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CN108152430A - 基于prm检测的卵巢癌标志物检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

基于prm检测的卵巢癌标志物检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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CN108152430A
CN108152430A CN201711396031.3A CN201711396031A CN108152430A CN 108152430 A CN108152430 A CN 108152430A CN 201711396031 A CN201711396031 A CN 201711396031A CN 108152430 A CN108152430 A CN 108152430A
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CN
China
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human
heavy
prm
oophoroma
light
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CN201711396031.3A
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陈薇
阮宏强
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Shanghai Applied Protein Technology Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Applied Protein Technology Co Ltd
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Abstract

本发明提供一种基于PRM检测的卵巢癌标志物检测试剂盒及其检测方法，属于卵巢癌标志物检测技术领域，用于快速准确检测5种标志物的含量，其包含常规质谱检测用试剂，重同位素标记标准肽段试管及专用的色谱分析柱，通过往血清中掺入5个卵巢癌蛋白标志物的10个人工合成的重标同位素肽段，使用PRM技术对血清中內源的5个卵巢癌蛋白标志物进行绝对定量分析，以达到帮助卵巢癌的诊断的目的，具有操作简单、耗时少、实验周期短、特异性强和灵敏度高的优点。

Description

基于PRM检测的卵巢癌标志物检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于卵巢癌标志物检测技术领域，尤其涉及一种基于PRM检测的卵巢癌标志物检测试剂盒，还涉及一种使用该试剂盒的检测方法。
背景技术
卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位，约占女性全身恶性肿瘤的4％。但因卵巢癌致死者，却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。
平行反应监测(Parallel reaction monitoring，PRM)平行反应监测属于靶向MS/MS分析，在整个液相分离过程中会不断地对每一个目标母离子的全部碎片离子图谱进行记录。相比于传统SRM只检测目标离子对的模式，PRM检测所选择的母离子窗口内的所有碎片信息。PRM主要的优势就是使用了超高分辨率的Orbitrap质量分析器，其能够将干扰信息与真实的信号进行区分，以及相比于传统的SRM方法能够更好的保证分析的选择性。
美国弗米利恩公司与Quest Diagnostics公司合作研发的OVA1测试盒能够在盆腔包块中检查出是否罹患卵巢癌，并确定是否需要手术治疗，帮助病人和医护人员确定属于什么类型的手术，以及应该由谁负责实施。OVA1卵巢癌定性血清测试将五个免疫测定组合形成一个单一数字评分系统。该免疫测试确定了五个行之有效的生物标志物---甲状腺素，载脂蛋白A-1，β2-微球蛋白(Beta2M)，转铁蛋白及癌抗原125，用来确定盆腔包块妇女可能发生肿瘤的可能性。但OVA1测试盒的检测的操作复杂、耗时长，且其灵敏度和特异性相对较差，已经不能满足需要。
发明内容
