CN117980331A - 抗fsh抗体用于神经退行性疾病 - Google Patents

Abstract

本公开提供通过在有需要的受试者中使用抗FSH抗体来治疗神经退行性疾病、特别是阿尔茨海默病的组合物和方法。在一些实施方案中，所述受试者具有FSH水平升高的状态。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗FSH抗体或其抗原结合部分。

Description

抗FSH抗体用于神经退行性疾病

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年7月21日提交的美国临时专利申请号63/224,067的优先权。该申请的内容通过引用以其整体并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在美国国立卫生研究院/国立老龄化研究所(National Institutes ofHealth/National Institute on Aging)授予的U19 AG60917和U19AG60917-02S1下由政府支持完成的。美国政府具有本发明的某些权利。

技术领域

本公开总体上涉及利用抗FSH抗体治疗受试者的神经退行性疾病的方法。特别地，本公开的抗体可用于治疗所有形式的阿尔茨海默病(AD)。

背景技术

老龄化群体的神经退行性疾病如阿尔茨海默病(AD)影响全世界约3500万人，估计每年有700万新病例(World Health Organization；Dementia Fact Sheet；2020年9月)。AD和其它神经退行性病症是一个主要的全球性健康问题，其导致进行性痴呆、深度残疾和受损的生活质量。女性构成AD群体的约70％(Andersen,K.等人，Neurology 53,1992-1997,(1999))，她们比男性具有更大的AD的终生风险，并且表现出约3倍更高的疾病进展率(Laws,K.R.等人，World J Psychiatry 6,54-65,(2016))和更广泛的行为症状(Koran,M.E.I.等人，Brain Imaging Behav 11,205-213,(2017)；Marongiu,R.，Front AgingNeurosci 11,242,(2019))。

然而，无论性别，用于阿尔茨海默病和其它神经退行性疾病的治疗选择很少，现有的药物无法阻止对神经元的损害，并且可用的对症治疗有限。因此，迫切且广泛地需要神经退行性疾病的治疗，所述神经退行性疾病例如阿尔茨海默病，其与β-淀粉样蛋白沉积和/或神经原纤维缠结有关。

发明内容

本公开至少部分地基于抗FSH抗体可以改善患有阿尔茨海默病的小鼠的认知的发现。

本文公开的是用于在有需要或处于风险的受试者中治疗阿尔茨海默病(AD)、预防AD的发作、减少认知或功能下降、或减少AD中的症状负荷的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗促卵泡激素(FSH)抗体或其抗原结合部分，其中抗FSH抗体、或其抗原结合部分包括(a)重链可变序列，其包括与选自SEQ ID NO 3、11、13和15的序列为至少90％同一性的序列；(b)轻链可变序列，其包括与选自SEQ ID NO 4、12、14和17的序列为至少90％同一性的序列；(c)重链CDR1(CDRH1)，其包括SEQ ID NO 5；(d)重链CDR2(CDRH2)，其包括SEQ ID NO 6；(e)重链CDR3(CDRH3)，其包括SEQ ID NO 7；(f)轻链CDR1(CDRL1)，其包括SEQ ID NO 8；(g)轻链CDR2(CDRL2)，其包括SEQ ID NO 9；和(h)轻链CDR3(CDRL3)，其包括SEQ ID NO 10。

在一些实施方案中，所述受试者具有FSH水平高的状态。在一些实施方案中，所述受试者为女性。在一些实施方案中，所述受试者为围绝经期的或绝经后的。在一些实施方案中，所述受试者为男性。

在一些实施方案中，所述状态是遗传病、化学疗法、手术绝经或睾丸切除术。在一些实施方案中，所述遗传病为特纳综合征(Turners syndrome)。

在一些实施方案中，所述方法在有需要的受试者中改变下述中的一项或更多项：(a)减少大脑中的Aβ积累；(b)减少大脑中的淀粉样斑块；(c)减少大脑中的Tau积累和(d)增强认知功能。在一些实施方案中，与受试者或对照中相应的参考水平相比，大脑中的Aβ积累、淀粉样斑块和Tau积累中的一者或更多者降低至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。

在一些实施方案中，如在选自由以下组成的组中的一种或更多种测试中所测定的，认知功能增强至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％：阿尔茨海默病评定量表-认知分量表(ADAS-cog)；临床总体印象变化量表(CIBIC-plus量表)；简易精神状态检查(MMSE)；神经精神问卷(NPI)；临床痴呆评定量表(CDR)；剑桥神经心理自动化成套测试(CANTAB)；Sandoz老年临床评定量表(SCAG)，Buschke选择性提醒测试；言语配对联想子测试；逻辑记忆子测试：韦克斯勒记忆量表修订版(WMS-R)的视觉再现子测试；外显3选项强迫选择任务；和本顿视觉保留测试。

在一些实施方案中，用选自由以下组成的组中的一种或更多种药剂同时治疗受试者：胆碱酯酶抑制剂，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，激素，维生素，抗精神病药，三环类抗抑郁药，苯二氮类药物(benzodiazepine)，胰岛素，NGF、CERE-110、β-阻断剂、人淀粉样蛋白疫苗、β或γ分泌酶抑制剂、烟碱或毒蕈碱激动剂的腺相关病毒递送，和第二抗体。

在一些实施方案中，所述胆碱酯酶抑制剂选自由加兰他敏(galantamine)、卡巴拉汀(rivastigmine)、他克林(tacrine)和多奈哌齐(donepezil)组成的组。在一些实施方案中，所述NMDA受体拮抗剂选自由氯胺酮(ketamine)、美沙酮(methadone)、美金刚胺(memantine)、金刚烷胺(amantadine)和右美沙芬(dextromethorphan)或它们的盐组成的组。在一些实施方案中，所述抗精神病药选自由阿立哌唑(aripiprazole)、利培酮(risperidone)、奥氮平(olanzapine)、喹硫平(quetiapine)或氟哌啶醇(haloperidol)组成的组。在一些实施方案中，所述苯二氮类药物(benzodiazepine)选自由劳拉西泮(lorazepam)、奥沙西泮(oxazepam)和替马西泮(temazepam)组成的组。在一些实施方案中，所述三环类抗抑郁药为去甲替林(nortriptyline)。在一些实施方案中，所述药剂为选自由雌激素、黄体酮(progesterone)和亮丙瑞林(leuprolide)组成的组的激素。在一些实施方案中，所述药剂为选自由叶酸和烟酰胺组成的组的维生素。在一些实施方案中，所述第二抗体选自由巴匹珠单抗(bapineuzumab)、苏兰珠单抗(solanezumab)、更汀芦单抗(gantenerumab)、克瑞组单抗(crenezumab)、泊奈组单抗(ponezumab)、BAN2401和阿杜那单抗(aducanumab)组成的组。

在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分皮下地、肌内地、静脉内地、鞘内地或颅内地施用至受试者。在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分以约0.2至50mg/kg受试者体重的剂量施用至有需要的受试者。在一些实施方案中，抗FSH抗体或其抗原结合部分每周两次、每周、每两周、每个月、每两个月或每六个月施用至有需要的受试者。

在一些实施方案中，认知下降是通过使用阿尔茨海默病评定量表-认知(ADAS-Cog)测试确定受试者在施用所述抗FSH抗体或其抗原结合片段之前和之后的评分来评估的。

在一些实施方案中，如通过ADAS-Cog所测定的认知下降的减少相对于安慰剂为至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。

在一些实施方案中，受试者患有轻度、中度或重度AD。在一些实施方案中，治疗是用于在受试者中完全地或部分地预防AD或其症状的预防性治疗。在一些实施方案中，治疗是用于在受试者中部分地或完全地治愈AD或与AD相关的症状的治疗性治疗。

本文还公开了一种药物组合物，其包括分离的抗促卵泡激素(FSH)抗体、或其抗原结合部分、以及药学上可接受的载体或赋形剂，其中所述组合物能够穿过血脑屏障从血液进入大脑，其中所述抗FSH抗体或其抗原结合部分包括(a)重链可变序列，其包括与选自SEQID NO 3、11、13和15的序列为至少90％同一性的序列；(b)轻链可变序列，其包括与选自SEQID NO 4、12、14和17的序列为至少90％同一性的序列；(c)重链CDR1(CDRH1)，其包括SEQ IDNO 5；(d)重链CDR2(CDRH2)，其包括SEQ ID NO 6；(e)重链CDR3(CDRH3)，其包括SEQ ID NO7；(f)轻链CDR1(CDRL1)，其包括SEQ ID NO8；(g)轻链CDR2(CDRL2)，其包括SEQ ID NO 9；和(h)轻链CDR3(CDRL3)，其包括SEQ ID NO 10。

在一些实施方案中，本文公开的组合物用于在有需要或处于风险的受试者中治疗阿尔茨海默病(AD)、预防AD的发病、或减少AD中的认知或功能下降，其中所述组合物静脉内地、鞘内地或颅内地施用至受试者。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实施或测试中可以使用与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料，但示例性方法和材料将在下文中描述。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用以其整体并入本文。在冲突的情况下，以本申请(包括定义)为准。材料、方法和实例仅是说明性的，并不旨在进行限制。

本发明的一个或更多个实施方案的详情记载于附图和下面的描述中。从说明书和附图、以及从权利要求中，本发明的其它特征、目的和优点将显而易见。

附图说明

图1A示出接受山羊IgG(对照)或Hu6(测试抗体)(200μg/小鼠，每天，i.p.，持续4周)的小鼠的新物体识别测试中的新/熟悉比。

图1B示出接受IgG(对照)或Hu6(测试抗体)的小鼠在僵直条件反射测试中的僵直时间(秒)。非配对学生t检验；n＝3-4/组；*p<0.05。

图2A示出单克隆抗FSH抗体(Hu6)对AD小鼠的认知的效果。示出了接受人IgG(对照；白色柱)或Hu6(测试抗体；黑色柱)的野生型(WT)或APP/PS1小鼠的新物体识别测试中的新/熟悉比；100μg/小鼠，持续4个月；前两个月每周5天，并且接下来两个月每周3天。

图2B示出单克隆抗FSH抗体(Hu6)对AD小鼠的认知的效果。示出了接受所示IgG(对照)或Hu6(测试抗体)的WT或APP/PS1小鼠在僵直条件反射测试中的％僵直时间。图2C描绘出接受IgG(白色柱)或Hu6(黑色柱)的野生型(WT)或APP/PS1小鼠在第1至第3分钟、第4至第7分钟和第8至第10分钟中的％僵直时间。非配对学生t检验；n＝3-4/组；*p<0.05

