel reaction monitoring，PRM)属于质谱靶向分析，在整个液相分离过程中会不断地对每一个目标母离子的全部碎片离子图谱进行记录。相比于传统SRM只检测目标离子对的模式，PRM检测所选择的母离子窗口内的所有碎片信息。PRM主要的优势就是使用了超高分辨率的Orbitrap质量分析器，其能够将干扰信息与真实的信号进行区分，以及相比于传统的SRM方法能够更好的保证分析的选择性。但目前还无法在较短时间内完成上千个蛋白质的靶向检测工作。
目前，针对组织、细胞以及体液等复杂样本中蛋白复杂度较高，同时该样本中的目的肽段丰度较低的情况下，想要快速高效地获得此类样本的全谱蛋白的表达量数据，仍无有效的解决方案。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种含复杂蛋白的样本的蛋白检测方法，以解决现有技术中无法在较短时间内完成复杂样本中全谱蛋白表达检测的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种复杂样本的蛋白检测方法，该方法包括：对复杂样本进行色谱分离以及质谱扫描采集质谱数据，其中，在质谱扫描采集质谱数据的过程中，采用DDA模式扫描采集的过程中穿插PRM模式的扫描采集；对质谱数据中的蛋白进行定性和定量分析，获得复杂样本的全谱蛋白的表达信息。
进一步地，在复杂样本中，目标蛋白的靶向肽段所对应的时间窗口进行PRM模式的扫描采集；优选地，采用四级杆质谱仪或三合一质谱仪进行DDA模式扫描和PRM模式的扫描采集。
进一步地，对质谱数据中的蛋白定量进行分析的步骤包括：利用DDA模式采集的质谱数据根据一级色谱峰面积进行定量分析；利用PRM模式采集的质谱数据根据靶向肽段的中前三高的二级碎片离子的加和进行定量分析。
进一步地，采用色谱分析柱对复杂样本进行色谱分离，其中色谱分析柱包括：色谱柱管，色谱柱管的外径为355～365μm，内径为100～200μm；填充于色谱柱管内的填料，填料为C18填料；以及与色谱柱管一体化设计的色谱柱尖。
进一步地，色谱柱管的长度为150～300mm。
进一步地，色谱柱尖的内径(指色谱柱尖的最尖端位置的内径)为2～8μm，优选为3～6μm；优选地，填料的粒径为1.5～3μm，优选为1.8～2.5μm。
进一步地，色谱分离的步骤中，采用75～150min的色谱分离梯度进行分离。
进一步地，复杂样本为组织样本、细胞样本或者体液样本。
进一步地，复杂样本为植物样本、动物样本或微生物样本。
进一步地，目标蛋白为基于DDA模式采集的质谱历史数据中的一种或多种蛋白。
应用本发明的技术方案，通过对现有的两种质谱数据的采集模式进行调整，对于复杂样本中表达丰度相对较高的蛋白，仅通过DDA采集模式即可进行定量，而对于表达丰度低的蛋白或者感兴趣的目标蛋白则进行PRM采集模式进行定量，这样既能够通过DDA模式获得该样本的全谱蛋白表达情况，又能够在DDA采集过程中，穿插PRM采集模式对目标蛋白进行更准确地定量，而且，基本在DDA采集模式下所花费的较短的时间范围内，既获得了此类样本的全谱蛋白表达情况，也获得了目标蛋白的更准确的定量情况。即该方法兼顾了DDA采集模式下蛋白全谱覆盖的高通量和PRM采集模式下靶向定量的高灵敏度和精确度的优点，而且操作简单、耗时少、实验周期短。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
术语解释：
复杂样本：包括动植物和微生物等的组织、细胞或者体液的样本，蛋白检测深度覆盖能够达到成千上万的样本称之为复杂样本。现有方法对此类样本通过花更多的质谱机间也能实现检测成千上万个蛋白，但对于表达丰度较低的蛋白可能仍无法检测到。
历史数据：指在进行本申请的“采用DDA模式扫描采集的过程中穿插PRM模式的扫描采集”的操作之前，基于之前的DDA模式扫描采集到的同一复杂样本的质谱数据。基于该之前采用的质谱数据，可以获知该复杂样本中的一些感兴趣的或欲关注的目标蛋白。进而在进行本申请的上述“采用DDA模式扫描采集的过程中穿插PRM模式的扫描采集”的操作时，能够准确设置PRM采集的目标蛋白的相关信息(比如时间窗口)。
如背景技术所提到的，现有技术中有很多需要对样本的全部蛋白表达模式和/或表达量进行检测的情况，但现有的蛋白质质谱检测方法中，要么是基于DDA扫描模式进行蛋白的质谱数据采集，要么是在已知样本表达谱的情况下，对感兴趣的目标蛋白进行定量的，因而仅采用PRM数据采集模式进行质谱数据的采集。然而，当所要检测的样本中的蛋白复杂度比较高时，DDA数据采集模式一方面需要花费很长的时间，以尽量将复杂的蛋白尽量分开，但仍有可能无法检测到某些低丰度的蛋白质肽段，因而也无法进行定量。而PRM模式倒是能够更准确地进行定量，但花费的时间会更长，无法在相对较短的时间内实现一个含复杂蛋白的样本中全部蛋白的表达情况。
为改善现有技术中的上述状况，发明人通过将这两种质谱数据的采集模式进行调整，对于复杂样本中表达丰度相对较高的蛋白，仅通过DDA采集模式即可进行定量，而对于表达丰度低的蛋白或者感兴趣的目标蛋白则进行PRM采集模式进行定量，这样既能够通过DDA模式获得该样本的全谱蛋白表达情况，又能够在DDA采集过程中，穿插PRM采集模式对目标蛋白进行更准确地定量，而且，基本在DDA采集模式下所花费的较短的时间范围内，既获得了此类样本的全谱蛋白表达情况，也获得了目标蛋白的更准确的定量情况。即该方法兼顾了DDA采集模式下蛋白全谱覆盖的高通量和PRM采集模式下靶向定量的高灵敏度和精确度的优点，而且操作简单、耗时少、实验周期短。
因此，在上述研究结果的基础上，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种复杂样本的蛋白检测方法，该方法包括：对复杂样本进行色谱分离以及质谱扫描采集质谱数据，其中，在质谱扫描采集质谱数据的过程中，采用DDA模式扫描采集的过程中穿插PRM模式的扫描采集；对质谱数据中的蛋白进行定性和定量分析，获得复杂样本的全谱蛋白的表达信息。
如前述，本申请的针对此类含复杂蛋白的样本的蛋白检测方法，通过在现有的质谱检测蛋白方法基础上，通过调整质谱数据的采集模式，即在DDA采集模式的过程中在特定的时间窗口进行PRM采集模式，从而使得该方法具有DDA采集模式下蛋白全谱覆盖的高通量和PRM采集模式下靶向定量的高灵敏度和精确度的优点。
根据研究目的的不同，上述PRM采集模式可以设置在DDA采用模式过程中不同的时间窗口。在一种优选的实施例中，在复杂样本中，目标蛋白的靶向肽段所对应的时间窗口进行PRM模式的扫描采集。例如，针对水稻不同发育阶段的种子进行蛋白提取，以获得其中影响大米营养品质或口感的蛋白的表达情况，则可以在DDA采集过程中，根据谷蛋白的靶向肽段的离子信息(包括保留时间和m/z比等)设置PRM采集。即，在DDA采集过程中，随着不同的蛋白肽段信息的采用，当出现谷蛋白的肽段信息时则改为PRM模式进行采集，谷蛋白的肽段信息采集完后，接着进行DDA模式的采集。此处需要说明的是，改为PRM模式进行采集并不意味着DDA采集模式停止，而是在同一时间窗口内DDA采集模式被PRM采集模式挤压，PRM模式所采集数据的时间挤占了DDA模式所采集数据的时间，使得在该时间窗口内的DDA模式所应该采集的其他蛋白可能被遗漏。
