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CN1088758C - 标记试剂和测定方法 - Google Patents

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Abstract

一种试剂，它含有：a)含有至少两个分析物残基的分析物部分，它连接于b)含有一个或多个适于质谱法检测的报道基团的标记部分，其中报道基团标示出分析物残基，选择标记部分各个位置的报道基团用以标示分析物部分限定位置的分析物残基。多种各含有不同的分析物部分的这类试剂 可提供试剂库，此库可用于包括靶物质的测定方法中。对标记部分的分析可阐明与靶物质结合的分析物部分之特征。测定核酸序列的方法使用了试剂库以测定靶核酸的序列。

Description

标记试剂和测定方法
在生物和化学分析中，常规使用的是用报道基团标记的分析物分子。根据本发明提出的想法可提供试剂，它具有至少两个与一个或多个报道基团相连接的分析物基团。可以下述方式使用这种试剂以便比简单标记的分析物产生多得多的分析信息。可以编码报道基团以使带有多种分析物基团和多种报道基团的试剂能被组合合成并同时使用，而且报道基团可在分析阶段被分辨出。
WO 93/06121(Affymax)描述了合成的寡聚体库，它含有多种不同的成员，每个成员所包含的寡聚体由一系列单体组成，单体与寡聚体中鉴定单体序列的一个或多个鉴定标记物相连接。寡聚体和鉴定标记物之间的连接优选包含固体颗粒，鉴定标记物优选为寡核苷酸。
Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol 89，No，12，1992年6月15日，p5381-5383(S Brenner和R A Lerner)描述了用于制备各含有遗传寡核苷酸标记物的试剂的库的编码的联合化学过程。
在Rapid Communications in Mass Spectrometry，Vol 6，p369-372(1992)中，G R Parr等人描述了合成的寡脱氧核糖核苷酸之基质辅助的激光解吸/离子化质谱法。
在Nucleic Acids Research，Vol 21，No.15，1993年7月25日，p3347-3357中，E Nordhoff等人描述了核酸在红外基质辅助的激光解吸/离子化质谱法中的离子稳定性。
本发明一方面提供了一种试剂，它含有：
a)分析物部分，该部分含有至少两个分析物残基，并连接于
b)标记部分，此部分含有一个或多个适于通过质谱法检测的报道基团，不包括寡核苷酸，
其中报道基团标示出分析物残基，选择标记部分各个位置的报道基团用以标示在分析物部分的限定位置上的分析物残基。
优选分析物部分与标记部分通过可裂解(如可光裂解)的键相连接。也可以提供接头基团使分析物部分和标记部分都结合到接头基团上。优选分析物部分是n个分析物残基的链，标记部分是至多n个报道基团的链，选择标记链的各个位置的报道基团用以标示分析物链的相应位置的分析物残基。n是至少为2的整数，优选为3至20。
本发明可用于检测所有感兴趣的分析物，它们包括但不局限于蛋白质/肽链，从而分析物残基是氨基酸残基；核酸/寡核苷酸链，从而分析物残基是核苷酸残基；糖链，从而分析物残基是糖残基。另外，分析物也可以是具有生物学、药物学或治疗活性的一类小分子。例如，它可以是带有质谱标记的核心分子，该分子具有这样的能力，即可以组合的方式改变不同的取代基，如烷基、酯、胺、醚等。
标记部分和/或其中的报道基团或每个报道基团能被观察/检测/分析以便提供关于分析物部分和/或其中的分析物残基的特征的信息。
在一个实施方案中，试剂的化学式为A-L-R，其中A是构成分析物部分的n个分析物残基的链，L是接头，R是构成标记部分的至多n个报道基团的链，n是2-20，其中标记部分含有限定分析物部分的分析物残基之定位的信息。
标记部分由一个或多个质量有所区别的报道基团组成，因此可通过质谱法分析之。报道基团的化学特性也可能不相同，因此可通过分子量互相区别。或者报道基团可以化学特性相同，但是通过含有不同的同位素(例如下文讨论的12C/13C和1H/2H)可互相区别。标记部分和/或报道基团适于在例如通过光化学或其它方法从试剂中裂解出来后通过质谱法分析。
质谱法作为检测系统的优点在于：其高度敏感性——仅需要几百个分子就可得到良好的信号；其广泛的动力学范围和高分辨率——可分辨出质量范围为100至200,000道尔顿的分子，分辨能力超过0.01；其通用性——可容易地分析出多种不同化学结构的分子；通过将质谱法和例如扫描激光解析结合反映分析物的潜力；相对于仅定性测定而言，还具有定量测定的能力。
因此质量标记结合了放射性和荧光的优点，并且还对新的应用有贡献。
在另一方面，本发明提供了上述试剂的库，其中此库由多种试剂构成，每种试剂含有不同的具有n个分析物残基的分析物部分。例如，此库可由4n种试剂构成，每种试剂含有不同的具有n个核苷酸残基的寡核苷酸链。此库中的试剂可混合存在于溶液中。
在另一方面，本发明提供了一种测定方法，它包括下述步骤：提供靶物质；在导致至少一种试剂与靶物质结合的条件下，将靶物质与所说的试剂库一起保温；除去未结合的试剂；回收结合的试剂或每种结合的试剂的标记部分；分析回收的标记部分，以此作为与靶物质结合的分析物部分的特征的指示。
可将靶物质固定，因为这么做可提供一种便利的方法以将结合的和未结合的试剂分开。靶物质一方面可以是生物体或组织或细胞群体，可以进行测定以筛选候选药物族。靶物质另一方面可以是核酸，这一方面将在下文中详细讨论。
本发明还提供了一种测定装置，它包括：其上具有两个或更多个间隔位置的支持物；固定于支持物上间隔位置的靶核酸的单个克隆；与支持物上间隔位置上的靶核酸的各个克隆杂交的本发明的不同试剂。
参看附图，其中：
图1是根据本发明的试剂合成的一般性图解。
图2表示具有三个不同的含有报道基团的标记链体系的试剂。
图3a是显示编码的寡核苷酸的合成的图解。
图3b是显示阅读标记链密码子的图解。
图4是显示通过逐渐连接进行序列分析的图解。
图5是关于将通过杂交进行的序列阅读扩展为寡核苷酸测定的图解。
图1和2的图例包括在本说明书的末尾。
参照下述的实施例应用，它们描述了怎样应用该方法分析核酸序列以及筛选候选药物。编码标记物的合成
用于同时标记多种分析物的方法的原理类似于Brenner和Lerner(1992)提出的以结合的核酸序列编码肽类的方法原理。他们想法的意图是加入标记物，此标记物可通过聚合酶链式反应来扩增。并通过测定产生的DNA分子的序列来阅读。
通过考虑试剂是如何制成的可最好地阐明试剂的结构。合成是从二价或多价接头开始的，此接头可在一个方向上逐步延伸以在分析物上增加残基，在另一方向上逐步延伸以增加残基特异性的报道基团(图1)。假设我们希望制备有机化合物的混合物，在合成的每个阶段引入不同的残基。例如，混合物可含有一组具有不同氨基酸序列的肽类或者一组具有不同碱基序列的寡核苷酸，或者一组具有潜在的药理活性的变异体，其核心结构上结合有不同的基团；在每种情况下，我们都希望用独特标记物标记每种结构变异体，通过分开各步骤中的合成并给标记物增加相应的残基可实现这一目的，在各步骤中不同的残基被增加到感兴趣的化合物上。
例如，假设我们希望制备4096种每种带有独特标记物的六核苷酸混合物，应将二价接头的四个样品与每种碱基和碱基的独特报道基团相偶合(图3a)，然后混合四种样品，分成四份并重复此过程。结果可得到一组二核苷酸，其中每种具有独特标记物，重复此过程直到完成六个偶合步骤。接头和报道基团
接头应具有一个适于分析物合成的基团-羟基、氨基或巯基都适于启动寡核苷酸的合成，已发现类似的基团可启动其它途径，例如多肽类的合成。对于一些类型的化合物而言，可能需要从形成分析物的一部分的“核心”化合物开始。启动加入报道基团的基团选择取决于报道基团的特征以及用来偶合它们的化学过程，这种化学过程不得不与用来合成分析物的化学过程相匹配。对于寡核苷酸合成的例子而言，有多种选择。确定的方法使用苯甲酰基和异丙基以保护碱基，用酸不稳定性的三苯甲基以在偶合过程中临时保护5′-OH基团，使用β-氰基乙基以保护磷酸酯。用以偶合报道基团的方法不会进攻这些保护基团或寡核苷酸中的其它键，标记物的合成不会受到寡核苷酸的延伸中所用的偶合、氧化和脱保护的影响。