图3示出荧光标记的抗FSH抗体Hu6向小鼠大脑中的渗透。

图4A示出通过表位精细定位确定的抗FSH抗体和FSH受体之间的相互作用。

图4B示出通过表位精细定位确定的抗FSH抗体和FSH受体之间的相互作用。

图5A示出代表性食蟹猴(Cynomolgus monkey)中的抗FSH抗体的生物分布和代谢，具有在单次i.v.注射⁸⁹Zr-MS-Hu6(1.3mg，～1.3mCi)后的48小时和120小时的全身PET/CT图像。

图5B示出单次i.v.注射⁸⁹Zr-MS-Hu6(1.3mg，～1.3mCi)后多器官的定量(SUVs)和血清放射性(γ计数)的图。

图6A示出将⁸⁹Zr-MS-Hu6以单次i.v.团注剂量(1.3mg，～1.3mCi)注射入食蟹猴的尾静脉后的生理参数的图(监测到100分钟)。

图6B示出将⁸⁹Zr-MS-Hu6以单次i.v.团注剂量(1.3mg，～1.3mCi)注射入食蟹猴的尾静脉后的血清生物化学的图(第0、2和5天)。

图7A示出使用Protein-Sol程序计算导出的抗FSH抗体的十二个物理化学参数与48种FDA批准的抗体和89种晚期临床开发中的抗体的实验推导的比较。

图7B示出使用Protein-Sol程序计算导出的抗FSH抗体的十二个物理化学参数和CDR区乱序的抗FSH抗体的计算变化的结果总结的表格。

图8A示出等电聚焦以确定抗FSH抗体的等电点(pI)的结果。

图8B示出用于评价制剂中的抗FSH抗体MS-Hu6的Fc和Fab区域与PBS中的抗FSH抗体MS-Hu6的稳定性的热漂移测定结果的图。

图8C示出用于评价制剂中的FSH与抗FSH抗体MS-Hu6的Fab区域的结合的稳定性的热漂移测定结果的图。

图8D示出用于评估制剂中的抗FSH抗体MS-Hu6与PBS中的抗FSH抗体MS-Hu6分别与自身或人IgG的结合的自相互作用色谱法(SIC)的UV吸光度(280nm)读数的图。

图8E示出用于评估制剂中的抗FSH抗体MS-Hu6与PBS中的抗FSH抗体MS-Hu6分别与自身或人IgG的结合的交叉相互作用色谱法(CIC)的UV吸光度(280nm)读数的图。

图8F示出疏水色谱结果的图，示出在pH 6.5下在20分钟内以1mL/min的流量(所示的保留时间)通过抗FSH抗体MS-Hu6时来自丁基琼脂糖凝胶柱的洗脱液的UV吸光度(280nm)。

图8G示出PBS中的抗FSH抗体MS-Hu6或制剂中的抗FSH抗体MS-Hu6在通过3个冻-融循环或在4℃、37℃和50℃孵育1周的应激测试(stress testing)后的代表性尺寸排阻色谱图和峰下面积。

各附图中的相似参考符号表示相似元素。

具体实施方式

本公开部分地基于抗FSH抗体可以改善患有阿尔茨海默病的小鼠的认知的出乎意料的发现。

除非本文另有定义，否则本申请中使用的技术和科学术语应具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。通常，与本文描述的药理学、细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学相关使用的命名法、以及药理学、细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学的技术是本领域中众所周知的和常用的那些。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

除非另有说明，否则本申请的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其在本领域技术范围内。这些技术在例如以下的文献中得到充分的解释：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，编辑，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A LaboratoryNotebook(J.E.Cellis，编辑，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，编辑，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell，编辑，1993-1998)J.Wiley和Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos，编辑，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人，编辑，1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis等人，编辑，1994)；Sambrook和Russell，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第三版，ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(2001)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(2002)；Harlow和LaneUsing antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY(1998)；Coligan等人，Short Protocols in Protein Science,JohnWiley&Sons,NY(2003)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons，1999)。

与本文描述的生物化学、免疫学、微生物学、分子生物学和病毒学相关使用的命名法、以及生物化学、免疫学、微生物学、分子生物学和病毒学的实验室程序和技术是本领域中众所周知的和常用的那些。

在本说明书和实施方案通篇中，单词包含(comprise)或例如包含(comprises)或含有(comprising)等变体将被理解为意指包含所述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。

应当理解，无论在本文是否用语言“包含(comprising)”对实施方案进行描述，还提供了用术语“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其它类似实施方案。

术语“包括(including)”用于意指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可交换使用。

术语“例如”或“诸如”后的任何实例(一个或更多个)不意指是详尽的或限制的。

除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。

本文使用的冠词“一”(“a”、“an”)和“该”(“the”)是指一个或超过一个(即至少一个)的冠词的语法宾语。举例来说，“一”元素意指一个元素或超过一个的元素。本文提及“约(about)”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的实例。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。数值范围包括限定该范围的数字。如本文中所使用的，术语“约”允许在有效数字的范围内的±10％的变化。

尽管所公开的数值范围和参数是近似值，但是尽可能精确地报告在具体实施例中记载的数值。然而，任何数值固有地包含必然由在它们各自的测试测量中发现的标准偏差引起的某些误差。此外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如，所述范围“1至10”应被认为包括最小值1和最大值10之间(并且包含最小值1和最大值10)的任何和所有子范围；即，以最小值1以上开始，例如1至6.1，并且以最大值10以下结束，例如5.5到10的所有子范围。

在就替代方案的Markush组或其它分组描述方面或实施方案时，本申请不仅包括作为整体列出的整个组，也包括组的单独的每个成员和主组的所有可能的子组，并且也包括缺少一个或更多个组成员的主组。本申请还设想明确排除替代方案的Markush组或其它分组中的任何组成员中的一个或更多个。

本文描述了示例性的方法和材料，但在各方面和实施方案的实施或测试中可以使用与本文描述的方法和材料的相似或等同的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，并不旨在进行限制。

定义

为了更容易地理解本公开，首先定义某些术语。这些定义应根据本公开的其余部分来阅读并且如本领域普通技术人员所理解的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在详细描述通篇中记载了附加定义。

如本文中所使用的，术语“神经退行性疾病”或“神经退行性病症”是指表征为在脑细胞和/或神经肌肉系统的细胞内部和外部的不溶性蛋白质的沉积的疾病。在一些实施方案中，病症是阿尔茨海默病。其它疾病包括但不限于进行性核上性麻痹、额颞叶变性(匹克病)、皮质基底变性和脑炎后帕金森症、额颞痴呆伴帕金森病-17(FTDP-17)、嗜银颗粒痴呆、英国型淀粉样血管病、脑淀粉样血管病、皮质基底变性、克-雅病(Creutzfeldt-Jakobdisease)、拳击员痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、唐氏综合征、额颞痴呆、连锁于17号染色体的额颞痴呆伴帕金森病、额颞叶变性、格-斯-施病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、包涵体肌炎、多系统萎缩、强直性肌营养不良、C型尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease type C)、非关岛型运动神经元病伴神经原纤维缠结、脑炎后帕金森病、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、缠结性痴呆(tangleonly dementia)、多发梗塞性痴呆和缺血性中风；综述参见例如Lee等人，Annu.Rev.Neurosci.24(2001)，1121-1 159，其中表1列出了Tau蛋白病的独特成员，或Sergeant等人，Bioch.Biophy.Acta，1739(2005)，179-97，其中图2中的列表)。

痴呆的最常见原因AD是通过在神经病理学中含有β-淀粉样蛋白(Aβ)肽的细胞外斑块和来自过度磷酸化的、不溶性的和丝状的tau蛋白的细胞内神经原纤维缠结(NFTs)进行诊断的(Gao Y.L等人,Ann Transl Med.2018年5月,6(10):175)。在一些实施方案中，疾病是淀粉样变性相关病况或路易体痴呆。在其它实施方案中，疾病是帕金森病或亨廷顿病(HD)，其共享的标志是大脑中具有纤维性淀粉样蛋白样结构的蛋白质聚集体。这些淀粉样蛋白纤维由易聚集的蛋白质构成，例如亨廷顿病中的突变的亨廷顿蛋白(HTT)、和帕金森病中的α-突触核蛋白(Stroo E等人，Front.Neurosci.,2017年2月14日,11:64)。

如本文中所使用的，术语“治疗”和其变体是指采取步骤以获得有益的或期望的结果，包括在患有神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病(AD))的受试者中的药理学和/或生理学结果。本公开的治疗可以减少神经退行性疾病的至少一种可辨别症状的严重性，或延缓或减慢神经退行性疾病的至少一种可辨别症状的发展。本公开的治疗可以是预防性的，即，其可以部分地或完全地预防神经退行性疾病(例如，AD)的发作。因此，如本文中所使用的术语“治疗”包括：(a)在可能易患AD但未被诊断患有AD的受试者中预防AD的发作；(b)抑制AD和/或其症状；(c)改善AD和/或其症状，例如导致AD消退，或减少认知或功能下降；(d)减缓AD和/或其症状的进展；或(e)与未治疗的对照的预期存活相比延长的存活。

如本文中所使用的，术语“治疗认知损害”、“增强认知功能”和其变体是指采取步骤以改善具有认知损害的受试者的认知功能，使得受试者在一个或更多个认知测试中的表现改善到任何可检测的程度，或是预防进一步的下降。优选地，用本公开的抗体治疗后，受试者的认知功能更类似于正常的、未受损的受试者的功能。在某些情况下，与未治疗/安慰剂治疗的对照受试者和受试者组的认知功能水平相比，受试者的认知功能得到改善。人类的认知损害的治疗可以将认知功能改善到任何可检测的程度(例如，至少约20％、至少约30％、至少约40％、或至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％)，但优选充分改善以允许受损的受试者以与正常的、未受损的受试者相同的熟练水平进行正常生活的日常活动。在一些情况下，受神经退行性病症(例如AD)影响的受试者的“治疗认知损害”是指采取步骤以改善受试者认知功能，使得在认知损害的治疗后，受试者的认知功能更类似于年龄匹配的正常的、未受损的受试者的功能、或年轻成年人受试者的功能。在一些情况下，受试者的“治疗认知损害”是指采取步骤以延迟或减缓患有神经退行性疾病(例如AD)的受试者的认知损害的发展。在一些情况下，受试者的“治疗认知损害”是指采取步骤以减少患有神经退行性疾病(例如AD)的受试者的认知功能的下降速率。