为了使得检测结果相对更准确，在本申请优选的实施例中，采用四级杆质谱仪或三合一质谱仪进行DDA模式扫描和PRM模式的扫描采集。四级杆质谱仪或三合一质谱仪为高分辨率的质谱仪，采集的质谱数据更准确，尤其是提高了低丰度蛋白，使得后续分析结果更准确，检测结果可信度更高。具体地，可以采用纳升级色谱仪Easy-nLC和高分辨质谱仪Q-Exactive系列以及赛默飞三合一高分辨质谱Orbitrap Fusion、Lomus等。
本申请所提供的上述方法中，对两种采集模式下采集的数据进行蛋白定量的方法按照现有方法进行定量即可。在本申请一种优选的实施例中，对质谱数据中的蛋白定量进行分析的步骤包括：利用DDA模式采集的质谱数据根据一级色谱峰面积进行定量分析；利用PRM模式采集的质谱数据根据靶向肽段的中前三高的二级碎片离子的加和进行定量分析。
为了进一步提高含复杂蛋白的样本中蛋白的分离度，进而获得更好的质谱采集数据，申请人还对现有的蛋白检测常用的色谱分析柱进行了改进，这种改进后的色谱分析柱的蛋白分离度更好。在本申请一种优选的实施例中，采用色谱分析柱对复杂样本进行色谱分离，其中色谱分析柱包括：色谱柱管，色谱柱管的外径为355～365μm，内径为100～200μm；填充于色谱柱管内的填料，填料为C18填料；以及与色谱柱管一体化设计的色谱柱尖。
上述优选实施例中的色谱分析柱，通过采用与色谱柱管一体化设计的色谱柱尖，并将色谱分析柱的内径由现有蛋白分离常用的75μm扩展为100～200μm，得色谱分析柱的内径相对较宽，较宽的内径可以保证提高色谱洗脱流速的时候维持柱压在非耐高压常规液相系统的正常压力范围内(280bar以内)，从而提高了色谱的稳定性；同时也有利于增加样本的上样量，提高质谱检测的灵敏度。此外，现有的色谱分析柱多为平头色谱柱与色谱喷针配合使用的，即是不带有柱尖的，这种色谱分析柱在洗脱过程中，洗脱峰会有拖尾现象，因而柱效相对较差。而本申请改进后的一体化成型的色谱分析柱，洗脱时不存在拖尾现象，对蛋白的分离度更好。因此，本申请所改进的色谱分析柱肽段分离度更好，稳定性更高，进而更有利于对目标蛋白进行定量分析，使得定量结果更准确。
本申请所改进的色谱分析柱，一方面扩大了色谱柱管的内径，另一方面改进了色谱柱尖的结构，使得肽段分得更开，从而分离效果更好。在此基础上，为了进一步提高蛋白的分离效果，在扩大了内径宽度的基础上进一步延长了色谱柱管的长度，在本申请一种优选的实施例中，上述色谱柱管的长度为150～300mm。
上述长度范围的色谱分析柱在具体使用中，根据所欲分离的样本中蛋白的丰富程度，以及研究目的的不同，可以在上述范围内进行合理选择。比如，可以选择长度为150mm或者300mm的色谱柱管长度，配合75～150min的梯度分离时长，即可使得肽段的分离效果更好。
上述改进的色谱分析柱中，与色谱柱管一体化成型的色谱柱尖，是通过对色谱柱管的一端进行拉伸得到，随着拉伸的延长，管柱的内径逐渐变小，内外径的厚度也逐渐变薄，所形成的色谱柱尖的内径与外径逐渐趋于接近，此时色谱柱尖的内径(即色谱柱尖的最尖端的开口的内径)为2～8μm，根据实际样本的不同，可以优选为3～6μm，内径过大，不利于喷雾，内径过小，容易使得色谱柱管压力过大，影响色谱柱管的运行稳定性。
本申请所提到的上述色谱分析柱，除了内径和一体化成型的色谱柱尖外，其余的填料或外径等参数，均可采用与现有的色谱分析柱类似的参数。为了更有效地对关节液中的蛋白进行高效分离，在本申请一种优选的实施例中，上述色谱分析柱中的填料为C18填料，更优选填料的粒径为1.5～3μm，进一步优选为1.8～2.5μm。选择粒径在该范围内的C18填料，具有色谱分辨率高同时色谱系统压力小的优势。
本申请所提供的上述蛋白表达的检测方法，根据实际研究项目的不同，含复杂蛋白的样本也不同。在本申请中，可以是植物样本、动物样本或微生物样本。
上述方法中的目标蛋白也可以根据实际应用领域或场景的不同而不同。在本申请一种优选的实施例中，目标蛋白为基于DDA模式采集的质谱历史数据中的一种或多种蛋白。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
实施例1：肝脏组织样本中蛋白标志物的检测
1.取9个肝脏组织的样本，每个样本取10μg肝脏组织蛋白酶解后的肽段，向其中加入25μL上样缓冲液，震荡混匀，制成肿瘤样本肽段溶液，备用；
2.取5μL步骤1制成的肝脏样本肽段溶液置于96孔上样板进行色谱进样；
3.色谱分离梯度设置如下表1：
流动相A：100％色谱级水+0.2v％甲酸；
流动相B：80％色谱级乙腈+0.2v％甲酸；
色谱梯度：150分钟梯度。
表1：
| 时间 | 持续时间 | 流速(纳升/分钟) | B％ |
| 0 | 0 | 600 | 5 |
| 140 | 140 | 600 | 45 |
| 141 | 1 | 600 | 95 |
| 150 | 9 | 600 | 95 |
4.质谱仪Q-Exactive HF(Thermo)设置如下：
一级质谱，扫描范围:300-1400m/z，分辨率:120000(@m/z 200)，AGC target(自动增益目标):3e6，Maximum IT(最大注入时间):80ms；
二级扫描，Isolation window(隔离窗口):1.6Da，分辨率:15000(@m/z 200)，AGCtarget自动增益目标):2e4，Maximum IT(最大注入时间):20ms，Microscans(微扫描):1，MS2Activation Type(二级活化类型):HCD，NCE:27；二级扫描个数Top20。
DDA扫描的过程中穿插设置10个PRM的扫描事件，PRM扫描肽段inclusion list(输入列表)如表2，Isolation window:1.6Da，分辨率:15000(@m/z 200)，AGC target:2e4，MaximumIT:40ms，Microscans:1，MS2Activation Type:HCD(高能碰撞模式)，NCE(碰撞能量):27。
表2：
5.对质谱数据进行Proteome Discoverer处理，随后进行Skyline软件处理，计算蛋白标志物在各组织样本中的表达量。结果见表3和表4：
表3：
| 样本1 | 样本2 | 样本3 | 样本4 | 样本5 | 样本6 | 样本7 | 样本8 | 样本9 | |