基于现有技术存在上述问题，本发明提供一种基于PRM检测的卵巢癌标志物检测试剂盒及其检测方法，用于快速准确检测5种标志物的含量，其包含常规质谱检测用试剂，重同位素标记标准肽段试管及专用的色谱分析柱，通过往血清中掺入5个卵巢癌蛋白标志物的10个人工合成的重标同位素肽段，使用PRM技术对血清中內源的5个卵巢癌蛋白标志物进行绝对定量分析，以达到帮助卵巢癌的诊断的目的，具有操作简单、耗时少、实验周期短、特异性强和灵敏度高的优点。
本发明通过以下详细技术方案达到目的：
一种适用卵巢癌PRM检测用的色谱分析柱，其包括柱管、填料和枪头，填料填充于柱管内，枪头套在柱管的一端；所述的柱管长度为115-125mm、外径为355-365um、内径为70-80um；所述的填料是2.5-3.5um粒径的C18反相填料。
其中，所述的柱管长度为120mm、外径为360um、内径为75um；所述的填料是3um粒径的C18反相填料。
一种基于PRM检测的卵巢癌标志物检测试剂盒，包括常规质谱检测用试剂、重同位素标记标准肽段试管、上述色谱分析柱、溶解buffer；所述的重同位素标记标准肽段试管包含甲状腺素、载脂蛋白A–1、β2-微球蛋白(Beta2M)、转铁蛋白和癌抗原125中的十条唯一序列，其中每个蛋白各有两段肽段序列。
其中，所述的重同位素标记标准肽段是VEHSDLSFSK、VNHVTLSQPK、EFQLFSSPHGK、HQTVPQNTGGK、GSPAINVAVHVFR、AADDTWEPFASGK、DLATVYVDVLK、DYVSQFEGSALGK、LGIWDDFIPK和ELPLLSPPQDK。
其中，所述的重同位素标记标准肽段的重同位素标记的氨基酸分别位于肽段序列C-末端的精氨酸和赖氨酸上。
其中，所述的重同位素标记标准肽段试管中每条标准肽段的浓度是50fmol。
其中，所述的溶解buffer是含0.1％甲酸的水溶液。
一种采用上述检测试剂盒的检测方法，其包括以下步骤：
步骤S10，取重同位素标记标准肽段试管，向其中加入90-110uL溶解buffer，震荡混匀，使用离心机进行速度为12000-14000g的离心45-75S，取上清液备用；
步骤S20，取0.08-0.12mg血清蛋白酶解肽段加入90-110uL溶解buffer，震荡混匀，制成血清肽段溶液，备用；
步骤S30，取1.8-2.2uL步骤S20制成的血清肽段溶液，并向其中加入9-11uL步骤S10制成的重同位素标记标准肽段溶液中，混合均匀，取3-5uL进行色谱进样；
色谱分离梯度设置如下：
PRM检测离子表设置如下：
M/Z Peptide L/H Protein
574.782753 VEHSDLSFSK light sp|P61769|B2MG_HUMAN
578.789852 VEHSDLSFSK heavy sp|P61769|B2MG_HUMAN
561.81693 VNHVTLSQPK light sp|P61769|B2MG_HUMAN
565.824029 VNHVTLSQPK heavy sp|P61769|B2MG_HUMAN
638.819669 EFQLFSSPHGK light sp|P02787|TRFE_HUMAN
642.826769 EFQLFSSPHGK heavy sp|P02787|TRFE_HUMAN
583.799268 HQTVPQNTGGK light sp|P02787|TRFE_HUMAN
587.806368 HQTVPQNTGGK heavy sp|P02787|TRFE_HUMAN
683.883135 GSPAINVAVHVFR light sp|P02766|TTHY_HUMAN
688.88727 GSPAINVAVHVFR heavy sp|P02766|TTHY_HUMAN
697.814781 AADDTWEPFASGK light sp|P02766|TTHY_HUMAN
701.82188 AADDTWEPFASGK heavy sp|P02766|TTHY_HUMAN
618.347728 DLATVYVDVLK light sp|P02647|APOA1_HUMAN
622.354828 DLATVYVDVLK heavy sp|P02647|APOA1_HUMAN
700.838256 DYVSQFEGSALGK light sp|P02647|APOA1_HUMAN
704.845356 DYVSQFEGSALGK heavy sp|P02647|APOA1_HUMAN
602.324056 LGIWDDFIPK light sp|Q8WXI7|MUC16_HUMAN
606.331156 LGIWDDFIPK heavy sp|Q8WXI7|MUC16_HUMAN