在一些实施方案中，治疗导致症状改善。这包括但不限于增强认知、更多自主性和/或改善神经精神功能障碍和行为功能障碍，其中任一种可为暂时的或长期的。

如本文中所使用的，术语“对照”是指未患有或未被诊断患有神经退行性病症的年龄匹配的受试者。在一些实施方案中，对照是指未用本公开的方法治疗或用安慰剂治疗的年龄匹配的和性别匹配的受试者。在一些实施方案中，对照是指正常健康群体中特定参数的量或程度的群体平均值。

如本文中所使用的，术语“抗体”和“免疫球蛋白”可交换使用。抗体或免疫球蛋白可以是天然的或部分或全部合成生产的，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体和多反应性抗体)、和抗体片段。因此，在本说明书的任何上下文中使用的术语“抗体”意指包括但不限于，任何特异性结合成员、免疫球蛋白类和/或同种型(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE)和其生物学相关的片段或特异性结合成员，包括但不限于Fab、F(ab')₂、scFv(单链或相关实体)和(scFv)₂。

如本文中所使用的，术语“抗体片段”可以包括使用如本文综述的本领域普通技术人员已知的和可获得的技术获得的那些抗体片段。因而，除了上文给出的“抗体”的定义之外，术语“抗体”可以进一步包括含有完整抗体的一部分的任何多肽或蛋白质，例如完整抗体的抗原结合或可变区。这些可以源自天然来源，或它们可以是部分或全部合成生产的。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab’)₂和Fv片段；双抗体(diabodies)和线性抗体。

如本文中所使用的，术语“表位”可指抗原的抗体或T细胞与之结合的区域，例如FSH的β亚单元内的区域，包括但不限于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2内的表位。“抗原”是指引发免疫反应或结合至该反应的产物的物质。人FSHβ表位为LVYKDPARPKIQK(SEQ ID NO:1)。小鼠FSHβ表位为LVYKDPARPNTQK(SEQ ID NO:2)。

如本文中所使用的，术语“促卵泡激素”和/或“FSH”可指促性腺激素，一种糖蛋白多肽激素。FSH是由垂体前叶腺(anterior pituitary gland)的促性腺细胞合成和分泌的，并且参与调节身体的发育、生长、成熟和生殖过程。FSH是一种35.5kDa的糖蛋白异二聚体，具有两个多肽单元，α和β亚单元。FSH在结构上类似于黄体生成素(LH)、促甲状腺激素(TSH)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)，共享相同的α亚单元，但β亚单元中具有变化。这使得β亚单元成为FSH抑制剂的有吸引力的治疗靶标，因为靶向β亚单元、例如位于β亚单元中的一个或更多个表位的抑制剂可以特异性地抑制FSH。编码人FSH的β亚单元的示例性基因可以在例如登录号NM_000510获得。编码鼠FSH的β亚单元的示例性基因可以在例如NM 008045获得。本领域普通技术人员将能够从提供的核苷酸序列获得预测的氨基酸序列。

已知在雌激素水平相对不受干扰时，在人类女性的末次月经前，促卵泡激素急剧上升以对抗卵巢储备的下降(Randolph,J.F.Jr.等人，J Clin Endocrinol Metab 88,1516-1522,(2003))。在该围绝经期中，通常在45岁和54岁之间(参考文献8)，某些神经病理学特征和认知特征显示出“峰值(spike)”，特别是与绝经前或绝经后的女性相比(Dubois,B.等人，Alzheimers Dement 12,292-323,(2016)；Epperson,C.N.等人，J ClinEndocrinol Metab 98,3829-3838,(2013)；Hampel,H.等人，Front Neuroendocrinol 50,31-51,(2018)；Jack,C.R.,Jr.等人Lancet Neurol 12,207-216,(2013))。此外，绝经后的女性的高血清FSH水平(>60IU/L)与AD的发作密切相关(Short,R.A.等人，Elevatedgonadotropin levels in patients with Alzheimer disease.Mayo Clin Proc 76,906-909,(2001)；Bowen,R.L.等人，J Neuroendocrinol 12,351-354,(2000))。

如本文中所使用的，术语“促卵泡激素受体”和/或“FSHR”可指与FSH相互作用的跨膜受体。FSHR是一种G蛋白偶联受体(GPCR)。FSHR的激活是FSH激素功能所必需的。FSH的β亚单元是结合FSHR所必需的，因此β亚单元赋予FSH其特异性的生物学作用。因此，由于FSH的生物学活性依赖于与FSHR的结合，抑制FSH的生物学活性既可以通过直接使FSH失活，例如通过与FSH的β亚单元结合，或通过直接使FSHR失活来实现。这是因为使FSHR失活将导致类似于使FSH失活的生物学活性的丧失，因为生物学活性依赖于FSH和FSHR之间的结合。编码人FSHR的示例性基因可以在例如登录号XM_011532734(转录变体X2)或XM_011532733(转录变体X1)获得。编码FSHR的示例性基因可以在例如登录号NM_013523.3获得。本领域普通技术人员能够从提供的核苷酸序列获得预测的氨基酸序列。

如本文中所使用的，术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”意指任何受试者，特别是哺乳动物受试者，例如，期望诊断、预后、预防或治疗的人类患者。在一些实施方案中，术语“患者”意指女性患者。在一些实施方案中，术语“患者”意指男性患者。在一些实施方案中，术语“患者”意指绝经的女性患者。在一些实施方案中，术语“患者”意指绝经前的女性患者。在一些实施方案中，术语“患者”意指围绝经期的女性患者。

如本文中所使用的，术语“施用”或其变体是指通过使用本领域普通技术人员已知的各种方法之一来分配或递送本公开的组合物。例如，本公开的抗体或包含本公开的抗体的组合物可以皮下地、肌内地、静脉内地、鞘内地或颅内地施用至受试者。施用可进行例如一次、多次和/或在一个或更多个延长期内。在一些方面，施用包括包括自我施用的直接施用，和包括开出药品或组合物处方的行为的间接施用。例如，如本文中所使用的，指示患者自我施用组合物或通过另一人施用组合物和/或向患者提供用于向患者施用组合物的处方的医生。

向受试者施用本公开的组合物或抗体的适当方法也将取决于例如受试者的年龄、在施用时受试者是否是活跃的或不活跃的、受试者是否显示出神经退行性病症的症状、认知损害的程度、和组合物的化学和生物学性质(例如溶解性、消化性、生物利用率、稳定性和毒性)。在一些实施方案中，本公开的组合物是静脉内施用的，例如，通过注射静脉内施用至受试者。本公开的抗体通常在盐水中稀释后通过静脉输注施用至患者。

如本文中所使用的，术语“载体”可包括在所采用的剂量或浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。通常药学上可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学上可接受的载体的实例包括但不限于缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括但不限于抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如但不限于血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如但不限于聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如但不限于甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括但不限于葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如但不限于EDTA；糖醇，例如但不限于甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，例如但不限于钠；和/或非离子表面活性剂，例如但不限于TWEEN、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS。这些组分的任何组合，包括可能包含的抑菌剂，可用于填充本公开的制剂。

如本文中所使用的，术语“同源性”可指存在两个组合物之间共享的结构。蛋白质的背景中的术语“同源性”可指两条或更多条氨基酸和/或肽序列之间的重叠的量(例如以百分比表示)。两条序列之间的“百分比同一性”是序列共享的相同位置的数量的函数(即，％同源性＝相同位置的数量/位置的总数×100)，考虑了为了两条序列的最佳对齐而需要引入的空位的数量和每个空位的长度。序列的比较和两条序列之间的百分比同一性的确定可以使用数学算法来完成。这样的同源性经由局部比对工具和/或算法在本领域中得到良好地呈现，并且可以包括成对比对、多序列比对方法、结构比对方法和/或系统发育分析方法。在序列的保守性置换不同的情况下，百分比同一性序列可以但不是必需向上调整以校正置换的保守性质。用于进行该调整的手段是本领域技术人员公知的。通常但不是必需，这涉及将保守性置换作为部分错配而不是全部错配来评分，从而增加了百分比序列同一性。因此，例如，在相同的氨基酸被给予评分1并且非保守性置换被给予评分0时，保守性置换被给予在0和1之间的评分。

通常，与通过本文描述的和本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所确定的，特定多肽的变体与特定参考多肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96％、97％、98％、99％、99％但低于100％的序列同一性。用于序列比对的工具包括BLAST套件的那些(StephenF.Altschul等人，(1997),“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of proteindatabase search programs”,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。另一流行的局部比对技术基于Smith-Waterm算法(Smith,T.F.&Waterman,M.S.(1981)“Identification ofcommon molecular subsequences.”J.Mol.Biol.147:195-197)。基于动态规划的一般全局比对技术是Needleman-Wunsch算法(Needleman,S.B.&Wunsch,C.D.(1970)“A generalmethod applicable to the search for similarities in the amino acid sequencesof two proteins.”J.Mol.Biol.48:443-453.)。例如，两条氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman-Wunsch算法确定，其已整合至GCG软件包(可在http://www.gcg.com获得)的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，和16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在要比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然后相对于较长的序列计算序列同一性，即，即使较短的序列与较长的序列的一部分显示100％序列同一性，总序列同一性将小于100％。除非另有说明，否则应使用将以下用作默认值的BLASTP程序(用于氨基酸序列)(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)来确定百分比同一性：字长(W)为3，期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵。

如本文中所使用的术语“保守序列修饰”或“保守性置换”可指对本公开的靶表位或抗体和其抗原结合部分的氨基酸修饰，所述修饰不会显著影响或改变抗FSH抗体(例如但不必需是Hf2、Hu6、Hu26或Hu28)和其抗原结合部分(包括但不限于SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2)的结合特征。这样的保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过例如定点诱变和PCR介导的诱变等本领域已知的标准技术而将修饰引入本公开的抗体。保守氨基酸置换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸置换。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本公开的抗FSH抗体特异性结合的靶表位(例如对于一些抗FSH抗体为FSH的β亚单元上的表位)内的一个或更多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替代，并且可以针对可测试的靶表位测试本公开的抗体，例如使用本文描述的或本领域已知的功能测定。同样，例如Hf2、Hu6、Hu26或Hu28等本公开的抗体的CDR区域内的一个或更多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替代，并且可以使用本文描述的功能测定来测试改变的抗体的保留功能。