| DDA_PRO_ID | 4395 | 4401 | 4368 | 4289 | 4374 | 4427 | 4364 | 4386 | 4251 |
| DDA+PRM_PRO_ID | 4078 | 4071 | 4035 | 3927 | 4037 | 4101 | 4070 | 4090 | 3950 |
表4：
| 目标蛋白 | DDA_谱图数 | DDA+PRM_谱图数 |
| NFIA | 0 | 68 |
| SMARCA5 | 0 | 95 |
| AHCTF1 | 0 | 99 |
| CREB3L3 | 0 | 220 |
| HHEX | 2 | 21 |
| GATAD2B | 3 | 64 |
| ARRB2 | 7 | 37 |
| ZHX3 | 8 | 102 |
| DR1 | 11 | 292 |
| CADM1 | 11 | 546 |
| LAMP1 | 14 | 253 |
| DNAJC1 | 16 | 262 |
| NFIC | 17 | 226 |
| SERPINB9 | 17 | 242 |
| CLEC2D | 19 | 236 |
| PDS5B | 19 | 420 |
| TAP1 | 24 | 393 |
| CEACAM1 | 27 | 506 |
| MTA2 | 33 | 274 |
| CRK | 43 | 369 |
| HMGN5 | 50 | 1069 |
| SMARCC2 | 66 | 577 |
| MLXIPL | 74 | 369 |
| PTPN6 | 82 | 713 |
| STAT5B | 91 | 241 |
| STAT1 | 91 | 284 |
| AP1G1 | 101 | 671 |
| YBX1 | 137 | 1991 |
| LGALS9 | 144 | 706 |
| STAT3 | 154 | 573 |
| PRDX1 | 416 | 1317 |
从表3和表4可以看出，本申请的方法与常规的蛋白检测方法相比，所检测的全谱蛋白的数目无明显影响(具体数值上略少的原因在于PRM模式采集质谱数据的同一时间，DDA模式无法进行采集，因而对该时间内的蛋白检测存在微量损失)。而本申请的检测方法通过穿插PRM的采集模式，不仅能够检测到DDA模式下无法检测到的蛋白，而且能够使在DDA模式下低丰度的蛋白的检测次数显著提升，在与常规方法相同的检测时间内，提高了检测灵敏度以及定量精确度。
实施例2：胃癌临床石蜡切片样本的全谱检测以及分子分型目标蛋白标志物的检测
1.取10μg石蜡切片样本蛋白酶解后的肽段加入25μL上样缓冲液，震荡混匀，制成肿瘤样本肽段溶液，备用；
2.取5μL步骤1制成的石蜡切片样本的肽段溶液置于96孔上样板进行色谱进样；
色谱分离梯度设置如下表5：
流动相A：100％色谱级水+0.2V％甲酸；
流动相B：80％色谱级乙腈+0.2V％甲酸；
色谱梯度：75分钟梯度。
表5：
| 时间 | 持续时间 | 流速(纳升/分钟) | B％ |
| 0 | 0 | 600 | 8 |
| 6 | 16 | 600 | 16 |
| 51 | 35 | 600 | 30 |
| 66 | 15 | 600 | 42 |
| 67 | 1 | 600 | 95 |
| 75 | 8 | 600 | 95 |
3.质谱仪Orbitrap Fusion Lumos(Thermo)设置如下:
一级质谱，扫描范围:300-1400m/z，分辨率:120000(@m/z 200)，RF lens(％):45，AGCtarget:5e5，Maximum IT:50ms；
二级扫描，Isolation window:1.6Da，MS2Activation Type:HCD，NCE:32；检测器：离子阱，离子阱扫描方式：Rapid，AGC target:5e3，Maximum IT:35ms，Microscans:1。
DDA扫描的过程中穿插进行10个PRM的扫描事件，Isolation window:1.6Da，分辨率:15000(@m/z 200)，AGC target:1e5，Maximum IT:80ms，Microscans:1，MS2ActivationType:HCD，NCE:32。
目的蛋白靶向定量inclusion list设置见表6：
表6：
4.对质谱数据进行Proteome Discoverer处理，随后进行Skyline软件处理。
检测到的中癌组织和癌旁组织中的蛋白的总量见表7，而计算不同石蜡切片样本中癌组织和癌旁组织中的蛋白标志物的相对含量值见表8。
表7：
| 样本编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 癌蛋白数目 | 2123 | 1944 | 2286 | 2278 | 2540 | 1993 | 1839 |
| 癌旁蛋白数目 | 2223 | 2267 | 2227 | 1969 | 2709 | 2688 | 2017 |
表8：
| 癌组织/正常组织 | No.1 | No.2 | No.3 | No.4 | No.5 | No.6 | No.7 |
| RBM39 | 1.14 | 1.73 | 1.61 | 1.71 | 1.21 | 4.41 | 0.71 |
| RPL4 | 0.96 | 1.07 | 1.73 | 1.05 | 0.8 | 2.96 | 0.57 |
| SLC25A12 | 0.34 | 0.45 | 1.36 | 9.36 | 0.36 | 1.83 | 0.47 |
| HADHB | 0.32 | 0.32 | 1.43 | 0.56 | 0.33 | 1.53 | 0.44 |
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过对现有的两种质谱数据的采集模式进行调整，对于复杂样本中表达丰度相对较高的蛋白，仅通过DDA采集模式即可进行定量，而对于表达丰度低的蛋白或者感兴趣的目标蛋白则进行PRM采集模式进行定量，这样既能够通过DDA模式获得该样本的全谱蛋白表达情况，又能够在DDA采集过程中，穿插PRM采集模式对目标蛋白进行更准确地定量，而且，基本在DDA采集模式下所花费的较短的时间范围内，既获得了此类样本的全谱蛋白表达情况，也获得了目标蛋白的更准确的定量情况。即该方法兼顾了DDA采集模式下蛋白全谱覆盖的高通量和PRM采集模式下靶向定量的高灵敏度和精确度的优点，而且操作简单、耗时少、实验周期短。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京谷海天目生物医学科技有限公司
<120> 复杂样本的蛋白检测方法
<130> PN107756GHTM
<160> 101