报道单体的偶合或链的加帽在各个步骤中都可能是不完全的(图2的B和C)，所以分析物偶合于嵌套的一组报道基团结构。这可以使从标记的组成推导分析物的结构变得较容易(图1；图3)。为了使合成变得较容易，接头需要通过连接，结合于固体支持物上，此连接可在不使分析物或报道基团降解的情况下被裂解。或者，此接头可带有能从试剂中分离中间体和终产物的基团，例如带电基团或亲脂基团。
报道基团可以有多种形式，主要的考虑是需要通过质谱法阅读此标记物的组成或序列。可能性包括具有不同原子或分子量的基团，例如不同长度或不同同位素组成的脂族链。使用同位素标记的亚甲基可以给四种不同报道基团中的每一种分配一组独特的式量(表1)。表1基于H和C同位素的报道基团的例子：
同位素组成 式量(-OCH2) 符号    碱基
12CH2 12CHD，13CH2；12CD2，13CHD13CD2     30313233     r30    Ar31    Cr32    Gr33    T
以寡核苷酸为例，这些标记物可以成套，它允许从系列中的部分产物之增长的质量中读出寡核苷酸中各个位置的碱基(表2)。假如加入报道基团的最小增长比最小和最大报道基团之间的质量差异要大的话，那么所有寡核苷酸序列都会给出独特系列的标记物片段重量。表2具有同位素报道基团的寡核苷酸的例子：
Figure C9419344200131
对于质谱法而言，将需要有一简单方法从分析物中裂解标记物链，有几种可能性，在这些方法中适于寡核苷酸和肽分析物的是：光不稳定性键的光引发裂解；酶裂解，如酯键的酶裂解；自由基引发的裂解。
进一步的需要是标记物应适合分析中所用的化学和生化过程：对于分子杂交中所用的寡核苷酸的例子或所提出的测序方法之一而言，它们必须是可溶的，必须不抑制分析中可能使用的某种酶解反应。经验表明，类似于表1中所示的亚甲基类似物的低聚乙二醇连接适于寡核苷酸的分子重缔合。另外这种连接至少适于一些酶解反应，正如我们已经表明的那样，通过六乙二醇接头束缚到玻璃上的寡核苷酸经用多聚核苷酸激酶和ATP处理可转变成5′-磷酸单酯。接头的所需特征
为了设想的应用，接头分子具有下列特征是必需的：
应可以将之与固体支持物相连接以允许进行可产生分析物和相应标记物的合成循环，而无需烦琐的中间体纯化。合成循环之后，应在保持分析物和标记物完整的条件下从固体支持物上除去接头。标记物合成的功能基团应是那些允许标记物的快速合成的基团，标记物可通过质谱法相互区别。
接头应具有被保护的功能基团，它分别允许分析物和标记物的延伸，所用条件是其中一个的化学过程不会干涉另一个的化学过程。
接头应优选带有带电的基团以使在没有基质时可进行质谱分析。除了这一目的外，还要求标记物应含有挥发性足够好的化合物以便能在质谱仪中蒸发，而不需求助于复杂的技术，如电喷射。标记物应产生稳定的离子，或产生断裂为可被用于鉴定相应分析物的特征模式的离子。
标记物和分析物之间的接头应优选可被光裂解，以使标记物可通过激光照射在质谱仪中直接裂解，通过暴露于灯下可方便地进行进一步的裂解以完全除去它们从而允许诸如连接之类的生化步骤。
连接产物应优选可溶于含水溶剂中以使它们可用于生化反应中。
本文所述的实施例中显示了具有这些所需特性的接头。可光裂解的基团
光裂解的基团根据的是已知的光不稳定性邻硝基苄基。此基团在寡核苷酸合成[见Pillai Synthesis 1(1980)的综述]中已被用作磷酸酯基团和2′-羟基基团这两者的保护基团。对于标记物和分析物之间接头的随后的结合而言，邻硝基苄基自身缺乏进一步的功能化。可购得的是化合物5-羟基-2-硝基苄醇。已知可在5，4位加上OMe基团，而不会显著降低光不稳定性特性(见Pillai的综述)，因此，可将5-羟基-2-硝基苄醇用作起始点，目的是从苄醇处延伸DNA合成，来自醚的标记物与接头链在5-羟基处偶合。
对于存在的功能性基团而言，需要允许分析物和标记物的组合合成，因此对于标记物的合成而言，从可光裂解的基团至所需的功能基团都需要接头臂。还优选在固体支持物上进行组合合成，因此接头臂在功能基团中必须是二价的，并具有邻位的保护基团以允许选择性合成转化。优选的标记试剂含有二醇连键/醚连键。为了合成的目的，通常可通过3′-羟基和琥珀酸酯连键将寡核苷酸与长链氨基CPG支持物相连接。因此相信所需的功能基团是醇。
已合成了下列中间体化合物：它包含芳香族的接头，此接头带有：用于分析物合成的甲氧基三苯甲基(-CH2ODMT)；
用于光裂解的邻硝基；
用于标记物合成的O-叔丁基二苯基甲硅烷基(OTBDPS)：
用于转变成带正电基团以用于质谱分析的叔胺基团；
用于与支持物结合的N-羟基琥珀酰亚氨基。
当分析物为肽时，需考虑的条件变化很小。在肽合成的大多数条件下，2-硝基苄基是稳定的，此基团和相关的类似物在肽合成(见Pillai的综述和其中包含的参考文献)中已被用作光不稳定性基团。已有几种树脂适于具有不同裂解模式的肽合成。分析物和标记物合成的邻位保护基团可以叔丁氧羰基和2-甲氧基乙氧基甲基为基础。可使用叔丁氧羰基保护氨基酸中的氨基，通过用三氟乙酸处理将其裂解。可使用2-甲氧基乙氧基甲基保护如前所述的以1，n烷基二醇衍生物的质量差异为基础的标记基团和标记物。已经表明叔丁氧羰基的裂解与2-甲氧基乙氧基甲基保护基团可以匹配。可用溶于二氯甲烷中的溴化锌选择性地裂解2-甲氧基乙氧基甲基保护基团。尽管上文阐明了步骤，但本领域技术人员应认识到这组邻位保护基团不会以任何方式限制本发明，它只是作为代表性的例子。报道基团的检测和分析
光裂解是从分析物中释放标记物的理想方法；它快速，可以在干态下进行，可使用扫描激光在很小的范围内反映，范围小到足以反映细胞内的特征(de Vries等人，1992)，从而可使用提出的方法检测定特定分析物的位置，此分析物已被用于“染色”细胞或组织切片中的不同细胞的表面或内部，如可能需要它们来反映配位体(如候选药物)和它们的受体之间的相互作用。
光敏保护基团对于很宽范围的化学残基都适用[Pillai的综述，1980]。可用作广泛范围的化合物之保护基团的光不稳定性邻硝基苄基形成了可设想出的许多分析物的理想的接头起始点，其中包括肽类和寡核苷酸。以寡核苷酸为例，它提供了光敏连键，此连键可定量断裂产生羟基。如在下文测序方法中所述，它可允许在连接延伸中产生脱保护的寡核苷酸。另外已知此基团在寡核苷酸合成过程中是稳定的。有必要修饰苄基环以提供可用以启动标记物合成的基团；诸如上述低聚乙二醇系列的报道基团不会干涉邻硝基苯甲酰基的光化学裂解反应(Pillai op.cit.)。在增强裂解的芳香环中可加入其它基团；可利用这种基团中加入带电基团以简化质谱仪中的分析。现代质谱仪可测定几百个分子，分辨能力超过0.01道尔顿，至高可达总质量200kD。因此优选的光不稳定性接头可表示为：其中带正电的基团R可与芳香环直接结合或存在于其中一个接头臂中：
Figure C9419344200171
仪器的使用
可通过几种质谱法形式中的一种分析提出的分子标记物。对于多种目的而言，尽管需要从分析物中裂解标记物，却不需要使标记物成为片段，事实上因为它会导致模棱两可而不合要求。质谱法的最新进展使得可以测定很大的分子而无需太多断裂；由于可以设计接头以使它在其余标记物稳定的条件下易于裂解，测定过程中应能够避免标记物的断裂。在大多数情况下分析物基团的挥发性比标记物要差，在许多应用中分析物基团会与固体底物结合，因此可防止它对质谱的干涉。
在不会导致绝大多数共价化学键断裂的条件下，光子照射使上述接头很不稳定。适当的仪器已被描述[de Vries等人，1992]，它使用激光，该激光可聚焦成小于1μm的点。通过移动可定位至0.1μm的镜台可扫描出至多250mm的象。
此仪器还可使待测物种离子化，此离子化是通过将离子化激光扫过镜台表面照射以使它与解吸附激光所破碎的物种相互作用。如果它不可能包括标记物中的带电残基，或者如果对于读出标记物来说断裂是必需的，那么此仪器可用于本方法。
本发明另一方面提供了测定靶核酸序列的方法，此方法包括下列步骤：
a)提供固定于支持物上的寡核苷酸，
b)使靶核酸与固定化的寡核苷酸杂交，
c)将来自b)的杂交体与如上定义的试剂库一起温育，库中的试剂都混合于溶液中，温育可使库中第一试剂的寡核苷酸链与相邻于固定化寡核苷酸的靶核酸杂交。
d)连接相邻的寡核苷酸，从而形成连接的第一试剂，
e)除去其它未连接的试剂，和
f)回收并分析连接的第一试剂的标记部分以作为靶核酸的第一部分的序列的指示。
实施例应用
通过参考将编码寡核苷酸用于核酸分析的方法，我们阐明了本发明可能的应用。1.通过逐渐连接确定核酸序列(图4)