抗FSH抗体及其抗原结合片段

本公开的抗体是抗FSH抗体或其抗原结合片段。抗FSH抗体可以采取本领域中多种形式中的一种，如本文所公开。抗体被部分地由它们所结合的抗原定义，因此，“抗FSH抗体”是特异性结合在FSH上发现的至少一个表位的任何此类抗体。在一些实施方案中，表位位于FSH的β亚单位中。在一些实施方案中，表位位于LVYKDPARPKIQK(SEQ ID NO：1)内。在一些实施方案中，表位位于LVYKDPARPNTQK(SEQ ID NO：2)内。在本领域中可以理解，抗体是至少包含通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。重链包括重链可变区(VH)和重链恒定区(CH1、CH2和CH3)。轻链包括轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。重链和轻链两者的可变区包括框架区(FWR)和互补决定区(CDR)。四个FWR区相对保守，而CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)代表高变区，从NH末端至COOH末端排列如下：FWR1，CDR1，FWR2，CDR2，FWR3，CDR3，FWR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域，而根据同种型，恒定区(一个或更多个)可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合。本领域已知，可以操纵单克隆抗体和其它抗体并使用重组DNA技术的技术来产生保留原始抗体的特异性的其它抗体或嵌合分子。此类技术可以进行将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。

CDR由本领域技术人员通过各种方法/系统来定义。这些系统和/或定义已经过多年的发展和完善并包括Kabat、Chothia、IMGT、AbM和Contact。Kabat定义基于序列可变性并且通常是最常用的。Chothia定义基于结构环区(structural loop region)的位置。IMGT系统基于可变结构域的结构中的序列可变性和位置。AbM定义是Kabat和Chothia之间的折衷。Contact定义基于对可用抗体晶体结构的分析。一个示例性的系统是Kabat和Chothia的组合。软件程序(例如，abYsis(www.bioinf.org.uk/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi))对于本领域技术人员来说是可用的和已知的，用于抗体序列的分析和CDR的确定。本文定义的特定的CDR序列通常基于Kabat定义。然而，将理解，提及特异性抗体的一个或更多个重链CDR和/或一个或更多个轻链CDR将包含本领域技术人员已知的所有CDR定义。

本公开的示例性抗FSH抗体或其抗原结合部分包含在US20190241651中示例的Hf2或其抗原结合部分，其通过引用以其整体并入本文。Hf2具有包括SEQ ID NO：3的可变重链区和包括SEQ ID NO：4的可变轻链区。Hf2具有包括SEQ ID NO：5的CDRH1、包括SEQ ID NO：6的CDRH2、包括SEQ ID NO：7的CDRH3、包括SEQ ID NO：8的CDRL1、包括SEQ ID NO：9的CDRL2和包括SEQ ID NO：10的CDRL3。然而，本公开的抗FSH抗体或其抗原结合部分不限于此。例如，在一些实施方案中，抗FSH抗体具有与SEQ ID NO：3具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的可变重链区。在一些实施方案中，SEQID NO：3具有至少一个保守性置换。在一些实施方案中，抗FSH抗体具有与SEQ ID NO：4具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的可变轻链区。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4具有至少一个保守性置换。在一些实施方案中，可变重链区的一个或更多个CDR与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7中的一者或更多者具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性。在一些实施例中，SEO ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7中的一者或更多者具有至少一个保守性置换。在一些实施方案中，可变轻链区的一个或更多个CDR与SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10中的一个或更多个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQID NO：10中的一个或更多个具有至少一个保守性置换。

本公开的另一示例性抗FSH抗体或其抗原结合部分包括在Gera S.等人，PNAS，117(46)：28971-79中示例的Hu6或其抗原结合部分。Hu6具有包括SEQ ID NO：11的可变重链区和包括SEQ ID NO：12的可变轻链区。Hu6具有包括SEQ ID NO：5的CDRH1、包括SEQ ID NO：6的CDRH2、包括SEQ ID NO：7的CDRH3、包括SEQ ID NO：8的CDRL1、包括SEQ ID NO：9的CDRL2和包括SEQ ID NO：10的CDRL3。在一些实施方案中，抗FSH抗体具有与SEQ ID NO：11具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的可变重链区。在一些实施方案中，SEQ ID NO：11具有至少一个保守性置换。在一些实施方案中，抗FSH抗体具有与SEQ ID NO：12具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的可变轻链区。在一些实施方案中，SEQ ID NO：12具有至少一个保守性置换。

本公开的另一示例性抗FSH抗体或其抗原结合部分包括在Gera S.等人，PNAS，117(46)：28971-79中示例的Hu26或其抗原结合部分。Hu26具有包括SEQ ID NO：13的可变重链区和包括SEQ ID NO：14的可变轻链区。Hu26具有包括SEQ ID NO：5的CDRH1、包括SEQ IDNO：6的CDRH2、包括SEQ ID NO：7的CDRH3、包括SEQ ID NO：8的CDRL1、包括SEQ ID NO：9的CDRL2和包括SEQ ID NO：10的CDRL3。本公开的再一示例性抗FSH抗体或其抗原结合部分包括在Gera S.等人，PNAS，117(46)：28971-79中示例的Hu28或其抗原结合部分。Hu28具有包括SEQ ID NO：15的可变重链区和包括SEQ ID NO：16的可变轻链区。Hu28具有包括SEQ IDNO：5的CDRH1、包括SEQ ID NO：6的CDRH2、包括SEQ ID NO：7的CDRH3、包括SEQ ID NO：8的CDRL1、包括SEQ ID NO：9的CDRL2和包括SEQ ID NO：10的CDRL3。

本公开的示例性抗FSH抗体的CDR如下表1所示：

表1：CDR序列

本公开的示例性抗FSH抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列如下表2所示：

表2：本公开的抗FSH抗体的VH和VL序列

在一些实施方案中，抗FSH抗体包含在表3中所示的以下CDR序列：

表3：CDR序列

本公开的抗体可以包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是技术人员已知的。多克隆抗体可以例如通过一次或多次注射免疫剂以及如果需要的佐剂等在哺乳动物中产生。通常，免疫剂和/或佐剂将通过多次皮下或腹膜内注射注射到哺乳动物中。免疫剂可以包括FSH多肽或其变体。可用的是将免疫剂与已知在被免疫的哺乳动物中为免疫原性的蛋白质缀合。这类免疫原性蛋白的实例包括但不限于钥孔血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白(bovine thyroglobulin)和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以使用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A，合成的海藻糖二霉菌酸酯(synthetic trehalose dicorynomycolate))。免疫方案可以由本领域技术人员选择而无需过度实验。

可选地，抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，例如由Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)描述的那些。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物，以引发产生或能够产生特异性结合至免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。

免疫剂通常包括FSH多肽或其变体。免疫剂可以包含FSH的β亚单位的抗原片段。免疫剂可以是包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的肽序列，或者基本上由SEQ ID NO：1或SEQID NO：2组成但具有保守性置换的肽序列。通常，如果需要人来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者如果需要非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂，例如聚乙二醇，将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，(1986)第59-103页)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在合适的培养基中培养，该培养基优选含有一种或更多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(the enzyme hypoxanthine guaninephosphoribosyl transferase)(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。

优选的永生化细胞系是有效融合、通过所选抗体产生细胞支持抗体的稳定的高水平表达并且对培养基如HAT培养基敏感的那些。更优选的永生化细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，其可以例如从加利福尼亚州圣地亚哥的索尔克研究所细胞分布中心(the Salk InstituteCell Distribution Center,San Diego,Calif)和弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection,Manassas,Va)获得。人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系也已被描述用于生产人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，Marcel Dekker，Inc.，New York,(1987)pp.51-63)。然后可以将培养杂交瘤细胞的培养基进行对于存在针对FSH的单克隆抗体的分析。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定(例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来确定。这类技术和测定是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Scatchard analysis of Munson and Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)来确定。

在鉴定出所需的杂交瘤细胞后，克隆可以通过限制稀释工序(dilutionprocedure)来亚克隆并通过标准方法生长。用于此目的的合适的培养基包括例如杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可以在哺乳动物中作为腹水在体内生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化工序例如蛋白A-琼脂糖凝胶法、羟基磷灰石层析法、凝胶电泳法、透析法或亲和层析法等从培养基或腹水液中分离或纯化。

单克隆抗体也可以通过重组DNA方法例如U.S.Pat.No.4,816,567中记载的那些来制造。编码本公开的单克隆抗体的DNA可以使用常规工序(例如，通过使用能够特异性结合至编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。本公开的杂交瘤细胞用作此类DNA的优选来源。一旦分离，可以将DNA置于表达载体中，然后将其转染到不另外产生免疫球蛋白蛋白的宿主细胞例如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，从而在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。DNA也可以被修饰，例如，通过置换人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列，如在U.S.Pat.No.4,816,567中的；或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接到免疫球蛋白的编码序列。这类非免疫球蛋白多肽可以被置换为本公开抗体的恒定结构域，或者可以置换为本公开抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体。

抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法在本领域是公知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和修饰重链的重组表达。重链通常在Fc区的任何点被截短从而防止重链交联。或者，相关的半胱氨酸残基被另外的氨基酸残基置换或被删除从而防止交联。

体外方法也适用于制备单价抗体。使用本领域已知的常规技术可以实现抗体的消化以产生其片段，特别是Fab片段。

在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段共价连接到脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒或纳米胶囊或被包封在其中。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段共价连接到血脑屏障蛋白，或缀合到结合至血管上的受体的抗体(例如针对转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、瘦素受体、脂蛋白受体、IGF受体、LDL受体、P-选择素(CD62P)、细胞内粘附分子-1(ICAM-1或CD54)或对于脑血管靶向的其他靶标的抗体)，以促进血脑屏障渗透以及抗FSH抗体或其抗原结合片段至疾病部位的递送。血脑屏障穿梭体(Blood brain barrier shuttle)，例如WO2014033074中公开的那些，可用于将抗FSH抗体或其抗原结合片段递送至大脑。

药物组合物

本公开的抗FSH抗体可以配制成药物组合物。这类药物组合物可以根据本领域公知的方法配制；参见，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2000)，the University of Sciences in Philadelphia,ISBN 683-306472。所述组合物可进一步包含药学上可接受的载体。合适的药学上的载体的实例在本领域是公知的，并且包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液(例如油/水乳液)、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。此外，注射用药物组合物可以在亲脂性溶剂中制备，所述溶剂包括但不限于油，例如植物油、橄榄油、花生油、棕榈油、大豆油、红花油等；合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯；胆固醇衍生物，包括胆固醇油酸酯、胆固醇亚油酸酯、胆固醇肉豆蔻酸酯等；或脂质体，如上所述。组合物可以在亲脂性溶剂中直接制备，或者优选作为油/水乳液制备(参见例如，Liu,F.等人.Pharm.Res.12:1060-1064(1995)；Prankerd,R.J.J.Parent.Sci.Tech.44:139-49(1990)；U.S.Pat.No.5,651,991)。