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Asp Leu Thr Glu His Lys Pro Ser Ala Ser Asn His Asn Leu Ala Pro
1 5 10 15
Ser Asp Asn Ser Pro Asn Lys
20
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Glu Tyr Leu His Glu Glu Asp Gly Glu Glu Gly Gln Pro Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Gln Ala Pro Gln Pro Gln Ser Ser Leu Gln Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Glu Pro His Ala Glu Thr Val Asn Thr Ser Gln Asn Asp Asp Met Val
1 5 10 15
Ser Ser Arg
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Thr Gln Pro Pro Glu Pro Ala Ala Glu Glu Thr Pro Ser Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Ser Gln Gly Asp Met Gln Asp Leu Asn Gly Asn Asn Gln Ser Val Thr
1 5 10 15
Arg
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Ala Val Ala Asp Ile Ser Ser Glu Asp Gln Gly Pro Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Ala Ala Met Gln Glu Glu Ala Gln Gln Leu Arg
1 5 10
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Ile Gly Gly Gly Asp Thr Thr Glu His Ile Gln Thr His Phe Glu Ser
1 5 10 15
Lys
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Asn Thr Gln Ile Asn Asn Ser Trp Gly Gln Glu Glu Arg
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
Ser Pro Phe Asn Ser Pro Ser Pro Gln Asp Ser Pro Arg
1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Glu Ile Gln Glu Pro Asp Pro Thr Tyr Glu Glu Lys
1 5 10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
His Glu Asp Thr Asn Leu Ala Ser Ser Thr Ile Val Lys
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Ile Gly Glu Val Trp Ala Ser His Glu Pro Arg
1 5 10
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
Phe Ser Asn Asp Gln Thr Val Glu Leu Glu Lys
1 5 10
<210> 16
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Arg Pro Gln Tyr Ser Asn Pro Pro Val Gln Gly Glu Val Met Glu Gly
1 5 10 15
Ala Asp Asn Gln Gly Ala Gly Glu Gln Gly Arg Pro Val Arg
20 25 30
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
Gly Ala Glu Ala Ala Asn Val Thr Gly Pro Gly Gly Val Pro Val Gln
1 5 10 15
Gly Ser Lys
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Gly Ile Pro Leu Glu Ser Thr Asp Gly Glu Arg
1 5 10
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
Ala Asp Glu Gly Ile Ser Phe Arg
1 5
<210> 20
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Leu Leu Gln Thr Ala Ala Thr Ala Ala Gln Gln Gly Gly Gln Ala Asn
1 5 10 15
His Pro Thr Ala Ala Val Val Thr Glu Lys
20 25
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Ser Leu His Leu Glu Ala Ser Leu Asp Lys
1 5 10
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
Phe Gln Ala Glu Ile Pro Asp Arg
1 5
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
Glu Lys Pro Ala Asp Met Gln Asn Phe Gly Leu Arg
1 5 10
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
Thr Leu Leu Ala Asp Gln Gly Glu Ile Arg
1 5 10
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
Ile Glu Glu Asp Phe Pro His Ile Arg