在步骤b)中需确定的序列首先与结合于固体支持物上的寡核苷酸杂交。如果需测序的DNA已被克隆进如噬菌体M 13的单链载体中，则可将固体支持物上的“引物”寡核苷酸选择成载体序列的一部分。在步骤c)中，将携有来自步骤b)的杂交体的固体支持物与编码的寡核苷酸试剂的溶液一起温育，例如与上述文库一起温育，此文库含有所有给定长度的序列，比如4096六核苷酸(通常为4nn聚体)。在步骤d)中，引入连接酶以使互补于靶DNA的开始六个碱基的六核苷酸与固定化的引物寡核苷酸相连接，通过此步骤通过将其寡核苷酸链与固定化的引物寡核苷酸相连接可使来自库中的第一编码的寡核苷酸试剂连接起来，这里指的是连接的第一试剂。
在步骤e)中，例如通过洗涤可除去未连接的试剂。在步骤f)中，连接的第一试剂之接头被断裂以解除标记链，回收并分析之以作为靶DNA的第一部分的序列的指示。
优选的，接头的除去也暴露了第一寡核苷酸链末端的羟基或磷酸基团，以使它适于与第二试剂的寡核苷酸链相连接。包括光化学、酶促和化学水解的几种断裂接头的方法可以被用以产生进一步的连接所需的3′-羟基或5′-磷酸基团。然后重复步骤c)、d)、e)和f)。这些步骤包括库中第二试剂的杂交，连接的第二试剂的标记链的连接回收和分析以及进一步连接所需的另一个3′-羟基或5′-磷酸基团的产生。重复此步骤直至所有DNA序列被读出或者直至反应产率很低以致毫无用处。
图4所示为此序列的四个时相。第一示图相应于第一轮循环中步骤e)末期的状况，第二示图相应于步骤f)末期的状况，第三示图相应于第二轮循环中步骤c)末期的状况，第四示图相应于第二轮循环中步骤d)末期的状况，此技术的循环特征已经显示出。2.通过相继的连接测定多种模板的核酸序列
作为第一个例子的扩展，可设想能够同时分析多个序列，例如，可将需测序的DNA的各个克隆固定化：
a)使用一系列针状物，将相同的载体寡核苷酸固定于每个针状物的末端，使靶DNA的单个克隆与固定于每个单个针状物上的寡核苷酸杂交。然后将携有这些杂交体的一系列针状物与溶液中的编码的寡核苷酸试剂的试剂库一起温育，此溶液中还含有直接成分。这一步骤的结果是每个针状物携有不同的连接的试剂，最后，如前所述回收和分析每种连接的试剂的标记链。如果将此系列针状物适当地间隔开，就可以将它们浸入微量滴定板的孔中，第一块板含有需测序的模板，第二块板含有试剂库和连接溶液，第三块板含有裂解来自针状物的标记链的试剂。
b)或者，用引物寡核苷酸包被表面，优选通过其5′末端或在其它的一些位点共价结合于表面。需测序的DNA的单个克隆位于被包被的支持物上的间隔位置，从而靶DNA的各个单独的克隆与固定于支持物上单个间隔位置的寡核苷酸杂交，然后将支持物与含有试剂库和连接成分的溶液一起温育，除去未连接的试剂，再裂解处于每个间隔位置的连接的试剂的接头并回收和分析标记物。优选通过例如激光解吸的方法来导致裂解，此方法能定位于表面上很小的区域。此方法的优点是可同时分析大量DNA序列。3.通过与寡核苷酸杂交扩展序列测定法a)方法I
已成功建立了以高密度将DNA点样于膜上的方法[Hoheisel等人，1992；Ross等人，1992]。为了测定指纹和序列，必须或单个地或以小套使用寡核苷酸，以使杂交模式不会太复杂以致于不能解释；结果，在分析的各轮循环中只有小部分的模板可产生信号。如果每次杂交的信号含有编码的信息，此信息使得其序列可被测定，可使用更复杂的混合物，在杂交的各轮循环中可搜集到更多的信息。混合物的复杂度依据DNA模板的长度以及分辨混合的寡核苷酸序列的分析方法的能力。
由这些质谱标记物或报道基团编码的核酸探针非常有用，其中使用多种探针是有利的，例如在DNA指纹或突变分析中。质谱标记物可提供多用性的优点。
在典型的核酸杂交测定中，可同时使用大量不同的探针，每个探针标记有其自身独有且适当的质谱标记物。由于质谱中标记物的分离和分辨，在其它探针的存在下，可独特地测出每个进行杂交的单个探针的序列。
本发明在此方面提供了测定靶核酸序列的方法，此方法包括下列步骤：
i)提供固定于支持物上的靶核酸，优选将靶核酸的单个克隆间隔地固定于支持物上。
ii)将来自i)的固定化的靶核酸与多种上述编码的寡核苷酸试剂一起温育，以使不同试剂的寡核苷酸链与支持物上的靶核酸杂交。
iii)除去未杂交的试剂，和
iv)回收并分析每种试剂的标记部分以作为部分靶核酸序列的指示。
下文优选使用试剂库，循环地重复杂交、连接、裂解和分析步骤以提供靶核酸序列的其它有关信息。b)方法II
当核酸与一系列寡核苷酸杂交时，可从所形成的双螺旋模式测出核酸序列。可被测定的序列长度大约为系列大小的平方根：如果使用所有65,536八核苷酸的系列，则待测定的序列应为200bp左右[Southern等人，1992]。通过将需测定序列中连续出现八个碱基的频率限制为不超过一次即可强加对大小的限制。国际专利申请WO 89/10977中描述了序列测定中的系列及其用途；国际申请WO 90/03382中描述了提供一系列通过例如其5′-末端或3′-末端固定于表面的寡核苷酸的方法。
通过本发明的方法，能大大延伸可被测定的序列长度。在本发明的此方面，此方法包括下列步骤：
a)提供固定于支持物上间隔位置上的一系列寡核苷酸，在某一位置上的寡核苷酸与在其它位置的寡核苷酸不同。优选该序列为通过共价键固定于支持物上的各个间隔位置的寡核苷酸的序列，
b)将靶核酸与一系列固定化的寡核苷酸一起温育以便在支持物上的一个或多个间隔位置上形成杂交体，
c)将来自b)的杂交体与编码的寡核苷酸试剂库一起温育以使库中试剂的寡核苷酸链与相邻于每个固定化寡核苷酸的靶核酸杂交，
d)连接相邻的寡核苷酸，从而在支持物上的一个或多个间隔位置上形成连接的试剂，
e)除去其它未连接的试剂，和
f)回收并分析每种连接的试剂的标记部分以作为部分靶核酸序列的指示。
优选使用激光以通过光化学产生每个间隔位置上的标记链的裂解。优选通过质谱法分析标记链。优选如上所述循环重复杂交、连接、裂解和分析步骤以得到靶核酸序列的其它有关信息。
构成图5的四个示图中显示了优选的操作顺序，第一示图表示步骤b)开始时的状况，第二示图表示步骤b)结束时的状况，此时靶核酸的一部分已经与形成系列一部分的被束缚的寡核苷酸杂交。第三示图表示步骤c)结束时的状况。第四示图表示步骤d)结束时的状况；库中的试剂已经与靶核酸杂交并连接于固定化的寡核苷酸上。
已知方法的这种扩展的结果是显著的，假如用于读出标记物的方法能分辨混合物，那么以相等于系列中寡核苷酸长度的长度延伸一次即可平方可读出的全长。在这种情况下可从由8个碱基延伸的一系列八核苷酸读出的长度大约为60,000个碱基。杂交分析和标记寡核苷酸的比较：a)以凝胶为基础的方法
最先进的自动化序列分析仪器每天可读出大约40000个碱基，这不包括提供凝胶上的反应所需的生物学和生物化学过程的时间。如果我们假定表面所用模板的密度为每平方毫米1个[Hoheisel等人，1992；Ross等人，1992]，那么100×100mm的面积之上可使用10000个模板。杂交后每个孔中可能有几个fmol的标记寡核苷酸，因此单次znsec脉冲的激光即可释放出足够的标记物以便阅读，但是即使我们假定需要100次脉冲，则读出一个孔的总时间是几毫秒，那么所有10000个孔可以在几分钟之内读出。如果寡核苷酸是六聚物，则所得的原始数据为60000个碱基。对于序列测定而言，由于从凝胶上可读出更长的连续长度，它就不会象凝胶上相同原始数据那样更有信息。如果可通过分析的再次循环延伸从系列中读出的序列，凝胶的优点当然会失去，然而以系列物为基础的方法的主要优点在于它能使数以千计的模板同时被分析的平行性；凝胶的宽度将可在凝胶上分析的模板数目限制为少于50。b)本发明的以系列物为基础的方法
现存的以系列物为基础之方法的主要缺点是：a)从大小为N的系列物中读出的序列仅约等于
Figure C9419344200231
以致系列物的大多数孔无法读出，通过加入标记寡核苷酸，系列物的占有率接近完全，以致大多数孔的信息都可得到，原因是来自标记物的其它信息有助于除去由于靶系列中短系列的大量出现而导致的模梭两可(表3)。
b)通过杂交从每个与寡核苷酸的相互作用中读出的序列长度必须受寡核苷酸长度的限制，这会导致阅读重复序列如连续的单个碱基的困难，通过连接的延长阅读只要可由重复连接所横越，则可允许多次的阅读。
c)在本测定方法中，放射性的敏感性高但分辨能力差，荧光的敏感性差但分辨能力高；这两种方法都相对较慢。使用质谱法的建议可改善分辨能力、速度和敏感性，并可提高读出标记物序列的潜力。表3.通常，可由分布于空间节段系列上的模板测定的序列约为即2L，其中L是通过寡核苷酸读出的连续长度的总和。它包括实施例3b而不是实施例2中的固体支持物上的寡核苷酸的长度。L                      2L12                     409614                     1638416                     6553618                     2262144具有潜在的药理活性的分析物