在一些实施方案中，本公开的抗FSH抗体可以配制成药物组合物，所述组合物包括例如一种或更多种缓冲液、一种或更多种盐、一种或更多种表面活性剂、一种或更多种糖和/或一种或更多种冻干保护剂/冷冻保护剂。所述抗FSH抗体制剂可以以摩尔浓度为约5mM、约10mM、约15mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM或约50mM包含磷酸盐。抗FSH抗体制剂可以以约0.001％、约0.002％、约0.003％、约0.004％或约0.005％(v/v)的浓度包含Tween-20。抗FSH抗体制剂可以以摩尔浓度为约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1.0mM、约2.0mM、约3.0mM、约4.0mM或约5.0mM包含氯化钠(NaCl)。抗FSH抗体制剂可以以摩尔浓度为约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、约190mM、约200mM、约210mM、约220mM、约230mM、约240mM、约250mM、约260mM、约270mM、约280mM、约290mM或约300mM包含蔗糖。

药物组合物可包含附加药剂。例如，用于治疗阿尔茨海默病，附加药剂可选自由胆碱酯酶抑制剂，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，激素，维生素，抗精神病药，三环抗抑郁药，苯二氮类药物，胰岛素，NGF、CERE-110、β-阻断剂、人淀粉样蛋白疫苗、β或γ分泌酶抑制剂、烟碱或毒蕈碱激动剂的腺相关病毒递送，和第二抗体(例如抗Aβ抗体、抗Tau抗体及其组合)组成的组。

本公开的组合物可以通过本领域已知的各种途径施用，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或皮内施用。

剂量和剂量方案取决于由医师容易确定的各种因素，例如病情的严重程度、患者和患者的病史。通常，向患者施用治疗有效量的组合物。在一些实施方案中，施用的组合物的量在约0.1mg/kg至约100mg/kg患者体重的范围内，以及两者之间的任何范围。根据病况的严重程度，约0.1mg/kg至约50mg/kg体重(例如，约0.1-15mg/kg/剂量，更通常为约0.2-25mg/kg体重)的组合物是施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次单独施用，还是通过连续输注。组合物可以以相对低的体积速率递送，例如但不是必须，从约0.001ml/天至10ml/天，以便最小化制剂释放部位附近的组织干扰或创伤。制剂可以根据特定的生物试剂以低剂量，以例如约0.01μg/hr或0.1μg/hr、0.25μg/hr、1μg/hr，通常高达约200μg/hr的速率释放；或者制剂可以以低体积速率递送，例如约0.001ml/天至约1ml/天的体积速率，例如0.01微克/天至约20毫克/天。剂量取决于许多因素，如活性成分的效力、生物利用度和毒性以及受试者的要求。这种治疗的进展容易通过常规方法和分析并基于医师或本领域其他技术人员已知的标准来监测。上述用于评估疾病成功治疗和改善的参数通过医师熟悉的常规工序是可容易测量的。

治疗方法

本文中公开的方法使得能够用本公开的组合物治疗受试者的神经退行性病症(例如阿尔茨海默病)。本公开的组合物包含施用于人类患者的重组全人抗FSH单克隆抗体。在优选的实施方案中，单克隆抗体在对FSH具有选择性的同时具有优异的安全特性。满足这些标准的优选的单克隆抗体为包含SEQ ID NO:5-10的CDR的抗体。本公开的抗体为针对阿尔茨海默病的生物治疗，其为识别FSH(包括斑块)的非天然存在的重组全人抗FSH单克隆抗体。本公开的优选抗体为由通过链间二硫键连接的2条重链和2条κ轻链构成的IgG1。

本公开的方法进一步包括将抗FSH抗体与针对神经退行性疾病(例如，AD)的另外的治疗剂组合施用。在一些实施方案中，将本公开的抗体与一种或多种药剂同时施用，所述药剂包括但不限于胆碱酯酶抑制剂，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，激素，维生素，抗精神病药，三环抗抑郁药，苯二氮类药物，胰岛素，NGF、CERE-110、β-阻断剂、人淀粉样蛋白疫苗、β或γ分泌酶抑制剂、烟碱或毒蕈碱激动剂的腺相关病毒递送，和第二抗体。胆碱酯酶抑制剂包括但不限于加兰他敏、卡巴拉汀、他克林和多奈哌齐。NMDA受体拮抗剂包括但不限于氯胺酮、美沙酮、美金刚胺、金刚烷胺和右美沙芬或它们的盐。抗精神病药剂包括但不限于阿立哌唑、利培酮、奥氮平、喹硫平或氟哌啶醇。苯二氮类药物包括但不限于劳拉西泮、奥沙西泮和替马西泮。三环抗抑郁药包括但不限于去甲替林。激素包括但不限于雌激素、黄体酮和亮丙瑞林。维生素包括但不限于叶酸和烟酰胺。第二抗体包括但不限于巴匹珠单抗(bapineuzumab)、苏兰珠单抗(solanezumab)、更汀芦单抗(gantenerumab)、克瑞珠单抗(crenezumab)、泊奈珠单抗(ponezumab)、BAN2401、和阿杜那单抗(aducanumab)。

此外，本文中描述的任何疗法可以包括用于治疗包括神经退行性疾病疗法的疗法的一种或更多种副作用的一种或更多种药剂。联合疗法(例如，抗FSH抗体组合物和一种或更多种另外的神经退行疗法或另外的治疗剂的共同施用)可以为例如同时的或依次的。例如，本公开的抗FSH抗体和另外的治疗剂可以同时或在不同时间施用。在一些实施方案中，可以首先及时施用一种或更多种另外的治疗剂，然后可以及时施用抗FSH抗体。

动物模型

动物模型用作用于开发和评价针对神经退行性病症的治疗的重要资源。动物模型中表征病理标志(例如淀粉样蛋白沉积和神经元纤维缠结)和认知损害的特征通常延及人类的病理标志和认知损害(LaFerla FM,Green KN.Cold Spring Harb PerspectMed.2012；2(11):a006320.2012年11月1日发表)。因此，预期此类动物模型中的功效可预测人类中的功效。

在一些实施方案中，神经退行性疾病的动物模型可以表达一种或更多种人类基因。阿尔茨海默病的动物模型可以包括一种或更多种基因中的一种或更多种突变，例如在淀粉样前体蛋白(APP，例如，具有瑞典突变(K670D/M671L)、印第安纳突变(V717F)、伦敦突变(V717I)和/或北极突变(E693G)的人转基因APP模型)、早老素1(PSEN1)、早老素2(PSEN2)、tau(MAPT，例如N279K、ΔK280、P301L、P301S、V337和/或R406W)、载脂蛋白E(APOE)、颗粒蛋白前体(PGRN)、TAR DNA结合蛋白TDP-43(TARDBP)、含缬酪肽蛋白(valosin-containing protein，VCP)中。阿尔茨海默病的动物模型的非限制性实例包括小鼠模型(例如，PDAPP、H6、J9、J20、Tg2576、APP23、C3-3、CRND8、ARC6/ARC48、C3-3 x PSEN1、PSAPP、APP^SLPS1^M146L、5XFAD、hBACE1/hAPP、hTau、Tau^P301L、Tau^V337M、Tau^P301S、Tau^{G272V、P301S}、3xTg-AD)。在一些实施方案中，动物模型可以为野生型(wt)动物和转基因(tg)动物的后代。神经退行性疾病的各种动物模型是本领域已知的，例如PD APP、Tg2576、APP23、TgCRNDS、J20、hPS2Tg和APP+PS1转基因小鼠。Sankaranarayanan,Curr.Top.Medicinal Chem.6:609-627,2006；Kobayashi等人，Genes Brain Behav.4:173-196.2005；Ashe和Zahns,Neuron.66:631-45,2010。此类痴呆的动物模型可以用于测定本公开的方法和组合物在治疗神经退行性疾病方面的有效性。

在一些实施方案中，动物模型可以用于评价药物组合物的安全性，例如，评价抗体疗法或包含抗体和一种或更多种另外的治疗剂的联合疗法的药物组合物的安全性。使用动物模型来评价药物组合物的安全性可以包括研究药代动力学、药效动力学、毒理学、功效、胚胎毒性、致癌潜力以及药物组合物的安全性的其它量度。用于评价药物组合物的安全性的动物模型可以包括例如使用小鼠、鱼、青蛙、兔、猫、犬或非人灵长类动物。

在动物模型和人类中的认知测试

神经退行性病症的动物模型中认知损害的程度和所述神经退行性病症的治疗方法的功效可以使用多种多样的认知测试来测试和确认。

新物体识别(NOR)测试：在针对再认记忆的该测试中，在第一段时间向小鼠呈现两个相同的物体，然后在第二段时间用新物体替换两个物体中的一个(Leger,M.等人，NatProtoc 8,2531-2537,(2013))。在一个实例中，测试针对诱导偏好和辨别能力进行；后者应当>0.25。在第1天，在空场地中进行习惯阶段(持续5至10分钟)，24小时后进行训练阶段，其允许在两个相同的物体置于相对的象限的习惯场地中进行5至10min的探索。进行20min至4小时的保留时间的测试阶段，随后用新物体替换一个物体并且进行5至10min的探索。使用ANY-Maze视频跟踪系统(Stoelting，UK)收集包括所花费的时间、头部进入象限的距离和次数以及物体嗅探时间的参数。

恐惧条件反射测试：恐惧条件反射测试测量较远的和近期的与情境相关的恐惧二者的获取(Kim,J.J.&Fanselow,M.S.Science 256,675-677,(1992)；Maren,S.等人，BehavBrain Res 88,261-274(1997))和唤回(Anagnostaras,S.G.等人，J Neurosci 19,1106-1114(1999))。在一个实例中，对于远事记忆，小鼠在幼年时将接受由持续三天的每天单足电击(1.0mA恒定电流，2秒)构成的情境条件反射(context conditioning)。然后，它们经历远事记忆回忆(20min)，每4个月测量僵直行为(freezing behavior)直至死亡或处死(如Amadi,U.等人，Psychol Sci 28,143-161,(2017)；Harmatz,E.S.等人，Biol Psychiatry81(2017)中那样)。对于近期的情境记忆唤回，在新的情境中施加情境条件反射，在条件反射后24小时进行记忆回忆。