618.845353 ELPLLSPPQDK light sp|Q8WXI7|MUC16_HUMAN
622.852452 ELPLLSPPQDK heavy sp|Q8WXI7|MUC16_HUMAN
质谱仪设置如下：
一级质谱，扫描范围：500-800m/z，分辨率：70000(@m/z 200)，AGC target：3e6，Maximum IT：200ms；一级质谱结束后根据成分列表触发15个二级PRM扫描；
二级PRM扫描，Isolation window：2Th，分辨率：35000(@m/z 200)，AGC target：3e6，Maximum IT：200ms，Microscans：1，MS2Activation Type：HCD，NCE：27；
步骤S40，对PRM质谱数据进行Skyline分析，并计算5种标志物在样品血清中的浓度。
其中，每个样品进行2-5个重复PRM检测试验。
本发明具有的有益效果：本发明通过使用PRM技术结合标志物唯一的重同位素标记标准肽对5种蛋白进行绝对定量分析，以帮助对卵巢癌的诊断，具有方便快捷、高选择性、高特异性及准确度高等优点，可以绝对定量分析血清中5种卵巢癌标志蛋白，且检测灵敏度高，蛋白检测可达pg/ml水平；采用纳升级色谱仪Easy-nLC和高分辨质谱仪Q-Exactive系列，分析更加准确、操作更加简单；实验周期短，一般2个小时即可完成5种蛋白的定量分析；试剂盒所含试剂均为蛋白质和一般无机盐水溶液，无可挥发性、有毒、有害物质，安全性高；针对血清中5种卵巢癌标志蛋白进行绝对定量分析，特异性强，实验结果一致性高，具有高灵敏度、高特异性等优点，采用该试剂盒的得到的实验结果真实可靠，可重复性强。
附图说明
图1，一种适用卵巢癌PRM检测用的色谱分析柱的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的描述。
实施例一：色谱分析柱。
如图1所示的一种适用卵巢癌PRM检测用的色谱分析柱，其包括柱管(1)、填料(2)和枪头(3)，填料(2)填充于柱管(1)内，枪头(3)套在柱管(1)的一端；所述的柱管(1)长度为120mm、外径为360um、内径为75um；所述的填料(2)是3um粒径的C18反相填料。
实施例二：卵巢癌标志物检测试剂盒
一种基于PRM检测的卵巢癌标志物检测试剂盒，包括常规质谱检测用试剂、重同位素标记标准肽段试管、上述色谱分析柱、含0.1％甲酸的水溶液；所述的重同位素标记标准肽段试管包含甲状腺素、载脂蛋白A–1、β2-微球蛋白(Beta2M)、转铁蛋白和癌抗原125中的十条唯一序列，其中每个蛋白各有两段肽段序列，分别是VEHSDLSFSK、VNHVTLSQPK、EFQLFSSPHGK、HQTVPQNTGGK、GSPAINVAVHVFR、AADDTWEPFASGK、DLATVYVDVLK、DYVSQFEGSALGK、LGIWDDFIPK和ELPLLSPPQDK，重同位素标记的氨基酸分别位于肽段序列C-末端的精氨酸和赖氨酸上。
作为优选实施例，所述的重同位素标记标准肽段试管中每条标准肽段的浓度是50fmol。
实施例三，卵巢癌标志物检测。
步骤S10，取重同位素标记标准肽段试管，向其中加入90-110uL溶解buffer，震荡混匀，使用离心机进行速度为13000g的离心60s，取上清液备用；
步骤S20，取0.1mg血清蛋白酶解肽段加入100uL溶解buffer，震荡混匀，制成血清肽段溶液，备用；
步骤S30，取2uL步骤S20制成的血清肽段溶液，并向其中加入10uL步骤S10制成的重同位素标记标准肽段溶液中，混合均匀，取4uL进行色谱进样；
色谱分离梯度设置如下：
时间(min) 流速 甲酸浓度 乙腈比例 纯水比例
0 300 0.1％ 2％ 98％
2 300 0.1％ 8％ 92％
47 300 0.1％ 35％ 65％
50 300 0.1％ 98％ 2％
60 300 0.1％ 98％ 2％
PRM检测离子表设置如下：
M/Z Peptide L/H Protein
574.782753 VEHSDLSFSK light sp|P61769|B2MG_HUMAN
578.789852 VEHSDLSFSK heavy sp|P61769|B2MG_HUMAN
561.81693 VNHVTLSQPK light sp|P61769|B2MG_HUMAN
565.824029 VNHVTLSQPK heavy sp|P61769|B2MG_HUMAN
638.819669 EFQLFSSPHGK light sp|P02787|TRFE_HUMAN