很多药物是组织特异性的。它们的作用经常依赖于与细胞表面受体的相互作用。有些药物家族根据的是核心结构；例如有几个含有短肽。跟踪候选药物以观察它们所瞄准的细胞或组织是有用的，同时跟踪许多不同的候选药物也是有用的。使用经编码的质量标记物标记的分析物库可在质谱仪中通过检查细胞或组织来跟踪相互作用。如果用光不稳定性保护基团结合标记物，即可使用扫描激光裂解，经质谱法偶合以反映整个动物或组织切片。
下列实施例将进一步阐明本发明。
根据下列反应图解1，实施例1至6显示了合成含有芳香族接头的化合物(8)的步骤，此接头带有：用于分析物合成的甲氧基三苯甲基(-OH2 ODMT)；用于光裂解的邻硝基；用于标记物合成的O-叔丁基二苯基甲硅烷基(OTBDPS)；用于转变为带正电基团以供质谱法分析的叔氨基；以及用于结合至支持物上的N-羟基琥珀酰亚氨基。
实施例7和8表示根据下列反应图解2的随后的步骤。
实施例9和10表示根据下列反应图解3制备基于丙烷-1，3-二醇的报道基团(13)的步骤。
实施例11至13表示根据下列反应图解4，涉及将保护的丙烷-1，3-二醇残基作为报道基团结合至化合物(6)的步骤。
实施例14至19描述了根据本发明的各种试剂的制备、鉴定和使用。一般细节
5-羟基-2-硝基苄醇购自Aldrich长链烷氨基可控孔度玻璃购自Sigma。无水溶剂指氮气氛下包装的Aldrich Sure Seal级物质。三乙胺用氢化钙预蒸馏并在使用前在氮气中存放。其它溶剂和试剂可从市场购买。
1H-NMR在Jeol 270MHz机上得到，用指定的溶剂并用四甲基甲硅烷作参照物。
红外在Nicolet 5DXC F.T.IR仪上得到，如指明的那样要么为溴化钾片要么为氯仿溶液。
熔点在Gallenkamp熔点仪上得到且未经校正。
Tlc在Kieselgel 60F254铝负载的Tlc板上用指明的溶剂体系进行。该板用紫外光显色和/或浸于3％w/v磷钼酸的乙醇溶液中然后用热气枪加热而显色。含三苯甲基的物质显示为亮橙色斑点，醇类为蓝色斑点。
硅胶色谱法采用闪级硅胶，粒度40-63μm进行。
用于反应图解和文本中的缩写：
DMT       -  4，4′-二甲氧基三苯甲基
THF       -  四氢呋喃
TBDPS     -  叔丁基二苯基甲硅烷
DMAD      -  4-二甲氨基吡啶
DCCI      -  二环己基二碳化二亚胺
CH2Cl2  -  二氯甲烷
CPG       -  可控孔度玻璃
MeI       -  碘代甲烷
Tresyl    -  2，2，2-三氟乙磺酰基
                实施例1
5-羟基-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2-硝基苄醇(化合物2，图解1)的合成
往溶于无水吡啶(40ml)中的5-羟基-2-硝基苄醇(5.11g，30.2mmol)中加入4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(10.25g，30.2mmol)并将烧瓶塞好。然后在室温下搅拌反应混合物共72小时。T.l.c.分析(乙醚/石油醚40-60℃，65％/35％)显示新的含三苯甲基的物质(RF 0.27)存在且原料醇消失。然后将吡啶旋转蒸发除去，最后一点通过与甲苯(×2)共蒸除去。将产生的胶状物溶于乙酸乙酯中，溶液用水(×1)和盐水(×1)洗涤。乙酸乙酯溶液然后用无水硫酸镁干燥并蒸发得到红棕色胶状物。将此胶状物溶于CH2Cl2(20ml)然后加至硅胶柱(14cm×6.5cm)上，用乙醚/石油醚40-60℃，65％/35％洗脱。将产物级分合并，旋转蒸发除去溶剂得到灰白色固体(13.49g，95％，mpt.80-82℃，分解)。分析样品通过用氯仿/石油醚40-60℃重结晶制备，mpt.134-7℃，分解。1H NMR(270MHz，CDCl3δ)：3.79(s，6H，DMT-OCH3)，4.63(s，2H，CH2-ODMT)，6.77-6.85(m，5H，芳基)，7.22-7.49(m，9H，芳基)，7.63(s，1H芳基)，8.06(d，1H，J＝9.06Hz，芳基).IR(KBr片)，1610，1509，1447，1334，1248，1090，1060，1033，828cm-1.
                实施例2
O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-5-[1-(3-溴-1-氧基丙基)]-2-硝基苄醇(化合物3，图解1)的合成
往溶于丙酮(150ml)中的化合物2(10.18g，21.6mmol)中加入1，3-二溴丙烷(11ml，108mmol)和碳酸钾(4.47g，32.3mmol)然后在80℃下加热反应混合物共3小时，然后在室温再搅拌16小时。T.l.c.分析(乙醚/石油醚40-60℃，60％/40％)显示原料完全消失，而形成两种新的含三苯甲基的物质；RF 0.48  占多数，RF 0.23占少数。然后通过旋转蒸发除去丙酮，将所得残余物分配在水和二氯甲烷中。分出二氯甲烷溶液并用盐水洗涤。然后将二氯甲烷溶液用无水硫酸镁干燥并蒸发成胶状物。将胶状物溶于20ml二氯甲烷中，然后加至硅胶柱(6.5cm×14cm)上，用乙醚/石油醚40-60℃，60％/40％洗脱。将纯产品级分合并，旋转蒸发除去溶剂，得到化合物3，为白色固体(8.18g，64％，mpt.132-4℃，RF0.48乙醚/石油醚40-60℃，60％/40％)。小量样品用乙酸乙酯/石油醚重结晶用于分析，mpt.132-4℃。1H NMR：(270MHz CDCl3，δ)：2.40(m，2H，-CH2-CH2-CH2-)，3.64(t，2H，J＝6.32Hz，CH2Br)，3.79(s，6H，OCH3)，4.27(t，2H，J＝6.04Hz，-OCH2CH2)，4.66(s，2H，Ar CH2ODMT)，6.84(d，4H，J＝8.79Hz，DMT芳基)，7.20-7.50(m，10H，9DMT芳基，1芳基)7.68(s，1H芳基)，8.1(d，1H，J＝9.06Hz，芳基).IR(KBr片)1608，1577，1511，1289，1253，1230，1174，1065，1030cm-1.
                实施例3
N-[O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2-氧基乙基)]-N-(2-羟乙基)胺(化合物5，图解1)的合成
在N2气氛下，往氢化钠(0.76g，60％的油分散体，19mmol)中加入无水THF(15ml)，接着以允许的氢生成速度加入二乙醇胺(2g，19mmol)在THF(30ml)中的浆状物。然后在N2气氛下于室温下搅拌反应混合物30分钟，在此期间形成灰色沉淀。产生的烷氧化物用加入叔丁基氯二苯基甲硅烷(4.95ml，19mmol)处理，接着在N2气氛下，将反应混合物在室温下搅拌2小时。T.l.c.分析(乙酸乙酯)显示产生了两个相对于原料为新的UV正性斑点，较多的为RF 0.05较少的为RF0.60。通过旋转蒸发除去THF，将残余物溶于0.1M碳酸钠溶液中。然后用乙酸乙酯(×2)萃取产物。再将乙酸乙酯萃取液合并，用盐水(×1)洗涤。然后将乙酸乙酯溶液用无水硫酸镁干燥，蒸发成油状物。将此油状物加至硅胶柱上，用氯仿/甲醇，90％/10％洗脱，合并RF 0.33的级分并旋转蒸发得到化合物5，为白色晶状固体(3.93g，60％，mpt.73-75℃)。少量样品用乙酸乙酯/石油醚40-60℃重结晶用于分析，mpt.76-77℃。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)：1.06(s，9H，tBu)，2.13(brs，1H，OH，D2O可交换的)，2.78(m，4H，CH2NHCH-2)，3.63(t，2H，J＝5.22Hz，-CH2OSi-)，3.78(t，2H，J＝5.22Hz，CH2OH)，7.40(m，6H，芳基)，7.66(m，4H，芳基).IR(KBr片)3100，1430，1114，1080，969，749，738，707cm-1.