径向臂迷宫测试：径向臂迷宫(RAM)行为任务是认知测试的另一实例，特别是测试空间记忆(Chappeli等人，Neuropharmacology 37:481-487,1998)。RAM设备由例如8个等距间隔的臂构成。迷宫臂从中心平台的每个面伸出。食物井位于每个臂的远端。将食物用作奖励。可以设置阻碍以防止进入任何臂。还可以提供在设备周围的许多额外的迷宫线索。在习惯阶段和训练阶段之后，可以在对照或测试化合物处理的条件下在RAM中测试受试者的空间记忆。作为测试的一部分，在试验前用溶媒对照或测试化合物的剂量范围中的一者来对受试者进行预处理。在各试验开始时，将八臂迷宫的一个子集的臂封锁。允许受试者获得未封锁的臂上的食物，在试验的该初始“信息阶段”期间允许通往未封锁的臂。然后，在信息阶段和随后的“保留测试”之间将受试者从迷宫中移出一段延迟时间，例如，延迟60秒、延迟15分钟、延迟1小时、延迟2小时、延迟6小时、延迟24小时或更长)，在此期间将迷宫上的障碍移除，从而允许通往全部8个臂。在该延迟时间之后，将受试者放回至中心平台上(通向先前封锁的臂的障碍被移除)并且允许其在试验的该保留测试阶段期间获得剩余的食物奖励。不同试验中被封锁的臂的特性和配置各不相同。跟踪受试者在保留测试阶段期间所犯的“错误”的数量。如果受试者进入食物在试验的延迟前部分已被取回的臂或如果在延迟后阶段再次访问已经访问过的臂，则在试验中发生错误。错误的数量越少表明空间记忆越好。然后，可以比较测试受试者在各种测试化合物治疗方案下所犯错误的数量，以确定测试化合物(例如，本公开的抗FSH抗体)在治疗具有认知损害的神经退行性病症方面的功效。

莫里斯水迷宫测试：可以用于评估测试化合物对神经退行性病症模型动物的认知损害的作用的另一认知测试为莫里斯水迷宫。水迷宫为周围有一组与迷宫相关的新颖图案的水池。用于水迷宫的训练方案可以基于已被证明是海马依赖性的、经修改的水迷宫任务(de Hoz等人，Eur.J.Neurosci.,22:745-54,2005；Steele和Morris,Hippocampus 9:118-36,1999)。训练受试者以找到隐藏在水池表面下方的水下逃生平台。在训练试验期间，将受试者从水池外缘周围的随机起始位置释放到迷宫(水池)中。起始位置因试验而异。如果受试者在设定的时间内没有找到逃生平台，则实验者引导受试者并且将其置于平台上以“教导”平台的位置。在最后一次训练试验后的延迟期后，在不存在逃生平台的情况下进行保留测试以评估空间记忆。如通过例如在该位置花费的时间或小鼠作出的穿过该位置的次数来衡量的、受试者对(现在不存在的)逃生平台的位置的偏好水平表明更好的空间记忆，即认知损害的治疗。然后，可以比较在不同治疗条件下对逃生平台的位置的偏好，以确定测试化合物(例如，本公开的抗FSH抗体)在治疗具有认知损害的神经退行性病症方面的功效。

动物模型中的其它测试：用于在动物模型中评价认知功能的其它测试包括五项选择连续反应时间测试(The 5-choice serial reaction time task:behaviouralpharmacology and functional neurochemistry.Psychopharmacology(Berl).2002October；163(3-4):362-80)。恐惧条件反射范例(Gould T J等人，2002BehavPharmacol.13(4):287-94；Hamm A O等人，2003Brain 126(Pt 2):267-75)和新物体识别(Animal Models of Cognitive Impairment,2006(Levin,E.D.&Buccafusco,J.J.编).Boca Raton,Fla.)。

人类中的测试：本领域已知用于在人类中评估认知功能的各种测试，例如但不限于阿尔茨海默病评估量表-认知分量表(ADAS-cog)；临床总体印象变化量表(CIBIC-plus量表)；简易精神状态检查(MMSE)；神经精神问卷(NPI)；临床痴呆评定量表(CDR)；剑桥神经心理自动化成套测试(CANTAB)；Sandoz老年临床评定量表(SCAG)、Buschke选择性提醒测试(Buschke和Fuld，1974)；言语配对关联子测试；逻辑记忆子测试：和外显3选项强迫选择任务(参见，例如，WO2012109491)；韦克斯勒记忆量表修订版(WMS-R)的视觉再现子测试(Wechsler，1997)；本顿视觉保留测试。参见Folstein等人，J Psychiatric Res12:189-98,(1975)；Robbins等人，Dementia 5:266-81(1994)；Rey,L'examen clinique enpsychologie,(1964)；luger等人，J Geriair Psychiatry Neurol12:168-79,(1999)；Marquis等人，2002和Masur等人，1994。

阿尔茨海默病的评估方法

本公开的神经退行性疾病(例如，AD)的风险、存在、严重性和进展的测量可以通过以下来确定：随时间推移的临床诊断、患者的整体功能水平的评估、日常生活能力或行为缺陷的评价、大脑结构的容量分析、脑中异常蛋白的病理性沉积(例如PETβ-淀粉样蛋白成像)或体液中的生化变量(例如tau蛋白或Abeta肽)的体内测量、和通过与疾病的自然病程/病史进行比较。在一些实施方案中，以下临床评估可以用于确定患者的阿尔茨海默病的阶段：临床痴呆评定(CDR)；自由和提示选择性提醒测试(FCSRT)；神经精神病学调查问卷(NPI-Q)；和包括Rey听觉言语学习测试(RA VLT)即时和延迟回忆、韦克斯勒记忆量表(WMS)言语配对关联学习测试即时和延迟回忆、Delis-Kaplan执行功能系统言语流畅度条件1和2、和韦克斯勒成人智力量表第四版符号搜索和编码子集的神经心理学成套测试；和认知药物研究计算化成套测试。

在一些实施方案中，生物标志物可以用于定义AD并且用于沿其范围(spectrum)对疾病进行分期。AD的生物标志物包括但不限于血液或CSF中的ApoE同种型、淀粉样蛋白PET、总Tau、磷酸-Tau、焦谷氨酸-Αβ、Αβ40和Αβ42、以及海马体积(HCV)MRI。

脑中的淀粉样蛋白斑块负荷可以通过¹⁸F-AV-45PET来测量。¹⁸F-AV-45为由AvidRadiopharmaceuticals(Philadelphia，Pennsylvania)开发的淀粉样蛋白配体。其以高亲和力(Kd＝3.1nM)与纤维状Αβ结合。18F-AV-45PET成像的结果显示患有AD的患者在预计淀粉样蛋白沉积高的皮质区域具有示踪剂的选择性保留，而健康对照显示从这些区域的快速洗出，仅有极少的皮质示踪剂保留。在AD和年龄相仿的对照受试者之间观察到18F-AV-45的平均摄取的显著差异。在AD患者和认知健康的对照中，18F-AV-45PET成像的重测方差均较低(小于5％)。¹⁸F-AV-45PET图像的视觉解释和皮质摄取的平均定量估计值与尸检时如通过免疫组织化学和银染神经炎性斑块评分测量的淀粉样蛋白病理的存在和量相关(Clark等人，2011)。

形态测量MRI测量也可以辅助AD的评估。这些包括全脑体积、海马体积、脑室体积和皮质灰质体积。评估方案中可以包括如通过ASL-MRI测量的脑血流量和如通过tf-fMRI测量的功能连接性。关于对PET成像和与辅助AD的评估相关的其它技术的进一步描述，参见例如WO2016087944A2。认知功能也可以使用成像技术例如正电子发射断层扫描(PET)、功能性磁共振成像(fMRI)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或允许测量脑功能的任何其它成像技术来测量。在动物中，认知功能也可以用电生理学技术来测量。

使用本公开的抗FSH抗体来治疗阿尔茨海默病导致这些参数中的一个或多个相对于基线测量值的改善或者至少防止或减缓AD从一个阶段向下一阶段的进展。

提供以下实施例以更好地说明请求保护的本发明并且以下实施例不应解释为限制本发明的范围。就提及具体材料而言，其仅为了说明的目的并且不旨在限制本发明。本领域技术人员可以在不运用创造能力的情况下和在不偏离本发明的范围的情况下开发出等同的手段或反应物。

实施例

除非另有说明，否则本公开的方法和组合物的实施采用分子生物学(包括重组技术)、细胞培养、微生物学、细胞生物学、生物化学、免疫学和神经科学的常规技术，这些技术完全在本领域技术人员的范围内。这样的技术在例如以下的文献中得到充分的解释："Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，第二版(Sambrook,1989)；"OligonucleotideSynthesis"(Gait，1984)；"Animal Cell Culture"(Freshney，1987)；"Methods inEnzymology""Handbook of Experimental Immunology"(Weir，1996)；"Gene TransferVectors for Mammalian Cells"(Miller和Calos，1987)；"Current Protocols inMolecular Biology"(Ausubel，1987)；"PCR:The Polymerase Chain Reaction",(Mullis，1994)；"Current Protocols in Immunology"(Coligan，1991)。这些技术适用于本公开的方法和组合物。对于特定实施方案特别有用的技术将在下面的部分中讨论。以下材料、试剂和方法用于本文所述的实施例。

转基因小鼠

在西奈山(Mount Sinai)产生和繁殖的APP/PS1小鼠携带包括APP^K670N/M671L和PSEN1^ΔE9的人类转基因(Minkeviciene，R.等人.J Neurochem105，584-594，(2008))。APP/PS1小鼠在6个月时出现淀粉样斑块，在随后的12月龄时出现明显的认知损害，但不表现出神经原纤维缠结Minkeviciene，R.等人.J Neurochem 105，584-594，(2008)；Onos，K.D.等人.PLoSGenet15，(2019)；Volianskis,A.，等人.Neurobiol Aging 31，1173-1187，(2010))。这些小鼠在纯C57BL/6J背景下繁殖时显示出由于癫痫发作活动而突然死亡的证据(Minkeviciene，R.等人.J Neurosci 29，3453-3462，(2009))。动物护理和处理是根据美国国立卫生研究院动物护理指南(NIH animal care guidelines)在西奈山进行的。方案由各机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committees)审查和批准。

在食蟹猴中的安全性研究

由于本文公开的组合物可应用于人类，为了了解所述组合物的生物分布和安全性，将包含抗FSH抗体的组合物作为单次团注注射至两只年龄分别为14岁和15岁的雄性食蟹猴(Cynomolgus monkey)的尾静脉。所有研究的猴子(长尾猕猴(Macaca fascicularis))喂食Teklad Global 20％蛋白质灵长类饮食(Protein Primate Diet)。所有方案由西奈山伊坎医学院和缅因州医学中心研究所的机构动物护理和使用委员会的批准。方案由各机构动物护理和使用委员会审查和批准。