642.826769 EFQLFSSPHGK heavy sp|P02787|TRFE_HUMAN
583.799268 HQTVPQNTGGK light sp|P02787|TRFE_HUMAN
587.806368 HQTVPQNTGGK heavy sp|P02787|TRFE_HUMAN
683.883135 GSPAINVAVHVFR light sp|P02766|TTHY_HUMAN
688.88727 GSPAINVAVHVFR heavy sp|P02766|TTHY_HUMAN
697.814781 AADDTWEPFASGK light sp|P02766|TTHY_HUMAN
701.82188 AADDTWEPFASGK heavy sp|P02766|TTHY_HUMAN
618.347728 DLATVYVDVLK light sp|P02647|APOA1_HUMAN
622.354828 DLATVYVDVLK heavy sp|P02647|APOA1_HUMAN
700.838256 DYVSQFEGSALGK light sp|P02647|APOA1_HUMAN
704.845356 DYVSQFEGSALGK heavy sp|P02647|APOA1_HUMAN
602.324056 LGIWDDFIPK light sp|Q8WXI7|MUC16_HUMAN
606.331156 LGIWDDFIPK heavy sp|Q8WXI7|MUC16_HUMAN
618.845353 ELPLLSPPQDK light sp|Q8WXI7|MUC16_HUMAN
622.852452 ELPLLSPPQDK heavy sp|Q8WXI7|MUC16_HUMAN
质谱仪设置如下：
一级质谱，扫描范围：500-800m/z，分辨率：70000(@m/z 200)，AGC target：3e6，Maximum IT：200ms；一级质谱结束后根据成分列表触发15个二级PRM扫描；
二级PRM扫描，Isolation window：2Th，分辨率：35000(@m/z 200)，AGC target：3e6，Maximum IT：200ms，Microscans：1，MS2Activation Type：HCD，NCE：27；
步骤S40，对PRM质谱数据进行Skyline分析，并计算5中标志物在样品血清中的浓度。
每个样品进行3个重复PRM检测试验，得到的结果如下：
Protein Name PRM_1(pmol/ml) PRM_2(pmol/ml) PRM_3(pmol/ml)
sp|P61769|B2MG_HUMAN 51.30 62.70 58.9
sp|P02787|TRFE_HUMAN 43.20 39.70 45.8
sp|P02766|TTHY_HUMAN 68.90 72.10 75.4
sp|P02647|APOA1_HUMAN 50.90 55.20 53.7
sp|Q8WXI7|MUC16_HUMAN 71.80 78.40 75.2
本发明提供的试剂盒及其检测方法比常规OVA1测试盒的检测方法的灵敏度和特异性相对较高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种适用卵巢癌PRM检测用的色谱分析柱，其包括柱管、填料和枪头，填料填充于柱管内，枪头套在柱管的一端，其特征在于，所述的柱管长度为115-125mm、外径为355-365um、内径为70-80um；所述的填料是2.5-3.5um粒径的C18反相填料。
2.根据权利要求1所述的适用卵巢癌PRM检测用的色谱分析柱，其特征在于，所述的柱管长度为120mm、外径为360um、内径为75um；所述的填料是3um粒径的C18反相填料。
3.一种基于PRM检测的卵巢癌标志物检测试剂盒，包括常规质谱检测用试剂，其特征在于，其还包括重同位素标记标准肽段试管、如权利要求1或2所述的色谱分析柱、溶解buffer；所述的重同位素标记标准肽段试管包含甲状腺素、载脂蛋白A–1、β2-微球蛋白(Beta2M)、转铁蛋白和癌抗原125中的十条唯一序列，其中每个蛋白各有两段肽段序列。
4.根据权利要求3所述的一种基于PRM检测的卵巢癌标志物检测试剂盒，其特征在于，所述的重同位素标记标准肽段是VEHSDLSFSK、VNHVTLSQPK、EFQLFSSPHGK、HQTVPQNTGGK、GSPAINVAVHVFR、AADDTWEPFASGK、DLATVYVDVLK、DYVSQFEGSALGK、LGIWDDFIPK和ELPLLSPPQDK。