                实施例4
N-[O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2-氧基乙基]-N-[O-(3-(O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-1-氧基甲基)-4-硝基苯基)-3-氧基丙基]-N-(2-羟基乙基)胺(化合物6，图解1)的合成
往溶于1-甲基-2-吡咯烷酮(65ml)的化合物3(7.46g，12.6mmol)中加入化合物5(8.63g，25.2mmol)。然后将反应混合物在80℃加热5小时，冷却后在室温再搅拌16小时。T.l.c.分析(乙酸乙酯)显示形成了含三苯甲基的新物质，即RF 0.51和残量的两种原料。将反应混合物倒入水(600ml)和盐水(100ml)的混合物中，产物用乙酸乙酯(3×200ml)萃取。然后合并乙酸乙酯萃取液，并用无水硫酸镁干燥。旋转蒸发除去乙酸乙酯得到棕色胶状物，它缓慢形成晶状产物。加入最小量的乙酸乙酯溶解残留的胶状物以使晶状产物可被滤出，化合物5的氢溴酸盐。然后将乙酸乙酯溶液置于硅胶柱(13cm×6.5cm)上，用乙酸乙酯洗脱。从此柱得到不充分地分离的残留的化合物3和所需的产物，将产物级分合并，蒸发成胶状物。将此胶状物溶于所需的最小量乙酸乙酯中，并置于另一硅胶柱(14cm×6.5cm)上，用梯度洗脱液洗脱，先用乙酸乙酯/石油醚40-60℃，50％/50％，接着用乙酸乙酯。合并产物级分，旋转蒸发除去溶剂得到胶状化合物6。最后的微量溶剂通过将胶状物放在高真空中1小时而除去。产物的产量为7.64g，71％。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)：1.04(s，9H，tBu)，1.97(m，2H，-CH2CH2CH2-)，2.7(m，6H，NCH2)，3.56(m，2H，CH2OH)，3.75(m，2H，CH2OSi)，3.78(s，6H，DMT-OCH3)，4.12(m，2H，ArOCH2CH2)，4.64(s，2H，ArCH2ODMT)，6.74-6.85(m，5H，芳基)7.2-7.65(m，20H，芳基)，8.05(d，1H，芳基).IR (KBr片)，1608，1579，1509，1287，1251，1232，1112，1092，1064，1035，826，754，703，613cm-1.
                实施例5
N-[O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2-氧基乙基]-N-[O-(3-(O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-1-氧基甲基)-4-硝基苯基)-3-氧基丙基]-N-[O-(3-羧基丙酰基)-2-氧基乙基]胺(化合物7，图解1)的合成
往溶于无水二氯甲烷(40ml)和无水吡啶(50ml)中的化合物6(5.64g，6.59mmol)中加入琥珀酸酐(2.06g，20.6mmol)和二甲氨基吡啶(210mg，1.72mmol)，将烧瓶塞住。然后将反应在室温搅拌共72小时。T.l.c.分析(甲醇/乙酸乙酯，10％/90％)显示形成了含三苯甲基的新物质RF 0.45，且原料消失。旋转蒸发除去溶剂，最后的微量吡啶通过与甲苯(×2)共蒸发除去。然后将所得胶状物分配在氯仿和水中。分出有机相，水相再用氯仿(×1)萃取。然后合并有机相并用盐水(×1)洗涤。氯仿溶液用无水硫酸镁干燥并蒸发成胶状物。最后的微量溶剂通过将胶状物放置在高真空中1小时而除去，得到化合物7，6.75g。该产物不需进一步纯化即可用于下一步。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)：1.0(s，9H，tBu)，1.9(m，2H，CH2CH2CH2)，2.5(m，4H，COCH2CH2COOH)，2.7(m，6H，N-CH2)，3.7(m，2H，CH2OSi)，3.75(s，6H，DMT-OCH3)，4.1(m，4H，CH2OCO和Ar-OCH2CH2，5.6(s，2H，ArCH2ODMT)，6.7(d，1H，芳基)，6.8(d，4H，芳基)7.2→7.7(m，20H，芳基)，8.02(d，1H，芳基).IR(CHCl3溶液)1736，1608，1579，1509，1288，1251，1232，1175，1158，1112，1093，1065，1035，755，703cm-1.
                实施例6
N[O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2-氧基乙基]-N-[O-(3-(O-(4，4-二甲氧基三苯甲基)-1-氧基甲基)-4-硝基苯基)-3-氧基丙基]-N-[(O-(琥珀酰基-(3-羧基丙酰基)))-2-氧基乙基]胺(化合物8，图解1)的合成
往溶于无水二氯甲烷(30ml)中的化合物7(2.99g，3.13mmol)中加入二环己基碳化二亚胺(0.710g，3.45mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(0.396g，3.44mmol)，将烧瓶塞住。然后将反应混合物在室温拌18小时，在此期间形成白色沉淀。将白色沉淀滤出，用水(×1)和盐水(×1)洗涤二氯甲烷溶液。然后将二氯甲烷溶液用无水硫酸镁干燥，将溶剂旋转蒸发，得到泡沫体3.26g(99％)。T.l.c.分析(乙酸乙酯)显示只有一种含三苯甲基的物质RF 0.74，没有明显的抑制。通过将少量物质流过硅胶柱提供分析样品的企图导致活性酯分解回到酸(化合物7)。此物不需进一步纯化而用于所有的后续装置中。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)：1.04(s，9H，tBu)，1.97(m，2H，CH2CH2CH2)，2.50→2.75(m，6H，琥珀酰基CH2+-OCCH2)，2.76-2.86(m，6H，NCH2)，3.08(m，2H，CH2CO2琥珀酰基)，3.77(s，6H，DMTOCH3)，3.86(m，2H，CH2OSi)，4.1→4.2(m，4H，ArOCH2+CH2O2C)，4.63(s，2H，ArCH2ODMT，6.7→6.9(m，5H，芳基)，7.01→7.7(m，20H，芳基)8.05(d，1H，芳基).IR(KBr片)，1742，1713，1509，1288，1251，1211，1175，1090，1067cm-1.
                      图解1
                      图解1(续)
Figure C9419344200331
                实施例7
衍生的长链烷氨基可控孔度玻璃(化合物9，图解2)
长链烷氨基可控孔度玻璃(Sigma Chemical  Co，3.5g)用溶于二氯甲烷(50ml)的三氯乙酸(1.5g)预处理2.5小时，用等份的二氯甲烷(共100ml)和无水乙醚(共100ml)洗涤，真空干燥。然后往CPG支持物中加入无水吡啶(35ml)，二甲氨基吡啶(42mg，344μmol)，三乙胺(280μl，201mmol)和化合物(8)(见图解1)(736mg，700μmol)。然后将混合物轻轻搅拌18小时，之后，用吡啶(7×10ml)，甲醇(5×15ml)和氯仿(5×15ml)多次洗涤玻璃珠，然后真空干燥。
                实施例8
结合到CPG支持物上的叔氨基的甲基化(化合物10，图解2)
往衍生的长链烷氨基可控孔度玻璃(化合物9，图解2)(1.01g)中加入无水THF(10ml)和碘代甲烷(0.5ml，8mmol)。然后将混合物轻轻搅拌18小时，用无水THF(5×10ml)多次洗涤玻璃珠并真空干燥。
                图解2
Figure C9419344200351
                 实施例9
一保护的1，3-丙二醇衍生物(化合物12a和化合物12b，图解3)的合成-一般工艺
在N2气氛下往氢化钠(1.05g 60％的油分散体，26.3mmol)中加入无水THF(10ml)，接着滴加溶于无水THF(20ml)中的1，3-丙二醇衍生物(26.3mmol)。在N2气氛下再搅拌30分钟以确保生成烷氧化物，其标志为生成灰色沉淀。产生的烷氧化物通过滴加溶于无水THF(20ml)中的叔丁基氯二苯基甲硅烷(7.24g，26.3mmol)处理，接着在N2气氛下再搅拌反应40分钟。然后旋转蒸发除去THF，将残余物分配在二氯甲烷和0.1M碳酸氢钠溶液中。分出二氯甲烷溶液并用盐水(×1)洗涤。然后将二氯甲烷溶液用硫酸镁干燥并蒸发成油状物。将此油状物置于硅胶柱(16cm×5cm)上，用乙醚/石油醚40-60℃，30％/70％混合物洗脱。将产物级分合并并旋转蒸发得到所需的1，3-丙二醇衍生物。
化合物的各自详情见下面。
12a 1-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-1，3-丙二醇，白色晶状固体，RF 0.21；乙醚/石油醚40-60℃，30％/70％，7.61g，92％，mpt40-42℃。IR(KBr片)3400，1448，1112，822，734，702，689，506，488cm-1.1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)：1.06(s，9H，tBu)，1.80(m，2H，CH2CH2CH2)，2.45(t，1H，OH)，3.84(m，4H，OCH2CH2CH2O-)，7.40(m，6H，芳基)，7.68(m，4H，芳基).