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
Ile Met Glu Ala Pro Ile Pro Lys
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
Trp His Ile Asp Thr Ile Met Arg
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
Phe Pro Pro Tyr Tyr Met Arg
1 5
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
Gly Gln Glu Ser Glu Tyr Gly Asn Ile Thr Tyr Pro Pro Ala Val Arg
1 5 10 15
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
Phe Leu Gln Glu Ser Asn Val Leu Tyr Gln His Asn Leu Arg
1 5 10
<210> 31
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
Glu Leu Ala Thr Asn Leu Asn Val Gly Thr Ser Ser Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ser Leu Lys
<210> 32
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
Thr Pro Val Val Gln Asn Ala Ala Ser Ile Val Gln Pro Ser Pro Ala
1 5 10 15
His Val Gly Gln Gln Gly Leu Ser Lys
20 25
<210> 33
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
Val Ser His Tyr Ile Ile Asn Ser Ser Gly Pro Arg Pro Pro Val Pro
1 5 10 15
Pro Ser Pro Ala Gln Pro Pro Pro Gly Val Ser Pro Ser Arg
20 25 30
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
Asn Leu Met Ile Asp Ile Gln Lys
1 5
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
Tyr Tyr Glu Ala Ala Asp Thr Val Thr Gln Phe Asp Asn Val Arg
1 5 10 15
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
Leu Val Gln Ala Phe Gln Phe Thr Asp Lys
1 5 10
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
Ile Pro Glu Leu Leu Ser Gly Gly Ser Val Asp Ser Glu Thr Arg
1 5 10 15
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
His Phe Glu Glu Leu Glu Thr Ile Met Asp Arg
1 5 10
<210> 39
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
Asp Ser Ser Thr Ser Pro Gly Asp Tyr Val Leu Ser Val Ser Glu Asn
1 5 10 15
Ser Arg
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
Ala Asn Phe Asp Ser Trp Ile Gly Leu His Arg
1 5 10
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Arg
1 5 10
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
Leu Pro Leu Ala Thr Ile Val Lys
1 5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
Leu Leu Val Glu Leu Val Gln Lys
1 5
<210> 44
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
Asp Ser Asn Ile Pro Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Val Lys
1 5 10 15
<210> 45
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
Phe His Asp Leu Leu Ser Gln Leu Asp Asp Gln Tyr Ser Arg
1 5 10
<210> 46
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
Gln Gln Ala His Asp Leu Leu Ile Asn Lys Pro Asp Gly Thr Phe Leu
1 5 10 15
Leu Arg
<210> 47
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
Gln Gly Ile Ser Trp Ser Pro Glu Glu Ile Glu Asp Ala Arg
1 5 10
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
Ser Thr Asp Val Glu Val Phe Leu Pro Lys
1 5 10
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
Asn Trp Thr Glu Asp Ile Glu Gly Gly Ile Ser Ser Pro Val Lys
1 5 10 15
<210> 50
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