5.根据权利要求3或4所述的一种基于PRM检测的卵巢癌标志物检测试剂盒，其特征在于，所述的重同位素标记标准肽段的重同位素标记的氨基酸分别位于肽段序列C-末端的精氨酸和赖氨酸上。
6.根据权利要求3或4所述的一种基于PRM检测的卵巢癌标志物检测试剂盒，其特征在于，所述的重同位素标记标准肽段试管中每条标准肽段的浓度是50fmol。
7.根据权利要求3所述的一种基于PRM检测的卵巢癌标志物检测试剂盒，其特征在于，所述的溶解buffer是含0.1％甲酸的水溶液。
8.一种采用如权利要求3-4任一所述的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤S10，取重同位素标记标准肽段试管，向其中加入90-110uL溶解buffer，震荡混匀，使用离心机进行速度为12000-14000g的离心45-75S，取上清液备用；
步骤S20，取0.08-0.12mg血清蛋白酶解肽段加入90-110uL溶解buffer，震荡混匀，制成血清肽段溶液，备用；
步骤S30，取1.8-2.2uL步骤S20制成的血清肽段溶液，并向其中加入9-11uL步骤S10制成的重同位素标记标准肽段溶液中，混合均匀，取3-5uL进行色谱进样；
色谱分离梯度设置如下：
PRM检测离子表设置如下：
M/Z Peptide L/H Protein
574.782753 VEHSDLSFSK light sp|P61769|B2MG_HUMAN
578.789852 VEHSDLSFSK heavy sp|P61769|B2MG_HUMAN
561.81693 VNHVTLSQPK light sp|P61769|B2MG_HUMAN
565.824029 VNHVTLSQPK heavy sp|P61769|B2MG_HUMAN
638.819669 EFQLFSSPHGK light sp|P02787|TRFE_HUMAN
642.826769 EFQLFSSPHGK heavy sp|P02787|TRFE_HUMAN
583.799268 HQTVPQNTGGK light sp|P02787|TRFE_HUMAN
587.806368 HQTVPQNTGGK heavy sp|P02787|TRFE_HUMAN
683.883135 GSPAINVAVHVFR light sp|P02766|TTHY_HUMAN
688.88727 GSPAINVAVHVFR heavy sp|P02766|TTHY_HUMAN
697.814781 AADDTWEPFASGK light sp|P02766|TTHY_HUMAN
701.82188 AADDTWEPFASGK heavy sp|P02766|TTHY_HUMAN
618.347728 DLATVYVDVLK light sp|P02647|APOA1_HUMAN
622.354828 DLATVYVDVLK heavy sp|P02647|APOA1_HUMAN
700.838256 DYVSQFEGSALGK light sp|P02647|APOA1_HUMAN
704.845356 DYVSQFEGSALGK heavy sp|P02647|APOA1_HUMAN
602.324056 LGIWDDFIPK light sp|Q8WXI7|MUC16_HUMAN
606.331156 LGIWDDFIPK heavy sp|Q8WXI7|MUC16_HUMAN
618.845353 ELPLLSPPQDK light sp|Q8WXI7|MUC16_HUMAN
622.852452 ELPLLSPPQDK heavy sp|Q8WXI7|MUC16_HUMAN
质谱仪设置如下：
一级质谱，扫描范围：500-800m/z，分辨率：70000(@m/z 200)，AGC target：3e6，Maximum IT：200ms；一级质谱结束后根据成分列表触发15个二级PRM扫描；
二级PRM扫描，Isolation window：2Th，分辨率：35000(@m/z 200)，AGC target：3e6，Maximum IT：200ms，Microscans：1，MS2 Activation Type：HCD，NCE：27；
步骤S40，对PRM质谱数据进行Skyline分析，并计算5种标志物在样品血清中的浓度。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，每个样品进行2-5个重复PRM检测试验。
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