12b 2-甲基-1-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-1，3-丙二醇，无色油状物，RF 0.21乙醚/石油醚40-60℃，30％/70％，6.60g，77％。IR(薄膜)3400，1472，1428，1087，1040，823，740，702cm-1.1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)：0.82(d，3H，J＝6.87Hz，CH3)，1.06(s，9H，tBu)，2.0(m，1H，CH-CH3)，2.68(t，1H，OH)，3.64(m，4H，CH2CH(CH3)CH2)，7.40(m，6H，芳基)，7.68(m，4H，芳基).参见P G McDougal等人，JOC，51，3388(1986)中不对称1，n-二醇的单甲硅烷基化的一般工艺。
            实施例10
2，2，2-三氟乙磺酸酯衍生物(化合物13a和13b，图解3)的合成-一般工艺
在N2气氛下往冷却至-15℃--30℃的溶于无水二氯甲烷(10ml)和无水三乙胺(0.84ml，6.03mmol)中的醇衍生物(4.94mmol)中在20-40分钟内滴加溶于无水二氯甲烷(5ml)中的2，2，2-三氟乙磺酰氯(1g，5.48mmol)。在N2气氛下于-15℃--30℃再搅拌30分钟完成反应。然后将反应混合物转移至分液漏斗中并用冰冷却的1.0M盐酸(×1)、冰冷却的水(×1)和冰冷却的盐水(×1)洗涤。然后将二氯甲烷溶液用硫酸镁干燥，旋转蒸发掉溶剂得到2，2，2-三氟乙磺酸酯。使用前将此2，2，2-三氟乙磺酸酯在-20℃于N2气氛下存放。
化合物的各自详情见下面。
13a  1-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-3-O-2，2，2-三氟乙磺酰基-1，3-丙二醇，白色晶体状固体，1.74g，77％，mpt.34-35℃。在处理反应之前取出3ml反应混合物用于加到其它反应中。1H NMR(270MHz.CDCl3，δ)：1.06(s，9H，tBu)，1.97，(m，2H，CH2CH2CH2)，3.77(t，2H，J＝5.49Hz，CH2-O)-Si)，3.84(q，2H，J＝8.79Hz，CF3-CH2-O)，4.54(t，2H，J＝6.05Hz，Tresyl O-CH2)，7.42(m，6H芳基)，7.64(m，4H，芳基).IR(KBr片)1386，1329，1274，1258，1185，1164，1137，1094，941，763，506cm-1.
13b 2-甲基-1-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-3-O-2，2，2-三氟乙磺酰基-1，3-丙二醇，无色油状物，2.57g，99％。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)：0.97(d，3H，J＝6.87Hz，CH3)，1.06(s，9H，tBu)，2.10(m，1H，CHCH3)，3.6(m，2H，CH2OSi)，3.8(q，2H，J＝8.79Hz，CF3CH2)，4.40(m，2H，Tresyl-O-CH2)，7.40(m，6H，芳基)，7.64(m，4H，芳基).2，2，2-三氟乙磺酸酯的一般情况见R K Crossland等人，JACS，93，4217(1971)。
                       图解3
Figure C9419344200391
                实施例11
N-[乙酰氧基-2-氧基乙基]-N-[O-(3-(O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-1-氧基甲基)-4-硝基苯基)-3-氧基丙基]-N-2-羟基乙基]胺(化合物15，图解4)的合成
往溶于无水THF(20ml)中的化合物11(1.72g，1.92mmol)中加入氟化四丁基铵(0.55ml 1M THF溶液，1.92mmol)。然后在室温搅拌反应共两小时。将反应混合物用水(50ml)稀释，旋转蒸发除去THF。水溶液然后用氯仿(×1)萃取。有机溶液用无水硫酸钠干燥，蒸发成胶状物。产物通过硅胶色谱法纯化，用乙酸乙酯洗脱柱子。合并产物级分并旋转蒸发得到化合物12，为无色胶状物，放置后缓慢结晶；0.73g，58％，mpt.95-97℃，RF 0.26乙酸乙酯。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)：1.75(brs，1H，OH)，2.0→2.1(m，5H，O2CCH3+CH2CH2CH2)，2.70→2.81(m，6H，CH2N)，3.58(m，2H，CH2OSi)，3.79(s，6H，DMT-OCH3)，4.17(m，4H，CH2O)，4.64(s，2H，ArCH2ODMT)，6.83(d，4H，DMT-芳基)7.2→7.5(m，10H，芳基)，7.69(s，1H，芳基)，8.10(d，1H，芳基).IR(KBr片)，3459，1738，1608，1577，1506，1444，1313，1288，1250，1230，1175，1154，1070，1035，984cm-1.
                实施例12
N-[O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-2-氧基乙基]-N-[O-(3-(O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-1-氧基甲基)-4-硝基苯基)-3-氧基丙基]-N-[乙酰氧基-2-氧基乙基]胺(化合物14，图解4)的合成
往溶于无水吡啶(10ml)中的化合物6(1.73g，2.02mmol)中加入乙酐(0.5ml，4.54mmol)和4-二甲氨基吡啶(55mg，0.45mmol)，将烧瓶塞住。然后将反应混合物在室温搅拌共16小时，T.l.c.分析(甲醇/乙酸乙酯5％/95％)显示原料完全消失，形成了新的含三苯甲基的斑点RF 0.80。旋转蒸发除去吡啶，最后微量通过与甲苯(×2)共蒸发除去。将所得胶状物分配在氯仿和水中。分出氯仿溶液并用盐水(×1)洗涤。然后将氯仿溶液用无水硫酸镁干燥，旋转蒸发掉溶剂得到1.94g无色胶状物。此物有足够的纯度用于下一步反应而不需进一步纯化。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)：1.04(s，9H，tBu)，1.9(m，2H，CH2CH2CH2)，2.01(s，3H，-O2CCH3)，2.74(m，6H，CH2N)，3.7(m，2H，CH2OSi)，3：8(s，6H，DMT-OCH3)，4.1(m，4，CH2O)，4.63(s，2H，ArCH2ODMT)，6.78(d，1H，芳基)6.83(d，4H，DMT芳基)，7.2→7.8(m 20H芳基)，8.05(d，2H，芳基)
            实施例13
N-[乙酰氧基-2-氧基乙基]-N-[O-(3-(O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-1-氧基甲基)-4-硝基苯基)-3-氧基丙基]-N-[O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-3-氧代-6-氧基己基]胺(化合物16，图解4)的合成
往溶于无水乙腈(5ml)中的化合物12(66mg，0.10mmol)中加入碳酸钾(55mg，0.4mmol)和化合物13a(1ml反应混合物，约0.30mmol)，然后用氯化钙干燥管塞住烧瓶。将反应混合物在室温搅拌共22小时后滤出碳酸钾，旋转蒸发除去溶剂。然后将所得油状物置于硅胶柱(14cm×1cm)上，产物用乙醚/石油醚40-60℃，75％/25％混合物洗脱。合并纯产物级分并蒸发成透明的胶状物，6mg，6％，在乙醚/石油醚40-60℃，80％/20％中RF0.47。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)：1.05(s，9H，tBu)，1.8(m，2H，CH2CHCH2OSi)，1.9(m，5H，O2CCH3+ArOCH2-)，2.76-2.92(m，6H，CH2N)，3.51(t，2H，J＝6.6Hz，OCH2CH2CH2OSi)，3.79(s，6H，DMT-OCH3)3.85(m，2H，CH2OSi)，4.12→4.23(m，4H，ArOCH2CH2+NCH2CH2OCOCH3)，4.64(s，2H，ArCH2ODMT)，6.83(m，5H，1芳基+DMT-芳基)，7.23→7.50(m，16H，芳基)，7.68(m，4H，芳基)，8.10(d，1H，J＝9.06Hz，芳基).
以类似于上面的反应条件，用2，2，2-三氟乙磺酸酯13b合成下列化合物。
N-[乙酰氧基-2-氧基乙基]-N-[O-(3-(O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-1-氧基甲基)-4-硝基苯基)-3-氧基丙基]-N-[O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-5-甲基-3-氧代-6-氧基己基]胺。此化合物为透明的胶状物，在乙醚/石油醚40-60℃，80％/20％中RF 0.53。1H NMR(270MHz，CDCl3，δ)：0.88(d，3H，CH-CH3)，1.00(s，9H，tBu)，1.9→2.1(m，6H，O2CCH3+CH-CH3+CH2CH2CH2)，2.7→3.0(m，6H，CH2N)，3.4→3.7(m，4H，CH2O-)，3.79(s，6H，DMT-OCH3)，4.0→4.4(m，6H，CH2O-)，4.64(s，2H，Ar CH2ODMT)，6.83(m，5H，芳基)，7.2→7.7(m，20H，芳基)，8.01(d，1H，芳基).