Ser Ile Met Ile Ser Gly Asn Val Leu Pro Asp Ala Thr Arg
1 5 10
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
Glu Asn Val Ser Asp Pro Ser Leu Thr Ile Thr Phe Gly Arg
1 5 10
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
Leu Phe Glu Leu Leu Glu Lys
1 5
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
Ile His Tyr Leu Asp Thr Thr Thr Leu Ile Glu Pro Val Ala Arg
1 5 10 15
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
Leu Gly Val Val Asp Val Phe Gln Glu Asp Lys
1 5 10
<210> 55
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 55
Asp Met Gly Val Tyr Thr Leu Asp Met Thr Asp Glu Asn Tyr Arg
1 5 10 15
<210> 56
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
Ala Ser Leu Pro Met Leu Ser Pro Thr Gly Ser Pro Gln Glu Val Glu
1 5 10 15
Val Gly Lys
<210> 57
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
Gln Ala Pro Glu Trp Thr Glu Glu Asp Leu Ser Gln Leu Thr Arg
1 5 10 15
<210> 58
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
Leu Ser Ala Met Pro Val Pro Phe Thr Pro Glu Leu Lys Pro Lys
1 5 10 15
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
Val Leu Ala Ile Asn Ile Leu Gly Arg
1 5
<210> 60
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 60
Ser Asp Asp Ser Val Ile Gln Leu Leu Asn Pro Asn Arg
1 5 10
<210> 61
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 61
Tyr Leu Glu Val Gln Tyr Lys Pro Gln Val His Ile Gln Met Thr Tyr
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gly Leu Thr Arg
20
<210> 62
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 62
Phe Asp Asn Gln Asp Glu Leu Asn Phe Leu Met Arg
1 5 10
<210> 63
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 63
Ile Ala Pro Val His Ile Asp Thr Glu Ser Ile Ser Ala Leu Ile Lys
1 5 10 15
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 64
Gly Leu Val Glu Phe Gln Asp Val Ser Phe Ala Tyr Pro Asn Gln Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 65
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 65
Leu Ser Gly Asp Leu Asn Ser Ile Gln Pro Ser Gly Ala Leu Ser Val
1 5 10 15
His Leu Ser Pro Pro Gln Thr Val Leu Ser Arg
20 25
<210> 66
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 66
Phe Leu Glu Gln Val His Gln Leu Tyr Asp Asp Ser Phe Pro Met Glu
1 5 10 15
Ile Arg
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 67
Trp Ala Ile Leu Gly Leu Gly Val Arg
1 5
<210> 68
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 68
Gln Gly Gly Leu Gly Pro Met Asn Ile Pro Leu Ile Ser Asp Pro Lys
1 5 10 15
<210> 69
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 69
Glu Leu Ser Ala Val Thr Phe Pro Asp Ile Ile Arg
1 5 10
<210> 70
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 70
Tyr Asp Asp Val Leu Ile Asn Gly Leu Pro Asp Trp Arg
1 5 10
<210> 71
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 71
Phe Val Val Asn Phe Gln Asn Ser Phe Asn Gly Asn Asp Ile Ala Phe
1 5 10 15
His Phe Asn Pro Arg
20
<210> 72
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 72