实施例1：抗FSH抗体增强卵巢切除的AD小鼠的认知

为了确定抗FSH抗体对AD小鼠的认知的影响，首先对C57BL/6J-同类系背景的6.5月龄雌性APP/PS1小鼠进行卵巢切除，并施用单克隆抗FSH Ab(Hu6)或人IgG(100μg/小鼠，每天，腹腔注射)持续4周。已知卵巢切除术会引起子宫萎缩并升高FSH水平(Sun L，等人,Cell.(2006)4月21日；125(2)：247-60)。

然后进行包括新物体识别(NOR)测试和恐惧条件反射测试(FCT)的认知测试。NOR测试是一种常用的行为测试，其中在第一段时间向小鼠呈现两个相同的物体，然后在第二段时间用新物体替换两个物体中的一个(Leger,M.等人.Nat Protoc 8,2531-2537(2013))。在第1天，在空场地中进行习惯阶段(持续5分钟)，24小时后，进行训练阶段，允许在其中两个相同的物体置于相对的象限的习惯场地中进行5分钟的探索。测试阶段接着20分钟的间隔，这相当于通常允许捕获记忆缺陷的保留时间范围。为了进行测试，用新物体替换一个物体，然后进行5分钟的探索。使用ANY-maze视频跟踪系统(Stoelting，UK)收集参数，包括所花费的时间、头部进入新/熟悉象限的距离和次数、以及物体嗅探时间。接受抗FSH抗体Hu6的小鼠显示出较高的探索新物体所花费的时间相对于探索熟悉物体的时间的比(参见图1A)。

对于FCT，小鼠接受由持续三天的每天单足电击(1.0mA,2秒)组成的情景条件反射，并通过测定情景中的僵直时间，在条件反射24h后经历记忆回忆。与IgG处理的小鼠相比，接受抗FSH抗体Hu6的小鼠在Hu6阻断FSH的情况下显示出改善的认知(参见图1B)。n＝3-4只小鼠/组，p>0.05。

在另一实验中，对7周龄雌性APP/PS1小鼠和野生型同窝小鼠进行卵巢切除。恢复一周后，小鼠腹腔注射100μg Hu6或人IgG，持续4个月(前两个月每周5天，后两个月每周3天)。分别使用新物体识别测试(图2A)和恐惧条件反射测试(图2B和2C)进行检测的APP/PS1小鼠的识别和情境记忆在Hu6注射4个月后得到改善。统计数据：平均值±SEM，双因素ANOVA，n＝5-8只小鼠/组，*P<0.05，或如所示。

这些结果表明，抗FSH抗体可以改善患有阿尔茨海默病的小鼠的认知和记忆。

实施例2：抗FSH抗体在小鼠大脑中的渗透

将Alexa750标记的人源化单克隆FSH抗体Hu6腹腔注射至C57BL/6小鼠。IVIS平台上的落射荧光(来自每组三只小鼠的图像和定量)显示了全脑(灌注后)中的抗体定位(图3)。对照(Ctrl)为未标记的Hu6。

实施例3：抗FSH抗体的精细定位

对抗FSH抗体序列(小鼠单克隆Hf2抗体)与各自的亲本FSH受体(FSHR)之间的原子相互作用进行了精细定位。与人FSHR(PDB ID 4AY9)的整个胞外域复合的人FSH的晶体结构被用作比较建模的模板(图4A)。小鼠FSHR(UniProt id Q9QWV8)和人FSHR之间的高序列同一性(88％)使得能够构建准确的同源性模型(图4B)。在人类复合物中，β-链的残基R44与FSHR的残基E197形成离子对(图4A)。残基K49与受体的残基E332形成另一稳定的离子对。经修饰的残基sTyr335的硫酸根基团(sulphate group)充当残基Y39和V38的主链胺的氢键受体。此外，残基Y39与FSHR的残基H289形成氢键，并且残基K242是残基A43的主链的氢键供体。经建模的小鼠FSHR-FSHβ复合物在很大程度上具有与人类复合物类似的结合模式，具有额外的相互作用，残基D41通过该相互作用与受体的残基K242形成氢键(图4B)。值得注意的是，发现小鼠FSHβ中的N46和T47残基以及人FSHβ中相应的K46和I47残基不与各自的受体发生相互作用(图4A和4B)。

不受理论的束缚，据信本公开的实施例将FSH和AD联系在一起，同时考虑了AD与血清FSH水平升高的密切临床联系(Casadesus G,等人.J Biomed Biotechnol.(3):39508(2006))，这为使用抗FSH抗体预防和治疗妇女的AD提供了基础。此外，由于FSH水平也在老年男性中升高(Araujo,A.B.&Wittert,G.A.Clinical endocrinology&metabolism 25,303-319,(2011)，抗FSH Ab改善小鼠的认知的例证发现使得能够在男女两性中使用抗FSH抗体。

实施例4：抗FSH抗体在食蟹猴模型中的安全性

由于本文公开的组合物可应用于人类，为了了解所述组合物的生物分布和安全性，在食蟹猴模型中对生物分布和安全性进行了评价。在过夜禁食后，将⁸⁹Zr标记的抗FSH抗体作为单次团注(1.3mg，～1.3mCi)注射至两只年龄分别为14岁和15岁的雄性食蟹猴的尾静脉。在注射后5分钟、30分钟、以及在48小时和120小时经由尾静脉抽取血液。使用Waveline Touch系统(DRE)和Welch Allyn直肠温度计记录生命体征，包括平均动脉压、收缩压和舒张压、呼吸频率、心率和直肠温度。

正电子发射断层扫描(PET)和磁共振(MR)图像是在一体化3TPET/MRI系统(Biograph mMR,Siemens Healthineers)上获取的。使用扫描仪自动地将每个PET床位(头、胸、骨盆)的全身MR图像整理在一起。MR参数如下：采集平面，冠状面；重复时间，1000毫秒；回波时间，79毫秒；切片数，224；平均数，2；空间分辨率为0.6mm x 0.6mm x 1.0mm；和采集时间，每床位29分钟56秒。采集后，使用Siemens专有的e7tools，利用具有点扩散函数(PSF)校正的有序子集期望最大化(OSEM)算法，对来自每个床位的PET原始数据进行离线重建和整理。双室(软组织和空气)衰减图用于衰减。使用Osirix MD 11.0版本进行图像分析。将全身MR图像与PET图像融合并在轴向平面上进行分析。在各种组织上绘制感兴趣区域(ROI)。对肝脏、肾脏、BAT(肩胛间区域)、皮下WAT、内脏WAT、性腺WAT、胆囊、脾脏、大脑和睾丸以其整体进行追踪；从肩部对骨髓进行成像；和3块腰椎；和从四头肌对肌肉进行成像。计算每个ROI的平均SUV。每个组织的89Zr-MS-Hu6摄取表示为每个器官的所有平均SUV值的平均值。收集血清用于由IDEXX BioAnalytics进行血液化学分析。

⁸⁹Zr标记的抗FSH抗体在5分钟时在血液中达到峰值，在48小时和120小时时有所下降但在血清中持续存在(图5A)。PET/CT扫描显示出肝脏和胆囊中的高的标准摄取值(SUV)，和肾脏、脾脏、脂肪库、骨髓和大脑区域中的较低的SUV(图5B)。

对经处理的猴子的标准安全参数进行长达100分钟的监测，对于心率、呼吸频率、平均动脉压、收缩压或舒张压、或直肠温度均未观察到注射后的明显的急性或延迟变化(图6A)。还在第0天(注射前)以及注射后第2天和第5天抽取血液。没有注意到与标准值有令人担忧的偏差(图6B)。这些结果表明，在作为对猴子的单次静脉内团注注射所测试的剂量下，使用包含抗FSH抗体的组合物的治疗通常是安全的。

实施例5：抗FSH抗体组合物的可制造性和制剂

包含基于亲和力、效力、特异性、功能性和药代动力学选择出的抗体的药物组合物可能具有影响制造的物理化学属性。因此，在对物理化学性质进行初步计算机筛选后，在早期阶段确定物理化学性质可能是非常有用的。计算机工具Protein-Sol用于基于来自48种FDA批准的抗体组合物和89种处于后期临床开发阶段的抗体的氨基酸序列和物理化学变量的机器学习，筛选抗FSH组合物(https://protein-sol.manchester.ac.uk/abpred)。Protein-Sol使用抗体序列(VH和VL)作为输入来提供以下的预测输出：基于生物膜干涉技术的克隆自身相互作用(CSI-BLI)、多特异性试剂(PSR)、杆状病毒颗粒ELISA(BVP-EL)、交叉作用色谱法(CIC)、ELISA、加速稳定性(AS)、疏水作用色谱法(HIC)、直立单层吸附色谱法(SMAC)、盐梯度亲和捕获(SGAC)、HEK细胞中的表达滴度(HEK)、亲和捕获(AC)和差示扫描荧光(DSF)。它还通过对8个实验参数进行平均排名，为每个序列提供元值(1＝最佳；100＝最差)。

在初始迭代中，Protein-Sol提供了影响可制造性的12个独立物理化学参数的预测值。对于所有输出，在输入VH和VL区后，本文公开的抗FSH组合物落入可接受的阈值内，因此被认为是安全的(图7A)。这些计算结果表明，本文公开的抗FSH抗体组合物的物理化学性质很可能具有与FDA批准的抗体相似的物理化学参数。

为了验证，产生了抗FSH抗体的版本，其中CDR区为乱序的，并且12个输出中的5个，即亲和捕获、交叉相互作用色谱法(CIC)、多特异性试剂(PSR)、HEK细胞(HEK)中的表达滴度和差示扫描荧光(DSF)落在各自的阈值之外，这是乱序版本将带来制造挑战的早期迹象(图7B)。事实上，尽管约65％的FDA批准的单克隆抗体在此类筛选后表明无制造挑战，但具有一些制造挑战的迹象的单克隆抗体已获得FDA批准。为了补充来自单个输出的数据，通过对8个实验参数进行平均排名，得到本文公开的抗FSH抗体组合物及其乱序序列对应物的元值(1＝最佳；100＝最差)。我们发现，元值对落在左下象限内，表明总体上可接受的物理化学性质，即使与在右上象限中的某些FDA批准的抗体相比也是如此(图7A)。