                      图解4
Figure C9419344200431
                实施例14
固体支持物上的寡核苷酸的合成
将带有接头9和10(图解2中的化合物9和10)的可控孔度玻璃被装入寡核苷酸自动合成仪(ABI 381A)所用的柱内；所用的量供0.2或1μmol规模合成。将该柱插入自动合成仪内，然后安排为适当的循环。使用两个不同种类的核苷酸前体：正常氨基磷酸化物(phosphoramidites)，在5′羟基上有二甲氧基三苯甲基保护基；在3′羟基上带5′氨基磷酸基和二甲氧基三苯甲基保护基的“逆合成子”。在这些支持物上合成的寡核苷酸列于表4中，其中R9和R10分别从化合物0和10衍生而来。产率根据每个偶联所释放的二甲氧基三苯甲基的量计算。这些产率相应于在常规寡核苷酸合成所用的CPG支持物上得到的产率。表  4端基       序列    正常方向    反方向R9          T5                 R10         T5                 R10，DMT    T5                 R9，DMT     T5      
Figure C9419344200444
R10，DMT    T5       R10         A10     
Figure C9419344200446
                实施例15
在保持分析物完整的条件下合成标记物
在支持物9上合成5′R9T5之后，将固体支持物分开，部分用5mM THF中的氟化四丁基铵在室温下处理10分钟以除去叔丁基二苯基甲硅烷基保护基。两个样品都用29％氨在室温下处理过夜以从固体支持物上除下产物。真空除去氨，将固体残余物溶于水中。HPLC显示甲硅烷基保护基被成功地除去，而保留了DMT基。此实施例显示两个保护基可在保留另一个的条件下除去；而且，保护基的除去并未破坏寡核苷酸链。
                实施例16
标记的分析物的生化反应
16a.标记的寡核苷酸的酶催化磷酸化
为了许多目的，在5′末端有磷酸基的寡核苷酸是有用的。如果寡核苷酸被用作连接反应的供体，这类基团是必须的；而引入放射性基团以测试生化性质是一个有用的途径。
寡核苷酸A5、A10和T5由结合在3′末端的标记物R9和R10产生，或已除去或没有除去甲硅烷基保护基(这通过用5mM氟化四丁基铵的乙腈溶液室温下处理正在固体支持物上的寡核苷酸15分钟而实现)。这些寡核苷酸用T4多聚核苷酸激酶的γ-33P-ATP用供应者推荐的标准方案磷酸化。产物在浸过纤维素的聚乙烯亚胺(PEI)上的薄层色谱法(用0.5M碳酸氢铵展开)显示出在每种情况下被标记的磷几乎完全转移到寡核苷酸上。
16b.标记寡核苷酸的酶催化连接
对于标记寡核苷酸的一些应用而言，将它们与受体连接是有用的。我们已阐明通过下列试验的酶催化连接可产生经标记的寡核苷酸：(1)在5′末端标记寡核苷酸
在此试验中，模板是5′-ATCAAGTCAGAAAAATATATA(SEQ IDNO.1)将它与供体3′-TAGTTCAGTC(SEQ ID NO.2)杂交，此供体5′末端已先用放射性磷磷酸化。进行了四个连接反应，每个反应中的序列T5都经过修饰，当它与模板中的5个A循环杂交后，可与供体的5′磷酸化末端连接。反应中所用的四个寡T的5′末端的特征有所不同，一个通过羟基结合有二甲氧基三苯甲基，第二和第三个通过磷酸二酯键在其5′末端结合有标记物R9和R10，第四个是阳性对照，具有正常的5′OH，阴性对照缺乏任何寡T。根据供货商的指示，使用T4连接酶进行连接反应。通过TLC在PEI-纤维素上分析反应，在0.75M的碳酸氢铵溶液中展开。所有四个反应在层析谱上都显示出多余的斑点，其迁移率比供体的低，阴性对照正如所期望的那样没有显示出多余的斑点，这阐明了具有不同标记物的寡核苷酸是如何能参与序列特异性的连接反应的。
Cozzarelli等人(1967)已阐明在互补模板存在时，结合于固体支持物上的多聚核苷酸可与受体连接。
                实施例17经标记的寡核苷酸与束缚于固体支持物上的寡核苷酸的杂交
实施例16b表明经标记的寡核苷酸可参与连接反应，这意味着它们也可参与溶液中双螺旋的形成，因为连接依赖于此过程。下列实验表明它们也可与束缚于固体支持物上的寡核苷酸形成双螺旋。根据制造商的指示，在胺化的聚丙烯膜的表面合成T10，已知此过程每mm2可产生大约10pmol寡核苷酸。用33P标记A10于3.5M氯化四甲胺中的溶液(65pmol/μl)的5′末端，用R10标记其3′末端，将此溶液涂在衍生的聚丙烯的表面，在4℃下放置过夜。在杂交溶剂中洗过后，发现大约三分之一的探针已和经束缚的寡-dT杂交。这接近于杂交的理论极限，表明经标记的寡核苷酸可高效地参与杂交反应。
                实施例18标记物的光解
通过光解除去标记物的潜力大大加强了其用途：它可允许在质谱仪中通过激光解吸直接分析；它可提供一除去标记物的简单方法以使其它生化或化学过程得以进行。18a.整体光解
已知硝基苄基在305nm的照射下不稳定。在已知不会导致核酸的可见损伤的条件下，以透照仪2cm的光照射R10A10和R10T5的水溶液达20分钟。HPLC分析显示出光解的预想产物。无可检测的残余原始化合物。18b.质谱仪中激光诱导的光解
将R10T5和T5R10样品在不加基质的条件下沉积在一次飞行质谱仪(Finnigan Lasermat)的金属靶上。谱图显示在质量243附近以正的方式有一单个饱和峰，在其它样品中不存在。
                实施例19
通过结合到不同分析物上的不同标记物的质谱的鉴定
通过常规固相法，但用“逆合成子”合成。一系列带有二甲氧基三苯甲基作为标记物连接在3′末端的五个胸苷残基。在质谱仪中，此化合物在质量304处以正离子形式给出大且独特的峰。相比之下，一系列带有前面记为R10的标记物的十个腺苷残基在质量243处以正离子形式给出大且独特的峰。在两种情况下，激光解吸在没有基质存在下进行。在两种情况下，没有标记物的寡核苷酸不存在所述峰。这些例子表明从分析物合成期间掺杂的标记物衍生的质谱示踪中峰的存在很容易鉴定分析物序列，而特征标记物很容易通过其不同质量鉴别。
                 附图说明
图1.带有特定标记物的分子合成的一般图解
合成从接头(L)开始，至少一个位点用于加入基团以合成分析物，一个位点用于合成标记物。在合成期间接头也可可逆地结合到固体支持物上，并可具有生成诸如可帮助分析的带电基团的位点。Pa和Pr分别是分析物前体和报道分子的临时保护基；它们可通过不同的处理脱去。例如，Pa可以是酸或碱不稳定基团，如三苯甲基、F-MOC或t-BOC，而Pr是可用氟化物处理脱去的基团，如甲硅烷基残基。基团U-Z也可有保护基，该保护基必须对除去Pa和Pr所用的试剂稳定。偶合化学对不同类型的分析物是不同的；标准方法对寡核苷酸和肽合成是有效的。
三种不同类型的标记物描述于附图2中。对于第一个图解，标记物的每个延伸由对加到分析物上的残基的位置和类型均为特异性的报道分子进行。加帽对于此图解是不重要的。
在第二和第三图解中，当残基被加到分析物上时，位置由报道分子在合成中的所述阶段达到的总质量限定。在这种情况下，通过封端一部分分子而终止标记物的部分延伸是重要的。第二和第三图解在加入报道分子的方式上是不同的。在第二图解中，它们在延伸剂中；在第三图解中，它们在帽子(封端剂)中。
图2.分子特异性标记物的三种类型A.举例说明由报道分子(E)组成的标记物，此报道分子确定了分析物(U-Z)中基团的位置(下标)和特性(上标)。这样的安排可包括一系列式量增加的脂族链以确定位置：例如，亚甲基对位置1，亚乙基对2，亚丙基对3等。这些可以被碳和氢的不同的同位素组成区分为特定类型基团：例如，有六种不同的CH2同位素组成，如前面表1中所示。其中四个相差一个质量单位并可容易地通过质谱法区分。可以设想其它区分标记方式。例如，无论位置还是基团都可被带不同电荷的报道基团标记。这些基团可通过包括质谱法的多种方法分离和识别。B.显示通过部分合成制得的标记物使得分析物的任何结构被连接到系列标记物上；系列的第一成员具有一个对分析物的第一个基团特异性的报道基团；第二个具有第一个报道基团加上对分析物的第二个基团特异性的第二个报道基团等等。这类系列可通过使用用于延伸标记物的两种前体容易地制备：一个被可逆的保护基保护而另一个防止进一步延伸。例如，RX和P-(CH2)nX的混合物，其中R是非反应性脂族基如甲基或乙基，P是可逆保护基，X是一可与被P保护的基团反应的活化残基。被非反应性脂族基“加帽”的那些分子不会参与下一轮的去保护和延伸。