Ser Leu Val Ala Leu Leu Val Glu Thr Gln Met Lys
1 5 10
<210> 73
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 73
Thr Pro Val Val Thr Gly Thr Gly Pro Asn Phe Ser Leu Gly Glu Leu
1 5 10 15
Gln Gly His Leu Ala Tyr Asp Leu Asn Pro Ala Ser Ala Gly Met Arg
20 25 30
<210> 74
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 74
Ala Thr Gln Leu Leu Glu Gly Leu Val Gln Glu Leu Gln Lys
1 5 10
<210> 75
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 75
Val Ser Gln Thr Pro Ile Ala Ala Gly Thr Gly Pro Asn Phe Ser Leu
1 5 10 15
Ser Asp Leu Glu Ser Ser Ser Tyr Tyr Ser Met Ser Pro Gly Ala Met
20 25 30
Arg
<210> 76
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 76
Leu Gly Asp Leu Asn Tyr Leu Ile Tyr Val Phe Pro Asp Arg Pro Lys
1 5 10 15
<210> 77
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 77
Ala Met Met Pro Gly Glu His Gly Ser Val Leu Ile Asp Ser Val Pro
1 5 10 15
Glu Val Pro Phe Pro Leu Ala Ser Lys
20 25
<210> 78
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 78
Asp Ile Gly Glu Gly Asn Leu Ser Thr Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Val Lys
20
<210> 79
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 79
Leu Gly Phe Asp Thr Leu His Gly Leu Val Ser Thr Leu Ser Ala Gln
1 5 10 15
Pro Ser Leu Lys
20
<210> 80
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 80
Lys Pro Leu Leu Leu Ile Leu Asp Asp Ala Thr Ser Ala Leu Asp Ala
1 5 10 15
Gly Asn Gln Leu Arg
20
<210> 81
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 81
Leu Ser Ile Gln Asp Asn Asn Val Asp Leu Ile Leu Ala Thr Pro Pro
1 5 10 15
Phe Ser Arg
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 82
Met Leu Ser Leu Asn Val Phe Ser Val Gln Val Gln Ala Phe Lys
1 5 10 15
<210> 83
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 83
Ala Thr Leu Leu Asp Trp Val Ala Ser Glu Pro Leu Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 84
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 84
Thr Phe Gln Leu Gln Leu Leu Ser Pro Ser Ser Ser Val Val Pro Ala
1 5 10 15
Phe Asn Thr Gly Thr Ile Thr Gln Val Ile Lys
20 25
<210> 85
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 85
Phe Ala Thr Leu Thr Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr Gln Gln Gln Gly
1 5 10 15
Ile Leu Gln Asp Arg
20
<210> 86
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 86
Thr Ile Ser Pro Glu His Val Ile Gln Ala Leu Glu Ser Leu Gly Phe
1 5 10 15
Gly Ser Tyr Ile Ser Glu Val Lys
20
<210> 87
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 87
Val Gly Leu Glu Ile Pro Gly Glu Met Trp Leu Ser Trp Val Pro Arg
1 5 10 15
<210> 88
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 88
Thr Ala Gln Ala Ile Glu Pro Tyr Ile Thr Asn Phe Phe Asn Gln Val
1 5 10 15
Leu Met Leu Gly Lys
20
<210> 89
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 89
Thr Leu Ala Gly Leu Val Val Gln Leu Leu Gln Phe Gln Glu Asp Ala
1 5 10 15
Phe Gly Lys
<210> 90