在对抗FSH抗体组合物的物理化学特性进行实验测试之前，开发了优选的制剂。为了防止在中性和碱性pH下的脱酰胺和异构化，治疗性抗体组合物通常在远离其等电pH(pI)的pH下配制。使用Expasy，抗FSH组合物的pI预测为8.58。等电聚焦用于确定pI。如下进行二维电泳：首先在室温下在不含DTT的复水缓冲液(8M尿素、2％ CHAPS、0.5％ IPG缓冲液和痕量溴酚蓝)中对抗FSH抗体(500μg)进行复水2小时。然后使用Ettan IPGphor 3等电聚焦系统(GE Healthcare)在18cm 3-10条带上运行样品。四个电压步骤(50V，10小时；500V，1小时；1000V，1小时；8000V，4小时)，然后进行考马斯蓝染色。等电聚焦证实pI为8.7(图8A)。

然后，对215种不同的抗FSH抗体制剂(包括盐、清洁剂和糖的不同组合)测试了热稳定性。热漂移测定使用荧光报告物Sypro–Orange(Protein Thermal Shift Dye Kit，ThermoFisher，Catalog#4461146)来检测在热-诱导的球状蛋白质去折叠后暴露的疏水性结构域。将在测试制剂中或在PBS中的抗FSH抗体(1.5μg/μL)在有或者没有人FSH(0.5μg/μL)的情况下在室温下孵育30分钟，使用StepOne Plus热循环仪(Applied Biosystems)以0.3℃的增量顺序地捕获荧光。T_m是基于熔融曲线的拐点计算的，热漂移由ΔTm＝T_mA–T_mB得出。

该测试产生了抗FSH抗体制剂，其包含2mg/mL的储备溶液，含20mM磷酸盐、0.001％(v/v)Tween-20、1mM NaCl和260mM蔗糖(pH＝6.58)。与在PBS中的抗FSH抗体相比，抗FSH抗体制剂的Fc和Fab区都显示出热漂移(ΔT_m)，表明抗FSH抗体制剂比PBS中更稳定(图8B)。测试了配制的抗FSH抗体与纯化的人FSH的结合。Fab而不是Fc区的ΔT_m为3.1℃，由于FSH结合而建立了较高的热稳定性(图8C)。此外，相对于在PBS中的抗FSH抗体，配制的抗FSH抗体显示出减弱的峰值信号(图8B)。这些结果表明，尽管添加的浓度相同(20μg/孔)，但较少数量的抗体分子经历去折叠-表明增强的稳定性。

为了进一步物理化学地表征配制的抗FSH抗体，进行了一系列的生化检测，即交叉相互作用色谱法(CIC)、自相互作用色谱法(SIC)、尺寸排阻色谱法(SEC)、疏水色谱法和多特异性测定。对于CIC和SIC，开发了内部NHS酯柱，与人IgG(用于CIC)或MS-Hu6(用于SIC)结合。抗FSH抗体在PBS和上述制剂中通过非结合柱，以及通过两个结合柱。如图8D和图8E所示，抗FSH抗体在各结合柱中的保留时间与非结合柱中的保留时间没有差异。这些结果表明，抗FSH抗体不会与其自身或与人IgG发生明显的相互作用，也表明少的聚集或没有聚集。

然后，使用丁基琼脂糖凝胶柱，抗FSH抗体在1.8M NH₂SO₄和0.1M Na₂PO₄中在pH6.5下在20分钟内以1mL/min的流量通过该柱。在280nm处监测UV吸光度，得到保留时间为7.1分钟(图8F)，低于11.2分钟的理论阈值(图7B)。

通过三次冻-融循环(从-80℃至室温)使在PBS和上述制剂中的抗FSH抗体经受压力，并在4℃、37℃或50℃下孵育1周，然后在所有情况下，进行SEC(图8G)。我们注意到一个主峰(#4)和三个次要的高分子量峰(#1至3)。对于在PBS和上述制剂中的抗FSH抗体而言，在所有条件下，峰1和2下的面积为总洗脱液的0％至0.91％之间。制剂中的抗FSH抗体的峰3总体保持为较低的(<1.5％)，但对于在PBS中的抗FSH抗体而言，在冻-融期间，峰3显著较高(高达12.7％)。此外，制剂中的抗FSH抗体的主峰4始终>99％，特别是与冻-融时的在PBS中的抗FSH抗体(87.2％)相比。综上，这些结果表明，即使在极端压力条件下，上述制剂也能防止聚集。将方案扩展至25mL洗脱液，在任何条件下都没有产生片段峰(图8G)。

其它实施方案

虽然已结合本发明的详细说明描述了本发明，但前述描述旨在进行说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。

Claims (29)

1.一种用于在有需要或处于风险的受试者中治疗阿尔茨海默病(AD)、预防AD的发作、减少认知或功能下降、或减少AD中的症状负荷的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗促卵泡激素(FSH)抗体或其抗原结合部分，其中所述抗FSH抗体、或其抗原结合部分包括：

(a)重链可变序列，其包括与选自SEQ ID NOs:3、11、13和15的序列为至少90％同一性的序列；

(b)轻链可变序列，其包括与选自SEQ ID NOs:4、12、14和17的序列为至少90％同一性的序列；

(c)重链CDR1(CDRH1)，其包括SEQ ID NO:5；

(d)重链CDR2(CDRH2)，其包括SEQ ID NO:6；

(e)重链CDR3(CDRH3)，其包括SEQ ID NO:7；

(f)轻链CDR1(CDRL1)，其包括SEQ ID NO:8；

(g)轻链CDR2(CDRL2)，其包括SEQ ID NO:9；和

(h)轻链CDR3(CDRL3)，其包括SEQ ID NO:10。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者具有FSH水平升高的状态。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述受试者为女性。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述受试者为男性。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述受试者为围绝经期的或绝经后的。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述状态为遗传病、化学疗法、手术绝经或睾丸切除术。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述遗传病为特纳综合征。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法在有需要的受试者中改变下述中的一项或更多项：

(a)减少大脑中的Aβ累积；

(b)减少大脑中的淀粉样斑块；

(c)减少大脑中的Tau累积；和

(d)增强认知功能。

9.根据权利要求8所述的方法，其中与受试者或对照中相应的参考水平相比，大脑中的Aβ累积、淀粉样斑块和Tau累积中的一者或更多者降低至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。

10.根据权利要求8所述的方法，其中如在选自由以下组成的组中的一种或更多种测试中所测定的，认知功能增强至少约20％、至少约30％、至少约40％、或至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％：阿尔茨海默病评定量表-认知分量表(ADAS-cog)；临床总体印象变化量表(CIBIC-plus量表)；简易精神状态检查(MMSE)；神经精神问卷(NPI)；临床痴呆评定量表(CDR)；剑桥神经心理自动化成套测试(CANTAB)；Sandoz老年临床评定量表(SCAG)，Buschke选择性提醒测试；言语配对联想子测试；逻辑记忆子测试：韦克斯勒记忆量表修订版(WMS-R)的视觉再现子测试；外显3选项强迫选择任务；和本顿视觉保留测试。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用选自由以下组成的组中的一种或更多种药剂同时治疗所述受试者：胆碱酯酶抑制剂，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，激素，维生素，抗精神病药，三环类抗抑郁药，苯二氮类药物，胰岛素，NGF、CERE-110、β-阻断剂、人淀粉样蛋白疫苗、β或γ分泌酶抑制剂、烟碱或毒蕈碱激动剂的腺相关病毒递送，和第二抗体。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述胆碱酯酶抑制剂选自由加兰他敏、卡巴拉汀、他克林和多奈哌齐组成的组。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述NMDA受体拮抗剂选自由氯胺酮、美沙酮、美金刚胺、金刚烷胺和右美沙芬或它们的盐组成的组。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗精神病药选自由阿立哌唑、利培酮、奥氮平、喹硫平或氟哌啶醇组成的组。

15.根据权利要求11所述的方法，其中所述苯二氮类药物选自由劳拉西泮、奥沙西泮和替马西泮组成的组。

16.根据权利要求11所述的方法，其中所述三环类抗抑郁药为去甲替林。

17.根据权利要求11所述的方法，其中所述药剂为选自由雌激素、黄体酮和亮丙瑞林组成的组的激素。

18.根据权利要求11所述的方法，其中所述药剂为选自由叶酸和烟酰胺组成的组的维生素。

19.根据权利要求11所述的方法，其中所述第二抗体选自由巴匹珠单抗、苏兰珠单抗、更汀芦单抗、克瑞组单抗、泊奈组单抗、BAN2401和阿杜那单抗组成的组。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗FSH抗体或其抗原结合部分皮下地、肌内地、静脉内地、鞘内地或颅内地施用至所述受试者。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗FSH抗体或其抗原结合部分以约0.2至50mg/kg受试者体重的剂量施用至有需要的受试者。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述抗FSH抗体或其抗原结合部分每周两次、每周、每两周、每个月、每两个月或每六个月施用至有需要的受试者。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述认知下降是通过使用阿尔茨海默病评定量表-认知(ADAS-Cog)测试确定所述受试者在施用所述抗FSH抗体或其抗原结合片段之前和之后的评分来评估的。

24.根据权利要求23所述的方法，其中如通过ADAS-Cog所测定的认知下降的减少相对于安慰剂为至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者患有轻度、中度或重度AD。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗是用于在所述受试者中完全地或部分地预防AD或其症状的预防性治疗。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗是用于在所述受试者中部分地或完全地治愈AD或与AD相关的症状的治疗性治疗。

28.一种药物组合物，其包括分离的抗促卵泡激素(FSH)抗体、或其抗原结合部分、以及药学上可接受的载体或赋形剂，其中所述组合物能够跨越血脑屏障从血液进入大脑，其中所述抗FSH抗体或其抗原结合部分包括：

(a)重链可变序列，其包括与选自SEQ ID NOs:3、11、13和15的序列为至少90％同一性的序列；

(b)轻链可变序列，其包括与选自SEQ ID NOs:4、12、14和17的序列为至少90％同一性的序列；

(c)重链CDR1(CDRH1)，其包括SEQ ID NO:5；

(d)重链CDR2(CDRH2)，其包括SEQ ID NO:6；

(e)重链CDR3(CDRH3)，其包括SEQ ID NO:7；

(f)轻链CDR1(CDRL1)，其包括SEQ ID NO:8；

(g)轻链CDR2(CDRL2)，其包括SEQ ID NO:9；和

(h)轻链CDR3(CDRL3)，其包括SEQ ID NO:10。

29.根据权利要求28所述的组合物，其用于在有需要或处于风险的受试者中治疗阿尔茨海默病(AD)、预防AD的发作、或减少AD中的认知或功能下降，其中所述组合物静脉内地、鞘内地或颅内地施用至所述受试者。