在B中，基团特异性信息含在用于扩大合成的残基中。如在A中所示，可用质量同位素提供信息。例如，每加入一个用C和H同位素标记的CH2残基到P-(CH2)nX中，就加入又一个可为报道分子提供不同的质量的位点。(CH2)n的质量范围为14n到17n且该范围中有4+3(n-1)种不同的质量。因此对于亚乙基，在范围28至34内有七种不同的质量，对于亚丙基，在范围42至51内有十种不同的质量。C.显示如何以不同方式加入基团特异性信息；在此情况下，它含在链的末端即例B的“帽子”中。而且，不同的质量可通过标记脂族残基提供。位置信息通过加入末端的延伸长度提供。假设E是(CH2)2-O而末端是式量为15至19的同位素标记的甲基。每次延伸将增加44个质量单位到报道分子中。最短的报道分子的质量范围将为44+15＝59至44+19＝63。第二个位置的质量范围将为88+15＝103至83+19＝107，等等直至第六个，其质量范围为284+15＝299至284+19＝303。在此范围内没有重叠，可以看出，报道分子的数目和范围可通过利用末端或用更多原子延伸而扩大和延伸。
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                  序列表(1)一般资料：
(i)申请人：
  (A)姓名：ISIS INNOVATION LIMITED
  (B)街道：2 South Parks Road
  (C)城市：Oxford
  (E)国家：  英国
  (F)邮编：OX1 3UB
  (A)姓名：SOUTHERN，EDWIN
  (B)街道：30 Staverton Road
  (C)城市：Oxford
  (E)国家：英国
  (F)邮编：OX2 6XJ
  (A)姓名：CUMMINS，WILLIAM JONATHAN
  (B)街道：5 Thorntree Drive
  (C)城市：Tring
  (D)州：Herts
  (E)国家：英国
  (F)邮编：HP23 4JE
(ii)发明名称：标记试剂和测定方法
(iii)序列数目：  2
(iv)计算机可读形式：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.25(EPO)
(vi)已有的申请资料：
  (A)申请号：GB 9315847.5
  (B)申请日：30-7-1993(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：21个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
ATCAAGTCAG AAAAATATAT A(2)SEQ ID NO：2的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：10个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
CTGACTTGAT

Claims (27)

1.一种试剂，它含有
a)分析物部分，该部分含有至少两个分析物残基，并连接于
b)标记部分，它含有一个或多个适于通过质谱法检测的报道基团，不包括寡核苷酸，
其中报道基团标示出分析物残基，选择标记部分各个位置的报道基团用以标示在分析物部分的限定位置上的分析物残基。
2.如权利要求1所要求的试剂，其中提供了接头基团以使分析物部分和标记部分结合于其上。
3.如权利要求1或2所要求的试剂，其中分析物部分是n个分析物残基的链。标记部分是至多n个报道基团的链，选择标记链各个位置的报道基团用以标示分析物链的相应位置的分析物残基。
4.如权利要求1至3中任一项所要求的试剂，其中分析物部分通过可光裂解的键与标记部分相连接。
5.如权利要求1至4中任一项所要求的试剂，它具有式A-L-R，其中A是构成分析物部分的n个分析物残基的链，L是接头，R是构成标记部分的至多n个报道基团的链，n是2-20，其中标记部分含有限定分析物部分的分析物残基之定位的信息。
6.如权利要求2至5中任一项所要求的试剂，其中接头含有带有羟基、氨基或巯基以用于合成分析物部分的芳香基团，以及用于合成标记部分的活性基团。
7.如权利要求6所要求的试剂，其中带有羟基、氨基或巯基以用于合成分析物部分的芳香基团还带有用于光裂解的邻硝基基团。
8.如权利要求1至7中任一项所要求的试剂，其中存在带电基团以供质谱法分析。
9.如权利要求1至8中任一项所要求的试剂，其中分析物部分是肽链。
10.如权利要求1至8中任一项所要求的试剂，其中分析物部分是寡核苷酸链。
11.如权利要求1至10中任一项所要求的试剂的试剂库，其中所述的库由多种试剂构成，每种含有不同的分析物部分。
12.如权利要求11所要求的试剂库，其中该库由4n种试剂构成，每种试剂含有不同的分析物部分，它是n个核苷酸的不同的寡核苷酸链。
13.如权利要求12所要求的试剂库，其中试剂混合于溶液中。
14.测定方法，它包括下列步骤：提供靶物质；在导致至少一种试剂与靶物质结合的条件下将靶物质与权利要求11至13中任一项所要求的试剂库一起温育；除去未结合的试剂；回收此种或每种结合的试剂的标记部分；分析回收的标记部分以作为结合于靶物质上的分析物部分之特征的指示。
15.如权利要求14所要求的测定方法，其中靶物质是生物体或组织或细胞群体。
16.测定靶核酸序列的方法，此方法包括下列步骤：
a)提供固定于支持物上的寡核苷酸，
b)将靶核酸与固定化的寡核苷酸杂交，
c)将来自b)的杂交体与权利要求13所要求的试剂库一起温育，以使库中的第一试剂的寡核苷酸链能与相邻于固定化寡核苷酸的靶核酸杂交，
d)连接相邻的寡核苷酸，从而形成连接的第一试剂，
e)除去其它未连接的试剂，和
f)回收并分析连接的第一试剂的标记部分以作为靶核酸的第一部分的序列的指示。
17.如权利要求16所要求的方法，它还包括下列步骤：
ci)将来自f)的杂交体与权利要求13所要求的试剂库一起温育，以使库中的第二试剂的寡核苷酸链与相邻于第一试剂的寡核苷酸链的靶核酸杂交，
di)连接相邻的寡核苷酸，从而形成连接的第二试剂，
ei)除去其它未连接的试剂，和
fi)回收并分析连接的第二试剂的标记部分以作为靶核酸的第二部分的序列的指示。
18.如权利要求16或17所要求的方法，其中：步骤a)中寡核苷酸固定于作为支持物的一系列针状物的末端；步骤b)中靶DNA的单个克隆与固定于每个单个针状物上的寡核苷酸杂交；步骤c)和d)中形成了一系列连接的试剂，不同的针状物携有不同的连接的试剂；步骤f)中回收每种连接的试剂的标记部分并分析之以作为部分靶DNA序列的指示。
19.如权利要求16或17所要求的方法，其中：步骤b)中靶DNA的每个单个克隆与固定于支持物的各个间隔位置上的寡核苷酸杂交；步骤c)和d)中提供了一系列连接的试剂，支持物的不同的间隔位置携有不同的连接的试剂；步骤f)中回收每种连接的试剂的标记部分并分析之以作为部分靶DNA序列的指示。
20.如权利要求16或17所要求的方法，其中此方法包括下列步骤：
a)提供一系列寡核苷酸，它们被相间隔地固定于支持物上，各个位置上的寡核苷酸互不相同，
b)将靶核酸与一系列固定化的寡核苷酸一起温育，以在支持物上的一个或多个间隔位置上形成杂交体，
c)将来自b)的杂交体与权利要求13所要求的试剂库一起温育以使库中试剂的寡核苷酸链与相邻于每个固定化寡核苷酸的靶核酸杂交，
d)连接相邻的寡核苷酸，从而在支持物上的一个或多个间隔位置上形成连接的试剂，
e)除去其它未连接的试剂，和
f)回收并分析每个连接的试剂的标记部分以作为部分靶核酸序列的指示。
21.如权利要求20所要求的方法，其中所述序列为通过共价键固定于支持物上的每个间隔位置上的寡核苷酸的序列。
22.分析靶DNA的方法，此方法包括下列步骤：
i)提供固定于支持物上的靶DNA，
ii)将来自i)的固定化靶DNA与权利要求10所要求的多种试剂一起温育以使不同试剂的寡核苷酸链与支持物上的靶DNA杂交，
iii)除去未杂交的试剂，和
iv)回收并分析每种试剂的标记部分以作为部分靶DNA序列的指示。
23.如权利要求22所要求的方法，还包括下列步骤：
iia)将来自iv)的杂交体与权利要求13所要求的试剂库一起温育，以使不同试剂的寡核苷酸链与靶DNA杂交，
iiia)连接与靶DNA杂交的相邻寡核苷酸，除去未连接的试剂，和
iva)回收并分析每种连接的试剂的标记部分以作为部分靶DNA序列的指示。
24.如权利要求22或23所要求的方法，其中靶核酸的各个克隆固定于支持物上的间隔位置，而在步骤ii)中，不同试剂的寡核苷酸链与位于支持物上不同的间隔位置的靶核酸杂交。
25.如权利要求14至24中任一项所要求的方法，其中通过光裂解从其相关试剂中回收每种标记部分。
26.如权利要求14至25中任一项所要求的方法，其中通过质谱法分析标记部分。
27.测定装置，它包括：其上具有两个或更多个间隔位置的支持物；固定于支持物上间隔位置的靶核酸的单个克隆；与支持物上间隔位置上的靶核酸的各个克隆杂交的根据权利要求10的不同试剂。
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