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 90
Ala Pro Ile Arg Pro Asp Ile Val Asn Phe Val His Thr Asn Leu Arg
1 5 10 15
<210> 91
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 91
Ile Glu Glu Val Pro Glu Leu Pro Leu Val Val Glu Asp Lys
1 5 10
<210> 92
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 92
Asn Ile Pro Gly Ile Thr Leu Leu Asn Val Ser Lys
1 5 10
<210> 93
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 93
Ile Val Gln Leu Leu Ala Gly Val Ala Asp Gln Thr Lys
1 5 10
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 94
Ile Tyr Ser Thr Leu Ala Gly Thr Arg
1 5
<210> 95
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 95
Leu Thr Val Asn Asp Phe Val Arg
1 5
<210> 96
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 96
Asp Leu Glu Glu Phe Phe Ser Thr Val Gly Lys
1 5 10
<210> 97
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 97
Gly Ile Ala Tyr Val Glu Phe Val Asp Val Ser Ser Val Pro Leu Ala
1 5 10 15
Ile Gly Leu Thr Gly Gln Arg
20
<210> 98
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 98
Thr Asp Ala Ser Ser Ala Ser Ser Phe Leu Asp Ser Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
Arg
<210> 99
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 99
Glu Ala Ala Leu Gly Ala Gly Phe Ser Asp Lys
1 5 10
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 100
Leu Glu Gln Asp Glu Tyr Ala Leu Arg
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 101
Asn Val Val Val Val Asp Gly Val Arg
1 5
Claims (13)
1.一种复杂样本的蛋白检测方法，其特征在于，所述方法包括：
对所述复杂样本进行色谱分离以及质谱扫描采集质谱数据，其中，在所述质谱扫描采集所述质谱数据的过程中，采用DDA模式扫描采集的过程中穿插PRM模式的扫描采集，所述PRM模式的扫描采集设置在所述DDA模式扫描采集过程中不同的时间窗口，在同一所述时间窗口内所述DDA模式被所述PRM模式挤压，所述PRM模式所采集数据的时间挤占了所述DDA模式所采集数据的时间；
对所述质谱数据中的蛋白进行定性和定量分析，获得所述复杂样本的全谱蛋白的表达信息；
其中，在所述复杂样本中，目标蛋白的靶向肽段所对应的时间窗口进行所述PRM模式的扫描采集。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用四级杆质谱仪或三合一质谱仪进行所述DDA模式扫描和所述PRM模式的扫描采集。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述质谱数据中的蛋白定量进行分析的步骤包括：
利用所述DDA模式采集的所述质谱数据根据一级质谱峰面积进行定量分析；
利用所述PRM模式采集的所述质谱数据根据所述靶向肽段中前三高的二级碎片离子的加和进行定量分析。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，采用色谱分析柱对所述复杂样本进行色谱分离，其中所述色谱分析柱包括：
色谱柱管，所述色谱柱管的外径为355~365μm，内径为100~200μm；
填充于所述色谱柱管内的填料，所述填料为C18填料；以及
与所述色谱柱管一体化设计的色谱柱尖。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述色谱柱管的长度为150~300mm。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述色谱柱尖的内径为2~8μm。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述色谱柱尖的内径为3~6μm。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述填料的粒径为1.5~3μm。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述填料的粒径为1.8~2.5μm。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述色谱分离的步骤中，采用75~150min的色谱分离梯度进行分离。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述复杂样本为组织样本、细胞样本或者体液样本。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述复杂样本为植物样本、动物样本或微生物样本。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白为基于所述DDA模式采集的质谱历史数据中的一种或多种蛋白。
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